ES2235232T3 - Anticuerpo monoclonal anti-mp52 humano. - Google Patents
Anticuerpo monoclonal anti-mp52 humano.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN ANTICUERPO MONOCLONAL DE RATON MP52, ANTI-HUMANO, QUE SE UNE AL MP52 HUMANO DIMERO, PERO NO AL MP52 HUMANO MONOMERICO. DICHO ANTICUERPO MONOCLONAL DE RATON QUE COMPRENDE IGG Y TIENE UNA ELEVADA ESPECIFICIDAD, SE PUEDE OBTENER SENSIBILIZANDO A RATONES CON MP52 HUMANO (CHO - MP52), PRODUCIDO EN CELULAS CHO Y CON MP62 HUMANO (RHMP52) PRODUCIDO EN ESCHERICHIA COLI. DICHO ANTICUERPO ES UTIL, POR EJEMPLO, EN LA PURIFICACION O ENSAYO DE MP52 HUMANO PRODUCIDO MEDIANTE TECNICAS DE INGENIERIA GENETICA.
Description
Anticuerpo monoclonal anti-MP52
humano.
Esta invención se refiere a un nuevo anticuerpo
monoclonal de ratón anti-MP52 humano. Más
específicamente, esta invención se refiere a un anticuerpo
monoclonal de ratón anti-MP52 humano que es capaz de
fijarse a un MP52 humano dímero, pero no a un MP52 humano
monómero.
Además, esta invención se refiere a un hibridoma
capaz de producir un anticuerpo monoclonal de ratón
anti-MP52 humano descrito arriba y al uso del
mismo.
El MP52 humano se aisló por primera vez por su
cDNA como un factor osteogénico perteneciente a la superfamilia de
genes TGF-\beta en 1994 (Biochem. Biophy. Res.
Comm., Vol. 204, No. 2, 1994). El MP52 humano está considerado como
una proteína que tiene 120 residuos de aminoácidos con alanina en
el término N, y su secuencia de aminoácidos se consigna en los
documentos WO 93/16099 y WO 95/04819. Es evidente por varios
ensayos en animales que MP52 está implicado en la osteogénesis
análogamente a otros factores osteogénicos. Sin embargo, han
quedado muchos puntos desconocidos en lo que respecta a la causa de
que MP52 se induzca directamente en la osteogénesis y el mecanismo
por el que se produce la osteogénesis, habiéndose publicado
solamente un pequeño número de informes acerca de ello.
Adicionalmente, el MP52 de ratón es diferente del
MP52 humano solamente en una de las secuencias de aminoácidos en el
sitio del terminal N, y por consiguiente el MP52 se deriva de un
gen conservado firmemente a lo largo de las especies de tal modo
que no es fácil obtener un anticuerpo para el MP52 humano a partir
de un ratón, aunque en el documento WO 93/16099 se consignó que se
había puesto a disposición un anticuerpo monoclonal de ratón.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar un anticuerpo monoclonal de ratón
anti-MP52 humano que es capaz de fijarse a un MP52
humano dímero, pero no a un MP52 humano monómero.
Se ha intentado producir MP52 humano por medio de
ingeniería genética. En la purificación del MP52 humano producido
por incubación de células hospedadoras que tienen integrado en
ellas cDNA que codifica MP52 humano, se ha encontrado eficaz
purificar el MP52 humano utilizando un anticuerpo monoclonal capaz
de fijarse específicamente a MP52 humano. Más específicamente, un
anticuerpo monoclonal específico para MP52 humano se dispone sobre
un soporte, y se pone en contacto con un MP52 groseramente
purificado para aislar MP52 humano por fijación, después de lo cual
se separa el MP52 humano. En este caso, con objeto a aislar el MP52
dímero activo, es aparentemente ventajoso emplear un anticuerpo
monoclonal tal que el mismo sea capaz de fijarse específicamente a
un MP52 humano
dímero.
dímero.
El anticuerpo monoclonal para MP52 humano puede
utilizarse para cuantificación del MP52 humano. La cuantificación de
MP52 humano es útil para la elucidación de los factores inductores
de MP52 y estudios sobre el mecanismo de la osteogénesis. En este
caso, un MP52 dímero puede catabolizarse en un cuerpo vivo para dar
un monómero desactivado o fragmentos del mismo. El MP52 dímero
activo puede detectarse únicamente utilizando un anticuerpo
monoclonal que se fije específicamente a un MP52 dímero.
Además, la invención proporciona un anticuerpo
que es capaz de fijarse a un sitio biológicamente activo de MP52
humano. Es decir, se proporciona un anticuerpo monoclonal de ratón
anti-MP52 humano que puede prevenir la fijación
entre MP52 humano y el receptor del mismo. El anticuerpo de la
invención reconoce específicamente una estructura de orden alto de
MP52 humano y se fija a MP52 humano en el sitio activo del mismo
para inhibir la actividad del mismo. Dado que el anticuerpo
reconoce un sitio activo de MP52 humano, no reconoce ninguna
porción inactiva incluso en el MP52 dímero. Esto es evidentemente
ventajoso cuando se aplica su separación o ensayo.
El anticuerpo monoclonal de ratón de esta
invención puede producirse por los pasos siguientes de acuerdo con
un proceso bien conocido para producir un anticuerpo
monoclonal:
(1) sensibilizar ratones con MP52 humano como un
inmunógeno durante un periodo de tiempo prolongado,
(2) realizar la fusión celular entre células del
bazo de ratones sensibilizados y células de mieloma de ratón,
(3) escrutar el hibridoma que produce un
anticuerpo monoclonal para MP52 humano a partir del hibridoma
resultante,
(4) clonar el hibridoma productor del anticuerpo
deseado,
(5) realizar el cultivo en gran escala de las
células clonadas para producir un anticuerpo, o trasplantar las
células clonadas a ratones intraperitonealmente para producir un
anticuerpo, y
(6) separar y purificar el anticuerpo contenido
en el sobrenadante de cultivo o la ascitis.
Los pasos anteriores se explicarán con mayor
detalle a continuación.
En la preparación de ratones inmunosensibilizados
en el paso (1), una solución de MP52 humano en ácido clorhídrico
acuoso 10 mM se mezcla y emulsiona con un adyuvante completo de
Freund (CFA) y la emulsión resultante se administra a ratones por
vía intraperitoneal varias veces a una frecuencia de 4 veces por
cada 4 meses. Un contenido del MP52 es convenientemente de 10 \mug
a 100 \mug. después de aproximadamente un intervalo de un mes
desde la administración, una solución de 10-100
\mug de MP52 humano emulsionada análogamente con un adyuvante
incompleto de Freund (IFA) se administra a los ratones por vía
intraperitoneal. Deseablemente, se administran a los ratones que se
han sensibilizado continuamente con MP52 humano junto con los
adyuvantes por vía subcutánea, después de un intervalo adicional de
uno a dos meses, 10-100 \mug de MP52 humano sin
adyuvante alguno, y, unos cuantos días antes de la fusión celular,
se administran ulteriormente por vía intravenosa a los ratones en
la vena del rabo 10-100 \mug de MP52 humano.
