JPH05504886A - ポリメラーゼ連鎖反応を利用する核酸の定量 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ポリメラーゼ′言′　・をｌ　る　の 本発明は試料中の特定の核酸セグメントの定量分析に関する６本発明は生物試料 中の特定のｍ　ＲＮ　Ａ分子の量の測定に特に有用である。従ってこの方法は医 療診断の分野に特に有用であるが、しかし遺伝学、分子生物学及び生化学の分野 にも適用できる。

米国特許第４，６８３．１９５号及び第４，６８３，２０２号は核酸増幅方法で あるポリメラーゼ連鎖応（ＰＣＲ）、及び特定のヌクレオチド配列の検出におけ るＰＣＨの利用を開始する。ヨーロッパ特許庁公開（ＥＰＯ）第２５８，０１７ 号はＰＣＨに利用するため好ましいＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼを 開示している。これらの公開物は本発明に参考文献として組入れている。

ＰＣＲは遺伝病診断（Ｉｌｕら、１９８９．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、υび！診断（例えばＨｏｒｎら、１９８Ｂ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８５：６０１２−６０１６；Ｔｏｄｄ　ら、１９８７． 　Ｎａｔｕｒｅ　３２９：５９９−６０４：Ｋａｗａｓａｋｉ＋　１９８８．　 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５：５６９８−５７０２； 及びＮｅｒｉら、１９８８．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｒ、ＵＳＡ 　８５：９２６８−９２７２を参照のこと）において広い有用性を有す、しかし ながら、これらの利用は単に定性的な結果、例えば正常細胞をバンクグランドと して、異常細胞由来の独特のｍＲＮＡ転写物の測定を提供している。

［Ｉ瘍におけるチミジル酸シンターゼのｍＲＮＡレベルの定量的な研究のための ＰＣＨの利用の試みは公開されている（Ｋａｓｈａｎｉ−５ａｂｅｔ、　１９８ ８．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４８：５７７５−５７７８参照）。

しかしながら、この研究は生物学試料中のｍＲＮＡの量の単なる相対的な比較を 提供する。既知濃度の内（ｉｎｔｅｒｎａｌ）標準品を用いないで特定のｍＲＮ Ａの絶対量を定量することばより困難である。その他の方法は、第２の、無関係 な鋳型ｃＤＮＡを共増幅するためのＰＣＲの利用による核酸物質の定量について 詳細している（Ｃｈｅｌ　ｌｙら、１９８８．　Ｎａｔｕｒｅ３３３　：　８５ ８−８６０及びＲａｐｐｏｌｅｅら、１９８Ｂ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４１ニア ０８−７１２を参照）０ｍ関係なｃＤＮＡ標準品の利用は、特定の標的ｍＲＮＡ に無関係な第２セツトのオリゴヌクレオチドブライマーの利用も必要とする。

増幅は指数的な工程であるため、プライマーベアーの長さ及びヌクレオチド配列 を含む、反応速度をコントロールする任意の変異要因における小さな相違はＰＣ Ｒ生成物の収量において大きな相違をもたらすことができる。２組のセットの無 関係なプライマーを利用する分析は従って、ｍＲＮＡの濃度の絶対的な測定より もむしろ２種の個々の増幅反応の相対的な比較のみを提供しうる。

Ｇ１１ｌｉｌａｎｄ　ら　（Ｊ、Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　 、ＶＣＬＡ　Ｓｙｍｐｏｓｉａｏｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕ ｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子及び細胞生物学シンポジウム）、１９８９年４月 ３〜２１日、要約書（＾ｂｓｔｒａｃｔ）ＷＨＯＯＩ）は増幅標準品としての無 関係な鋳型に関連するいくつかのｒｊＩＮを回避するためのｍＲＮＡ定量の択一 的な手法を詳細している。しかしながらＧ１１ｌａｎｄ　らはその他の固有の制 限を挙げている。１つの手法は特定の標的ｍＲＮＡに関連する遺伝子についての ゲノムイントロン及びエキソンの地図化を必要とする。　Ｇ１１ｌａｎｄらは、 増幅せしめた後にヘテロ二重鎖の形成を引き起こす、内積本島の作製のための位 置特異的突然変異誘発を利用する択一的な手法も試みている。このようなヘテロ 二重鎖はオリジナルの試料中に存在する標的配列の量の過剰評価をもたらす、Ｓ 麿ｉｔｈら（Ｓｓｉｔｈ　ら、１９８９．ム」ｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、　１１８ ：２６５−２７２）は、ヒトマクロファージにおける２種のＩＬ−１ｍＲＮＡの 発現レベルを定量的に評価するためのＲＮＡドツトプロットアッセイを利用して いる。　５ｓｉｔｈらは、この方法によるＩＬ−１αｍＲＮＡの感度のレベルは およそ１０７個の分子であり、そして誘発せしめていないマクロファージにおい てＩＬ−１αｍＲＮＡが検出されなかったことを報告している０本発明は試料ア ッセイにおいて１０４個の分子を容易に測定でき、且つ未誘発及び誘発マクロフ ァージ中のＩ　Ｌ−１ａｍＲＮＡを容易に検出できる定量方法を提供する。感度 におけるこの１０００倍の上昇は臨床及び研究の目的のための定量分析において 重大な進歩を提供する。

試料中の特定の核酸セグメントの量の直接的、高精度的、及び再現的定量の方法 が所望されている。定量的ＰＣＨの有用性は多数の研究分野における有用な情報 を提供するであろう、より詳しくは、本発明は疾病の診断及び癌治療における重 要な情報を提供する０例えば、信頼できる高感度定量分析は、外因性刺激に対す る応答性におけるｍＲＮＡ合成の誘発の程度の検査において重要となりうる０本 発明は当分野におけるその他の試みに固有の真人なる制限を解決し、従って生物 学試料中の核酸セグメントの量を高精度に定置するための手段を提供する。

