JPH11123095A - ポリメラーゼ連鎖反応を利用する核酸の定量用のプラスミド及びキット - Google Patents
ポリメラーゼ連鎖反応を利用する核酸の定量用のプラスミド及びキットInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明はポリメラーゼが連鎖反応によるサン
プル中の標的核酸セグメントの量の決定のための方法を
提供を課題とする。 【解決手段】 本発明の方法は標的核酸及び内部標準核
酸セグメントの同時増幅を包含する。各セグメント由来
の増幅ＤＮＡの量を決定し、そして標準曲線と比較し、
増幅前のサンプル中に存在する標的核酸セグメントの量
を決定する。この方法は生物サンプル中の特異的なｍＲ
ＮＡの量を決定するのに特に好適である。更に、多重ｍ
ＲＮＡの定量のための内部標準品を提供する。
プル中の標的核酸セグメントの量の決定のための方法を
提供を課題とする。 【解決手段】 本発明の方法は標的核酸及び内部標準核
酸セグメントの同時増幅を包含する。各セグメント由来
の増幅ＤＮＡの量を決定し、そして標準曲線と比較し、
増幅前のサンプル中に存在する標的核酸セグメントの量
を決定する。この方法は生物サンプル中の特異的なｍＲ
ＮＡの量を決定するのに特に好適である。更に、多重ｍ
ＲＮＡの定量のための内部標準品を提供する。
Description
【０００１】本発明は試料中の特定の核酸セグメントの
定量分析に関する。本発明は生物試料中の特定のｍＲＮ
Ａ分子の量の測定に特に有用である。従ってこの方法は
医療診断の分野に特に有用であるが、しかし遺伝学、分
子生物学及び生化学の分野にも適用できる。
定量分析に関する。本発明は生物試料中の特定のｍＲＮ
Ａ分子の量の測定に特に有用である。従ってこの方法は
医療診断の分野に特に有用であるが、しかし遺伝学、分
子生物学及び生化学の分野にも適用できる。
【０００２】米国特許第４，６８３，１９５号及び第
４，６８３，２０２号は核酸増幅方法であるポリメラー
ゼ連鎖応（ＰＣＲ）、及び特定のヌクレオチド配列の検
出におけるＰＣＲの利用を開始する。ヨーロッパ特許庁
公開（ＥＰＯ）第２５８，０１７号はＰＣＲに利用する
ため好ましいＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ
を開示している。これらの公開物は本発明に参考文献と
して組入れている。
４，６８３，２０２号は核酸増幅方法であるポリメラー
ゼ連鎖応（ＰＣＲ）、及び特定のヌクレオチド配列の検
出におけるＰＣＲの利用を開始する。ヨーロッパ特許庁
公開（ＥＰＯ）第２５８，０１７号はＰＣＲに利用する
ため好ましいＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ
を開示している。これらの公開物は本発明に参考文献と
して組入れている。
【０００３】ＰＣＲは遺伝病診断（Wuら、1989, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86 : 2757-2760 及びMyerswitz,
1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 3955-3959、
を参照のこと）、並びに疾病感受性及び癌診断（例えば
Hornら、1988, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 85 : 6012-
6016 ; Toddら、1987, Nature 329 : 599-604 ; Kawasa
ki, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 5698-570
2 ; 及びNeriら、1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85 : 9268-9272 を参照のこと）において広い有用性を
有す。しかしながら、これらの利用は単に定性的な結
果、例えば正常細胞をバックグランドとして、異常細胞
由来の独特のｍＲＮＡ転写物の測定を提供している。
Natl. Acad. Sci. USA 86 : 2757-2760 及びMyerswitz,
1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 3955-3959、
を参照のこと）、並びに疾病感受性及び癌診断（例えば
Hornら、1988, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 85 : 6012-
6016 ; Toddら、1987, Nature 329 : 599-604 ; Kawasa
ki, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 5698-570
2 ; 及びNeriら、1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85 : 9268-9272 を参照のこと）において広い有用性を
有す。しかしながら、これらの利用は単に定性的な結
果、例えば正常細胞をバックグランドとして、異常細胞
由来の独特のｍＲＮＡ転写物の測定を提供している。
【０００４】腫瘍におけるチミジル酸シンターゼのｍＲ
ＮＡレベルの定量的な研究のためのＰＣＲの利用の試み
は公開されている（Kashani-Sabet, 1988, Cancer Res.
48: 5775-5778 参照）。しかしながら、この研究は生
物学試料中のｍＲＮＡの量の単なる相対的な比較を提供
する。既知濃度の内（ｉｎｔｅｒｎａｌ）標準品を用い
ないで特定のｍＲＮＡの絶対量を定量することはより困
難である。その他の方法は、第２の、無関係な鋳型ｃＤ
ＮＡを共増幅するためのＰＣＲの利用による核酸物質の
定量について詳細している（Chellyら、1988, Nature 3
33 : 858-860及びRappoleeら、1988, Science 241 : 70
8-712 を参照）。無関係なｃＤＮＡ標準品の利用は、特
定の標的ｍＲＮＡに無関係な第２セットのオリゴヌクレ
オチドプライマーの利用も必要とする。
ＮＡレベルの定量的な研究のためのＰＣＲの利用の試み
は公開されている（Kashani-Sabet, 1988, Cancer Res.
48: 5775-5778 参照）。しかしながら、この研究は生
物学試料中のｍＲＮＡの量の単なる相対的な比較を提供
する。既知濃度の内（ｉｎｔｅｒｎａｌ）標準品を用い
ないで特定のｍＲＮＡの絶対量を定量することはより困
難である。その他の方法は、第２の、無関係な鋳型ｃＤ
ＮＡを共増幅するためのＰＣＲの利用による核酸物質の
定量について詳細している（Chellyら、1988, Nature 3
33 : 858-860及びRappoleeら、1988, Science 241 : 70
8-712 を参照）。無関係なｃＤＮＡ標準品の利用は、特
定の標的ｍＲＮＡに無関係な第２セットのオリゴヌクレ
オチドプライマーの利用も必要とする。
【０００５】増幅は指数的な工程であるため、プライマ
ーペアーの長さ及びヌクレオチド配列を含む、反応速度
をコントロールする任意の変異要因における小さな相違
はＰＣＲ生成物の収量において大きな相違をもたらすこ
とができる。２組のセットの無関係なプライマーを利用
する分析は従って、ｍＲＮＡの濃度の絶対的な測定より
もむしろ２種の個々の増幅反応の相対的な比較のみを提
供しうる。
ーペアーの長さ及びヌクレオチド配列を含む、反応速度
をコントロールする任意の変異要因における小さな相違
はＰＣＲ生成物の収量において大きな相違をもたらすこ
とができる。２組のセットの無関係なプライマーを利用
する分析は従って、ｍＲＮＡの濃度の絶対的な測定より
もむしろ２種の個々の増幅反応の相対的な比較のみを提
供しうる。
【０００６】Gilliland ら（J.Cellular Biochemistry,
VCLA Symposiaon Molecular and Cellular Biology
（分子及び細胞生物学シンポジウム）、１９８９年４月
３〜２１日、要約書（Ａｂｓｔｒａｃｔ）ＷＨ００１）
は増幅標準品としての無関係な鋳型に関連するいくつか
の問題を回避するためのｍＲＮＡ定量の択一的な手法を
詳細している。しかしながらＧｉｌｌａｎｄらはその他
の固有の制限を挙げている。１つの手法は特定の標的ｍ
ＲＮＡに関連する遺伝子についてのゲノムイントロン及
びエキソンの地図化を必要とする。Ｇｉｌｌａｎｄら
は、増幅せしめた後にヘテロ二重鎖の形成を引き起こ
す、内標準品の作製のための位置特異的突然変異誘発を
利用する択一的な手法も試みている。このようなヘテロ
二重鎖はオリジナルの試料中に存在する標的配列の量の
過剰評価をもたらす。Ｓｍｉｔｈら（Smith ら、1989,
J.lmmunol. Meth. 118 : 265-272）は、ヒトマクロファ
ージにおける２種のＩＬ−１ｍＲＮＡの発現レベルを定
量的に評価するためのＲＮＡドットブロットアッセイを
利用している。Ｓｍｉｔｈらは、この方法によるＩＬ−
１αｍＲＮＡの感度のレベルはおよそ１０7 個の分子で
あり、そして誘発せしめていないマクロファージにおい
てＩＬ−１αｍＲＮＡが検出されなかったことを報告し
ている。本発明は試料アッセイにおいて１０4 個の分子
を容易に測定でき、且つ未誘発及び誘発マクロファージ
中のＩＬ−１αｍＲＮＡを容易に検出できる定量方法を
提供する。感度におけるこの１０００倍の上昇は臨床及
び研究の目的のための定量分析において重大な進歩を提
供する。
VCLA Symposiaon Molecular and Cellular Biology
（分子及び細胞生物学シンポジウム）、１９８９年４月
３〜２１日、要約書（Ａｂｓｔｒａｃｔ）ＷＨ００１）
は増幅標準品としての無関係な鋳型に関連するいくつか
の問題を回避するためのｍＲＮＡ定量の択一的な手法を
詳細している。しかしながらＧｉｌｌａｎｄらはその他
の固有の制限を挙げている。１つの手法は特定の標的ｍ
ＲＮＡに関連する遺伝子についてのゲノムイントロン及
びエキソンの地図化を必要とする。Ｇｉｌｌａｎｄら
は、増幅せしめた後にヘテロ二重鎖の形成を引き起こ
す、内標準品の作製のための位置特異的突然変異誘発を
利用する択一的な手法も試みている。このようなヘテロ
二重鎖はオリジナルの試料中に存在する標的配列の量の
過剰評価をもたらす。Ｓｍｉｔｈら（Smith ら、1989,
J.lmmunol. Meth. 118 : 265-272）は、ヒトマクロファ
ージにおける２種のＩＬ−１ｍＲＮＡの発現レベルを定
量的に評価するためのＲＮＡドットブロットアッセイを
利用している。Ｓｍｉｔｈらは、この方法によるＩＬ−
１αｍＲＮＡの感度のレベルはおよそ１０7 個の分子で
あり、そして誘発せしめていないマクロファージにおい
てＩＬ−１αｍＲＮＡが検出されなかったことを報告し
ている。本発明は試料アッセイにおいて１０4 個の分子
を容易に測定でき、且つ未誘発及び誘発マクロファージ
中のＩＬ−１αｍＲＮＡを容易に検出できる定量方法を
提供する。感度におけるこの１０００倍の上昇は臨床及
び研究の目的のための定量分析において重大な進歩を提
供する。
【０００７】試料中の特定の核酸セグメントの量の直接
的、高精度的、及び再現的定量の方法が所望されてい
る。定量的ＰＣＲの有用性は多数の研究分野における有
用な情報を提供するであろう。より詳しくは、本発明は
疾病の診断及び癌治療における重要な情報を提供する。
例えば、信頼できる高感度定量分析は、外因性刺激に対
する応答性におけるｍＲＮＡ合成の誘発の程度の検査に
おいて重要となりうる。本発明は当分野におけるその他
の試みに固有の莫大なる制限を解決し、従って生物学試
料中の核酸セグメントの量を高精度に定量するための手
段を提供する。
的、高精度的、及び再現的定量の方法が所望されてい
る。定量的ＰＣＲの有用性は多数の研究分野における有
用な情報を提供するであろう。より詳しくは、本発明は
疾病の診断及び癌治療における重要な情報を提供する。
例えば、信頼できる高感度定量分析は、外因性刺激に対
する応答性におけるｍＲＮＡ合成の誘発の程度の検査に
おいて重要となりうる。本発明は当分野におけるその他
の試みに固有の莫大なる制限を解決し、従って生物学試
料中の核酸セグメントの量を高精度に定量するための手
段を提供する。
【０００８】本発明は試料中の標的核酸セグメントを定
量する方法を提供、ここで、該方法は以下の段階： （ａ）該試料に一定量の標準核酸セグメントを加え； （ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応を実施するのに適切な条件
のもとで該試料を処理し（ここで該核酸は一本鎖とさ
れ、そして重合のための試薬、即ち、デオキシヌクレオ
シド５′三リン酸及び１対のオリゴヌクレオチドプライ
マーに暴露せしめ、ここで該一対のプライマーは該標的
及び該標準核酸セグメントの両方に特異的であり、これ
によって該一対のプライマーそれぞれの伸長生成物が合
成のための鋳型として該標的及び該標準セグメントの個
々の鎖を利用することにより合成されうることができ、
これによって１方のプライマーの伸長生成物を該鋳型鎖
から分離せしめる際に該対の他方のプライマーの伸長生
成物の合成のための鋳型として働くことができる）； （ｃ）一本鎖分子を形成せしめるため、該プライマー伸
長生成物を、それらが合成された鋳型から分離させ； （ｄ）段階（ｃ）において作られる一本鎖分子に基づい
て少なくとも１回、段階（ｂ）及び（ｃ）を繰り返し
（ここで段階（ｂ）及び（ｃ）は増幅の１周期とす
る）； （ｅ）段階（ｄ）において作られる増幅せしめた該標的
及び該標準セグメントの量を測定し；そして （ｆ）増幅前の該試料中に存在する該標的核酸セグメン
トの量を、段階（ｄ）において作られる増幅せしめた該
標的及び該標準セグメントから計算すること；を含んで
成る。
量する方法を提供、ここで、該方法は以下の段階： （ａ）該試料に一定量の標準核酸セグメントを加え； （ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応を実施するのに適切な条件
のもとで該試料を処理し（ここで該核酸は一本鎖とさ
れ、そして重合のための試薬、即ち、デオキシヌクレオ
シド５′三リン酸及び１対のオリゴヌクレオチドプライ