La producción de MP52 humano se ha intentado
utilizando un vector de expresión que tiene integrado en él el cDNA
que codifica MP52 humano y células animales tales como células CHO
y bacterias tales como Escherichia coli como hospedador. Los
autores de la presente invención han intentado producir un
anticuerpo monoclonal utilizando como antígeno sensibilizador MP52
humano producido en células CHO (al que se hace referencia en lo
sucesivo en esta memoria como CHO-MP52) [la línea
de células animales MC-2 productora de MP52 humano
ha sido depositada en el National Institute of Bioscience and
Human-Technology, Agencia de Ciencia y Tecnología
Industrial (1-3, Higashi 1-chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón) con el número de
depósito internacional FERM BP-5142.] y el MP52
humano producida por Escherichia coli (a la que se hace
referencia en lo sucesivo en esta memoria como rhMP52) [un vector de
expresión para MP52 humano ha sido depositado en el National
Institute of Bioscience and Human-Technology,
Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial (1-3,
Higashi 1-chome, Tsukuba-shi,
Ibaraki, Japón) con el número de depósito internacional FERM
BP-5499], respectivamente. Los anticuerpos
resultantes eran todos ellos IgMs que tenían una especificidad
inferior. Sin embargo, los autores de la invención han conseguido
producir con éxito un anticuerpo monoclonal que tiene una
especificidad mayor utilizando a la vez CHO-MP52 y
rhMP52 como antígeno sensibilizador.
En la fusión celular del paso (2) el bazo del
ratón suficientemente inmunosensibilizado en el paso (1) se extirpa
primeramente y se prepara luego una suspensión de células del bazo
de manera convencional. A continuación, se somete una mezcla de las
células de bazo resultantes y células de mieloma de ratón a
tratamiento de fusión celular utilizando polietilenglicol caliente.
Después del tratamiento, las células no fusionadas se separan de la
mezcla de células utilizando un medio que contiene suero de ternero
fetal (FCS) y HAT [hipoxantina (H), aminopterina (A) y timidina
(T)]. La mezcla resultante se vierte poco a poco en una placa de 96
pocillos a una baja concentración (una concentración a la cual un
clon es capaz de propagarse en un pocillo) y al cabo de una semana
se recupera un sobrenadante en el pocillo en el que se ha
confirmado la propagación.
El ensayo de un anticuerpo
anti-MP52 humano producido en el sobrenadante del
paso (3) puede realizarse utilizando una placa con 96 pocillos
recubierta con MP52 humano utilizada como inmunógeno de acuerdo con
un método ELISA convencional. A fin de seleccionar el anticuerpo
para MP52 humano que no se fija a un MP52 humano monómero, pero se
fija a un MP52 dímero, se combinan dos métodos ELISA en los cuales
se utilizan 1) MP52 humano dímero sin tratar (no reducido)
(D-rhMP52) y 2) MP52 humano monómero reducido
(M-rhMP52). En este caso, la molécula monómera en
estado reducido puede formar fácilmente el dímero correspondiente
cuando se aplica en forma de capa sobre la placa y por
consiguiente, el monómero a utilizar para recubrimiento se sulfona
de una manera convencional para evitar la reconstrucción de la
molécula dímera. Adicionalmente, la reactividad específica del
anticuerpo con el MP52 humano monómero y el MP52 humano dímero se
confirma de acuerdo con el método de transferencia Western. Como
resultado, se obtuvieron un anticuerpo monoclonal que reacciona
fuertemente con M-rhMP52 o D-rhMP52
y un anticuerpo monoclonal que reacciona con ambos.
La especificidad del anticuerpo monoclonal puede
confirmarse por el método de transferencia Western. A saber, rhMP52s
en las condiciones no reductoras (D-rhMP) y en las
condiciones reductoras (M-rhMP) se someten a
SDS-PAGE, y se transfieren luego a una membrana de
nitrocelulosa por el método estándar. La membrana de nitrocelulosa
que lleva la rhMP52 transferida sobre ella se incubó en el
sobrenadante de cultivo que contenía un anticuerpo monoclonall, se
detectó por medio de un inmunoglobulina de conejo marcada con HRPO.
Los resultados estaban de acuerdo con los del escrutinio primario
con el método ELISA.
Adicionalmente, la especificidad puede
confirmarse con TGF-\beta2 y BMP-2
al que se asemeja el MP52 humano como antígeno para el método ELISA
del mismo modo. Todos los anticuerpos monoclonales obtenidos
fallaban en lo referente a reaccionar con el
TGF-\beta2 y el BMP-2.
El procedimiento de clonación en el paso (4) se
realiza vertiendo poco a poco a razón de 0,5 células por pocillo de
acuerdo con un método de dilución limitante.
El paso (5) se realiza de acuerdo con un método
bien conocido. En comparación con el caso en que se incuba un
hibridoma clonado en un medio convencional y se obtiene un
anticuerpo a partir del sobrenadante cultivado, el anticuerpo puede
recuperarse a concentraciones de varios centenares hasta varios
miles de veces mayores por trasplante intraperitoneal del hibridoma
en ratones.
El paso (6) se realiza de acuerdo con un método
bien conocido. Puede aplicarse cromatografía de afinidad utilizando
proteína A o proteína G.
Las características del presente anticuerpo
monoclonal pueden resumirse como se muestra a continuación:
(1) Se fija a un MP52 dímero.
(2) No se fija a un MP52 monómero.
(3) La subclase de la cadena H del mismo es
\gamma.
(4) No reacciona cruzadamente con otros factores
osteogénicos pertenecientes a la superfamilia de genes
TGF-\beta, especialmente
TGF-\beta y BMP-2 que tienen
secuencias de aminoácidos similares.
La purificación de MP52 humano utilizando el
presente anticuerpo monoclonal puede llevarse a cabo de acuerdo con
un método convencional. El presente anticuerpo monoclonal se
adsorbe sobre un adsorbente tal como Sephadex (fabricado por
Pharmacia). Una solución de MP52 humano groseramente purificado se
pasa a través de dicho adsorbente para adsorber el MP52 humano. A
continuación, el MP52 humano adsorbido puede tratarse con un
eluyente adecuado de manera convencional para proporcionar MP52
humano de mayor pureza.
Los anticuerpos pueden clasificarse para
tipificación por el método ELISA de sándwich utilizando los
anticuerpos monoclonales purificados (20 especies de
aMP-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16, 18, 20, 21, y 22) y los correspondientes anticuerpos
monoclonales marcados cada uno con HRPO.
Como resultado, se identificaron los anticuerpos
monoclonales que diferían en especificidad para 10 especies de
epítopes. Los mismos se clasificaron como tipos A, B, C, D, E, F,
G, H, I, y J como se indica.
Se sabe que la línea de células osteoblásticas de
rata ROB/C26 posee un receptor para el MP52 humano. Se sabe que,
cuando se añade el MP52 humano al cultivo de esta línea de células,
la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) aumenta. Cuando se
añaden los anticuerpos monoclonales purificados al cultivo y, si los
mismos inhiben la actividad de ALP, puede determinarse que inhiben
la actividad biológica de MP52 humano.