本発明は試料中の標的核酸セグメントを定量する方法を提供、ここで、該方法は 以下の段階： （ａ）該試料に一定量の標準核酸セグメントを加え；（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反 応を実施するのに適切な条件のもとて該試料を処理しくここで該核酸は一本鎖と され、そして重合のための試薬、即ち、デオキシヌクレオシド５′三リン酸及び １対のオリゴヌクレオチドブライマーのに暴露せしめ、ここで該一対のプライマ ーは該標的及び該標準核酸セグメントの両方に特異的であり、これによって該一 対のプライマーそれぞれの伸長生成物が合成のための鋳型として該標的及び該標 準セグメントの個々の鎖を利用することにより合成されうることができ、これに よって１方のプライマーの伸長生成物を該鋳型鎖から分離せしめる際に該対の他 方のプライマーの伸長生成物の合成のための鋳型として働くことができる）； （Ｃ）−末鎖分子を形成せしめるため、該プライマー伸長生成物を、それらが合 成された鋳型から分離させ；（ｄ）段階（Ｃ）において作られる一本鎖分子に基 づいて少なくとも１回、段階（ｂ）及び（ｃ）を繰り返しくここで段階（ｂ）及 び（ｃ）は増幅の１周期とする）；（ｅ）段階（ｄ）において作られる増幅せし めた該標的及び該標準セグメントの量を測定し；そして（ｆ）増幅前の該試料中 に存在する該標的核酸セグメントの量を、段階（ｄ）において作られる増幅せし めた該標的及び該標準セグメントから計蒐すること；を含んで成る。

本発明は標的核酸セグメントの定量のための内積本島を提供するために有用なプ ラスミドも提供する。該プラスミドはＤＮＡ配列を含んで成り、ここで該ＤＮＡ 配列は該標的核酸セグメントに含まれているＤＮＡ配列と同一である配列を更に 含んで成る。

本発明は生物学試料中の特定の核酸セグメントの定量のためのキットも提供する 。

図１はプラスミドＡＷ１０８及びＡＷ１０９に並んだ、表Ｉの５′プライマー及 び３′プライマーの位置を示す０本発明に関連するその他の特徴も示した。

図２Ａ−Ｃにおいて、リポ多＄Ｉ（ＬＰＳ）誘発及び未誘発マクロファージに存 在するＩＬ−１αｍＲＮＡの量はＩＬ−１αプライマーペアーを用いて測定して いる。

図２Ａは増幅化標準品及び標的ＤＮＡ力；識別できる臭化エチジウム染色アクリ ルアミドゲルを図示する。

図２Ｂは鋳型濃度に対して製造される、標準及び標的ＩＬ−１αＰＣＲ生成物Ｄ ＮＡの量をプロットしている。

図２０は製造された標準及び鋳型ＩＬ−１αＰＣＲ生成物ＤＮＡ、対、増幅周期 の回数をプロットしている。

図３はＡＷ１０８ｃＲＮＡ及びＬＰＳ誘発マクロファージから単離したＲＮＡの 試料を含むノーザンブロントの結果を示す。

図４は同一条件のもとで、同一のｃＤＮＡ鋳型を利用した、異なるプライマーセ フ）に関する増幅効率を示す。

本発明は試料中の核酸セグメントの絶対蓋を測定するだめの方法を提供する０本 方法は、１つの反応混合物に混合せしめた２種類の異なる核酸のセグメントのポ リメラーゼ連鎖反応による増幅を包含する。この２ｍのセグメントは標的セグメ ント及び内標準セグメントを含む、この内積本島はこの標的核酸と同一のオリゴ ヌクレオチドブライマーペアーを用いて増幅せしめる；しかしながら、この２ｍ の核酸セグメントはそのサイズによって区別される増幅生成物を作る。

標準セグメントは既知量において存在する。増幅の後、この２種のポリメラーゼ 連鎖反応生成物のそれぞれの量を測定し、そしてオリジナル試料に存在するこの 標的セグメントの量は！１１！曲線に対して外挿することによって定量される。

更に、本明細書に説明する内積本島は複数の遺伝子に関するプライマー配列を含 み、従って同し標準品が多数の異なる対象の核酸セグメントに利用できる。

本発明は、ｏ、ｔｎｇ以下の全ＲＮＡを含む試料中に存在する微量の特定のｍＲ ＮＡの量を正確に測定するための迅速な、高感度なぞして信転できる方法を提供 することにおいて特に有用性を有す。この方法は単一細胞レベルにてさえの特定 のサブ集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）における特定のｍＲＮＡの異なる発 現レベルの測定を十分に可能にする手法を提供する。

該標的核酸及び該内標準核酸の共増幅により、種々の因子が本質的にコンロート され、そして標的及び［準核酸に間する一様なＰＣＲ生成物の収量が及ぼされる 。真人な数の変異因子がＲＣＲ反応の速度に影響を及ぼす。このような変異因子 はポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＭｇＣ１□、核ｆｌＩ鋳型及びプライマーの濃度、 並びに「プライマー−ダイマーｊ形成及び試験管間差を含む。

増幅前の試料中に存在するこの標的核酸セグメントの量は標準曲線を用いて決定 される。この４１１準曲線は、ポリメラーゼ連鎖反応において作られる標準セグ メントの量を、増幅の前に存在する種々の既知量のＲＮＡに対してプロットする ことによって作製される。精度のため、増幅前に存在する［！１！セグメントの 量は共増幅反応混合物の段階希釈によって変える。このポリメラーゼ連鎖反応に おいて作られる標的セグメントの量を次１′−この標準曲線と比較し、増幅前の 試料中に存在する標的セグメントの量を決定する。他方、この標準曲線は増幅周 期数の対して製造される標準及び標的セグメントの量をプロットすることによっ て作製されつる。精度をよくするため、増幅周期の回数は、種々の回数の増幅周 期が終了した後に、１つの共増幅反応混合物からアリコートを取り出すことによ り変えることが好適である。