マーに暴露せしめ、ここで該一対のプライマーは該標的
及び該標準核酸セグメントの両方に特異的であり、これ
によって該一対のプライマーそれぞれの伸長生成物が合
成のための鋳型として該標的及び該標準セグメントの個
々の鎖を利用することにより合成されうることができ、
これによって１方のプライマーの伸長生成物を該鋳型鎖
から分離せしめる際に該対の他方のプライマーの伸長生
成物の合成のための鋳型として働くことができる）； （ｃ）一本鎖分子を形成せしめるため、該プライマー伸
長生成物を、それらが合成された鋳型から分離させ； （ｄ）段階（ｃ）において作られる一本鎖分子に基づい
て少なくとも１回、段階（ｂ）及び（ｃ）を繰り返し
（ここで段階（ｂ）及び（ｃ）は増幅の１周期とす
る）； （ｅ）段階（ｄ）において作られる増幅せしめた該標的
及び該標準セグメントの量を測定し；そして （ｆ）増幅前の該試料中に存在する該標的核酸セグメン
トの量を、段階（ｄ）において作られる増幅せしめた該
標的及び該標準セグメントから計算すること；を含んで
成る。
【０００９】本発明は標的核酸セグメントの定量のため
の内標準品を提供するために有用なプラスミドも提供す
る。該プラスミドはＤＮＡ配列を含んで成り、ここで該
ＤＮＡ配列は該標的核酸セグメントに含まれているＤＮ
Ａ配列と同一である配列を更に含んで成る。
の内標準品を提供するために有用なプラスミドも提供す
る。該プラスミドはＤＮＡ配列を含んで成り、ここで該
ＤＮＡ配列は該標的核酸セグメントに含まれているＤＮ
Ａ配列と同一である配列を更に含んで成る。
【００１０】本発明は生物学試料中の特定の核酸セグメ
ントの定量のためのキットも提供する。
ントの定量のためのキットも提供する。
【００１１】本発明は試料中の核酸セグメントの絶対量
を測定するための方法を提供する。本方法は、１つの反
応混合物に混合せしめた２種類の異なる核酸のセグメン
トのポリメラーゼ連鎖反応による増幅を包含する。この
２種のセグメントは標的セグメント及び内標準セグメン
トを含む。この内標準品はこの標的核酸と同一のオリゴ
ヌクレオチドプライマーペアーを用いて増幅せしめる；
しかしながら、この２種の核酸セグメントはそのサイズ
によって区別される増幅生成物を作る。
を測定するための方法を提供する。本方法は、１つの反
応混合物に混合せしめた２種類の異なる核酸のセグメン
トのポリメラーゼ連鎖反応による増幅を包含する。この
２種のセグメントは標的セグメント及び内標準セグメン
トを含む。この内標準品はこの標的核酸と同一のオリゴ
ヌクレオチドプライマーペアーを用いて増幅せしめる；
しかしながら、この２種の核酸セグメントはそのサイズ
によって区別される増幅生成物を作る。
【００１２】標準セグメントは既知量において存在す
る。増幅の後、この２種のポリメラーゼ連鎖反応生成物
のそれぞれの量を測定し、そしてオリジナル試料に存在
するこの標的セグメントの量は標準曲線に対して外挿す
ることによって定量される。更に、本明細書に説明する
内標準品は複数の遺伝子に関するプライマー配列を含
み、従って同じ標準品が多数の異なる対象の核酸セグメ
ントに利用できる。
る。増幅の後、この２種のポリメラーゼ連鎖反応生成物
のそれぞれの量を測定し、そしてオリジナル試料に存在
するこの標的セグメントの量は標準曲線に対して外挿す
ることによって定量される。更に、本明細書に説明する
内標準品は複数の遺伝子に関するプライマー配列を含
み、従って同じ標準品が多数の異なる対象の核酸セグメ
ントに利用できる。
【００１３】本発明は、０．１ng以下の全ＲＮＡを含む
試料中に存在する微量の特定のｍＲＮＡの量を正確に測
定するための迅速な、高感度なそして信頼できる方法を
提供することにおいて特に有用性を示す。この方法は単
一細胞レベルにてさえの特定のサブ集団（ｓｕｂｐｏｐ
ｕｌａｔｉｏｎ）における特定のｍＲＮＡの異なる発現
レベルの測定を十分に可能にする手法を提供する。
試料中に存在する微量の特定のｍＲＮＡの量を正確に測
定するための迅速な、高感度なそして信頼できる方法を
提供することにおいて特に有用性を示す。この方法は単
一細胞レベルにてさえの特定のサブ集団（ｓｕｂｐｏｐ
ｕｌａｔｉｏｎ）における特定のｍＲＮＡの異なる発現
レベルの測定を十分に可能にする手法を提供する。
【００１４】該標的核酸及び該内標準核酸の共増幅によ
り、種々の因子が本質的にコンロートされ、そして標的
及び標準核酸に関する一様なＰＣＲ生成物の収量が及ぼ
される。莫大な数の変異因子がＲＣＲ反応の速度に影響
を及ぼす。このような変異因子はポリメラーゼ、ｄＮＴ
Ｐ，ＭｇＣｌ2 、核酸鋳型及びプライマーの濃度、並び
に「プライマー−ダイマー」形成及び試験管間差を含
む。
り、種々の因子が本質的にコンロートされ、そして標的
及び標準核酸に関する一様なＰＣＲ生成物の収量が及ぼ
される。莫大な数の変異因子がＲＣＲ反応の速度に影響
を及ぼす。このような変異因子はポリメラーゼ、ｄＮＴ
Ｐ，ＭｇＣｌ2 、核酸鋳型及びプライマーの濃度、並び
に「プライマー−ダイマー」形成及び試験管間差を含
む。
【００１５】増幅前の試料中に存在するこの標的核酸セ
グメントの量は標準曲線を用いて決定される。この標準
曲線は、ポリメラーゼ連鎖反応において作られる標準セ
グメントの量を、増幅の前に存在する種々の既知量のＲ
ＮＡに対してプロットすることによって作製される。精
度のため、増幅前に存在する標準セグメントの量は共増
幅反応混合物の段階希釈によって変える。このポリメラ
ーゼ連鎖反応において作られる標的セグメントの量を次
にこの標準曲線と比較し、増幅前の試料中に存在する標
的セグメントの量を決定する。他方、この標準曲線は増
幅周期数の対して製造される標準及び標的セグメントの
量をプロットすることによって作製されうる。精度をよ
くするため、増幅周期の回数は、種々の回数の増幅周期
が終了した後に、１つの共増幅反応混合物からアリコー
トを取り出すことにより変えることが好適である。
グメントの量は標準曲線を用いて決定される。この標準
曲線は、ポリメラーゼ連鎖反応において作られる標準セ
グメントの量を、増幅の前に存在する種々の既知量のＲ
ＮＡに対してプロットすることによって作製される。精
度のため、増幅前に存在する標準セグメントの量は共増
幅反応混合物の段階希釈によって変える。このポリメラ
ーゼ連鎖反応において作られる標的セグメントの量を次
にこの標準曲線と比較し、増幅前の試料中に存在する標
的セグメントの量を決定する。他方、この標準曲線は増
幅周期数の対して製造される標準及び標的セグメントの
量をプロットすることによって作製されうる。精度をよ
くするため、増幅周期の回数は、種々の回数の増幅周期
が終了した後に、１つの共増幅反応混合物からアリコー
トを取り出すことにより変えることが好適である。
【００１６】本発明の方法は試料中の核酸セグメントの
量を絶対量よりも相対量として測定することで非常に優
れている。更に、本方法は標準品を増幅せしめるために
第２セットのオリゴヌクレオチドプライマーを採用する
ことによって絶対量が得られる場合よりもより精度が高
い（ここでこのプライマーのセットは標的セグメントを
増幅するために用いるセットとは異なる）。
量を絶対量よりも相対量として測定することで非常に優
れている。更に、本方法は標準品を増幅せしめるために
第２セットのオリゴヌクレオチドプライマーを採用する
ことによって絶対量が得られる場合よりもより精度が高
い（ここでこのプライマーのセットは標的セグメントを
増幅するために用いるセットとは異なる）。
【００１７】本発明の方法は標的ＲＮＡ又はＤＮＡの定
量のために有用である。試料中に存在するＤＮＡの量を
決定するために本明細書記載の方法は直接適用されう
る。以降に詳細の実施例が示す通り、本発明は全ＲＮＡ
の試料中の特定のｍＲＮＡの量を決定するのにも有用で
ある。この内標準核酸セグメントはＤＮＡプラスミド上
に提供される。適切に置かれたＴ７ポリメラーゼプロモ
ーター又はその他の適切なプロモーター、例えばＳＰ６
プロモーターの存在は、このプラスミドがｃＲＮＡ合成
のための鋳型として利用されることを可能にする。本発
明の目的のために本明細書では、「ｃＲＮＡ」なる語は
ＲＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ鋳型から合成されるリ
ボ核酸セグメントに関するものと定義する。更に、該プ
ラスミドは精製及びその後のインビトロ合成ｃＲＮＡの
定量を促進せしめるため、３′末端にポリアデニル化配
列を含みうる。
量のために有用である。試料中に存在するＤＮＡの量を
決定するために本明細書記載の方法は直接適用されう
る。以降に詳細の実施例が示す通り、本発明は全ＲＮＡ
の試料中の特定のｍＲＮＡの量を決定するのにも有用で
ある。この内標準核酸セグメントはＤＮＡプラスミド上
に提供される。適切に置かれたＴ７ポリメラーゼプロモ
ーター又はその他の適切なプロモーター、例えばＳＰ６
プロモーターの存在は、このプラスミドがｃＲＮＡ合成
のための鋳型として利用されることを可能にする。本発
明の目的のために本明細書では、「ｃＲＮＡ」なる語は
ＲＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ鋳型から合成されるリ
ボ核酸セグメントに関するものと定義する。更に、該プ
ラスミドは精製及びその後のインビトロ合成ｃＲＮＡの
定量を促進せしめるため、３′末端にポリアデニル化配
列を含みうる。
【００１８】好適な態様に詳細の通り、該ＤＮＡ鋳型は
プラスミドＡＷ１０８又はＡＷ１０９のいづれかであ
り、そして該ＲＮＡポリメラーゼはＴ７ポリメラーゼで
ある。１つの態様においてＡＷ１０８ｃＲＮＡは、Ｔ７
ポリメラーゼによりｐＡＷ１０８から有意な鎖（ｓｅｎ
ｓｅ ｓｔｒａｎｄ）として合成される。ｐＡＷ１０８
の構造は図１において示す。図１に示すプライマー列は
ｐＡＷ１０８とｐＡＷ１０９の両方に関して同一であ
る。従ってこのｃＲＮＡ分子は逆転写酵素、ＤＮＡポリ
メラーゼによる逆転写のための内標準鋳型として働く。
逆転写酵素はＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡ転写物を作る。本
発明の好ましい態様では、この内標準ｃＲＮＡは有意鎖
として合成される。標的ｍＲＮＡ及び標的ｃＲＮＡの逆
転写の後に、ＰＣＲを行う。
プラスミドＡＷ１０８又はＡＷ１０９のいづれかであ
り、そして該ＲＮＡポリメラーゼはＴ７ポリメラーゼで
ある。１つの態様においてＡＷ１０８ｃＲＮＡは、Ｔ７
ポリメラーゼによりｐＡＷ１０８から有意な鎖（ｓｅｎ
ｓｅ ｓｔｒａｎｄ）として合成される。ｐＡＷ１０８
の構造は図１において示す。図１に示すプライマー列は
ｐＡＷ１０８とｐＡＷ１０９の両方に関して同一であ
る。従ってこのｃＲＮＡ分子は逆転写酵素、ＤＮＡポリ
メラーゼによる逆転写のための内標準鋳型として働く。
逆転写酵素はＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡ転写物を作る。本
発明の好ましい態様では、この内標準ｃＲＮＡは有意鎖
として合成される。標的ｍＲＮＡ及び標的ｃＲＮＡの逆
転写の後に、ＰＣＲを行う。
【００１９】当業者に明らかであろうが、本発明の方法
に有用なプラスミドを作製するための莫大な数の方法が
知られている。Higuchi, 1988, Nucleic Acids Researc
h 16: 7351 〜7367及びHo, 1989, Gene 77 : 51-59
は、所望する合成ＤＮＡを組入れた新規のプラスミドの
操作のための２通りの方法を詳細している。他方、合成
ＤＮＡセグメントは制限酵素分解及び適切に処理せしめ
た親プラスミド又はファージベクターとのリゲーション
を介して挿入されうる。好ましい態様の内標準品ｐＡＷ
１０８は、一本鎖ｃＲＮＡ標準品が、種々のｍＲＮＡの
数を定量するのに利用されることを可能にする、複数の
プライマーセットを含む。ｐＡＷ１０８プラスミドにお
ける固有の制限酵素部位の存在は、このプラスミドに新
しいプライマーセットを加える多様性を付与する。この
ＢａｍＨＩ部位は、逆転写のための直鎖状鋳型を提供す
るため、このプラスミドを直鎖状にするために利用され
る。プラスミドＡＷ１０８を含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）の保存品は、ブタペスト条約に従ってアメリカンタ
イプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（12301 Park
lawn Drive, Rockville, Maryland)に寄託されている。
ＡＷ１０９を含むＥ．コリの保存品も、ブタペスト条約
に従ってアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａ
ＴＣＣ）（12301 Parklawn Drive, Rockville, Marylan
d)に寄託されている。
に有用なプラスミドを作製するための莫大な数の方法が
知られている。Higuchi, 1988, Nucleic Acids Researc
h 16: 7351 〜7367及びHo, 1989, Gene 77 : 51-59
は、所望する合成ＤＮＡを組入れた新規のプラスミドの
操作のための２通りの方法を詳細している。他方、合成
ＤＮＡセグメントは制限酵素分解及び適切に処理せしめ
た親プラスミド又はファージベクターとのリゲーション
を介して挿入されうる。好ましい態様の内標準品ｐＡＷ
１０８は、一本鎖ｃＲＮＡ標準品が、種々のｍＲＮＡの
数を定量するのに利用されることを可能にする、複数の
プライマーセットを含む。ｐＡＷ１０８プラスミドにお
ける固有の制限酵素部位の存在は、このプラスミドに新
しいプライマーセットを加える多様性を付与する。この
ＢａｍＨＩ部位は、逆転写のための直鎖状鋳型を提供す
るため、このプラスミドを直鎖状にするために利用され
る。プラスミドＡＷ１０８を含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）の保存品は、ブタペスト条約に従ってアメリカンタ
イプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（12301 Park
lawn Drive, Rockville, Maryland)に寄託されている。
ＡＷ１０９を含むＥ．コリの保存品も、ブタペスト条約