Como resultado, se reconoció que las especies de
aMP-4, 5, 8, 11, 20 y 21 manifiestan una actividad
inhibidora fuerte. De las especies así ensayadas,
aMP-4 y aMP-5 eran anticuerpos que
reaccionaban específicamente con el D-rhMP52 y, por
tanto, se consideró que eran anticuerpos monoclonales que eran
capaces de inhibir sustancialmente la fijación MP52/receptor de
MP52 en condiciones fisiológicas.
La cuantificación de MP52 humano utilizando el
presente anticuerpo monoclonal puede realizarse por un método ELISA
bien conocido. Ejemplos específicos del mismo se describen también
como ejemplos en la presente memoria descriptiva. La cuantificación
de MP52 humano puede realizarse a una sensibilidad tan baja como
42,4 pg/ml.
La Fig. 1 es un mapa plasmídico del vector de
expresión de rhMP52 (pKOT245) obtenido por la referencia 1 (2).
La Fig. 2 es un mapa plasmídico del vector de
expresión de CHO-MP52, pMSS99 (5,0 kb). La
secuencia de bases del DNA de CHO-MP52 corresponde a
los nucleótidos desde 576 a 2297 como se muestra en SEQ ID NO:5 del
Listado de Secuencias.
La Fig. 3 es una fotografía del diagrama
analítico de la transferencia Western sobre la reactividad del
presente anticuerpo monoclonal para un rhMP52 monómero (A) y un
rhMP52 dímero(B).
La Fig. 4 es un diagrama obtenido cuando se
investigó la identificación (es decir la tipificación) de los
presentes anticuerpos monoclonales. Como ejemplos ilustrativos se
muestran dichos anticuerpos recubiertos con aMP-1
y
aMP-4.
aMP-4.
La Fig. 5 es un diagrama que muestra las curvas
de cuantificación para MP52 utilizando el presente anticuerpo
monoclonal.
La presente invención se ilustra por las
referencias y ejemplos siguientes.
Referencia
1
Una región madura de cDNA de MP52 humano se
amplificó por PCR utilizando el vector de plásmido (pSK52s) que
contenía cDNA descrito en el documento WO93/16099 como DNA
molde.
De acuerdo con el proceso para aumentar una
productividad de las proteínas diana consignado por M Nobuhara,
et al. {Agric. Biol. Chem., 52(6),
1331-1338, 1988}, una parte del DNA de la región
madura del gen MP52 se sustituyó con una secuencia de DNA diseñada
que no permite alternación alguna de la secuencia de aminoácidos
codificada en la secuencia de DNA para aumentar el contenido de AT
alrededor del codón de iniciación ATG.
La reconstrucción se introdujo por el método PCR
utilizando el iniciador de PCR aguas arriba diseñado que abarcaba la
mutación de SEQ ID NO:3 del Listado de Secuencias. Para la secuencia
de DNA de los iniciadores PCR se utilizaron el DNA de SEQ ID NO:3
como iniciador de aguas arriba, y el DNA de SEQ ID NO:4 del Listado
de Secuencias como iniciador de aguas abajo.
La PCR se realizó por adición del DNA molde (10
ng), 50 picomoles de cada uno de los iniciadores PCR en una
dirección ordenada y en una dirección inversa, dNTP (0,2 mmol) y
MgCl_{2} (1,5 mmol) en el mismo tubo de ensayo, junto con la
DNA-polimerasa Taq (5 U).
Se realizaron 30 ciclos de PCR; las condiciones
de cada ciclo eran 94ºC durante un minuto para desnaturalización,
55ºC durante un minuto para asociación de los iniciadores, y 72ºC
durante dos minutos para extensión de los iniciadores.
Los productos obtenidos por la PCR se aislaron
por electroforesis en agarosa de punto de fusión bajo al 1,5% (FMC),
y se aislaron los fragmentos de aproximadamente 360 pb (Fragmento
1).
Con objeto de aumentar el número de copias del
plásmido por bacterias, se cambió la región ori para origen
de replicación desde la del vector pBR al vector pUC. Se aisló la
región del promotor Tac del vector de expresión en E. coli
pKK223-3 disponible en el mercado (adquirido de
Pharmacia Biotech) por digestión con las endonucleasas de
restricción SspI y EcoRI, se trató con Nucleasa de
Haba Mung (Takara Shuzo, Núm. de Catálogo 2420A), se ligó al codón
de partida del Fragmento 1 por medio de DNA-Ligasa
T4 (Takara Shuzo, Catálogo 2011A). La región del terminador
rrnBT_{1}T_{2} de pKK223-3 se aisló por
digestión con las endonucleasas de restricción SalI y
SspI, y se ligó con el codón de terminación del Fragmento 1
digerido por SalI. Se ligó luego al sitio SmaI del
vector pUC18 para construir el vector de expresión {pKOT245 (No. de
Acceso BIKOKEN-KI FERM BP-5499)}
(Fig. 1) para la producción de la proteína. La longitud de pKOT245
es 3,7 kb. La secuencia de nucleótidos del vector de expresión
construido para la proteína se analizó por medio del secuenciador de
DNA ALF de Pharmacia.
La transformación se realizó de acuerdo con el
método de transformación con cloruro de rubidio por Kushner et
al. (Genetic Engineering, p. 17, Elsevier, 1978).
Resumidamente, se utilizó pKOT245 para transformar la cepa
hospedadora E. coli W3110M de acuerdo con el método descrito
arriba para producir transformantes de E. coli para la
producción de la proteína.
Los E. coli que expresaban la proteína de
la invención se precultivaron en el medio SOC modificado (triptona
Bacto 20 g/l, extracto de levadura Bacto 5 g/l, NaCl 0,5 g/l,
MgCl_{2}\cdot6H_{2}O 2,03 g/l, glucosa 3,6 g/l). Se
utilizaron 100 ml de la suspensión de bacterias para inocular 5 l
del medio de producción (triptona Bacto 5 g/l, ácido cítrico 4,3
g/l, K_{2}HPO_{4} 4,675 g/l, KH_{2}PO_{4} 1,275 g/l, NaCl
0,865 g/l, FeSO_{4}\cdot7H_{2}O 100 mg/l,
CuSO_{4}\cdot5H_{2}O 1 mg/l, MnSO_{4}\cdotnH_{2}O 0,5
mg/l, CaCl_{2}\cdot2H_{2}O 2 mg/l,
Na_{2}B_{4}O_{7}\cdot10H_{2}O 0,225 mg/l,
(NH_{4})_{6}Mo_{7}O_{24} 0,1 mg/l,
ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O 2,25 mg/l,
CoCl_{2}\cdot6H_{2}O 6 mg/l, MgSO_{4}\cdot7H_{2}O 2,2
g/l, tiamina\cdotHCl 5,0 mg/l, glucosa 3 g/l), que se cultivó en
un fermentador de 10 litros con
aireación-agitación, y luego, después de alcanzar la
etapa inicial de la fase de crecimiento logarítmico (DO_{550} =
5,0), se añadió
isopropil-\beta-D-tiogalacto-piranosido
a una concentración final de 1 mM y se continuó el cultivo hasta
alcanzar DO_{550} = 150. Durante el cultivo, se mantuvo la
temperatura a 32ºC, y el pH a 7,15 por adición de amoníaco. Con
objeto de prevenir la disminución de una concentración de oxígeno
disuelto, se aceleró la agitación para mantener la concentración de
oxígeno disuelto al 50% de la saturación de aire. Se continuó el
cultivo añadiendo solución de glucosa al 50% hasta un nivel de 0,2%
para obtener una alta densidad de células, con una indicación de
aumento brusco de la concentración de oxígeno disuelto.