本発明の方法は試料中の核酸セグメントの量を絶対量よりも相対量として測定す ることで非常に優れている。更に、本方法は標準品を増幅せしめるために第２セ ントのオリゴヌクレオチドブライマーを採用することによって絶対量が得られる 場合よりもより精度が高い（ここでこのプライマーのセントは標的セグメントを 増幅するために用いるセントとは異なる）。

本発明の方法は標的ＲＮＡ又はＤＮＡの定量のために有用である。試料中に存在 するＤＮＡの量を決定するために本明細書記載の方法は直接通用されうる。以降 に詳細の実施例が示す透り、本発明は全ＲＮＡの試料中の特定のｍＲＮＡの量を 決定するのにも有用である。この内標準核酸セグメントはばＳＰ６プロモーター の存在は、このプラスミドがｃ　ＲＮＡ合成のための鋳型として利用されること を可能にする。本発明の目的のために本明細書では、ｒｃＲＮＡ」なる語はＲＮ ＡポリメラーゼによりＤＮＡ鋳型から合成されるリボ核酸セグメントに関するも のと定義する。更に、該プラスミドは精製及びその後のインビトロ合成ｃＲＮＡ の定量を促進せしめるため、３′末端にポリアデニル化配列を含みうる。

好適な態様に詳細の通り、該ＤＮＡ鋳型はプラスミドＡＷ１０８又はＡＷ１０９ のいづれかであり、そして１ＲＮＡポリメラーゼはＴ７ボリメラーゼである。１ つの１！欅においてＡＷ１０８ｃＲＮＡは、Ｔ７ポリメラーゼによりｐＡＷ１０ 日から存意な＠　（ｓ　ｅ　ｎ　ｓ　ｅ　ｓ　ｔ　ｒ　ａ　ｎ　ｄ　）として合 成さレル。ｐＡＷｌｏＢの構造は図１において示す０図１に示すプライマー列は ｐＡＷ１０８とｐＡＷ１０９の両方に関して同一である。従ってこのｃＲＮＡ分 子は逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼによる逆転写のための内標準鋳型として働 く。

逆転写酵素はＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡ転写物を作る０本発明の好ましい態様では 、この内標準ｃＲＮＡは有意鎖として合成される。標的ｍＲＮＡ及び標的ｃＲＮ Ａの逆転写の後に、ＰＣＲを行う。

当業者に明らかであろうが、本発明の方法に有用なプラスミドを作製するための 真人な数の方法が知られている。旧ｇｕｃｈｉ、　１９８８．　Ｎｕｃｌｅｉｃ 　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１６：７３５１〜７３６７及びＨｏ。

１９８９、　Ｇｅｎｅ　７７：５１−５９＋！、所望する合成りＮＡを組入レタ 新規のプラスミドの操作のための２通りの方法を詳細している。

他方、合成りＮＡ上セグメント制限酵素分解及び適切に処理せしめた親プラスミ ド又はファージベクターとのリゲーションを介して挿入されうる。好ましい態様 の内積本島ｐＡＷＩＯ８は、一本１ｃＲＮＡ標準品が、種々のｍＲＮＡの数を定 量するのに利用されることを可能にする、複数のプライマーセントを含む、ｐＡ Ｗ１０Ｂプラスミドにおける固有のＦｌＩＩＩ！酵素部位の存在は、このプラス ミド′に新しいプライマーセットを加える多様性を付与する。このＢａｍＨ１部 位は、逆転写のための直Ｍ状鋳型を提供するため、このプラスミドを直鎖状にす るために利用される。プラスミドＡＷＩ０８を含むＥ、：ｌ’Ｊ　（Ｅ、ｃｏｌ ｉ）の保存品は、ブタベスト条約に従ってアメリカンタイプカルチャーコレクシ ョン（ＡＴＣＣ）（１２３０１Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉ ｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）に寄託されている。ＡＷ１０９を含むＥ、コリの 保存品も、ブタベスト条約に従ってアメリカンタイプ力ルチャーコレクンヨン（ ＡＴＣＣ）　（１２３０１Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌ ｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）に寄託されている。

プラスミドＡＷ１０８は、Ｏｋａｙａｍａ　とＢｅｒｇ＋　１９８３．　Ｍｏ１ ．ＣｅＩＩ　Ｂｉｏｌ、　３：２８０−２８９に開示のｐｃＤＶｌ及びｐＬＩに 由来する。ｐＬ１由来のＳＶ４０プロモーター領域をｐｃＤＶｌの中に挿入せし めた（参照論文に従って）、Ｔ７プロモーター、合成オリゴヌクレオチド配列及 びＩＬ−１α遺伝子由来のポリアデニル化謂域を次に挿入し、ＡＷ１０８プラス ミドが１２種の特定のｍＲＮＡの定量のための内積本島となるようにした。この プラスミドをＥ、コリに形質転換せしめ、そして５０μｍ／−１のアンピシリン の添加されたルリア培地中で増殖させた。

プラスミドＡＷＩＱ８をｐＡＷ１０９を作製するための出発材料としてその後利 用した。ｐＡＷｌｏＢを含むＥ、コリの培養物を増殖させ、そしてプラスミドＤ ＮＡを標準的な方法により精製した。このプラスミドをＥａｍＨｒ及びｎ±■制 限エンドヌクレアーゼにより消化せしめ、そしてｌｋｂのフラグメントを精製し た。このフラグメントは図１において示す通り、５′及び３′プライマ一列並び にポリアデニル化配列を含む、プラスミドｐ　Ｓ　Ｐ　７２　（Ｐｒｏ＊ｅｇａ 　Ｂｉｏｔｅｃ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｉ３ｃｏｎｓｉｎ）は、クローン化を 促進するようにポリリンカーに隣接するＴ７プロモーターを含む、このプラスミ ドはアンピンリン耐性遺伝子も含む。