に従ってアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａ
ＴＣＣ）（12301 Parklawn Drive, Rockville, Marylan
d)に寄託されている。
【００２０】プラスミドＡＷ１０８は、Okayama とBer
g, 1983, Mol. Cell Biol. 3 : 280-289 に開示のｐｃ
ＤＶ１及びｐＬ１に由来する。ｐＬ１由来のＳＶ４０プ
ロモーター領域をｐｃＤＶ１の中に挿入せしめた（参照
論文に従って）。Ｔ７プロモーター、合成オリゴヌクレ
オチド配列及びＩＬ−１α遺伝子由来のポリアデニル化
領域を次に挿入し、ＡＷ１０８プラスミドが１２種の特
定のｍＲＮＡの定量のための内標準品となるようにし
た。このプラスミドをＥ．コリに形質転換せしめ、そし
て５０μｌ／mlのアンピシリンの添加されたルリア培地
中で増殖させた。
g, 1983, Mol. Cell Biol. 3 : 280-289 に開示のｐｃ
ＤＶ１及びｐＬ１に由来する。ｐＬ１由来のＳＶ４０プ
ロモーター領域をｐｃＤＶ１の中に挿入せしめた（参照
論文に従って）。Ｔ７プロモーター、合成オリゴヌクレ
オチド配列及びＩＬ−１α遺伝子由来のポリアデニル化
領域を次に挿入し、ＡＷ１０８プラスミドが１２種の特
定のｍＲＮＡの定量のための内標準品となるようにし
た。このプラスミドをＥ．コリに形質転換せしめ、そし
て５０μｌ／mlのアンピシリンの添加されたルリア培地
中で増殖させた。
【００２１】プラスミドＡＷ１０８をｐＡＷ１０９を作
製するための出発材料としてその後利用した。ｐＡＷ１
０８を含むＥ．コリの培養物を増殖させ、そしてプラス
ミドＤＮＡを標準的な方法により精製した。このプラス
ミドをＢａｍＨＩ及びＢｇｌII制限エンドヌクレアーゼ
により消化せしめ、そして１kbのフラグメントを精製し
た。このフラグメントは図１において示す通り、５′及
び３′プライマー列並びにポリアデニル化配列を含む。
プラスミドｐＳＰ７２（Promega Biotec, Madison, Wis
consin）は、クローン化を促進するようにポリリンカー
に隣接するＴ７プロモーターを含む。このプラスミドは
アンピシリン耐性遺伝子も含む。
製するための出発材料としてその後利用した。ｐＡＷ１
０８を含むＥ．コリの培養物を増殖させ、そしてプラス
ミドＤＮＡを標準的な方法により精製した。このプラス
ミドをＢａｍＨＩ及びＢｇｌII制限エンドヌクレアーゼ
により消化せしめ、そして１kbのフラグメントを精製し
た。このフラグメントは図１において示す通り、５′及
び３′プライマー列並びにポリアデニル化配列を含む。
プラスミドｐＳＰ７２（Promega Biotec, Madison, Wis
consin）は、クローン化を促進するようにポリリンカー
に隣接するＴ７プロモーターを含む。このプラスミドは
アンピシリン耐性遺伝子も含む。
【００２２】ｐＡＷ１０８由来のＢｇｌII−ＢａｍＨＩ
フラグメントをＢｇｌII及びＢａｍＨＩ切断ｐＳＰ７２
にリゲートせしめた。これらは両方共、ポリリンカー領
域内に固有の制限部位である。このリゲーション混合物
をＥ．コリＤＨ５αの形質転換のために用い、そして得
られるアンピシリン耐性コロニーを選別した。このプラ
スミドをそのＢｇｌII−ＢａｍＨＩインサートの正しい
方向性についてアッセイした。得られるプラスミドｐＡ
Ｗ１０９はｍＲＮＡの定量の内標準品として適切であ
る。
フラグメントをＢｇｌII及びＢａｍＨＩ切断ｐＳＰ７２
にリゲートせしめた。これらは両方共、ポリリンカー領
域内に固有の制限部位である。このリゲーション混合物
をＥ．コリＤＨ５αの形質転換のために用い、そして得
られるアンピシリン耐性コロニーを選別した。このプラ
スミドをそのＢｇｌII−ＢａｍＨＩインサートの正しい
方向性についてアッセイした。得られるプラスミドｐＡ
Ｗ１０９はｍＲＮＡの定量の内標準品として適切であ
る。
【００２３】当業者に明らかな通り、本発明に有用な内
標準品を提供するために所望するＤＮＡ配列の挿入のた
めには莫大な数のその他プラスミドが有用である。一般
に、本発明の実施のために必要とされる、このようなプ
ラスミドの適切な宿主系の中への形質転換、この形質転
換宿主の増殖、及びプラスミドＤＮＡの調製の方法はMa
niatisらの、Molecular Cloning-A Laboratory Manual,
Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor,
New York, 1985において見い出されうる。
標準品を提供するために所望するＤＮＡ配列の挿入のた
めには莫大な数のその他プラスミドが有用である。一般
に、本発明の実施のために必要とされる、このようなプ
ラスミドの適切な宿主系の中への形質転換、この形質転
換宿主の増殖、及びプラスミドＤＮＡの調製の方法はMa
niatisらの、Molecular Cloning-A Laboratory Manual,
Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor,
New York, 1985において見い出されうる。
【００２４】本明細書で用いられる語「５′プライマ
ー」は、該標的ヌクレオチドセグメントの有意鎖におい
て含まれている配列と同一の配列を含んで成るオリゴヌ
クレオチドに関する。
ー」は、該標的ヌクレオチドセグメントの有意鎖におい
て含まれている配列と同一の配列を含んで成るオリゴヌ
クレオチドに関する。
【００２５】本明細書で用いられる語「３′プライマ
ー」は前記の標的ヌクレオチドセグメントの有意鎖にお
いて含まれる配列と同一の配列に相補する配列を含んで
成るオリゴヌクレオチドに関する。それ故、本発明の方
法において有用な３′プライマーはｍＲＮＡ，ｃＲＮＡ
又はＤＮＡ鋳型とハイブリダイズするであろう。内標準
品ｃＲＮＡ及び標的ｍＲＮＡセグメントの両方に対する
３′及び５′プライマーについて更に説明すると、３′
プライマーハイブリダイゼーションの領域は、５′プラ
イマーハイブリダイゼーション領域の３′側に位置す
る。
ー」は前記の標的ヌクレオチドセグメントの有意鎖にお
いて含まれる配列と同一の配列に相補する配列を含んで
成るオリゴヌクレオチドに関する。それ故、本発明の方
法において有用な３′プライマーはｍＲＮＡ，ｃＲＮＡ
又はＤＮＡ鋳型とハイブリダイズするであろう。内標準
品ｃＲＮＡ及び標的ｍＲＮＡセグメントの両方に対する
３′及び５′プライマーについて更に説明すると、３′
プライマーハイブリダイゼーションの領域は、５′プラ
イマーハイブリダイゼーション領域の３′側に位置す
る。
【００２６】これら３′及び５′プライマーは本発明の
方法において以下の通りに機能する：該３′プライマー
はＰＣＲ反応におけるＤＮＡ合成を開始させてアンチセ
ンスＤＮＡ鎖を作り、これは５′プライマーをＰＣＲ反
応に含ませる際に第２一本鎖ＤＮＡ合成のための鋳型と
して働く。このような５′及び３′プライマーを本明細
書で「プライマーペアー」と称す。
方法において以下の通りに機能する：該３′プライマー
はＰＣＲ反応におけるＤＮＡ合成を開始させてアンチセ
ンスＤＮＡ鎖を作り、これは５′プライマーをＰＣＲ反
応に含ませる際に第２一本鎖ＤＮＡ合成のための鋳型と
して働く。このような５′及び３′プライマーを本明細
書で「プライマーペアー」と称す。
【００２７】好ましい態様において、プライマーペアー
のほとんどの構成員は、各標的ｍＲＮＡをコードする遺
伝子における２つのエキソン−イントロン結合部にまた
がるようにデザインされている。これによってこのプラ
イマーは所望の標的ｍＲＮＡにのみ効率的にハイブリダ
イズするであろう。従って、生物学試料中の少量の夾雑
遺伝子ＤＮＡは標的ｍＲＮＡの正確な定量に影響しない
であろう。
のほとんどの構成員は、各標的ｍＲＮＡをコードする遺
伝子における２つのエキソン−イントロン結合部にまた
がるようにデザインされている。これによってこのプラ
イマーは所望の標的ｍＲＮＡにのみ効率的にハイブリダ
イズするであろう。従って、生物学試料中の少量の夾雑
遺伝子ＤＮＡは標的ｍＲＮＡの正確な定量に影響しない
であろう。
【００２８】従って、プライマーペアーはＰＣＲ反応に
おいて、標準核酸、即ち本明細書で例示するプラスミド
ＡＷ１０８及びＡＷ１０９において含まれるＤＮＡセグ
メントと同一のプライマー配列を有す核酸のセグメント
を増幅せしめるために機能するであろう。本明細書で詳
細する通り、両方のプラスミドは以下の通りに並んだ１
２組のプライマーペアーのＤＮＡ配列を含んで成るＤＮ
Ａ配列を含む：１２種の標的ｍＲＮＡの５′プライマー
と配列において同一のＤＮＡの後に、同じ１２種の標的
ｍＲＮＡに関する３′プライマーの相補性ＤＮＡ配列が
くる（図１）。ｐＡＷ１０８及びｐＡＷ１０９内のプラ
イマーペアーＤＮＡ配列は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、
マクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、血
小板由来増殖因子Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）、血小板由来増殖
因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）、低密度リポタンパク質リセプ
ター（ＬＤＬ−Ｒ）、３−ヒドロキシ−３−メチルグル
タリル補酵素Ａリダクターゼ（ＨＭＧ）、インターロイ
キン−１α（ＩＬ−１α）、インターロイキン−１β
（ＩＬ−１β）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、
β型血小板由来増殖因子リセプター（ＰＤＧＦ−ＢＲ）
及びリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）をコードするｍ
ＲＮＡに相当する。本発明の方法の実施において、ＡＷ
１０８又はＡＷ１０９ｃＲＮＡにより提供される内標準
品の増殖のために有用なプライマーペアーを表Ｉに挙げ
る。
おいて、標準核酸、即ち本明細書で例示するプラスミド
ＡＷ１０８及びＡＷ１０９において含まれるＤＮＡセグ
メントと同一のプライマー配列を有す核酸のセグメント
を増幅せしめるために機能するであろう。本明細書で詳
細する通り、両方のプラスミドは以下の通りに並んだ１
２組のプライマーペアーのＤＮＡ配列を含んで成るＤＮ
Ａ配列を含む：１２種の標的ｍＲＮＡの５′プライマー
と配列において同一のＤＮＡの後に、同じ１２種の標的
ｍＲＮＡに関する３′プライマーの相補性ＤＮＡ配列が
くる（図１）。ｐＡＷ１０８及びｐＡＷ１０９内のプラ
イマーペアーＤＮＡ配列は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、
マクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、血
小板由来増殖因子Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）、血小板由来増殖
因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）、低密度リポタンパク質リセプ
ター（ＬＤＬ−Ｒ）、３−ヒドロキシ−３−メチルグル
タリル補酵素Ａリダクターゼ（ＨＭＧ）、インターロイ
キン−１α（ＩＬ−１α）、インターロイキン−１β
（ＩＬ−１β）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、
β型血小板由来増殖因子リセプター（ＰＤＧＦ−ＢＲ）
及びリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）をコードするｍ
ＲＮＡに相当する。本発明の方法の実施において、ＡＷ
１０８又はＡＷ１０９ｃＲＮＡにより提供される内標準
品の増殖のために有用なプライマーペアーを表Ｉに挙げ
る。
【００２９】
【表１】
【００３０】ＴＮＦ、腫瘍壊死因子；Ｍ−ＣＳＦ、マク
ロファージ−コロニー刺激因子；ＰＤＧＦ−Ａ、血小板
由来増殖因子Ａ；ＰＤＧＦ−Ｂ、血小板由来増殖因子
Ｂ；ａｐｏ−Ｅ、アポリポタンパク質Ｅ；ＬＤＬ−Ｒ、
低密度リポタンパク質リセプター；ＨＭＧ，３−ヒドロ
キシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａリダクターゼ；Ｉ
Ｌ−１α、インターロイキン−１α；ＩＬ−１β、イン
ターロイキン−１β；ＩＬ−２、インターロイキン−
２；ＰＤＧＦ−Ｒ，β型血小板由来増殖因子リセプタ
ー；ＬＰＬ、リポタンパク質リパーゼ。
ロファージ−コロニー刺激因子；ＰＤＧＦ−Ａ、血小板
由来増殖因子Ａ；ＰＤＧＦ−Ｂ、血小板由来増殖因子
Ｂ；ａｐｏ−Ｅ、アポリポタンパク質Ｅ；ＬＤＬ−Ｒ、
低密度リポタンパク質リセプター；ＨＭＧ，３−ヒドロ
キシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａリダクターゼ；Ｉ
Ｌ−１α、インターロイキン−１α；ＩＬ−１β、イン
ターロイキン−１β；ＩＬ−２、インターロイキン−
２；ＰＤＧＦ−Ｒ，β型血小板由来増殖因子リセプタ
ー；ＬＰＬ、リポタンパク質リパーゼ。
【００３１】その他のｍＲＮＡ標的であって本発明によ
り生物学試料中において容易に定量されるものには以下
のもの（但しそれらに限定しない）、即ち、顆粒球コロ
ニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコ
ロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、酸性繊維芽細胞増殖
因子（ａＦＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧ
Ｆ），Ｃ−マクドナーネコ肉腫（ｃ−ＭｃＤｏｎｏｕｇ
ｈ ｆｅｌｉｎｅ ｓａｒｃｏｍａ）（ｃ−ｆｍｓ）、
トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、白
血球付着性タンパク質−１（ＬＦＡ−１）、インターロ
イキン−２リセプター−α（ＩＬ−２Ｒα）、アルファ
ーアクチン、デスミン、β−アクチン、インターロイキ
ン−６（ＩＬ−６）、インターフェロン−α（ＩＦＮ−