El caldo de cultivo obtenido por el método
descrito arriba se centrifugó para recoger las células, las cuales
se suspendieron luego en tampón Tris-HCl 25 mM que
contenía ácido
etileno-diamina-tetraacético 10 mM
(pH 7,3). Se disgregaron las células por paso a través de un
homogeneizador (fabricado por APV Gaulin Inc.) y se centrifugaron
de nuevo para recoger el precipitado que contenía los cuerpos de
inclusión.
Después de lavar tres veces con Triton
X-100 al 1%, los cuerpos de inclusión de E.
coli se centrifugaron a 3.000 x g durante 30 minutos a 4ºC, y se
solubilizó luego el precipitado resultante por tratamiento mediante
ultrasonidos con tampón Tris-HCl 20 mM, pH 8,3,
urea 8 M, DTT 10 mM, y EDTA 1 mM.
La solución solubilizada se centrifugó a 20.000 x
g durante 30 minutos a 4ºC y se recogió el sobrenadante resultante.
El sobrenadante obtenido se sometió a SP-Sepharose
FF (Pharmacia AB) equilibrada con tampón Tris-HCl 20
mM de pH 8,3, urea 6 M, y EDTA 1 mM, y a continuación, después de
lavado con la misma solución, se eluyó con la misma solución que
contenía NaCl 0,5 M. Se añadieron al producto eluido
Na_{2}SO_{3} y Na_{2}S_{4}O_{6} hasta alcanzar la
concentración final respectivamente de 111 mM y 13 mM, después de lo
cual se sulfonó a 4ºC durante 15 horas. La solución sulfonada se
filtró a través de gel sobre Sephacryl S-200
(Pharmacia AB) equilibrado con tampón Tris-HCl 20
mM, pH 8,3, urea 6 M, NaCl 0,2 M, y EDTA 1 mM para obtener los
monómeros sulfonados purificados de la proteína de la
invención.
La solución de los monómeros sulfonados se añadió
a un volumen 9 veces mayor de tampón de Na-glicina
50 mM de pH 9,8, NaCl 1 M, CHAPS 30 mM, EDTA 5 mM, GSH 2 mM
(glutatión de tipo reducción), y GSSG 1 mM (glutatión de tipo
oxidación) con agitación, y se incubó luego durante 3 días a 4ºC
para oxidar y replegar la proteína de la invención.
El MP52 replegado se cargó en una columna
RESOURCE RPC (Pharmacia AB) de una HPLC en fase inversa
preequilibrada con acetonitrilo al 25% que contenía 0,05% de TFA, y
se eluyó luego con un gradiente lineal de acetonitrilo al
25-45% que contenía 0,05% de TFA. El producto
eluido se monitorizó a 280 nm de absorbancia. Las fracciones de
proteína homodímeras se recogieron y liofilizaron. La muestra se
filtró a través de gel por medio de Sephacryl S-200
equilibrado con tampón Tris-fosfato 20 mM de pH 8,0
que contenía urea 0,8 M y NaCl 1 M, a continuación de lo cual la
fracción de proteína homodímera se recogió utilizando HPLC en fase
inversa del mismo modo que se ha descrito arriba.
El análisis de la secuencia de aminoácidos
N-terminal para las proteínas purificadas se realizó
utilizando un secuenciador de aminoácidos Modelo 476A (Applied
Biosystems Inc.) para confirmar la secuencia de aminoácidos desde el
terminal N hasta la secuencia del aminoácido 30-avo
como se muestra en SEQ ID NO:1 del Listado de Secuencias.
El análisis de la composición de aminoácidos de
las proteínas purificadas obtenidas anteriormente se realizó por
medio de un secuenciador de aminoácidos (PICO TAG Systems, Waters).
El resultado se representó en la Tabla 1. El número descrito en la
Tabla 1 indica el número de residuos de aminoácidos para una
proteína monómera.
Se confirmó que el peso molecular de las
proteínas purificadas obtenidas anteriormente era aproximadamente 28
KDa en la electroforesis sobre SDS-PAGE en
condiciones no reductoras.
A partir de los resultados que se muestran en los
apartados a), b) y c) anteriores, se encuentra que la proteína de
la invención comprende 119 restos de amino-ácidos partiendo del Pro
N-terminal simplemente.
Referencia
2
El vector pSK52s que contenía el gen de MP52
humano, que fue suministrado por el Dr. Hötten de Biopharm GmbH, se
digirió con HindIII y el fragmento de DNA que contenía el
gen de MP52 humano se aisló por la extracción a partir de geles de
agarosa de punto de fusión bajo al 0,8% y se ligó en el sitio
HindIII del vector pABstop, que ha sido suministrado por el
Dr. Gerd Zettlmeissl de Behringwerke AG. La estructura del vector
de expresión de CHO-MP52, pMSS99 (5,0 kb) como se
representa en Fig. 2, fue confirmada por la secuenciación del DNA y
el mapeado con enzimas de restricción. La secuencia de DNA de
CHO-MP52 en pMSS99 correspondía a los nucleótidos
desde el 576-avo al 2279-avo
mostrados en SEQ ID NO:5 del Listado de Secuencias.
Células
CHO-DUKX-B11, mutantes de las
células CHO, que fueron proporcionadas por el Dr. Zettlmeissl de
Behringwerke AG, se co-transfectaron con pMSS99 y
pSVOAdhfr que fue proporcionado también por el Dr. Zettlmeissl, por
el método de transferencia de DNA mediado por fosfato de calcio. A
continuación, se establecieron los clones altamente productores de
CHO-MP52 por protocolo de amplificación de genes
utilizando metotrexato (MTX).
Diez \mug de pMSS99 y 2 \mug de pSV0Adhfr se
disolvieron en 1 ml de HEPES 25 mM-NaCl 140
mM-Na_{2}HPO_{4} 0,75 mM (pH 7,05), y se
mezclaron luego con 50 \mul de CaCl_{2} 2,5M. Los precipitados
resultantes se extendieron sobre células
CHO-DUKX-B11 en una cápsula de 10 cm
y se mantuvieron a la temperatura ambiente durante 30 minutos. A
continuación, se añadieron 8 ml de MEM ALPHA con ribo- y
desoxirribonucleósidos (MEM\alpha^{+}) que contenían 10% de
suero bovino fetal (FBS) a la capa de células para incubación en
una incubadora con CO_{2} durante 4-6 h. Después
del tratamiento con glicerol al 10% en MEM\alpha^{+} que
contenía 10% de FBS a la temperatura ambiente durante 3 min, las
células se cultivaron en MEM\alpha^{+} que contenía 10% de FBS
durante 2 días. A continuación, las células se pusieron de nuevo en
MEM ALPHA sin ribo- y desoxirribo-nucleósidos
(MEM\alpha^{-}) que contenían 10% de FBS dializado para
seleccionar los transformantes. Los clones transformantes se
aislaron y se ensayaron en cuanto a la expresión de
CHO-MP52 por análisis mediante transferencia
Western como se describe en la sección siguiente.