ｐＡＷ１０８由来の旦工±Ｈ−且互旦Ｈｌフラグメントを旦ｌ土■及びＢａ工Ｈ １切断ｐＳＰ７２にリゲートせしめた。

これらは両方共、ポリリンカー領域内に固有の制限部位である。このリゲーショ ン混合物をＥ、　ｒｌＪＤＨ５αの形質転換のために用い、そして得られるアン ビンリン耐性コロニーを選別した。このプラスミドをその旦ｌ±ＩＩ−ＢａｍＨ Ｉインサートの正しい方向性についてアッセイした。得られるプラスミドＰＡＷ １０９はｍＲＮＡの定量の内積本島として適切である。

当業者に明らかな遺り、本発明に有用な内積本島を提供するために所望するＤＮ Ａ配列の挿入のためには真人な数のその他プラスミドがを用である。一般に、本 発明の実施のために必要とされる、このようなプラスミドの適切な宿主系の中へ の形質転換、この形質転換宿主の増殖、及びプラスミドＤＮＡの調製の方法はＦ Ｉａｎｉａｔｉｓらの、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　−Ａ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ 、　１９８５において見い出されうる。

本明細書で用いられる語「５′プライマーゴは、該標的ヌクレオチドセグメント の有意頷において含まれている配列と同一の配列を含んで成るオリゴヌクレオチ ドに関する。

本明細書で用いられる語「３′プライマー」は前記の標的ヌクレオチドセグメン トの有意鎖において含まれる配列と同一の配列に相補する配列を含んで成るオリ ゴヌクレオチドに関する。それ故、本発明の方法においてを用な３′プライマー はｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ又はＤＮＡ鋳型とハイブリダイズするであろう、内積本島 ｃＲＮＡ及び標的ｍＲＮＡセグメントの両方に対する３′及び５′プライマーに ついて更に説明すると、３′プライマーハイプリダイゼーンヨンの領域は、５′ プライマーハイプリダイゼーシヲン領域の３′側に位！する。

これら３′及び５′プライマーは本発明の方法において以下の通りに機能する： 該３′プライマーはＰＣＲ反応におけるＤＮＡ合成を開始させてアンチセンスＤ ＮＡ１ｊを作り、これは５′プライマーをＰＣＲ反応に含ませる際に第２−末鎖 ＤＮＡ合成のための鋳型として働く、このような５′及び３′プライマーを本明 細書で「プライマーペアー」と称す。

好ましい態様において、プライマーペアーのほとんどの構成員は、各標的ｍＲＮ Ａをコードする遺伝子における２つのエキソンーイントロン結合部にまたがるよ うにデザインされている。これによってこのプライマーは所望の標的ｍＲＮＡに のみ効率的にハイブリダイズするであろう。従って、生物学試料中の少量の夾雑 遺伝子ＤＮＡは標的ｍＲＮＡの正確な定量に影響しないであろう。

従って、プライマーペアーはＰＣＲ反応において、標準核酸、即ち本明細書で例 示するプラスミドＡＷ１０８及びＡＷ１０９において含まれるＤＮＡセグメント と同一のプライマー配列を有す核酸のセグメントを増幅せしめるために機能する であろう０本明細書で詳細する通り、両方のプラスミドは以下の通りに並んだ１ ２ｍのプライマーペアーのＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ配列を含む、１２種の 標的ｍＲＮＡの５′プライマーと配列において同一のＤＮＡの後に、同じ１２種 の標的ｍＲＮＡに関する３′プライマーの相補性ＤＮＡ配列がくる（図１）、ｐ ＡＷ１０８及びｐＡＷ１０９内のプライマーペアーＤＮＡ配列は、腫瘍壊死因子 （ＴＮＦ）、マクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−Ｃ５Ｆ）、血小板由来増 殖因子Ａ　（ＰＤＧＦ−Ａ）　、血小板由来増殖因子Ｂ　（ＰＤＩ：。

Ｆ−Ｂ）　、低密度リポタンパク質すセプター（ＬＤＬ−Ｒ）、３−ヒドロキシ −３−メチルグルタリル補酵素Ａリダクターゼ（ＨＭＧ）　、インターロイキン −１α（ＩＬ−１α）、インターロイキン−１β（ｒＬ−１β）、インターロイ キン−２（ＩＬ−２）、β型皿小板由来増殖因子リセブター（ＰＤＣ，Ｆ−ＢＲ ）及びリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）をコードするｍＲＮＡに相当する０本 発明の方法の実施において、ＡＷ１０８又は、ａ、Ｗ１０９ｃＲＮＡにより提供 される内積本島の増殖のために有用なプライマーペアーを表■に挙げる。

ＴＮＦ、！ｌｌＸ壊死因子；Ｍ−Ｃ３Ｆ、マクロファージ−コロニー刺激因子、 ＰＤＧＦ−Ａ、血小板由来増殖因子Ａ；ＰＤＧＦ−Ｂ、血小板由来増殖因子Ｂ； ａｐｏ−Ｅ、アポリポタンパクｉＥ　；　ＬＤＬ−Ｒ，低密度リポタンパク譬す セプター；ＨＭＧ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵１ＡＩＪダクタ ーゼ；ＩＬ−１α、インターロイキン−１α、ＩＬ−１β、インターロイキン− １β１ｌＬ−２、インターロイキン−２；　ＰＤＧＦ−Ｒ１β型血小板由来増殖 因子リセブター；ＬＰＬ、リポタンパク質リパーゼ。