α）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、インターロ
イキン−６−リセプター（ＩＬ−６Ｒ）、血小板由来増
殖因子−αリセプター（ＰＤＧＦ−αＲ）、インターロ
イキン−２リセプターβ（ＩＬ−２Ｒβ）、インターロ
イキン−３（ＩＬ−３）及びインターロイキン−４（Ｉ
Ｌ−４）並びにヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）が含ま
れる。これらのＲＮＡの発現の検出及び測定に有用なプ
ライマーペアーの例は、表IIにおいて示すオリゴヌクレ
オチド配列により例示す。
り生物学試料中において容易に定量されるものには以下
のもの（但しそれらに限定しない）、即ち、顆粒球コロ
ニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコ
ロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、酸性繊維芽細胞増殖
因子（ａＦＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧ
Ｆ），Ｃ−マクドナーネコ肉腫（ｃ−ＭｃＤｏｎｏｕｇ
ｈ ｆｅｌｉｎｅ ｓａｒｃｏｍａ）（ｃ−ｆｍｓ）、
トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、白
血球付着性タンパク質−１（ＬＦＡ−１）、インターロ
イキン−２リセプター−α（ＩＬ−２Ｒα）、アルファ
ーアクチン、デスミン、β−アクチン、インターロイキ
ン−６（ＩＬ−６）、インターフェロン−α（ＩＦＮ−
α）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、インターロ
イキン−６−リセプター（ＩＬ−６Ｒ）、血小板由来増
殖因子−αリセプター（ＰＤＧＦ−αＲ）、インターロ
イキン−２リセプターβ（ＩＬ−２Ｒβ）、インターロ
イキン−３（ＩＬ−３）及びインターロイキン−４（Ｉ
Ｌ−４）並びにヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）が含ま
れる。これらのＲＮＡの発現の検出及び測定に有用なプ
ライマーペアーの例は、表IIにおいて示すオリゴヌクレ
オチド配列により例示す。
【００３２】
【表２】
【００３３】
【表３】
【００３４】ｐＡＷ１０８及びｐＡＷ１０９内の各プラ
イマーセット由来のＰＣＲ生成物は、利用する特定のプ
ライマーペアーに依存して３００〜３０８塩基対（bp）
である。例示のこの３００〜３０８bpのセグメントの長
さは任意の内標準品のデザインの限定を強いるものでは
ない。唯一必要なことは、この標準セグメントの長さ
を、標的ｎＲＮＡのＰＣＲ生成物とサイズにおいて相違
し、且つこのセグメントの長さが好適な分析系（例えば
アクリルアミド電気泳動、アガロースゲル電気泳動又は
その他のクロマトグラフィー手段）における固有の検出
限界内にあるようにデザインすることである。ＰＣＲ増
幅生成物間のこのサイズの相違は、標的ｍＲＮＡ増幅生
成物から内標準ｃＲＮＡ増幅生成物の容易なる分離（例
えばゲル電気泳動による）を可能にする。固有ＢａｍＨ
Ｉ部位はＡＷ１０８又はＡＷ１０９プラスミドを直鎖状
にしてｃＲＮＡ転写物を作るために利用される。このよ
うな転写物は例えば処理及び未処理試料中の多数の異な
る種類のｍＲＮＡの定量に有用である。この方法は処理
もしくは未処理細胞又は組織の転写表現型を提供するた
めに利用でき、従って莫大な数の臨床及び研究用途を提
供する。
イマーセット由来のＰＣＲ生成物は、利用する特定のプ
ライマーペアーに依存して３００〜３０８塩基対（bp）
である。例示のこの３００〜３０８bpのセグメントの長
さは任意の内標準品のデザインの限定を強いるものでは
ない。唯一必要なことは、この標準セグメントの長さ
を、標的ｎＲＮＡのＰＣＲ生成物とサイズにおいて相違
し、且つこのセグメントの長さが好適な分析系（例えば
アクリルアミド電気泳動、アガロースゲル電気泳動又は
その他のクロマトグラフィー手段）における固有の検出
限界内にあるようにデザインすることである。ＰＣＲ増
幅生成物間のこのサイズの相違は、標的ｍＲＮＡ増幅生
成物から内標準ｃＲＮＡ増幅生成物の容易なる分離（例
えばゲル電気泳動による）を可能にする。固有ＢａｍＨ
Ｉ部位はＡＷ１０８又はＡＷ１０９プラスミドを直鎖状
にしてｃＲＮＡ転写物を作るために利用される。このよ
うな転写物は例えば処理及び未処理試料中の多数の異な
る種類のｍＲＮＡの定量に有用である。この方法は処理
もしくは未処理細胞又は組織の転写表現型を提供するた
めに利用でき、従って莫大な数の臨床及び研究用途を提
供する。
【００３５】該ｃＲＮＡ及び標的ｍＲＮＡは同一の反応
において逆転写される。この方法により、該ｃＲＮＡは
ｍＲＮＡ定量のための標準品として働くのみでなく、逆
転写反応のための内ｍＲＮＡコントロールも提供する。
逆転写酵素はＲＮＡ鋳型を利用するｃＤＮＡ合成を開始
せしめるプライマーを必要とする。本発明の実施におい
て、標準ｃＲＮＡ及び標的ｍＲＮＡの両方にハイブリダ
イズするオリゴヌクレオチドプライマーがこれになるこ
とができるであろう。このプライマーは標的ｍＲＮＡの
ＰＣＲ増幅のために利用される３′プライマーと同一の
配列でありうる。他方、この逆転写反応のためのプライ
マーは、ｍＲＮＡ及びｃＲＮＡと３′増幅プライマーの
配列、例えばオリゴ（ｄＴ）の末端の位置にてハイブリ
ダイズするオリゴヌクレオチドでありうる。従って得ら
れるｃＤＮＡはその中に３′増幅プライマーの配列と同
一の配列を含む。本明細書で開示する好ましい態様にお
いて、ＡＷ１０８ｃＲＮＡ並びにＡＷ１０９ｃＲＮＡは
３′末端にポリアデニル化配列を含み、そしてオリゴ
（ｄＴ）がｃＲＮＡ及びｍＲＮＡ鋳型の逆転写のための
プライマーとして利用される。更にオリゴ（ｄＴ）は同
一の逆転写酵素反応混合物から１以上の標的配列の増幅
を可能にする。
において逆転写される。この方法により、該ｃＲＮＡは
ｍＲＮＡ定量のための標準品として働くのみでなく、逆
転写反応のための内ｍＲＮＡコントロールも提供する。
逆転写酵素はＲＮＡ鋳型を利用するｃＤＮＡ合成を開始
せしめるプライマーを必要とする。本発明の実施におい
て、標準ｃＲＮＡ及び標的ｍＲＮＡの両方にハイブリダ
イズするオリゴヌクレオチドプライマーがこれになるこ
とができるであろう。このプライマーは標的ｍＲＮＡの
ＰＣＲ増幅のために利用される３′プライマーと同一の
配列でありうる。他方、この逆転写反応のためのプライ
マーは、ｍＲＮＡ及びｃＲＮＡと３′増幅プライマーの
配列、例えばオリゴ（ｄＴ）の末端の位置にてハイブリ
ダイズするオリゴヌクレオチドでありうる。従って得ら
れるｃＤＮＡはその中に３′増幅プライマーの配列と同
一の配列を含む。本明細書で開示する好ましい態様にお
いて、ＡＷ１０８ｃＲＮＡ並びにＡＷ１０９ｃＲＮＡは
３′末端にポリアデニル化配列を含み、そしてオリゴ
（ｄＴ）がｃＲＮＡ及びｍＲＮＡ鋳型の逆転写のための
プライマーとして利用される。更にオリゴ（ｄＴ）は同
一の逆転写酵素反応混合物から１以上の標的配列の増幅
を可能にする。
【００３６】該標準及び標的鋳型の両方のＰＣＲ増幅に
おいて同一のプライマーが利用される；従ってこの標準
と標的ＲＮＡの増幅との間にプライマー効率の相違はな
い。該標的ｍＲＮＡ及び内標準ｃＲＮＡの一連の希釈系
列を同一の試験管内において増幅せしめ、そしてこの反
応を増幅の指数期において停止せしめた場合、増幅前に
この試料中に存在している標的ｍＲＮＡの量は内標準ｃ
ＲＮＡ標準曲線に対して外挿せしめることによって決定
できる。製造されるＤＮＡの量を該標準及び標的の両方
に関する出発材料の量に対してプロットする。この標準
曲線は出発材料中の標的の量を決定するための該標的デ
ーターの外挿を可能にする。この値は標的ｍＲＮＡの分
子数／全ＲＮＡｎｇとして表わされうる。他方、これは
％もしくは重量、又はコピー数として測定されうる。
おいて同一のプライマーが利用される；従ってこの標準
と標的ＲＮＡの増幅との間にプライマー効率の相違はな
い。該標的ｍＲＮＡ及び内標準ｃＲＮＡの一連の希釈系
列を同一の試験管内において増幅せしめ、そしてこの反
応を増幅の指数期において停止せしめた場合、増幅前に
この試料中に存在している標的ｍＲＮＡの量は内標準ｃ
ＲＮＡ標準曲線に対して外挿せしめることによって決定
できる。製造されるＤＮＡの量を該標準及び標的の両方
に関する出発材料の量に対してプロットする。この標準
曲線は出発材料中の標的の量を決定するための該標的デ
ーターの外挿を可能にする。この値は標的ｍＲＮＡの分
子数／全ＲＮＡｎｇとして表わされうる。他方、これは
％もしくは重量、又はコピー数として測定されうる。
【００３７】他方、増幅周期の数を変えることによる標
的ｍＲＮＡの量の測定についての方法を提供する。製造
される増幅生成物の量を、該標準及び標的セグメントの
両方に関する増幅周期の数に対してプロットする。この
プロットしたデーターはこの反応部分の増幅の速度が指
数的であるかを示す。従って、形成される生成物の速度
は、存在している標的セグメントの初期量を決定するた
め、出発材料の速度を均等化することができる。これは
以下の式に従って行なわれる。
的ｍＲＮＡの量の測定についての方法を提供する。製造
される増幅生成物の量を、該標準及び標的セグメントの
両方に関する増幅周期の数に対してプロットする。この
プロットしたデーターはこの反応部分の増幅の速度が指
数的であるかを示す。従って、形成される生成物の速度
は、存在している標的セグメントの初期量を決定するた
め、出発材料の速度を均等化することができる。これは
以下の式に従って行なわれる。
【００３８】
【数１】
【００３９】式中、Ｎｏは材料の出発量、そしてＮは製
造される増幅生成物の量である。
造される増幅生成物の量である。
【００４０】本発明の他の態様において、第３のプライ
マー列を内標準プラスミドの中の５′プライマー列と
３′プライマー列の間に挿入せしめた。この第３オリゴ
ヌクレオチド列は一連の合成配列を含んで成る。その中
には５′及び３′プライマーペアーを含むプラスミドに
関する各ＲＮＡに相等する配列が存在する。この列は、
定量すべきそれぞれの標的ＲＮＡのため、この増幅生成
物がその中にこの第３オリゴヌクレオチド列の一部と同
一の配列を含むようにデザインされている。従って、増
幅標的及び増幅標準ＤＮＡセグメントはプローブハイブ
リダイゼーション部位を提供する同一の内部セグメント
を含み、これにより各プライマーペアーに関して、この
オリゴヌクレオチドプローブは増幅標的及び増幅標準Ｄ
ＮＡを検出するために有用である。
マー列を内標準プラスミドの中の５′プライマー列と
３′プライマー列の間に挿入せしめた。この第３オリゴ
ヌクレオチド列は一連の合成配列を含んで成る。その中
には５′及び３′プライマーペアーを含むプラスミドに
関する各ＲＮＡに相等する配列が存在する。この列は、
定量すべきそれぞれの標的ＲＮＡのため、この増幅生成
物がその中にこの第３オリゴヌクレオチド列の一部と同
一の配列を含むようにデザインされている。従って、増
幅標的及び増幅標準ＤＮＡセグメントはプローブハイブ
リダイゼーション部位を提供する同一の内部セグメント
を含み、これにより各プライマーペアーに関して、この
オリゴヌクレオチドプローブは増幅標的及び増幅標準Ｄ
ＮＡを検出するために有用である。
【００４１】第３オリゴヌクレオチド列がこの標準プラ
スミドの中に含まれている場合、このＰＣＲ反応は標識
の利用なしで実施できる。各標準及び標的鋳型に関し
て、逆転写並びに増幅反応は共増幅よりもむしろ別々の
試験管内において実施することが好適である。増幅の
後、生成物の量は、該第プライマー列により付与される
内部配列に相当する配列を有す一本鎖オリゴヌクレオチ
ドを採用するドットプロットフォーマットの利用により
定量される。
スミドの中に含まれている場合、このＰＣＲ反応は標識
の利用なしで実施できる。各標準及び標的鋳型に関し
て、逆転写並びに増幅反応は共増幅よりもむしろ別々の
試験管内において実施することが好適である。増幅の
後、生成物の量は、該第プライマー列により付与される
内部配列に相当する配列を有す一本鎖オリゴヌクレオチ
ドを採用するドットプロットフォーマットの利用により
定量される。
【００４２】本発明の実施例に示す通り、ヒトマクロフ
ァージのリポ多糖（ＬＰＳ）誘発及びコントロール培養
物から単離したＩＬ−１αｍＲＮＡを含む複数のリンホ
カインｍＲＮＡの量を測定するために、ＡＷ１０８内標
準品を利用する。リンホカインｍＲＮＡレベルはヒトア
テローム斑組織（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃｐｌ
ａｑｕｅ ｔｉｓｓｕｅ）においても測定した。
ァージのリポ多糖（ＬＰＳ）誘発及びコントロール培養
物から単離したＩＬ−１αｍＲＮＡを含む複数のリンホ
カインｍＲＮＡの量を測定するために、ＡＷ１０８内標
準品を利用する。リンホカインｍＲＮＡレベルはヒトア
テローム斑組織（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃｐｌ
ａｑｕｅ ｔｉｓｓｕｅ）においても測定した。
【００４３】本発明により提供される通り、標的ｍＲＮ
Ａは内標準品であってある程該標的自体と同一の配列を
有するものを利用することによって最も正確に定量され
る。内標準品として無関係な鋳型を用いるＰＣＲ増幅に
よるｍＲＮＡ配列の定量は比較データーのみを提供し、
その理由はこの標準と標的ｍＲＮＡに関するプライマー
ペアーの効率性における相違にある。これは増幅工程に
おいて固有であり、その理由はＰＣＲ増幅は指数的な工
程であるからである。増幅（Ｎ）の程度は式：Ｎ＝Ｎｏ
（１＋ｅｆｆ）n で得られ、ここで式中Ｎｏは材料の初
期量、ｅｆｆは効率、そしてｎは周期の回数である。従
って、効率における小さな相違はＰＣＲ生成物における
大きな相違ももたらし、そして生物学試料中の存在する
鋳型の量の誤認を招く。更にプライマー効率における相
違は定量分析のための、調節が困難なパラメーターであ
る。本発明はこの問題を解決する。
Ａは内標準品であってある程該標的自体と同一の配列を
有するものを利用することによって最も正確に定量され
る。内標準品として無関係な鋳型を用いるＰＣＲ増幅に
よるｍＲＮＡ配列の定量は比較データーのみを提供し、
その理由はこの標準と標的ｍＲＮＡに関するプライマー