Los clones productores de
CHO-MP52 se seleccionaron ulteriormente de modo
escalonado en concentraciones crecientes que metotrexato (MTX) para
amplificar el gen MP52 de acuerdo con el gen pSVOAdhfr. Se
obtuvieron varios clones que producían 1-3 \mug
de CHO-MP52/10^{6} células/24 h para MTX 400
nM.
Se examinaron los clones en cuanto a la expresión
de CHO-MP52 por análisis de transferencia Western
como sigue. Los sobrenadantes de cultivo (1-15
\mul) se aplicaron sobre SDS-PAGE (gel de
poliacrilamida en gradiente al 15-25%, Daiichi Pure
Chemicals) en condiciones reductoras, y se transfirieron luego las
proteínas a una membrana de PVDF (Clear Blot
Membrane-P, ATTO). La membrana se bloqueó con Block
Ace (Dai-Nihon Seiyaku) durante 1 hora, se enjuagó
con solución salina tamponada con Tris (TBS), y se trató luego con
10 \mug/ml de anticuerpos de pollo para CHO-MP52
en Block Ace diluido 10 veces, durante una noche. Después de lavado
de la membrana con Tween 20 al 0,1% en TBS (TTBS), la membrana se
trató con conjugado de conejo anti-IgG de
pollo-ALP (Sigma A 9171) en Block Ace diluido 10
veces durante 1 h. La membrana se lavó con TTBS, y a continuación se
hizo reaccionar con un estuche de Sustrato Conjugado de Fosfatasa
alcalina (BIO-RAD) para visualizar las bandas
correspondientes aMP52.
La línea de células CHO que exhibía la máxima
productividad de CHO-MP52, MC-2
(Depósito No. FERM BP-5142), se cultivó con frascos
rodantes que contenían MEM\alpha^{-} complementado con 10% de
FBS, MTX 400 nM, 100 U/ml de penicilina, y 100 \mug/ml de
estreptomicina. Después que las células MC-2
llegaron a la confluencia, se lavaron con MEM\alpha^{-} exento
de suero y se cultivaron luego en DEM/F12 exento de suero
complementado con HEPES 10 mM (pH 7,3), 10 KIU de Aprotinina,
butirato de sodio 1 mM, 6 \mug/ml de selenato de sodio, 5
\mug/ml de transferrina, 18 \mug/ml de etanolamina, 9 \mug/ml
de insulina, 100 U/ml de penicilina, y 100 \mug/ml de
estreptomicina. El medio acondicionado se recogió cada día durante
una semana.
El sobrenadante de cultivo de CHO y 0,1 vol de
tampón de fosfato de sodio 0,2M, pH 6,0, se mezclaron y se aplicaron
a una columna POROS HS (10 ml), PerSeptive Biosystems) equilibrada
previamente con NaCl 50 mM, tampón de fosfato de sodio 20 mM, pH
6,0. Se eluyeron las proteínas con un gradiente lineal de NaCl desde
0,05 a 2M y se recogieron con 20 fracciones de 10 ml. Los MP52s
eluidos se observaron como tres tipos de monómeros y se determinó
que sus pesos moleculares aparentes eran aproximadamente 52, 40 y
14 kD por análisis SDS-PAGE en condiciones
reductoras. Estos monómeros forman tres tipos de homodímeros (104
kD, 80 kD y 28 kD) y tres tipos de heterodímeros (92 kD: 40
kD-52 kD, 66 kD: 14 kD-52 kD, y 54
kD: 14 Kd-40 kD) y la totalidad de dichos dímeros se
designaron CHO-MP52 excepto el homodímero de 28 kD
que parecía reconocerse como un homodímero maduro de MP52 humano
(documento WO 95/04819). Por esta razón, el homodímero de 104 kD y
el homodímero de 80 kD se aislaron de las fracciones anteriores
para examinar las secuencias de aminoácidos
N-terminales y las actividades biológicas.
Las fracciones de la quinta a la novena se
agruparon y se concentraron aproximadamente 10 veces. El concentrado
se cargó en Superdex 200 pg , 6 D.I. x 60 cm, Pharmacia) equilibrada
previamente con tampón de fosfato de sodio 20 mM, pH 7,1, que
contenía NaCl 1M. La elución se realizó al caudal de 0,5 ml/min.
Las fracciones que contenían el homodímero de 104 kD y las
fracciones que contenían el homodímero de 80 kD se agruparon por
separado. Se aplicó cada una a una columna HPLC de fase inversa
RESOURCE RPC, 3 ml, Pharmacia) y se eluyeron éstas en acetonitrilo
al 35-40%. Las concentraciones del
CHO-MP52 aislado se determinaron por densitometría
de las bandas de proteínas sobre gel SDS-PAGE.
El análisis de la secuencia de aminoácidos
N-terminal se realizó utilizando un secuenciador de
impulsos en fase líquido-gas (Applied Biosystems
modelo 476) para el homodímero de 80 kD y el homodímero de 104 kD,
respectivamente. Los resultados se muestran en la Tabla 2.
Las secuencias de aminoácidos de 80 kD eran desde
Lys 121 o Ala 122 hasta Arg 474 y la de 104 kD era desde Ala 1 a Arg
474 en SEQ ID NO:5 del Listado de Secuencias. Se encontró
nuevamente que las células CHO producían tres tipos de homodímeros,
104 Kd, 80 kd y 28 kD, y tres tipos de heterodímeros a saber,
dímeros de 92 kD, 66 kD y 54 kD.
Un tipo de dímero (al que se hace referencia en
lo sucesivo abreviadamente como "D-rhMP52",
como se describe específicamente en la Referencia 1) fue expresado
por E. coli (Depósito No. FERM BP-5499) con
un plásmido (pKOT245) que incluía un cDNA codificante de la
secuencia de aminoácidos de MP52 humano y que se constituyó por
oxidación de un rhMP52 de tipo monómero obtenido por solubilización
del cuerpo de inclusión del mismo por el método estándar. El
D-rhMP52 se pasó a través de procesos de refino
tales como la precipitación isoeléctrica y la permeación con gel
para obtener el rhMP52 a la concentración final de aproximadamente
0,5 mg/ml. Este rhMP52 purificado se utilizó como antígeno. Por
otra parte, un tipo de dímero (al que se hace referencia en lo
sucesivo abreviadamente como "CHO-MP52", como
se describe específicamente en la Referencia 2) fue expresado por
una célula CHO (Depósito No. FERM BP-5142) y se
utilizó a la concentración arriba mencionada como antígeno. La
producción de un ratón inmunizado se efectuó por inyección
intraperitoneal en un ratón BALB/c de 70, 20, 10, y 52 \mug de la
emulsión preparada por disolución del CHO-MP52 (que
contenía no menos de 80% de un precursor incompletamente procesado)
en una solución acuosa 10 mM de ácido clorhídrico y mezcla de la
solución resultante con un adyuvante completo de Freund (CFA) en
una relación de 1:1 respectivamente los días cero, 7º, 16º, y 112º y
18 \mug de la emulsión del MP52 (que contenía una ligera cantidad
de monómero) preparada análogamente el día 29º y, después de un
intervalo de aproximadamente 1 mes, 50 \mug de la emulsión
preparada por mezcla de una solución que contenía el
D-rhMP52 con un adyuvante incompleto de Freund (IFA)
a una tasa de 1:1. Al ratón sensibilizado así continuamente seis
veces, se administraron 60 \mug del D-rhMP52 por
vía subcutánea sin utilizar un adyuvante el día 42º después de la
inyección final y, después de un intervalo de 42 días (tres días
antes de la fusión celular), se administraron por vía intravenosa
50 \mug del D-rhMP52 a través de la vena del
rabo.