その他のｍＲＮＡ４１！的であって本発明により生物学試料中において容易に定 量されるものには以下のもの（但しそれらに限定しない）、即ち、顆粒球コロニ ー刺激因子（Ｇ−Ｃ３Ｆ　）　、ＷＩ粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇ Ｍ−Ｃ３Ｆ）、酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因 子（ｂＦＧＦ）、Ｃ−マクドナーネコ肉腫（ｃ−ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ　ｆｅｌｉ ｒｘｅ　ｓａｒｃｏｍａ）（ｃ−ｆｍｓ）、トランスフォーミング成長因子−β （ＴＧＦ−β）、白血球付着性タンパク質−１（ＬＦＡ−１）、インターロイキ ン−２リセプター−α（ｌ　Ｌ−２Ｒα）、アルファーアクチン、デスミン、β −アクチン、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターフェロン−α（ＩＦ Ｎ−α）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−ｒ）、インターロイキン−６−リセブ ター（ＩＬ−６Ｒ）、血小板由来増殖因子−αリセプター（ＰＤＣ；Ｆ−αＲ） 、インターロイキン−２リセプターβ（ｒＬ−２Ｒβ）、イン！−ｏイキ７−３ （ＩＬ−３）及びインターロイキン−４（ｌＬ−４）並びにヒト免疫不全ウィル ス（ＨＩ　Ｖ）が含まれる。これらのＲＮＡの発現の検出及び測定に有用なプラ イマーベアーの例は、表口において示すオリゴヌクレオチド配列により例示す。

ｌ−↓ Ｇ−Ｃ５Ｆ　５’ＧＧＴＧ八ＧＴＧΔへＴＧ丁ＧＣＣ八ＣＣ’ｒ　＞’。

５’Ｃ；ＴＴＣＴＴＣＣＡ丁ＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧ３°：ＧＭ−Ｃ５Ｆ　５’Ｃ ＡＣＴＧＣＴＧＣｒ’ＧＡＧＡＴＧ八ＡＴＧＡＡＡＣＡＧゴ°。

ｂＦＧＦ　５’　ＧＡＣＣＣＴＣＡＣＡＴＣＡＡＧＣｒＡＣＡＡＣ１°。

５°ＧＡＧＧＧＴＣＴＴＡＣＣＡＡＡＣＴＧＣＡＧＧ　３°；ＴＧＦ−β　５゛ ＣＡＴＣＡＡＣＧＧＧＴＴＣＡＣＴＡＣＣＧ　３°。

ｓ゛ＴＣＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＡＴＡＧ　３°；ＬＦＡ−１５’ＧＡ ＧＴＧＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＧＡＡＡＡＧＧＴ。

５’ＣＡＣＡＣＡＣＴＣＴＣＧＧＣＴＣＴＣＡＴＣ３’；ＩＬ−２Ｒα５’ＧＣ ＴＧＣＣＡＧＧＣＡＧＡＧＣＴＣｒＧＴＧＡＣＧコ゛。

５’ＧＴＴＣＣＧＡＧＴＧＧＣＡＧＡＧＣＴＴＧＴＧＣ３’；α−７クチン　５ ’ＧＣＡＣＡＡＣＴＧＧＣＡＴＣＧＴＧＣＴＧ　３’。

５へＧＡＣＴＣＣへ丁ＣＣＣＧΔＴＧＡＡＧＧ３’；デスミン　５’ＡＧＣｉＡ ＧＡＧＣＣＧＧＡＴＣＡＡＣＣＴＴＣＴ。

５’ＴＣＧＣＴＧＡＣＧＡＣＣＴＣＴＣＣＡＴＣ３゛；β−７クチン　５’ＣＣ ＴＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧ丁ＣＣＴＧ　：Ｉ’。

５’ＧＧＡＧＣＡＡＴＧＡＴＣＴＴＧＡＴＣ’ｒＴＣ１°。

Ｌ−６５’ＣＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡ八ＧＣＧＣＣＴＴＣ３°。

５’ＧＧＣＡＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡ丁ＴＧＡＡ丁Ｃ丁；ＩＦＮ−α　５’ＡＧＣ ＴＧＣＡＡＧＴＣ八八ＧＣＴＧＣＴＣ丁。

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５°Ｇ丁ＧＧＡＡＣＴＧＣＴＧＴＧＣＡＧＴＣＧＣｒ、　及び）（ｒＶ５°ＡＧ ＴＧＧＧＧＧＧＡＣＡＴＣ３°。

５゛゛「口”ＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＡＴＧ３°。

ｐＡＷ１０８及びｐＡＷ１０９内の各プライマーセット由〜３ｏｓｂｐのセグメ ントの長さは任意の内環本島のデザインの限定を強いるものではな）。唯一必要 なことは、この標準セグメントの長さを、標的ｎ　ＲＮ　ＡのＰＣＲ生成物とナ イズＳこおいて相違し、且つこのヒグノントの長さが好適な分析系′（例えばア クリルアミドをへ泳更ｈ、アガロースゲル電気泳動４はその他のクロマトグラフ ィー４ｇ　、’２　）に除ける固有の検出゛績界内にあるようにデザインず°る εとである。ＰＣＲＩｔ幅生成物間のこのサイズの相違１よ、標的ｍＲＮＡ増幅 生成勿から白檀１１１！　ｃ　ＲＮ　Ａ増幅生成物の容易なる分ｊｉｌｔ（例え ばゲル電気泳動による）を可能にする。固有Ｂａ工Ｈ１部位はＡＷＬＯ８又はＡ Ｗ１０９プラスミドを直鎖状にしてｃＲＮＡ転写物を作るために利用される。こ のような転写物は例えば処理及び未処理試料中の多数の異なる種類のｍ　ＲＮ　 Ａの定量に有用である。この方法は処理もしくは未処理細胞又は組織の転写表現 型を提供するために利用でき、従って真人な数の臨床及び研究用途を提供する。