ペアーの効率性における相違にある。これは増幅工程に
おいて固有であり、その理由はＰＣＲ増幅は指数的な工
程であるからである。増幅（Ｎ）の程度は式：Ｎ＝Ｎｏ
（１＋ｅｆｆ）n で得られ、ここで式中Ｎｏは材料の初
期量、ｅｆｆは効率、そしてｎは周期の回数である。従
って、効率における小さな相違はＰＣＲ生成物における
大きな相違ももたらし、そして生物学試料中の存在する
鋳型の量の誤認を招く。更にプライマー効率における相
違は定量分析のための、調節が困難なパラメーターであ
る。本発明はこの問題を解決する。
【００４４】核酸セグメントの正確な定量におけるプラ
イマー効率の有意な効果は以降の実施例に示した。ＡＷ
１０８ｃＲＮＡを複数の異なるプライマーセットのＰＣ
Ｒ増幅のための鋳型として利用した。これら異なるプラ
イマーセットによる、同一ＰＲＣ条件のもとでの増幅の
効率は数段の桁の範囲にわたって変化した。本発明はＰ
ＣＲによるいかなる定量的なｍＲＮＡの発現の試みに明
らかに重要であるこのような問題に向けられており、そ
して標的ｍＲＮＡ及び内標準ｃＲＮＡに関する同一のプ
ライマーの利用によってプライマー効率の問題を解決す
る。
イマー効率の有意な効果は以降の実施例に示した。ＡＷ
１０８ｃＲＮＡを複数の異なるプライマーセットのＰＣ
Ｒ増幅のための鋳型として利用した。これら異なるプラ
イマーセットによる、同一ＰＲＣ条件のもとでの増幅の
効率は数段の桁の範囲にわたって変化した。本発明はＰ
ＣＲによるいかなる定量的なｍＲＮＡの発現の試みに明
らかに重要であるこのような問題に向けられており、そ
して標的ｍＲＮＡ及び内標準ｃＲＮＡに関する同一のプ
ライマーの利用によってプライマー効率の問題を解決す
る。
【００４５】本発明は、核酸の標準及び標的セグメント
の増幅を同一の反応において実施することを必要とす
る。本発明の好ましい態様において、標準ｃＲＮＡ及び
標的ｍＲＮＡの逆転写酵素反応も同一の反応において実
施する。標的核酸は、標準及び標的逆転写酵素反応並び
に増幅反応を別々に行なうことにより定量できることを
当業者は過去の実績から理解できるであろう。しかしな
がら、このような方法の精度は、逆転写及び増幅の段階
が両方の増幅のために類似の効率により行なわれること
の度合に依存する。同一の試験内において両方の逆転写
酵素反応を行うこと及び同一の反応試験管内において両
方の増幅反応を行うことにより、優れた精度が保証され
る。
の増幅を同一の反応において実施することを必要とす
る。本発明の好ましい態様において、標準ｃＲＮＡ及び
標的ｍＲＮＡの逆転写酵素反応も同一の反応において実
施する。標的核酸は、標準及び標的逆転写酵素反応並び
に増幅反応を別々に行なうことにより定量できることを
当業者は過去の実績から理解できるであろう。しかしな
がら、このような方法の精度は、逆転写及び増幅の段階
が両方の増幅のために類似の効率により行なわれること
の度合に依存する。同一の試験内において両方の逆転写
酵素反応を行うこと及び同一の反応試験管内において両
方の増幅反応を行うことにより、優れた精度が保証され
る。
【００４６】与えられた試料中の増幅ＤＮＡフラグメン
トの量は増幅効率に影響を及ぼす。高い鋳型濃度を利用
する場合（又はＰＣＲ増幅の結果として起こる高い濃
度）、効率的な増幅に関する制限要因である現象が生ず
ことがある。このような現象には、酵素の基質飽和、酵
素の阻害生成物、不完全な生成物鎖の分離及び生成物鎖
の再アニール化が含まれる。しかしながらこの問題は、
一定の範囲の周期回数にわたり指数的な増幅を提供する
濃度の範囲を見い出すための、特定の標的ｍＲＮＡの初
期滴定により容易に解決される。従って、本発明を用い
る特定のｍＲＮＡの信頼できる定量評価を得るため、標
準及び標的鋳型の両方に関する濃度の範囲、並びに増幅
周期の回数は、この反応が指数期であり続けるような範
囲とするべきである。
トの量は増幅効率に影響を及ぼす。高い鋳型濃度を利用
する場合（又はＰＣＲ増幅の結果として起こる高い濃
度）、効率的な増幅に関する制限要因である現象が生ず
ことがある。このような現象には、酵素の基質飽和、酵
素の阻害生成物、不完全な生成物鎖の分離及び生成物鎖
の再アニール化が含まれる。しかしながらこの問題は、
一定の範囲の周期回数にわたり指数的な増幅を提供する
濃度の範囲を見い出すための、特定の標的ｍＲＮＡの初
期滴定により容易に解決される。従って、本発明を用い
る特定のｍＲＮＡの信頼できる定量評価を得るため、標
準及び標的鋳型の両方に関する濃度の範囲、並びに増幅
周期の回数は、この反応が指数期であり続けるような範
囲とするべきである。
【００４７】従って好ましい態様において、この反応条
件は５０ng〜１μｇの全細胞ＲＮＡと約２×１０2 〜２
×１０7 個のｃＲＮＡの分子を利用する。５０pg程度の
細胞ＲＮＡも本発明の目的のために適切である。詳細す
る実施例においては、１×１０4 個の分子程度の少ない
ＩＬ−１αが検出された。本発明の方法を採用するため
にｍＲＮＡを全ＲＮＡ調製物から精製する必要はない。
件は５０ng〜１μｇの全細胞ＲＮＡと約２×１０2 〜２
×１０7 個のｃＲＮＡの分子を利用する。５０pg程度の
細胞ＲＮＡも本発明の目的のために適切である。詳細す
る実施例においては、１×１０4 個の分子程度の少ない
ＩＬ−１αが検出された。本発明の方法を採用するため
にｍＲＮＡを全ＲＮＡ調製物から精製する必要はない。
【００４８】本方法によって分析されるために適する試
料はヒト又は非ヒト由来でありうる；それらは培養試
料、又は切除組織もしくは免疫学的に定義された表現型
の細胞から単離したものでありうる。この後者は、酵素
解離細胞のモノクローナル抗体染色及び蛍光−活性化セ
ルソーター（ＦＡＣＳ）単離又は免疫組織学染色スライ
ドから特定領域の採取により得ることができる。これは
特定のｍＲＮＡを製造する細胞タイプの信頼できる同定
を可能にするであろう。
料はヒト又は非ヒト由来でありうる；それらは培養試
料、又は切除組織もしくは免疫学的に定義された表現型
の細胞から単離したものでありうる。この後者は、酵素
解離細胞のモノクローナル抗体染色及び蛍光−活性化セ
ルソーター（ＦＡＣＳ）単離又は免疫組織学染色スライ
ドから特定領域の採取により得ることができる。これは
特定のｍＲＮＡを製造する細胞タイプの信頼できる同定
を可能にするであろう。
【００４９】本発明の方法において作られる増幅ＤＮＡ
の量は種々の方法により測定できる。例えば標識プライ
マーであって任意のプライマーペアーの１方もしくは両
方の構成員が標識されているもの、又は標識ヌクレオチ
ドがＰＣＲにおいて利用でき、そしてこの標識物の一体
化を測定することによって増幅ＤＮＡの量が決定でき
る。この標識はアイトープ又はアイソトープでないこと
ができる。他方、増幅生成物の量は電気泳動及びこの増
幅生成物の染色又は標識プローブとのハイブリダイゼー
ションによる識別化によって決定できる。染色ゲルに基
づく生成物の量の計算のためにはデンシロメーターが利
用でき、標識プローブを用いる場合はオートラジオグラ
フからの外挿による。標識プローブを用いる場合、この
プローブは増幅生成物よりも過剰において存在させるべ
きである。本発明の１つの態様において、プライマーを
アイソトープにより標識せしめ、そして得られる増幅生
成物をアクリルアミドゲル上で電気泳動させる。この生
成物が移動したと予測される領域を切り出し、そして存
在する標識量をセレンコブ（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ）カウン
ティングにより測定する。存在する標識量を既知の出発
材料の量に対してプロットする。
の量は種々の方法により測定できる。例えば標識プライ
マーであって任意のプライマーペアーの１方もしくは両
方の構成員が標識されているもの、又は標識ヌクレオチ
ドがＰＣＲにおいて利用でき、そしてこの標識物の一体
化を測定することによって増幅ＤＮＡの量が決定でき
る。この標識はアイトープ又はアイソトープでないこと
ができる。他方、増幅生成物の量は電気泳動及びこの増
幅生成物の染色又は標識プローブとのハイブリダイゼー
ションによる識別化によって決定できる。染色ゲルに基
づく生成物の量の計算のためにはデンシロメーターが利
用でき、標識プローブを用いる場合はオートラジオグラ
フからの外挿による。標識プローブを用いる場合、この
プローブは増幅生成物よりも過剰において存在させるべ
きである。本発明の１つの態様において、プライマーを
アイソトープにより標識せしめ、そして得られる増幅生
成物をアクリルアミドゲル上で電気泳動させる。この生
成物が移動したと予測される領域を切り出し、そして存
在する標識量をセレンコブ（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ）カウン
ティングにより測定する。存在する標識量を既知の出発
材料の量に対してプロットする。
【００５０】本発明の方法は、単一のポリメラーゼ連鎖
反応において製造される鋳型及び標準セグメントの増幅
した量を測定することを必要とする。従って本方法は、
増幅鋳型セグメントを増幅標準セグメントと区別するこ
とを必要とする。もしそれらのセグメントのサイズが異
なる場合、増幅セグメントを互いに区別することは比較
的容易である。即ち、この増幅生成物はゲル電気泳動に
より容易に分離できる。しかしながら、本発明はそれら
の増幅生成物が異なるサイズであることを必要とせず、
なぜなら１方の増幅セグメントをその他から区別するた
めのその他の方法が利用できるからである。例えば、一
方のセグメントに特異的な内部プローブを、他方のセグ
メントに特異的な内部プローブと異なって標識せしめる
ことができる。
反応において製造される鋳型及び標準セグメントの増幅
した量を測定することを必要とする。従って本方法は、
増幅鋳型セグメントを増幅標準セグメントと区別するこ
とを必要とする。もしそれらのセグメントのサイズが異
なる場合、増幅セグメントを互いに区別することは比較
的容易である。即ち、この増幅生成物はゲル電気泳動に
より容易に分離できる。しかしながら、本発明はそれら
の増幅生成物が異なるサイズであることを必要とせず、
なぜなら１方の増幅セグメントをその他から区別するた
めのその他の方法が利用できるからである。例えば、一
方のセグメントに特異的な内部プローブを、他方のセグ
メントに特異的な内部プローブと異なって標識せしめる
ことができる。
【００５１】本明細書に詳細の定量方法はインビボ生物
学試料の分析に有用である。以降の実施例に示す通り、
ヒトアテローマ障害対正常血管におけるＰＤＧＦ−Ａ及
び−Ｂ鎖ｍＲＮＡの定量ＰＣＲ分析は、インビボでの細
胞及び組織の生態学の研究においてこの手法の感度を強
調せしめた。例えば、本方法をアテローマ硬化症組織に
おけるＩＬ−１α及びＩＬ−１βのｍＲＮＡの測定のた
めに用いる場合、この結果は疾病の病原において炎症性
又は免疫学的因子が存在しうることを示唆した。
学試料の分析に有用である。以降の実施例に示す通り、
ヒトアテローマ障害対正常血管におけるＰＤＧＦ−Ａ及
び−Ｂ鎖ｍＲＮＡの定量ＰＣＲ分析は、インビボでの細
胞及び組織の生態学の研究においてこの手法の感度を強
調せしめた。例えば、本方法をアテローマ硬化症組織に
おけるＩＬ−１α及びＩＬ−１βのｍＲＮＡの測定のた
めに用いる場合、この結果は疾病の病原において炎症性
又は免疫学的因子が存在しうることを示唆した。
【００５２】その高感度性、速さ及び正確度に基づき、
本定量的ＰＣＲ方法は従来可能であったものよりもより
広範囲にわたる方法において、遺伝子の発現のための研
究に利用されることができ、インビボ起源例えば生検由
来の非常に少ない細胞数及び非常に少量の組織試料から
の遺伝子発現の定量的な測定を可能にする。この技術
は、例えば感染疾患症状、癌、代謝性疾患者及び自己免
疫疾患の診断及び分析に有用でありうる、特定のＲＮＡ
分子の発現レベルにおける変化に基づく情報も提供でき
る。
本定量的ＰＣＲ方法は従来可能であったものよりもより
広範囲にわたる方法において、遺伝子の発現のための研
究に利用されることができ、インビボ起源例えば生検由
来の非常に少ない細胞数及び非常に少量の組織試料から
の遺伝子発現の定量的な測定を可能にする。この技術
は、例えば感染疾患症状、癌、代謝性疾患者及び自己免
疫疾患の診断及び分析に有用でありうる、特定のＲＮＡ
分子の発現レベルにおける変化に基づく情報も提供でき
る。
【００５３】本発明の方法が、試料中の１もしくは数種
の核酸の定量のためのキットとして商品化を受けること
ができることが当業者に明らかであろう。例えば、その
最も簡単な態様において、このようなキットは内標準品
及び適切なオリゴヌクレオチドプライマーペアーが付与
されている。その他の態様において、キットは内標準
品、適切なオリゴヌクレオチドプライマーペアー、ＤＮ
Ａポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ヌ
クレオチド三リン酸、制限酵素、緩衝剤を、ｃＲＮＡ及
びｃＤＮＡ合成、制限酵素分解、並びにＰＣＲによる増
幅のために含んでよい。更に、キットは重合の試薬とし
て熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばサーマス アク
アティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由
来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼＴａｑを含んでよい。
本発明の方法を以下に例示するが、本発明は広範囲の用
途に有用であり、以下の実施例に何らその範囲の限定が
されることはない。
の核酸の定量のためのキットとして商品化を受けること
ができることが当業者に明らかであろう。例えば、その
最も簡単な態様において、このようなキットは内標準品
及び適切なオリゴヌクレオチドプライマーペアーが付与
されている。その他の態様において、キットは内標準
品、適切なオリゴヌクレオチドプライマーペアー、ＤＮ
Ａポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ヌ
クレオチド三リン酸、制限酵素、緩衝剤を、ｃＲＮＡ及
びｃＤＮＡ合成、制限酵素分解、並びにＰＣＲによる増
幅のために含んでよい。更に、キットは重合の試薬とし
て熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばサーマス アク
アティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由
来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼＴａｑを含んでよい。
本発明の方法を以下に例示するが、本発明は広範囲の用
途に有用であり、以下の実施例に何らその範囲の限定が
されることはない。
【００５４】
【実施例】実施例１ 方 法 Ａ．内標準品及びＲＮＡの調製 オリゴヌクレオチド重複伸長及びＰＣＲによる増幅の技
術を利用して合成遺伝子を作製した。利用する方法は位
置特異的突然変異誘発において利用されるＨｏらにより
詳細の方法と類似した（Ｈｏら、１９８９，Ｇｅｎｅ
７７：５１−５９）。作製後、この合成遺伝子を、Ｔ７
ポリメラーゼプロモーター及びポリアデニル化配列を含
むオカヤマ−バーグ（Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ）ベク
ターにサブクローン化せしめた。得られるプラスミド、
ＡＷ１０８を図１に示す。このプラスミドを、Ｔ７ポリ
メラーゼによる（その製造者（Promega Biotec, Madiso
n,Wisconsin）の転写プロトコールに従って）転写のた
めの鋳型として利用した。得られるＡＷ１０８ｃＲＮＡ
生成物をオリゴ（ｄＴ）クロマトグラフィー及びゲル電
気泳動により精製した。他方、ｐＡＷ１０９をｃＲＮＡ
鎖の調製のために利用した。このｃＲＮＡ生成物をキア
ゲン−チップ（Ｑｉｕｇｅｎ−ｔｉｐ）システム（Qiag
en Inc., Studio City, California）を用いた選別溶
出、その後のオリゴ（ｄＴ）クロマトグラフィーにより
精製した。ＲＮＡの精製及びＲＮＡ転写物の追い出しの
ため、キアゲン−チップをその製造者の仕様書に従って
利用した。
術を利用して合成遺伝子を作製した。利用する方法は位
置特異的突然変異誘発において利用されるＨｏらにより
詳細の方法と類似した（Ｈｏら、１９８９，Ｇｅｎｅ
７７：５１−５９）。作製後、この合成遺伝子を、Ｔ７
ポリメラーゼプロモーター及びポリアデニル化配列を含
むオカヤマ−バーグ（Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ）ベク
ターにサブクローン化せしめた。得られるプラスミド、
ＡＷ１０８を図１に示す。このプラスミドを、Ｔ７ポリ
メラーゼによる（その製造者（Promega Biotec, Madiso
n,Wisconsin）の転写プロトコールに従って）転写のた
めの鋳型として利用した。得られるＡＷ１０８ｃＲＮＡ
生成物をオリゴ（ｄＴ）クロマトグラフィー及びゲル電
気泳動により精製した。他方、ｐＡＷ１０９をｃＲＮＡ
鎖の調製のために利用した。このｃＲＮＡ生成物をキア
ゲン−チップ（Ｑｉｕｇｅｎ−ｔｉｐ）システム（Qiag
en Inc., Studio City, California）を用いた選別溶
出、その後のオリゴ（ｄＴ）クロマトグラフィーにより
精製した。ＲＮＡの精製及びＲＮＡ転写物の追い出しの
ため、キアゲン−チップをその製造者の仕様書に従って
利用した。
【００５５】ＡＷ１０８ｃＲＮＡ又はＡＷ１０９ｃＲＮ
Ａのいづれのため、この精製ｃＲＮＡを２６０nmで吸光
度を測定することによって定量した。存在している分子
の数は、転写物の分子量に基づいて決定した。ＡＷ１０
８ｃＲＮＡは１０２６個のヌクレオチドの長さであり、
従って１モル＝３．３８６×１０5 gm（１０２６×３３
０）である。従って、３．３８６×１０5 gmは６×１０
23個のｃＲＮＡ分子を含む。１pgのＡＷ１０８ｃＲＮＡ
中の分子の数は（６×１０23）／（３．３８６×１０5
gm）＝１．７７×１０6 個である。
Ａのいづれのため、この精製ｃＲＮＡを２６０nmで吸光
度を測定することによって定量した。存在している分子
の数は、転写物の分子量に基づいて決定した。ＡＷ１０
８ｃＲＮＡは１０２６個のヌクレオチドの長さであり、
従って１モル＝３．３８６×１０5 gm（１０２６×３３
０）である。従って、３．３８６×１０5 gmは６×１０
23個のｃＲＮＡ分子を含む。１pgのＡＷ１０８ｃＲＮＡ
中の分子の数は（６×１０23）／（３．３８６×１０5
gm）＝１．７７×１０6 個である。
【００５６】全細胞ＲＮＡをChomczynski ら、1987, An
alyt. Biochem. 162 : 156-156に従って、酸性グアニジ
ウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出
法によりマクロファージ及び組織から単離した。
alyt. Biochem. 162 : 156-156に従って、酸性グアニジ
ウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出
法によりマクロファージ及び組織から単離した。
【００５７】Ｂ．ゲル電気泳動によるｃＲＮＡの精製 ＰＡＷ１０８から調製したｃＲＮＡをＴＢＥ緩衝液中
で、高純度の１％低融点アガロースにおいて電気泳動さ
せた。１kbに相当するゲルの領域をゲルから切り出し、
そして１mMの２−ＭＥを含む０．１ＭのＮＥＴＳ緩衝液
（０．１ＭのＮａＣｌ，０．０１ＭのＥＤＴＡ；０．０
１Ｍのトリス−ＨＣｌ，pH７．４；０．２％のＳＤＳ）
０．２〜０．４mlに、９５℃の湯浴中で３〜５分間にわ
たり溶かし、そしてアイスバケットの中です早く固形化
せしめた。この試料を次に−７０℃で少なくとも２時間
凍結させた。
で、高純度の１％低融点アガロースにおいて電気泳動さ
せた。１kbに相当するゲルの領域をゲルから切り出し、
そして１mMの２−ＭＥを含む０．１ＭのＮＥＴＳ緩衝液
（０．１ＭのＮａＣｌ，０．０１ＭのＥＤＴＡ；０．０
１Ｍのトリス−ＨＣｌ，pH７．４；０．２％のＳＤＳ）
０．２〜０．４mlに、９５℃の湯浴中で３〜５分間にわ
たり溶かし、そしてアイスバケットの中です早く固形化
せしめた。この試料を次に−７０℃で少なくとも２時間
凍結させた。
【００５８】この溶融アガロースの凍結試料を次に３７
℃で融解させ、そして低温室内に置かれたエッペンドル
フ遠心機において最高速度で遠心せしめた。この上清液
を他のエンペンドルフ試験管に移し、そして１％のイソ
アミルアルコールを含む１００μｌのフェノールクロロ
ホルムの混合物により抽出せしめた。このフェノールは
０．１％のＮＥＴＳ緩衝液により飽和されている。この
水性相を集め、そしてＲＮＡをエタノール沈澱させた。
このＲＮＡペレットを２ＭのＬｉＣｌ ０．１mlその後
０．１mlのエタノールにより洗浄した。このＲＮＡを乾
燥させ、その後適量の除菌蒸留水（２〜１００μｌ）に
溶解し、そして逆転写のために準備された。
℃で融解させ、そして低温室内に置かれたエッペンドル
フ遠心機において最高速度で遠心せしめた。この上清液
を他のエンペンドルフ試験管に移し、そして１％のイソ
アミルアルコールを含む１００μｌのフェノールクロロ
ホルムの混合物により抽出せしめた。このフェノールは
０．１％のＮＥＴＳ緩衝液により飽和されている。この
水性相を集め、そしてＲＮＡをエタノール沈澱させた。
このＲＮＡペレットを２ＭのＬｉＣｌ ０．１mlその後
０．１mlのエタノールにより洗浄した。このＲＮＡを乾
燥させ、その後適量の除菌蒸留水（２〜１００μｌ）に
溶解し、そして逆転写のために準備された。
【００５９】Ｃ．増幅のために利用したオリゴヌクレオ
チド オリゴヌクレオチドはバイオサーチ（San Rafael, Cali
fornia）ＤＮＡ合成装置のもとで合成した。ほとんどの
プライマーはＲＮＡ−特異性プライマーである。５′プ
ライマーは最初の２つのエキソンの結合部にまたがり、
そして３′プライマーは次の２つのエキソンの結合部に
またがる。他方、この５′プライマーは第１及び第２エ
キソンの結合部にまたがり、そしてこの３′プライマー
は第２及び第３エキソンの結合部にまたがる。これらの
配列に関連する遺伝子、及びプライマーを用いて得られ
る増幅生成物を表Ｉに示した。
チド オリゴヌクレオチドはバイオサーチ（San Rafael, Cali
fornia）ＤＮＡ合成装置のもとで合成した。ほとんどの
プライマーはＲＮＡ−特異性プライマーである。５′プ
ライマーは最初の２つのエキソンの結合部にまたがり、
そして３′プライマーは次の２つのエキソンの結合部に
またがる。他方、この５′プライマーは第１及び第２エ
キソンの結合部にまたがり、そしてこの３′プライマー
は第２及び第３エキソンの結合部にまたがる。これらの
配列に関連する遺伝子、及びプライマーを用いて得られ
る増幅生成物を表Ｉに示した。
【００６０】Ｄ．ｃＤＮＡの調製 既に詳細の方法により（Gerard, 1987, Focus (Bethesd
a Research Labs) 9 :5を参照のこと）、ＲＮＡをｃＤ
ＮＡへと逆転写させた。１μｇの全細胞ＲＮＡ、１．７
７×１０2 〜１．７７×１０6 個のＡＷ１０８ｃＲＮＡ
の分子、１×ＰＣＲ緩衝液（２０mMのトリス−ＨＣｌ，
pH８．０，５０mMのＫＣＬ，２mMのＭｇＣｌ2 ，１００
μｇ／mlのＢＳＡ）、１mMのＤＴＴ，０．５mMのｄＮＴ
Ｐ，１０ユニットのRNasin (Promega Biotec, Madison,
Wisconsin) ，０．１μｇのオリゴ（ｄＴ）１２〜１８
及び１００ユニットのＢＲＬモロニー（Ｍｏｌｏｎｅ
ｙ）ＭｕＬＶ逆転写酵素（Bethesda Research Laborato
ries, Bethesda, Marlyland)を含む逆転写反応体１０μ
ｌを調製した。この反応体を３７℃で６０分間インキュ
ベートし、９５℃で５〜１０分間加熱し、次いで氷の上
で冷却せしめた。
a Research Labs) 9 :5を参照のこと）、ＲＮＡをｃＤ
ＮＡへと逆転写させた。１μｇの全細胞ＲＮＡ、１．７
７×１０2 〜１．７７×１０6 個のＡＷ１０８ｃＲＮＡ
の分子、１×ＰＣＲ緩衝液（２０mMのトリス−ＨＣｌ，
pH８．０，５０mMのＫＣＬ，２mMのＭｇＣｌ2 ，１００
μｇ／mlのＢＳＡ）、１mMのＤＴＴ，０．５mMのｄＮＴ
Ｐ，１０ユニットのRNasin (Promega Biotec, Madison,
Wisconsin) ，０．１μｇのオリゴ（ｄＴ）１２〜１８
及び１００ユニットのＢＲＬモロニー（Ｍｏｌｏｎｅ
ｙ）ＭｕＬＶ逆転写酵素（Bethesda Research Laborato
ries, Bethesda, Marlyland)を含む逆転写反応体１０μ
ｌを調製した。この反応体を３７℃で６０分間インキュ
ベートし、９５℃で５〜１０分間加熱し、次いで氷の上
で冷却せしめた。
【００６１】Ｅ．増幅工程 このｃＤＮＡ反応混合物の１／１０を０．１μｇ／μｌ
のｔＲＮＡによって３倍希釈系列において希釈し、その
後総容量５０μｌにおける最終濃度１×ＰＣＲ緩衝液、
５０μＭのｄＮＴＰ，０．１μＭの各５′及び３′プラ
イマー、１×１０6 cpm の32Ｐ末端標識化プライマー並
び１ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-E
lmer Cetus, Norwalk, Connecticut）に調整した。蒸発
を防ぐためにこの混合物上１００μｌの鉱油を載せ、そ
の後パーキン−エルマーシータス−サーマル サイクラ
ー（Perkin-Elmer Cetus Thermal Cycler)を用いて２５
周期にわたり増幅せしめた。他方、上記と同一の条件を
用い、周期の回数を変えながら、このｃＤＮＡ反応混合
物の１／１０を増幅せしめた。この増幅方法は９５℃で
３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のプライマーのアニ
ール化、そして７２℃で１分間の伸長を含む。オリゴヌ
クレオチド又はポリヌクレオチドキナーゼを用いること
によってγ−32Ｐ−ＡＴＰにより標識せしめ、そして一
体化されなかったヌクレオチドはバイオ−ゲル（Ｂｉｏ
−Ｇｅｌ）Ｐ−４カラムによって除去した。
のｔＲＮＡによって３倍希釈系列において希釈し、その
後総容量５０μｌにおける最終濃度１×ＰＣＲ緩衝液、
５０μＭのｄＮＴＰ，０．１μＭの各５′及び３′プラ
イマー、１×１０6 cpm の32Ｐ末端標識化プライマー並
び１ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-E
lmer Cetus, Norwalk, Connecticut）に調整した。蒸発
を防ぐためにこの混合物上１００μｌの鉱油を載せ、そ
の後パーキン−エルマーシータス−サーマル サイクラ
ー（Perkin-Elmer Cetus Thermal Cycler)を用いて２５
周期にわたり増幅せしめた。他方、上記と同一の条件を
用い、周期の回数を変えながら、このｃＤＮＡ反応混合
物の１／１０を増幅せしめた。この増幅方法は９５℃で
３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のプライマーのアニ
ール化、そして７２℃で１分間の伸長を含む。オリゴヌ
クレオチド又はポリヌクレオチドキナーゼを用いること
によってγ−32Ｐ−ＡＴＰにより標識せしめ、そして一
体化されなかったヌクレオチドはバイオ−ゲル（Ｂｉｏ
−Ｇｅｌ）Ｐ−４カラムによって除去した。
【００６２】Ｆ．定量分析 １０μｌの各ＰＣＲ反応混合物を、トリス／ボレート／
ＥＤＴＡ緩衝液中で８％のポリアクリルアミドゲルにお
いて電気泳動させた。ゲルを臭化エチジウムにより染色
し、そしてＵＶ−光照射のもとで写真撮影した。適切な
バンドをこのゲルから取り出し、そしてセレンコブ カ
ウンティング（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ ｃｏｕｎｔｉｎｇ）
により放射活性を測定した。切り出したゲルバンドから
回収される放射活性の値を該鋳型濃度に対してプロット
した。データーはスライド−ライトプラスプログラム
（Slide-Write Plus program)(Advanced Graphics Soft
ware）による指数曲線フィッティングによりプロットし
た。標的ｍＲＮＡの量はＡＷ１０８ｃＲＮＡ内標準曲線
に対する外挿によって定量した。
ＥＤＴＡ緩衝液中で８％のポリアクリルアミドゲルにお
いて電気泳動させた。ゲルを臭化エチジウムにより染色