Después de 3 días subsiguientes a la inmunización
final, se extirpó el bazo del ratón sensibilizado y se prepararon
las células del bazo. Las células del bazo así obtenidas se
mezclaron con una cepa de células de mieloma murino (SP2/0) a una
relación de 10:1, se centrífugo la mezcla resultante a 1500 rpm, y
los sedimentos de células se ablandaron lentamente mientras se
mantenían calientes en polietilenglicol al 40% (PEG1500) a 37ºC.
Los sedimentos de células ablandados se agitaron suavemente con la
punta de una pipeta mientras se vertía lentamente sobre ellos 1 ml
de un medio de cultivo RPMI 1640 que no contenía FCS (producido por
Niisui Seiyaku K.K.). A continuación, se aumentó gradualmente la
velocidad de centrifugación desde 250 rpm a 1000 rpm durante un
periodo de aproximadamente 6 minutos. Los sedimentos obtenidos al
final de la centrifugación acelerada se lavaron una sola vez con un
medio de cultivo exento de FCS. Finalmente, los sedimentos se
distribuyeron entre los pocillos de una placa de 96 pocillos con
ayuda de una solución preparada por adición de HAT [hipoxantina H,
aminopterina (A), y timidina (T)] a un medio de cultivo RPMI 1640
que contenía 20% de FCS de tal modo que se pusieron 10.000 células
de bazo en cada pocillo.
El producto de aproximadamente 6.000 células
fusionadas se ensayó respecto a la capacidad para producir un
anticuerpo monoclonal para MP52 humano por el procedimiento
siguiente.
1) El D-rhMP52 utilizado para la
inmunización y un rhMP52 de tipo monómero obtenido por reducción del
D-rhMP52 y sometimiento del producto de reducción a
sulfonación del grupo SH del mismo (a lo que se hace referencia en
lo sucesivo abreviadamente como "M-rhMP52")
para inhibir el enlace -SS- se depositaron en placas (NUNC,
MAXISORP), cada uno de ellos a una concentración de 1 \mug/ml) en
una cantidad fijada de 50 \mul y se incubaron a la temperatura
ambiente durante 1 hora para recubrir las placas.
2) Las placas recubiertas se lavaron con PBS
(líquido de lavado) que contenía Tween 20 y a continuación el
sobrenadante de cultivo no diluido se añadió a ellas en una
cantidad fijada de 50 \mul por pocillo de placa y se incubaron a
la temperatura ambiente durante 1 hora.
3) El contenido de los pocillos se lavó tres
veces con el líquido de lavado y se añadieron luego a los pocillos
anticuerpos de inmunoglobulina de conejo marcados con HRPO para las
inmunoglobulinas de ratón (DAKO, F206) a una concentración de
aproximadamente 1 \mug/ml en una cantidad fijada de 45 \mul por
pocillo. El diluyente utilizado en este caso se preparó por
disolución de caseína (producida por Kanto Kagaku K.K.) a una
concentración de 2 mg/ml en una solución tampón de
Tris-hidroximetil-aminometano 0,1M
(TBS, pH 7,4).
4) Se incubaron los pocillos a la temperatura
ambiente durante 1 hora y se lavaron 3 veces con el líquido de
lavado, y se añadió a los pocillos lavados un líquido colorante
(Chromogen-TMB, producido por Behringwerke) en una
cantidad fijada de 50 \mul por pocillo.
5) La reacción de coloración subsiguiente se dejó
transcurrir a la temperatura ambiente durante aproximadamente 5
minutos y se paró luego por adición de 50 \mul de ácido sulfúrico
0,5N.
6) El grado de coloración se midió a una
absorbancia de DO_{450} nm dentro de 30 minutos después de la
parada de la reacción.
En un total de 23 anticuerpos monoclonales
designados secuencialmente aMP-1 hasta
aMP-23, se obtuvieron los 20 anticuerpos
monoclonales con exclusión de aMP-17,
aMP-19, y aMP-23 que no toleraban el
proceso de clonación subsiguiente. Los resultados se muestran en la
Tabla 3. En la discriminación entre el ensayo positivo y el
negativo, se utilizó el valor medio \pm10 DE (DO_{450} nm =
0,05) como el valor de corte. Los anticuerpos monoclonales,
aMP-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 12, 14, 15, 18, y 22
reaccionaban sólo con D-rhMP52 y los anticuerpos
monoclonales aMP-8, 10, 11, 13, 16, 20 y 21
reaccionaban con D-rhMP52 y con
M-rhMP52. Desde el punto de vista de la
especificidad, los 20 anticuerpos monoclonales se clasificaron en
al menos dos clases de anticuerpos.
1) El rhMP52 (1 \mug/pista/0,5 mm) se sometió a
SDS-PAGE utilizando un gel en gradiente
15-25% (producido por Daiichi Kagakusha K.K.) en
condiciones no reductoras (para hacer que el antígeno migrara como
D-rhMP52) y en condiciones reductoras (para hacer
que el antígeno migrara como M-rhMP52) y se
transfirió luego (30 V, 2 h), a una membrana de nitrocelulosa por
el método estándar.
2) La membrana de nitrocelulosa que se había
utilizado como base para la transferencia se mantuvo sumergida en
una solución de TBS que contenía caseína a una concentración de
aproximadamente 3 mg/ml durante no menos de 20 minutos para
bloquear una reacción inespecífica.
3) La membrana de nitrocelulosa que soportaba el
rhMP52 transferido sobre ella se incubó en el sobrenadante de
cultivo que contenía un anticuerpo monoclonal (en el intervalo de 4
\mug/ml-40 \mug/ml) por agitación mediante
sacudidas en el sobrenadante de cultivo en su forma no modificada a
la temperatura ambiente durante 1 hora.
4) El anticuerpo incubado se lavó con una gran
cantidad de solución tampón de fosfato (PBS, pH 7,2) (repitiendo
tres veces los 5 minutos de inmersión en la solución, y
reemplazando la solución con un suministro nuevo al final de cada
inmersión).
5) Los anticuerpos de inmunoglobulina de conejo
marcados con HRPO para las inmunoglobulinas de ratón se pusieron
como anticuerpo secundario a una concentración de 1 \mug/ml en
una solución diluida de caseína-TBS y se incubaron
en ella a la temperatura ambiente durante 1 hora.
6) El anticuerpo incubado se lavó a fondo del
mismo modo que anteriormente en 4).