該ｃＲＮＡ及び標的ｍＲＮＡは同一の反応において逆転写される。この方法によ り、該ｃＲＮＡはｍＲＮＡ定量のための標準品として働くのみでなく、逆転写反 応のための内ｍＲＮＡコントロールも提供する。逆転写酵素はＲＮＡ鋳型を利用 するｃＤＮＡ合成を開始せしめるプライマーを必要とする。

本発明の実施において、標準ｃＲＮＡ及び標的ｍＲＮＡの両方にハイブリダイズ するオリゴヌクレオチドプライマーがこれになることができるであろう、このプ ライマーは標的ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅のために利用される３′プライマーと同一 の配列でありうる。他方、この逆転写反応のためのプライマーは、ｍＲＮＡ及び ｃＲＮＡと３′増幅プライマーの配列、例えばオリゴ（ｄＴ）の末端の位１にて ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドでありうる。従って得られるｃＤＮＡは その中に３′増幅プライマーの配列と同一の配列を含む。本明細書で開示する好 ましい１！様において、ＡＷ１０８ｃＲＮＡ並びにＡＷ１０９ｃＲＮＡは３′末 端にポリアデニル化配列を含み、そしてオリゴ（ｄＴ）がｃＲＮＡ及びｍＲＮＡ 鋳型の逆転写のためのプライマーとして利用される。更にオリゴ（ｄＴ）は同一 の逆転写酵素反応混合物から１以上の標的配列の増幅を可能にする。

該標準及び標的鋳型の両方のＰＣＲ増幅において同一のプライマーが利用される ；従ってこの標準と標的ＲＮＡの増幅との間にプライマー効率の相違はない、該 標的ｍＲＮＡ及び内積ｉ！ｃＲＮＡの一連の希釈系列を同一の試験管内において 増幅せしめ、そしてこの反応を増幅の指数期において停止せしめた場合、増幅前 にこの試料中に存在している標的ｍＲＮＡの量は内標準ｃＲＮＡ標準曲線に対し て外挿せしめることによって決定できる。製造されるＤＮＡの量を該標準及び標 的の両方に間する出発材料の量に対してプロットする。この標準曲線は出発材料 中の標的の量を決定するための該標的データーの外挿を可能にする。この値は標 的ｍＲＮＡの分子数／全ＲＮＡｎｇとして表わされうる。他方、これは％もしく は重量、又はコピー数として測定されうる。

他方、増幅周期の数を変えることによる標的ｍＲＮＡの量の測定についての方法 を提供する。製造される増幅生成物の量を、該標準及び標的セグメントの両方に 間する増幅周期の数に対してプロットする。このプロットしたデーターはこの反 応部分の増幅の速度が指数的であるかを示す、従って、形成される生成物の速度 は、存在している標的セグメントの初期量を決定するため、出発材料の速度を均 等化することができる。これは以下の式に従って行なわれる。

Ｎｏ（ｍＲＮＡ）　Ｎ　（ｍＲＮＡ） 式中、Ｎｏは材料の出発量、そしてＮは製造される増幅生成物の量である。

本発明の他の態様において、第３のプライマー列を内標準プラスミドの中の５′ プライマー列と３′プライマ一列の間に挿入せしめた。この第３オリゴヌクレオ チド列は一連の合成配列を含んで成る。その中には５′及び３′プライマーペア ーを含むプラスミドに関する各ＲＮＡに相等する配列が存在する。この列は、定 置すべきそれぞれの標的ＲＮＡのため、この増幅生成物がその中にこの第３オリ ゴヌクレオチド列の一部と同一の配列を含むようにデザインされている。従って 、増幅標的及び増幅標準ＤＮＡセグメントはブローブハイプリダイゼーシッン部 位を提供する同一の内部セグメントを含み、これにより各プライマーペアーに関 して、このオリゴヌクレオチドプローブは増幅標的及び増幅標ｌＤＮＡを検出す るために有用である。

第３オリゴヌクレオチド列がこの標準プラスミドの中に含まれている場合、この ＰＣＲ反応は！１１にの利用なしで実施できる。各標準及び標的鋳型に関して、 逆転写並びに増幅反応は共増幅よりもむしろ別々の試験管内において実施するこ とが好適である。増幅の後、生成物の量は、該第プライマー列により付与される 内部配列に相当する配列を有す一末鎖オリゴヌクレオチドを採用するドツトプロ ットフォーマントの利用により定量される。

本発明の実施例に示す通り、ヒトマクロファージのリポ多ＩＩ　（ＬＰＳ）３９ 発及びコントロール培養物から単離したＩＬ＝１αｍＲＮＡを含む複数のリンホ カインｍＲＮＡの量を測定するために、ＡＷ１０Ｂ内標準品を利用する。リンホ カインｍＲＮＡレベルはヒトアテローム型組１！（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔ ｉｃ　ｐｌａｑｕｅ　ｔｉｓｓｕｅ）におし１ても測定した。

本発明により提供される通り、標的ｍＲＮＡは内積本島であっである程該標的自 体と同一の配列を有するものを利用することによって最も正確に定量される。内 積本島として無関係な鋳型を用いるＰＣＲ増幅によるｍＲＮＡ配列の定量は比較 データーのみを提供し、その理由はこの標準と標的ｍＲＮＡに関するプライマー アーの効率性における相違にある。これは増幅工程において固有であり、その理 由はＰＣＲ増幅は指数的な工程であるからである。増幅（Ｎ）の程度は式二Ｎ＝ Ｎｏ　（１＋ｅｆ　ｆ）”で得られ、ここで式中ＮＯは材料の初期量、ｅｆｆは 効率、そしてｎは周期の回数である。従って、効率における小さな相違はＰＣＲ 生成物における大きな相違ももたらし、そして生物学試料中の存在する鋳型の量 の誤認を招く、更にプライマー効率における相違は定量分析のための、調節が困 難なパラメーターである０本発明はこの問題を解決する。