し、そしてＵＶ−光照射のもとで写真撮影した。適切な
バンドをこのゲルから取り出し、そしてセレンコブ カ
ウンティング（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ ｃｏｕｎｔｉｎｇ）
により放射活性を測定した。切り出したゲルバンドから
回収される放射活性の値を該鋳型濃度に対してプロット
した。データーはスライド−ライトプラスプログラム
（Slide-Write Plus program)(Advanced Graphics Soft
ware）による指数曲線フィッティングによりプロットし
た。標的ｍＲＮＡの量はＡＷ１０８ｃＲＮＡ内標準曲線
に対する外挿によって定量した。
【００６３】Ｇ．ノーザンブロット分析 ＲＮＡを、ホルムアルデヒドを含む１．５％のアガロー
スゲルにおいて電気泳動させ、そして２０×ＳＳＣ（１
×ＳＳＣは０．１５Ｍの塩化ナトリウム及び０．０１５
Ｍのクエン酸ナトリウムを含む）中でニトロセルロース
フィルターに移した。このブロットを、ml当り２×１０
6 cpm の32Ｐ−末端標識化オリゴヌクレオチドとハイブ
リダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、０．７５
ＭのＮａＣｌ，０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム、pH
７．０，２０mMのリン酸ナトリウム、pH７．０，５mMの
ＥＤＴＡ，ml当り２００μｇの酵母ＲＮＡ及び１％のサ
ルコシル（ｓａｒｋｏｓｙｌ）（ｓｉｍｇｍａ）中にお
いて５５℃で４時間にわたった。このブロットを１×Ｓ
ＳＣ中で５５℃、３０分間洗浄し、そして−７０℃にて
増感スクリーンによりオートラジオグラフせしめた。
スゲルにおいて電気泳動させ、そして２０×ＳＳＣ（１
×ＳＳＣは０．１５Ｍの塩化ナトリウム及び０．０１５
Ｍのクエン酸ナトリウムを含む）中でニトロセルロース
フィルターに移した。このブロットを、ml当り２×１０
6 cpm の32Ｐ−末端標識化オリゴヌクレオチドとハイブ
リダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、０．７５
ＭのＮａＣｌ，０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム、pH
７．０，２０mMのリン酸ナトリウム、pH７．０，５mMの
ＥＤＴＡ，ml当り２００μｇの酵母ＲＮＡ及び１％のサ
ルコシル（ｓａｒｋｏｓｙｌ）（ｓｉｍｇｍａ）中にお
いて５５℃で４時間にわたった。このブロットを１×Ｓ
ＳＣ中で５５℃、３０分間洗浄し、そして−７０℃にて
増感スクリーンによりオートラジオグラフせしめた。
【００６４】Ｈ．マクロファージ培養物 ヒト末梢血液単球を軟膜調製物から、フィコル／ヒパク
勾配遠心、その後の１時間にわたるプラスチックへの吸
着により単離した。次に吸着細胞を取り出し、そして２
％の仔牛血清及び２０００ユニット／mlの組換マクロフ
ァージ−コロニー刺激因子（Cetus Corporation, Emery
ville, California)の添加されたＲＰＭ１１６４０倍地
中において、６ウェルプレート上に１０6 細胞数／ウエ
ルで再培養せしめた。１０日後、この半分の培養物を５
μｇ／mlのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）により処理した。核酸
単離のために５時間後に全ての培養物を集収した。
勾配遠心、その後の１時間にわたるプラスチックへの吸
着により単離した。次に吸着細胞を取り出し、そして２
％の仔牛血清及び２０００ユニット／mlの組換マクロフ
ァージ−コロニー刺激因子（Cetus Corporation, Emery
ville, California)の添加されたＲＰＭ１１６４０倍地
中において、６ウェルプレート上に１０6 細胞数／ウエ
ルで再培養せしめた。１０日後、この半分の培養物を５
μｇ／mlのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）により処理した。核酸
単離のために５時間後に全ての培養物を集収した。
【００６５】Ｉ．ヒト組織試料 頸動脈試料を患者の同意の上で手術の際に採取した。組
織学的に正常な冠状動脈のＲＮＡを心臓移植受容者から
回収した。
織学的に正常な冠状動脈のＲＮＡを心臓移植受容者から
回収した。
【００６６】実施例２ ヒトマクロファージ全ＲＮＡの調製におけるＩＬ−１α
の定量 本方法の実施例として、ヒトマクロファージのＬＰＳ誘
発培養物から単離したＩＬ−１αｍＲＮＡの量を測定す
るためにＡＷ１０８内標準品を利用した。この分析を行
うために２通りのプロトコールを利用した。第１の場合
において、標準曲線を作製するために、鋳型及び標準ｍ
ＲＮＡの量を段階希釈によって変更せしめた。第２の場
合において、増幅周期数を変え、そしてＰＣＲ生成物の
量に対してプロットした。
の定量 本方法の実施例として、ヒトマクロファージのＬＰＳ誘
発培養物から単離したＩＬ−１αｍＲＮＡの量を測定す
るためにＡＷ１０８内標準品を利用した。この分析を行
うために２通りのプロトコールを利用した。第１の場合
において、標準曲線を作製するために、鋳型及び標準ｍ
ＲＮＡの量を段階希釈によって変更せしめた。第２の場
合において、増幅周期数を変え、そしてＰＣＲ生成物の
量に対してプロットした。
【００６７】Ａ．内標準品の量を変えることによるｍＲ
ＮＡの定量 ５０ngの全マクロファージＲＮＡと１．７７×１０6 個
のＡＷ１０８ｃＲＮＡ分子を混ぜ、その後ｃＤＮＡへと
逆転写させた。１／１０のこのｃＤＮＡ混合物の段階的
３倍希釈液を表１に挙げたＩＬ−１α特異性プライマー
を用いて増幅せしめた。約１×１０6 cpm の32Ｐ末端標
識化５′プライマーをこの増幅に含ませている。反応生
成物をゲル電気泳動により分離させ、そして臭化エチジ
ウム染色によって識別化させた（図２Ａ）。切り出した
バンドから日収される放射活性の値を鋳型濃度に対して
プロットした（図２Ｂ）。この実験において、標的ｍＲ
ＮＡ及びＡＷ１０８ｃＲＮＡを段階的３倍希釈の後に増
幅させ、そしてこの結果は、この方法が３倍以下のＲＮ
Ａ濃度における相違を分析できることを示唆した。ＡＷ
１０８ｃＲＮＡとＩＬ−１αｍＲＮＡ増幅の反応速度が
ＰＣＲ反応の指数期において同一である事実は、ＡＷ１
０８ｃＲＮＡについての標準曲線を作製し、そしてマク
ロファージ中のＩＬ−１αｍＲＮＡに関するコピー数に
対する外挿を可能にする。図２Ｂにおいて示す通り、１
ngのＬＰＳ−誘発マクロファージ全ＲＮＡと１×１０4
個のＡＷ１０８ｃＲＮＡの分子は同量のＩＬ−１αＰＣ
Ｒ生成物を提供した。言い換えるならば、１ngのＬＰＳ
誘発マクロファージＲＮＡは１×１０4 個のＩＬ−１α
ｍＲＮＡの分子を含む。
ＮＡの定量 ５０ngの全マクロファージＲＮＡと１．７７×１０6 個
のＡＷ１０８ｃＲＮＡ分子を混ぜ、その後ｃＤＮＡへと
逆転写させた。１／１０のこのｃＤＮＡ混合物の段階的
３倍希釈液を表１に挙げたＩＬ−１α特異性プライマー
を用いて増幅せしめた。約１×１０6 cpm の32Ｐ末端標
識化５′プライマーをこの増幅に含ませている。反応生
成物をゲル電気泳動により分離させ、そして臭化エチジ
ウム染色によって識別化させた（図２Ａ）。切り出した
バンドから日収される放射活性の値を鋳型濃度に対して
プロットした（図２Ｂ）。この実験において、標的ｍＲ
ＮＡ及びＡＷ１０８ｃＲＮＡを段階的３倍希釈の後に増
幅させ、そしてこの結果は、この方法が３倍以下のＲＮ
Ａ濃度における相違を分析できることを示唆した。ＡＷ
１０８ｃＲＮＡとＩＬ−１αｍＲＮＡ増幅の反応速度が
ＰＣＲ反応の指数期において同一である事実は、ＡＷ１
０８ｃＲＮＡについての標準曲線を作製し、そしてマク
ロファージ中のＩＬ−１αｍＲＮＡに関するコピー数に
対する外挿を可能にする。図２Ｂにおいて示す通り、１
ngのＬＰＳ−誘発マクロファージ全ＲＮＡと１×１０4
個のＡＷ１０８ｃＲＮＡの分子は同量のＩＬ−１αＰＣ
Ｒ生成物を提供した。言い換えるならば、１ngのＬＰＳ
誘発マクロファージＲＮＡは１×１０4 個のＩＬ−１α
ｍＲＮＡの分子を含む。
【００６８】Ｂ．増幅周期回数を変えることによるｍＲ
ＮＡの定量 ５００ngの全マクロファージＲＮＡを１．７７×１０6
個のＡＷ１０８ｃＲＮＡの分子により逆転写せしめた。
このｃＤＮＡ混合物の１／１０を含むアリコートのそれ
ぞれをプロトコールＥと同一の条件のもとで１４，１
６，１８，２０，２２，２４，２６又は２８周期の増幅
にかけた。切り出したバンドから日収される放射活性の
値を周期の回数の関数としてプロットした（図２Ｃ）。
増幅の速度は両方の鋳型に関して１４〜２２回の周期の
間にて指数的であった。２４，２６及び２８回の周期で
は、速度は劇的に減少しそしてプラトーに達した。増幅
の効率はこれらの曲線の傾きから求め、そしてＡＷ１０
８ｃＲＮＡ及びＩＬ−１αｍＲＮＡの両方に関して８８
％であることが分った。増幅効率は指数期において両方
の共増幅標的に関して同一であるため、ＩＬ−１αｍＲ
ＮＡの絶対値は
ＮＡの定量 ５００ngの全マクロファージＲＮＡを１．７７×１０6
個のＡＷ１０８ｃＲＮＡの分子により逆転写せしめた。
このｃＤＮＡ混合物の１／１０を含むアリコートのそれ
ぞれをプロトコールＥと同一の条件のもとで１４，１
６，１８，２０，２２，２４，２６又は２８周期の増幅
にかけた。切り出したバンドから日収される放射活性の
値を周期の回数の関数としてプロットした（図２Ｃ）。
増幅の速度は両方の鋳型に関して１４〜２２回の周期の
間にて指数的であった。２４，２６及び２８回の周期で
は、速度は劇的に減少しそしてプラトーに達した。増幅
の効率はこれらの曲線の傾きから求め、そしてＡＷ１０
８ｃＲＮＡ及びＩＬ−１αｍＲＮＡの両方に関して８８
％であることが分った。増幅効率は指数期において両方
の共増幅標的に関して同一であるため、ＩＬ−１αｍＲ
ＮＡの絶対値は
【００６９】
【数２】
【００７０】を採用して、ＡＷ１０８ｃＲＮＡ内標準品
との比較により求められうる（式中Ｎｏは材料の初期
量、そしてＮは増幅の程度である）。この方法により求
められる１ngのＬＰＳ誘発マクロファージ全ＲＮＡ中の
ＩＬ−１αｍＲＮＡの量は１．１×１０4 分子数であ
る。従って、この二通りの択一的な方法のいづれかを利
用する定量についての結果は同じであった。
との比較により求められうる（式中Ｎｏは材料の初期
量、そしてＮは増幅の程度である）。この方法により求
められる１ngのＬＰＳ誘発マクロファージ全ＲＮＡ中の
ＩＬ−１αｍＲＮＡの量は１．１×１０4 分子数であ
る。従って、この二通りの択一的な方法のいづれかを利
用する定量についての結果は同じであった。
【００７１】Ｃ．ＰＣＲ結果とノーザン分析との関係 定量的ＰＣＲ方法により測定されたＬＰＳ誘発マクロフ
ァージ中のＩＬ−１αｍＲＮＡの量をノーザンブロット
分析によって確認した。このＰＣＲ分析（上記参照）
は、１ngのマクロファージＲＮＡと１×１０4 個のＡＷ
１０８ｃＲＮＡ分子が同量のＩＬ−１αＰＣＲ生成物を
作り出すことを示した。マクロファージＲＮＡ及びＡＷ
１０８ｃＲＮＡの２倍段階希釈物を、ＩＬ−１α３′プ
ライマーによるプローブ化によるノーザンブロット分析
にかけた。標的ＲＮＡ分子のサイズは、マクロファージ
中のＩＬ−１αｍＲＮＡに関しては〜２，２００ヌクレ
オチド、そしてＡＷ１０８ｃＲＮＡに関しては１０２６
ヌクレオチドと予測される。図３において示す通り、マ
クロファージＲＮＡ及びＡＷ１０８ｃＲＮＡの全ての希
釈物にて同等の強さのハイブリダイゼーションシグナル
が検出された。この結果は、定量ＰＣＲ方法により予測
されたｍＲＮＡの量がノーザン分析の結果と相互関係を
有すことを示した。
ァージ中のＩＬ−１αｍＲＮＡの量をノーザンブロット
分析によって確認した。このＰＣＲ分析（上記参照）
は、１ngのマクロファージＲＮＡと１×１０4 個のＡＷ
１０８ｃＲＮＡ分子が同量のＩＬ−１αＰＣＲ生成物を
作り出すことを示した。マクロファージＲＮＡ及びＡＷ
１０８ｃＲＮＡの２倍段階希釈物を、ＩＬ−１α３′プ
ライマーによるプローブ化によるノーザンブロット分析
にかけた。標的ＲＮＡ分子のサイズは、マクロファージ
中のＩＬ−１αｍＲＮＡに関しては〜２，２００ヌクレ
オチド、そしてＡＷ１０８ｃＲＮＡに関しては１０２６
ヌクレオチドと予測される。図３において示す通り、マ
クロファージＲＮＡ及びＡＷ１０８ｃＲＮＡの全ての希
釈物にて同等の強さのハイブリダイゼーションシグナル
が検出された。この結果は、定量ＰＣＲ方法により予測
されたｍＲＮＡの量がノーザン分析の結果と相互関係を
有すことを示した。
【００７２】実施例３ プライマー効率の相違の効果 ＰＣＲ増幅の効率に影響することができる変異要因は多
数ある。容易にコントロールできるいくつかのパラメー
ターには鋳型、ｄＮＴＰ，ＭｇＣｌ2 、プライマー、ポ
リメラーゼの濃度及びＰＣＲ周期プロフィールが含まれ
る。しかしながら、プライマー効率における相違は定量
分析のための制御が困難なパラメーターである。定量Ｐ
ＣＲ方法におけるプライマー効率を分析するため、７種
のプライマーセット：ＩＬ−１β、ＰＤＧＦ−Ａ，ＰＤ
ＧＦ−Ｂ，ＰＤＧＦ−Ｒ，ＩＬ−２，ＬＰＬ及びａｐｏ
−ＥのＰＣＲ増幅のための鋳型としてＡＷ１０８ｃＲＮ
Ａを利用した。図４において示す通り、同一ＰＣＲ増幅
条件のもとでのこれら異なるプライマーセットによる増
幅の効率は、数段の桁の範囲にわたって変化した。例え
ばＩＬ−１βプライマーはａｐｏ−Ｅプライマーよりも
１０5 倍より効率的であった。従って、ＰＣＲによるｍ
ＲＮＡ発現性の定量のためあらゆる試みにおいて標的ｍ
ＲＮＡ及び内標準品の増幅のためには同一のプライマー
を利用することが重要である。
数ある。容易にコントロールできるいくつかのパラメー
ターには鋳型、ｄＮＴＰ，ＭｇＣｌ2 、プライマー、ポ
リメラーゼの濃度及びＰＣＲ周期プロフィールが含まれ
る。しかしながら、プライマー効率における相違は定量
分析のための制御が困難なパラメーターである。定量Ｐ
ＣＲ方法におけるプライマー効率を分析するため、７種
のプライマーセット：ＩＬ−１β、ＰＤＧＦ−Ａ，ＰＤ
ＧＦ−Ｂ，ＰＤＧＦ−Ｒ，ＩＬ−２，ＬＰＬ及びａｐｏ
−ＥのＰＣＲ増幅のための鋳型としてＡＷ１０８ｃＲＮ
Ａを利用した。図４において示す通り、同一ＰＣＲ増幅
条件のもとでのこれら異なるプライマーセットによる増