7) El anticuerpo lavado se mantuvo sumergido en
un agente colorante (TrueBlue/sustrato de peroxidasa, producido por
Kirkegaard Perry Laboratories) para someterlo a una reacción de
coloración. A continuación, se lavó el mismo concienzudamente con
agua corriente. Los resultados estaban de acuerdo con los del
escrutinio primario por el método ELISA. Los resultados se muestran
en la Fig. 3.
Las subclases de un anticuerpo monoclonal
producido por el clon se decidieron por el uso de un estuche de
isotipificación de anticuerpos monoclonales de ratón, RPN29
producido por Amersham Corp. de acuerdo con el manual de
manipulación del mismo. Las subclases del anticuerpo monoclonal se
muestran en la Tabla 4. Se encontró que todos los anticuerpos
monoclonales tenían una subclase de cadena L de \kappa y subclase
de cadena H de \gamma1 o
\gamma2a.
\gamma2a.
El MP52 humano es una molécula que pertenece a la
superfamilia de genes TGF-\beta y se ha encontrado
que se asemeja en términos de estructura y secuencia de aminoácidos
a la otra superfamilia de genes TGF-\beta,
particularmente TGF-\beta2 y
BMP-2. Para estudiar el anticuerpo monoclonal de
esta invención y determinar si el mismo manifestaría o no
especificidad para el MP52 humano, se obtuvieron el
TGF-\beta2 humano recombinante (rhTGF\beta2) y
el BMP-2 humano recombinante
(rhBMP-2) y se sometieron a ELISA del mismo modo
que en el Ejemplo 3 anterior para determinar su especificidad. Los
resultados se muestran en la Tabla 5.
Todos los anticuerpos monoclonales fallaban en lo
referente a reaccionar con el TGF-\beta2 y
BMP-2. Así pues, se confirmó que los mismos son
anticuerpos específicos para MP52.
La purificación de los anticuerpos monoclonales
procedentes del sobrenadante de cultivo y los fluidos de ascitis de
ratón se realizó por el uso de la columna de proteína A o proteína
G (producida por Pharmacia) de acuerdo con su manual de
manipulación. La columna de proteína A se utilizó para purificar el
anticuerpo procedente del sobrenadante de cultivo y la columna de
proteína G para purificar el anticuerpo procedente de los fluidos
de ascitis.
1) Los anticuerpos monoclonales purificados (20
especies de aMP1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,
16, 18, 20, 21 y 22) se distribuyeron cada uno entre los pocillos
de una placa de 96 pocillos a una concentración de 1 \mug/ml para
recubrir cada uno de los pocillos en una cantidad fijada de 50
\mul (1 hora a la temperatura ambiente).
2) Después que los pocillos recubiertos se
lavaron tres veces con un líquido de lavado
(BEP-II, producido por Behringwerke), se distribuyó
una solución obtenida por dilución del D-rhMP52 a
una concentración prescrita de 30 ng/ml con caseína/TBS en una
cantidad fijada de 50 \mul entre los pocillos y se incubó a la
temperatura ambiente durante 1 hora.
3) Después de lavar 3 veces con líquido de
lavado, los anticuerpos monoclonales indicados en 1) arriba,
biotinilados previamente por el uso de un sistema de marcación de
anticuerpos (producido por American Qualex Corp. y comercializado
bajo la designación de "Biotinylation Kit") se diluyeron cada
uno hasta una concentración de 1 \mug/ml con caseína/TBS, y se
añadió cada uno de los anticuerpos monoclonales biotinilados a los
pocillos de todas las clases de anticuerpo monoclonal aplicadas
anteriormente en 1). Por ejemplo, todas las especies biotiniladas
de aMP-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,
14, 15, 16, 18, 20, 21 y 22 se hicieron reaccionar cada una con las
placas recubiertas con la especie de aMP-1 y todos
los anticuerpos monoclonales biotinilados se hicieron reaccionar
cada uno con las placas recubiertas con las especies de
aMP-2 - 22 del mismo modo que anteriormente
(temperatura ambiente durante 1 hora).
4) Después de lavar 3 veces con líquido de
lavado, se añadió una AVIDINA-PEROXIDASA marcada
con HRPO (producida por Sigma) a una concentración de 1 \mug/ml a
caseína/TBS y se incubó a la temperatura ambiente durante 1
hora.
5) Después de lavar del mismo modo que
anteriormente, se sometieron las placas a una reacción de
coloración del mismo modo que en 3 y 4).
6) Después de incubación durante 15 minutos, se
paró la reacción y se midió el grado de reacción de color del mismo
modo que en 3), 5) y 6).
Parte de los resultados se muestran en la Fig. 4.
Uno y el mismo anticuerpo monoclonal debería producir resultados
iguales en todas las combinaciones. Sin embargo, se encontró que
las especies de aMP-1 y aMP-4
representadas a modo de ejemplo en la Fig. 4, eran anticuerpos
totalmente diferentes. Basándose en estos resultados, se
determinaron la semejanza y desemejanza de todos los anticuerpos
monoclonales. Como resultado, se identificaron los anticuerpos
monoclonales que diferían en especificidad para 10 especies de
epítopes. Se clasificaron los mismos como A, B, C, D, E, F, G, H,
I, y J como se indica en la Tabla 6.
Se sabe que la línea de células osteoblásticas de
rata ROB/C26 posee un receptor para el MP52 humano. Es sabido que
cuando se añade el MP52 humano al cultivo de esta línea de células,
la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) aumenta. Cuando se
añadió el rhMP52 en una cantidad prescrita, y se añadieron todos
los anticuerpos monoclonales purificados a la concentración final de
20 \mug/ml, se estudió si los mismos inhibirían o no la actividad
de ALP. Cuando se añadió el rhMP52 a una concentración de 10 ng/ml
a la ROB/C26 y se incubó luego durante varios díías, se condujo un
estímulo a través del receptor MP52 en la superficie de las células
y, como resultado, se incrementó la actividad de ALP. La actividad
de ALP podría cuantificarse por una reacción de coloración causada
con un sustrato específico para ALP del mismo modo que en el ELISA
(con tal que la longitud de onda para la determinación fuese
DO_{405} nm). Los resultados se muestran en la Tabla 7. El rhMP52
solo en ausencia del anticuerpo mostró una actividad de ALP de
0,158 DO_{405} nm. Esta actividad de ALP cambiaba por la adición
de un anticuerpo monoclonal. La fuerza de la actividad inhibidora
del anticuerpo monoclonal se evaluó proporcionalmente a la
insignificancia de este cambio de la actividad de ALP. Como
resultado, se encontró que las especies de aMP-4,
5, 8, 11, 20 y 21 manifestaban una actividad inhibidora fuerte. De
las especies así ensayadas, aMP-4 y
aMP-5 eran anticuerpos que reaccionaban
específicamente con el D-rhMP52 (Tabla 1) y, por
esta razón, se consideró que eran anticuerpos monoclonales que, al
contrario que las especies de aMP-8, 11, 20 y 21 que
reaccionaban adicionalmente con el M-rhMP52, eran
capaces de inhibir sustancialmente la fijación MP52/receptor de MP52
en condiciones fisiológicas. Los hibridomas que producen los
anticuerpos monoclonales aMP-4 y
aMP-5 han sido depositados en el Life Science
Industrial Technology Research Institute de la Agencia de
Tecnología Industrial (1-3, Higashi
1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki,
Japón), respectivamente, bajo los Núms. de Depósito FERM
BP-5939 (FERM P 15555) y FERM
BP-5940 (FERM P 155556).