核酸セグメントの正確な定量におけるプライマー効率の有意な効果は以降の実施 例に示した。ＡＷ１０８ｃＲＮＡを複数の異なるプライマーセントのＰＣＲ増幅 のための鋳型として利用した。これら異なるプライマーセットによる、同−ＰＲ Ｃ条件のもとての増幅の効率は数段の桁の範囲にわたって変化した０本発明はＰ ＣＲによるいかなる定量的なｍ　ＲＮ　Ａの発現の試みに明らかに１嬰であるこ のような問題に向けられており、そして標的ｍＲＮＡ及び内標準ｃＲＮＡに間す る同一のプライマーの利用によってプライマー効率の問題を解決する。

本発明は、核酸の標準及び標的セグメントの増幅を同一の反応において実施する ことを必要とする０本発明の好ましいｎ様において、標準ｃＲＮＡ及び標的ｍＲ ＮＡの逆転写酵素反応も同一の反応において実施する。標的核酸は、標準及び標 的逆転写酵素反応並びに増幅反応を別々に行なうことにより定量できることを当 業者は過去の実績から理解できるであろう、しかしながら、このような方法の精 度は、逆転写及び増幅の段階が両方の増幅のために１α位の効率により行なわれ ることの度合に依存する。同一の試験内において両方の逆転写酵素反応を行うこ と及び同一の反応試験管内において両方の増幅反応を行うことにより、優れた精 度が保証される。

与えられた試料中の増幅ＤＮＡフラグメントの量は増幅効率に影響を及ぼす、高 い鋳型濃度を利用する場合（又はＰＣＲ増幅の結果として起こる高い濃度）、効 率的な増幅に関する制限要因である現象が生ずことがある。このような現象には 、酵素の基質飽和、酵素の阻害生成物、不完全な生成物鎖の分離及び生成Ｓａの 再アニール化が含まれる。しかしながらこの問題は、一定の範囲の周期回数にわ たり指数的な増幅を提供する濃度の範囲を見い出すための、特定の標的ｍＲＮＡ の初期滴定により容易に解決される。従って、本発明を用いる特定のｍ　ＲＮ　 Ａの信頬できる定量評価を得るため、４１［？１及び標的鋳型の両方に関する濃 度の範囲、並びに増幅周期の回数は、この反応が指数期であり続けるような範囲 とするべきである。

従って好ましいＭ様において、この反応条件は５０ｎｇ〜１ｕｇの全細胞ＲＮＡ と約２ｘｌＯ”　〜２ｘｌＯ’個のｃＲＮＡの分子を利用する。５ｏｐｇ程度の 細胞ＲＮＡも本発明の目的のために適切である。詳細する実施例においては、■ ×１０４個の分子程度の少ないＩＬ−１αが検出された０本発明の方法を採用す るためにｍ　ＲＮ　Ａを全ＲＮ　Ａ　ｉｌｌ　！％ｊ物から精製する必要はない 。

本方法によって分析されるために適する試料はヒト又は非ヒト由来でありうる； それらは培養試料、又は切除組織もしくは免疫学的に定義された表現型の細胞か ら単離したものでありうる。この後者は、酵素解離細胞のモノクローナル抗体染 色及び蛍光−活性化セルソータ−（ＦＡＣ５）単離又は免疫組織学染色スライド から特定１域の採取により得ることができる。これは特定のｍＲＮＡを製造する 細胞タイプの信鯨できる同定を可能にするであろう。

本発明の方法において作られる増幅ＤＮＡの量は種々の方法により測定できる０ 例えば標識プライマーであって任意のプライマーベアーの１方もしくは両方の構 成員が標識されているもの、又は標識ヌクレオチドがＰＣＲにおいて利用でき、 そしてこのＭｔｉ物の一体化を測定することによって増幅ＤＮＡの量が決定でき る。この標識はアイトープ又はアイソトープでないことができる。他方、増幅生 成物の量は電気泳動及びこの増幅生成物の染色又はＭＩＲブａ−ブとのハイブリ ダイゼーン３ンによる識別化によって決定できる。染色ゲルに基づく生成物の量 の計冨のためにはデンシロメーターが利用でき、標識プローブを用いる場合はオ ートラジオグラフからの外挿による。標識プローブを用いる場合、このプローブ は増幅生成物よりも過剰において存在させるべきである０本発明の１つのＢ樟に おいて、プライマーをアイソトープにより標識せしめ、そして得られる増幅生成 物をアクリルアミドゲル上で電気泳動させるにの生成物が移動したと予測される 領域を切り出し、そして存在する標識量をセレンコブ（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ）カウ ンティングにより測定する。存在する標識量を既知の出発材料の量に対してプロ ットする。

本発明の方法は、単一のポリメラーゼ連鎖反応において製造される鋳型及び標準 セグメントの増幅した量を測定することを必要とする。従って本方法は、増幅鋳 型セグメントを増幅標準セグメントと区別することを必要とする。もしそれらの セグメントのサイズが異なる場合、増幅セグメントを互いに区別することは比較 的容易である。！ｐち、この増幅生成物はゲル電気永動により容易に分離できる 。しかしながら、本発明はそれらの増幅生成物が異なるサイズであることを必要 とせず、なぜなら１方の増幅セグメントをその他から区別するためのその他の方 法が利用できるからである０例えば、一方のセグメントに特異的な内部プローブ を、他方のセグメントに特異的な内部プローブと異なって標識せしめることがで きる。