幅の効率は、数段の桁の範囲にわたって変化した。例え
ばＩＬ−１βプライマーはａｐｏ−Ｅプライマーよりも
１０5 倍より効率的であった。従って、ＰＣＲによるｍ
ＲＮＡ発現性の定量のためあらゆる試みにおいて標的ｍ
ＲＮＡ及び内標準品の増幅のためには同一のプライマー
を利用することが重要である。
【００７３】実施例４ 未処理及びＬＰＳ誘発マクロファージ中の特定のｍＲＮ
Ａの定量 本ＰＣＲ定量技術の主なる利点は、本方法が平行して複
数の標的ｍＲＮＡの種類の分析を可能にすることにあ
る。表III は、ＬＰＳ処理に応答したヒトマクロファー
ジ中の６種のサイトカインの発現レベルの定量からの結
果を示す。ＬＰＳ誘発後のＩＬ−１β及びＩＬ−１αｍ
ＲＮＡのレベルはおよそ５０倍上昇した。ＰＤＧＦ−
Ａ，Ｍ−ＣＳＦ及びＴＮＦに関するｍＲＮＡのレベルは
５〜１０倍上昇した。しかしながら、ＰＤＧＦ−ＢｍＲ
ＮＡのレベルはコントロールとＬＰＳ−処理細胞に関し
て一定であり続けた。各ｍＲＮＡの絶対量を測定したた
め、この手法はマイクログラム程度の全ＲＮＡを用い
て、休息中及び誘発状態の両方における転写表現型の詳
細な、且つ多面的な情況を提供する。
Ａの定量 本ＰＣＲ定量技術の主なる利点は、本方法が平行して複
数の標的ｍＲＮＡの種類の分析を可能にすることにあ
る。表III は、ＬＰＳ処理に応答したヒトマクロファー
ジ中の６種のサイトカインの発現レベルの定量からの結
果を示す。ＬＰＳ誘発後のＩＬ−１β及びＩＬ−１αｍ
ＲＮＡのレベルはおよそ５０倍上昇した。ＰＤＧＦ−
Ａ，Ｍ−ＣＳＦ及びＴＮＦに関するｍＲＮＡのレベルは
５〜１０倍上昇した。しかしながら、ＰＤＧＦ−ＢｍＲ
ＮＡのレベルはコントロールとＬＰＳ−処理細胞に関し
て一定であり続けた。各ｍＲＮＡの絶対量を測定したた
め、この手法はマイクログラム程度の全ＲＮＡを用い
て、休息中及び誘発状態の両方における転写表現型の詳
細な、且つ多面的な情況を提供する。
【００７４】 表 III ＬＰＳ誘発及び未誘発ヒトマクロファージ+ 中の 特定のｍＲＮＡレベル（分子数／細胞）* mRNAの種類 未誘発 誘発 誘発／未誘発 IL-1α 1.4 69 49 IL-1β 51 2,950 58 PDGF-A 0.05 0.48 10 PDGF-B 0.47 0.47 1 M-CSF 0.06 0.47 8 TNF 1.8 8.4 4.7 * 分子数／細胞＝分子数／μｇＲＮＡ（図２において計算の通り）×細胞当り単 離されたμｇＲＮＡ + 単球由来マクロファージを１０日間培養した。収集の５時間前に培養物の半分 を５μｇ／mlのＬＰＳにさらした。
【００７５】実施例５ 正常及びアテローマ硬化症ヒト血管の定量分析 少量の材料によってさえも本技術によって正確な定量結
果を得ることができるため、本発明は未処理な、又は限
られた量の試料、例えばインビボ由来生検断片の分析の
ための重要な手段である。例として、表IVはアテローマ
硬化症頸動脈及び正常頸動脈の、ヒト由来の６種のｍＲ
ＮＡの定量結果の比較を示す。これらのデーターはアテ
ローマ硬化症血管において、ＰＤＧＦ−Ａ及びＰＤＧＦ
−ＢｍＲＮＡのレベルにおいて３〜５倍の上昇を示し、
β型ＰＤＧＦリセプター（ＰＤＧＦ−Ｒ）においては変
化は示されず、そしてＬＤＬリセプターにおいて１／３
への減少を示した。疾病組織においてＩＬ−１α及びＩ
Ｌ−１αｍＲＮＡのレベルの上昇があった。
果を得ることができるため、本発明は未処理な、又は限
られた量の試料、例えばインビボ由来生検断片の分析の
ための重要な手段である。例として、表IVはアテローマ
硬化症頸動脈及び正常頸動脈の、ヒト由来の６種のｍＲ
ＮＡの定量結果の比較を示す。これらのデーターはアテ
ローマ硬化症血管において、ＰＤＧＦ−Ａ及びＰＤＧＦ
−ＢｍＲＮＡのレベルにおいて３〜５倍の上昇を示し、
β型ＰＤＧＦリセプター（ＰＤＧＦ−Ｒ）においては変
化は示されず、そしてＬＤＬリセプターにおいて１／３
への減少を示した。疾病組織においてＩＬ−１α及びＩ
Ｌ−１αｍＲＮＡのレベルの上昇があった。
【００７６】表 IV 正常及びアテローマ硬化症血管における特定のｍＲＮＡ
レベル（分子数／μｇ全ＲＮＡ）* mRNAの種類 アテローマ硬化症 正常 PDGF-A 1.8×105 3.３×104 PDGF-B 7.6×104 2.2 ×104 PDGF-C 1.1×104 1.4 ×104 LDL-R 4.0×103 1.３×104 IL-1α 1.0×102 ND+ IL-1β 6.4×104 1.0 ×102 * 図２において計算の通り+ ND、検出不能
レベル（分子数／μｇ全ＲＮＡ）* mRNAの種類 アテローマ硬化症 正常 PDGF-A 1.8×105 3.３×104 PDGF-B 7.6×104 2.2 ×104 PDGF-C 1.1×104 1.4 ×104 LDL-R 4.0×103 1.３×104 IL-1α 1.0×102 ND+ IL-1β 6.4×104 1.0 ×102 * 図２において計算の通り+ ND、検出不能
【００７７】分子生物学、医療診断技術、生化学、ウイ
ルス学、遺伝子学及び関連する分野における当業者によ
ってなされる本発明の態様のその他の改良は、添付する
請求の範囲に含まれるであろう。
ルス学、遺伝子学及び関連する分野における当業者によ
ってなされる本発明の態様のその他の改良は、添付する
請求の範囲に含まれるであろう。
【図１】図１はプラスミドＡＷ１０８及びＡＷ１０９に
並んだ、表Ｉの５′プライマー及び３′プライマーの位
置を示す。本発明に関連するその他の特徴も示した。
並んだ、表Ｉの５′プライマー及び３′プライマーの位
置を示す。本発明に関連するその他の特徴も示した。
【図２】図２Ａ−Ｃにおいて、リポ多糖（ＬＰＳ）誘発
及び未誘発マクロファージに存在するＩＬ−１αｍＲＮ
Ａの量はＩＬ−１αプライマーペアーを用いて測定して
いる。図２Ａは増幅化標準品及び標的ＤＮＡが識別でき
る臭化エチジウム染色アクリルアミドゲルを図示する。
図２Ｂは鋳型濃度に対して製造される、標準及び標的Ｉ
Ｌ−１αＰＣＲ生成物ＤＮＡの量をプロットしている。
図２Ｃは製造された標準及び鋳型ＩＬ−１αＰＣＲ生成
物ＤＮＡ、対、増幅周期の回数をプロットしている。
及び未誘発マクロファージに存在するＩＬ−１αｍＲＮ
Ａの量はＩＬ−１αプライマーペアーを用いて測定して
いる。図２Ａは増幅化標準品及び標的ＤＮＡが識別でき
る臭化エチジウム染色アクリルアミドゲルを図示する。
図２Ｂは鋳型濃度に対して製造される、標準及び標的Ｉ
Ｌ−１αＰＣＲ生成物ＤＮＡの量をプロットしている。
図２Ｃは製造された標準及び鋳型ＩＬ−１αＰＣＲ生成
物ＤＮＡ、対、増幅周期の回数をプロットしている。
【図３】図３はＡＷ１０８ｃＲＮＡ及びＬＰＳ誘発マク
ロファージから単離したＲＮＡの試料を含むノーザンブ
ロットの結果を示す。
ロファージから単離したＲＮＡの試料を含むノーザンブ
ロットの結果を示す。
【図４】図４は同一条件のもとで、同一のｃＤＮＡ鋳型
を利用した、異なるプライマーセットに関する増幅効率
を示す。
を利用した、異なるプライマーセットに関する増幅効率
を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１０年９月１４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ドイル，マイケル ブイ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94611, オークランド，マウンテインゲイト ウェ イ 2709 (72)発明者 マーク，デイビッド エフ. アメリカ合衆国，ニュージャージー 08536，プレインズボーロ，ソーロー ド ライブ 182
Claims (13)
- 【請求項１】 標的核酸の定量のための内標準品を提供
するためのプラスミドであって、ここで該プラスミドは
該標的核酸セグメントにおいて含まれている核酸配列と
同一のＤＮＡ配列の並んだ列を含んで成り、これによ
り、一対のオリゴヌクレオチドプライマーがＰＣＲ反応
において該プラスミドＤＮＡ配列及び該標的核酸セグメ
ントのそれぞれに含まれている核酸のセグメントを増幅
せしめることが可能であり、これによって該増幅標的核
酸及び該増幅標準核酸セグメントが区別されることがで
きる、プラスミド。 - 【請求項２】 前記プラスミドがＴ７ポリメラーゼプロ
モーターを更に含んで成り、これによりｃＲＮＡ分子が
前記の並んだ列を鋳型として用いて製造されることがで
きる、請求項１に記載のプラスミド。 - 【請求項３】 前記プラスミドがポリアテニル化配列を
更に含んで成り、これにより前記のｃＲＮＡ分子がオリ
ゴ（ｄＴ）プライム化逆転写反応における鋳型として利
用できる、請求項２に記載のプラスミド。 - 【請求項４】 前記の内標準品が２〜３２種の標的核酸
セグメントの定量に適する請求項３に記載のプラスミ
ド。 - 【請求項５】 前記の標的核酸セグメントがＴＮＦ，Ｍ
−ＣＳＦ，ＰＤＧＦ−Ａ，ＰＤＧＦ−Ｂ，ＰＤＧＦ−
Ｒ，ａｐｏ−Ｅ，ＬＤＬ−Ｒ，ＨＭＧ，ＩＬ−１，ＩＬ
−２，ＬＰＬ，Ｇ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦ，ａＦＧＦ，
ｂＦＧＦ，ｃ−ｆｍｓ，ＴＧＦ−β，ＬＦＡ−１，ＩＬ
−２Ｒα，α−アクチン、デスミン、β−アクチン、Ｉ
Ｌ−６，ＩＦＮ−α，ＩＦＮ−γ，ＩＬ−６Ｒ，ＰＤＧ
Ｆ−αＲ，ＩＬ−２Ｒβ，ＩＬ−３，ＩＬ−４及びＨＩ
Ｖタンパク質より成る群から選ばれるタンパク質をコー
ドする核酸配列の中に含まれている、請求項４に記載の
プラスミド。 - 【請求項６】 前記プラスミドがｐＡＷ１０８及びｐＡ
Ｗ１０９より成る群から選ばれる請求項５に記載のプラ
スミド。 - 【請求項７】 生物試料中の特定の標的核酸セグメント
の定量のためのキットであって、 内標準品及び少なくとも１組のオリゴヌクレオチドプラ
イマー、ここで該プライマーの組は該内標準品に含まれ
ている核酸セグメントを増幅せしめるために働くことが
できる；を供する独立の容器を含んで成るキット。 - 【請求項８】 逆転写酵素を更に含んで成る請求項７に
記載のキット。 - 【請求項９】 前記の内標準品がｃＲＮＡ分子である請
求項８に記載のキット。 - 【請求項１０】 前記のｃＲＮＡが２〜３２種類の標的
核酸セグメントの定量に適する請求項９に記載のキッ
ト。 - 【請求項１１】 前記の標的核酸セグメントがＴＮＦ，
Ｍ−ＣＳＦ，ＰＤＧＦ−Ａ，ＰＤＧＦ−Ｂ，ＰＤＧＦ−
Ｒ，ａｐｏ−Ｅ，ＬＤＬ−Ｒ，ＨＭＧ，ＩＬ−１，ＩＬ
−２，ＬＰＬ，Ｇ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦ，ａＦＧＦ，
ｂＦＧＦ，ｃ−ｆｍｓ，ＴＧＦ−β，ＬＦＡ−１，ＩＬ
−２Ｒα，α−アクチン、デスミン、β−アクチン、Ｉ
Ｌ−６，ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ，ＩＬ−６Ｒ，ＰＤＧ
Ｆ−αＲ，ＩＬ−２Ｒβ，ＩＬ−３，ＩＬ−４及びＨＩ
Ｖタンパク質より成る群から選ばれるタンパク質をコー
ドする核酸配列に含まれている請求項１０に記載のキッ
ト。 - 【請求項１２】 前記のｃＲＮＡがｐＡＷ１０８ｃＲＮ
Ａ又はｐＡＷ１０９ｃＲＮＡである請求項１０に記載の
キット。 - 【請求項１３】 熱安定性ポリメラーゼ及びポリメラー
ゼ直鎖反応に適切な緩衝剤を更に含んで成る請求項８に
記載のキット。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US39698689A | 1989-08-21 | 1989-08-21 | |
| US396986 | 1989-08-21 | ||
| US413623 | 1989-09-28 | ||
| US07/413,623 US5219727A (en) | 1989-08-21 | 1989-09-28 | Quantitation of nucleic acids using the polymerase chain reaction |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2512734A Division JP2878453B2 (ja) | 1989-08-21 | 1990-08-20 | ポリメラーゼ連鎖反応を利用する核酸の定量 |
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|---|---|
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| JP3331178B2 JP3331178B2 (ja) | 2002-10-07 |
Family
ID=27015717
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2512734A Expired - Lifetime JP2878453B2 (ja) | 1989-08-21 | 1990-08-20 | ポリメラーゼ連鎖反応を利用する核酸の定量 |
| JP23075898A Expired - Lifetime JP3331178B2 (ja) | 1989-08-21 | 1998-08-17 | ポリメラーゼ連鎖反応を利用する核酸の定量用のプラスミド及びキット |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2512734A Expired - Lifetime JP2878453B2 (ja) | 1989-08-21 | 1990-08-20 | ポリメラーゼ連鎖反応を利用する核酸の定量 |
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|---|---|
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| AU (1) | AU653920B2 (ja) |
| CA (1) | CA2064906C (ja) |
| DE (1) | DE69033044T2 (ja) |
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| ES (1) | ES2132069T5 (ja) |
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