Los anticuerpos monoclonales se clasificaron en
10 tipos como se describe en el Ejemplo 8. De entre ellos, se
construyó un ELISA de sándwich utilizando aMP-4 de
tipo C y aMP-5 de tipo D. A saber:
1) Se recubre una placa de 96 pocillos con 50
\mul de aMP-5 purificado cada vez a la
concentración de 5 \mug/ml (1 h, a la temperatura ambiente).
2) Después de lavar con un líquido de lavado, se
añaden a cada pocillo 50 \mul de MP52 purificado a la
concentración de 1 ng/ml como máximo, que se diluye con tampón
caseína/Tris ordenadamente. La placa se incuba durante 1 h a la
temperatura ambiente.
3) Después de lavar con un líquido de lavado, se
añaden a cada pocillo 50 \mul de anticuerpo aMP-4
purificado y biotinilado a la concentración de 1 \mug/ml, dejando
en reposo durante 1 h a la temperatura ambiente.
4) Después de lavar con un líquido de lavado, se
añade AVIDINA-PEROXIDASA (SIGMA
A-3151) a la concentración de 1 \mug/ml,
manteniendo en reposo durante 1 h a la temperatura ambiente.
5) Después de lavar con un líquido de lavado, se
deja transcurrir la reacción de coloración subsiguiente del mismo
modo que se ha indicado en 3) y 4).
6) Después de 30 minutos, se para la reacción de
coloración subsiguiente por adición de 50 \mul de ácido sulfúrico
0,5N.
7) Se midió el grado de coloración a una
absorbancia de DO_{450} nm después de la parada de la
reacción.
Los resultados se muestran en Fig. 5. El límite
de detección era aproximadamente 23,9 pg/ml y el límite de
cuantificación era 42,4 pg/ml.
En esta memoria descriptiva, el límite de
detección significa una concentración de MP52 que es
significativamente mayor que la de la solución sin MP52 como
concentración de ruido, y el límite de cuantificación significa la
concentración más baja de MP52 que se detecta con fiabilidad.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Resultado del título de
anticuerpos anti-MP52 detectado por
ELISA
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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
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Subclases de anticuerpo
monoclonal
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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
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Especificidad de anticuerpo
monoclonal
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\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
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Clasificación de los anticuerpos
monoclonales
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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr}
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Ensayo de inhibición de la
actividad de ALP por los anticuerpos
monoclonales
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El anticuerpo monoclonal de ratón
anti-MP52 humano de la presente invención es útil
para empleo, por ejemplo, en la purificación o el ensayo de MP52
humano producido por técnicas de ingeniería genética.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Hoechst Marion Roussel
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Anticuerpo monoclonal
anti-MP52 humano
\vskip1.000000\baselineskip
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<130> 24848PWO_DR
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<140> EP 97 91
8417.3-2116
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<141>
13-05-1997
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<150> JP 8-141137
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<151>
13-05-1996
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<160> 6
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 357
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(357)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residuos de aminoácidos pertinentes
en SEQ ID No. 1 desde 1 a 119 en el WO 95/04819
\vskip1.000000\baselineskip
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<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Hötten, Gertrud
\hskip1cmNeidhardt, Helge
\hskip1cmPaulista, Michael
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<302> Nuevo factor de
crecimiento/diferenciación de la familia
TGF-beta
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<310> WO 95/04819
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<312>
1995-02-16
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<313> 1 a 357
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 2
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 3
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<211> 27
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:
\hskip1cmOligonucleótido
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> diversos_característica
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<222> (1)..(27)
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<223> Iniciador de PCR aguas arriba de MP52
tipo maduro
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipataatgccac tagcaactcg tcagggc
\hfill27
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido
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<220>
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<221> diversos_característica
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<222> (1): (26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Iniciador de PCR aguas abajo de MP52
tipo maduro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtcgactac ctgcagccac acgact
\hfill26
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2703
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (640)..(2142)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína morfogénica ósea MP52
\newpage
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<220>
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<221> mat_péptido
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<222> (72)..(2142)
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<223> parte madura más propéptido
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido_señal
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<222> (640)..(720)
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<220>
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<221> diversos_característica
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<222> (1783)..(2142)
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<223> MP52 maduro
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<300>
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<301> Hötten, Gertrud
\hskip1cmNeidhardt, Helge
\hskip1cmPaulista, Michael
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<302> Nuevo factor de
crecimiento/diferenciación de la familia
TGF-\beta
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<310> WO 95/04819
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<312>
16-02-1995
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 501
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (14)
1. Un anticuerpo monoclonal de ratón
anti-MP52 humano que se fija a un MP52 humano
dímero pero no a un MP52 humano monómero.
2. Un anticuerpo monoclonal de ratón de acuerdo
con la reivindicación 1, con las características adicionales
mencionadas a continuación:
- (1)
- la subclase de la cadena H del mismo es \gamma;
- (2)
- no reacciona cruzadamente con otros factores osteogénicos pertenecientes a la superfamilia TGF-\beta, especialmente TGF-\beta y BMP-2 que tienen secuencias de aminoácidos similares.
3. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, en el cual dicho anticuerpo monoclonal se
fija al sitio activo de MP52 humano.
4. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el cual dicho
anticuerpo monoclonal es aMP-4, FERM
P-15555.
5. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el cual dicho
anticuerpo monoclonal es aMP-5, FERM
P-15556.
6. Un hibridoma capaz de producir el anticuerpo
monoclonal de ratón anti-MP52 humano de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
7. El hibridoma de acuerdo con la reivindicación
6, que es capaz de producir el anticuerpo monoclonal de ratón
aMP-4, FERM P-15555 o
aMP-5, FERM P-15556.
8. Un método para la purificación de un MP52
humano dímero que comprende utilizar el anticuerpo monoclonal de
ratón anti-MP52 humano de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
9. El método para la purificación de un MP52
humano dímero de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende
utilizar el anticuerpo monoclonal de ratón
anti-MP52 humano aMP-4, FERM
P-15555 o aMP-5, FERM
P-15556.
10. Un método in vitro para la detección
de MP52 humano dímero que comprende utilizar el anticuerpo
monoclonal de ratón anti-MP52 humano de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
11. El método para la detección de un MP52 humano
dímero de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende utilizar
el anticuerpo monoclonal de ratón anti-humano
aMP-4, FERM P-15555 o
aMP-5, FERM P-15556.
12. Un método in vitro para inhibir la
actividad de MP52 humano dímero utilizando un anticuerpo monoclonal
de ratón anti-MP52 humano de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
13. Uso de un anticuerpo monoclonal de ratón de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la
preparación de una composición farmacéutica para inhibir la
actividad de MP52 humano dímero implicada en la osteogénesis.
14. El método o la utilización de acuerdo con la
reivindicación 12 ó 13, que comprende utilizar el anticuerpo
monoclonal de ratón anti-MP52 humano
aMP-4, FERM P-15555 o
aMP-5, FERM P-15556.
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