本明細１に詳細の定量方法はインビボ生物学試料の分析に有用である。以降の実 施例に示す通り、ヒトアテローマ障害対正常血管におけるＰＤＧＦ−Ａ及び−Ｂ 　Ｍｍ　ＲＮ　Ａの定量ＰＣＲ分析は、インビボでの細胞及び組織の生態学の研 究においてこの手法の感度を強よせしめた０例えば、本方法をアテローマ硬化症 組織における１Ｌ−１α及びＩＬ−１βのｍその高感度性、速さ及び正確度に基 づき、本定量的ＰＣＲ方法は従来可能であったものよりもより広範囲にわたる方 法において、遺伝子の発現のための研究に利用されることができ、インビボ起源 例えば生検出来の非常に少ない細胞数及び非常に少量の組織試料からの遺伝子発 現の定量的な測定を可能にする。この技術は、例えば怒染疾患症状、癌、代謝性 疾患者及び自己免疫疾患の診断及び分析に有用でありうる、特定のＲＮＡ分子の 発現レベルにおける変化に基づ（情報も提供できる。

本発明の方法が、試料中の１もしくは数種の核酸の定量のためのキットとして商 品化を受けることができることが当業者に明らかであろう０例えば、その最も簡 単なり様において、このようなキットは内積本島及び適切なオリゴヌクレオチド プライマーベアーが付与されている。その他の態様において、キットは内１１［ 本島、適切なオリゴヌクレオチドプライマーベアー、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮ Ａポリメラーゼ、逆転写酵素、ヌクレオチド三リン酸、制限酵素、緩衝剤を、ｃ ＲＮＡ及びｃＤＮＡ合成、制限酵素分解、並びにＰＣＲによる増幅のために含ん でよい、更に、キットは重合の試薬として熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば サーマス　アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａユ且ｌ工工且且１）由来の熱安 定性ＤＮＡポリメラーゼＴａｑを含んでよい。

本発明の方法を以下に例示するが、本発明は広範囲の用途に有用であり、以下の 実施例に何らその範囲の限定がされることはない。

夫厳涯よ １−広 Ａ、′：Ｉ　びＲＮＡの１ オリゴヌクレオチド重複伸長及びＰＣＲによる増幅の技術を利用して合成遺伝子 を作製した。利用する方法は位置特異的突然変異誘発において利用されるＨｏら により詳細の方法と類似した（Ｈｏら、１９８９．Ｇｅｎｅ　７７：５ｌ−５９ ）。作製後、この合成遺伝子を、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター及びポリアデニ ル化配列を含むオカヤマーバーグ（Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ）ベクターにサブ クローン化せしめた。得られるプラスミド、ＡＷ１０８を図１に示す、このプラ スミドを、Ｔ７ポリメラーゼによる（その製造者（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅ ｃ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）の転写プロトコールに従って） 転写のための鋳型として利用した。得られるＡＷ１０８ｃＲＮＡ生成物をオリゴ （ｄＴ）クロマトグラフィー及びゲル電気泳動により精製した。他方、ｐＡＷ１ ０９をｃＲＮＡｔｌの調製のために利用した。このｃ　ＲＮ　Ａ生成物をキアゲ ンーチップ（Ｑｉｕｇｅｎ−ｔｉｐ）システム（Ｑｉａｇｅｎ　Ｉｎｃ、、　５ ｔｕｄｉｏ　Ｃ１ｔｙ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）を用いた選別溶出、その後の オリゴ（ｄＴ）クロマトグラフィーにより精製した。ＲＮＡの精製及びＲＮＡ転 写物の追い出しのため、キアゲンーチップをその製造者の仕様書に従って利用し た。

ＡＷ１０８ｃＲＮＡ又はＡＷ１０９ｃＲＮＡのいづれのため、この精製ｃＲＮＡ を２６０ｎｍでの吸光度を測定することによって定量した。存在している分子の 数は、転写物の分子量に基づいて決定した。ＡＷ１０８ｃＲＮＡは１０２６個の ヌクレオチドの長さであり、従って１モル＝３．３８６Ｘ１０’ｇｓ（１０２６ Ｘ３３０）である、従って、３．３８６Ｘ１０’ｇ−は６Ｘ１０”個のｃＲＮＡ 分子を含む、ｔｐｇのＡＷ１０８ｃＲＮＡ中の分子の数は（６Ｘ１０”）／（３ ，３８６Ｘ１０’ｇｍ）〜１．７７ＸＩＱ”個である。

全細胞ＲＮＡをＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ　ら、１９８７．担す上βヨＢｉｏｃｈ ｅｍ。

１６２　：　１５６〜１５６に従って、酸性グアニジウム−チオシアネート−フ ェノール−クロロホルム抽出法によりマクロファージ及び組織から単離した。

Ｂ、ゲル”気　によるｃ　ＲＮ　Ａの　１ＰＡＷ１０８から調製したｃ　ＲＮ　 ＡをＴＢＥｔｌＩ衝液中で、高純度の１％低融点アガロースにおいて電気泳動さ せた。１ｋｂに相当するゲルの領域をゲルから切り出し、そして１ｍＭの２−Ｍ Ｅを含むＯ，ＬＭのＮＥＴＳ緩衝液（０，１ＭのＮａＣ１，０，ＯＩＭのＥＤＴ Ａ；０．ＯＩＭのトリス−ＨＣｌ。

ｐＨ１，４；　０．２％の５ＤＳ）０．２〜０．４ｍｌに、９５℃の湯浴中で３ 〜５分間にわたり溶かし、そしてアイスバケットの中です早く固形化せしめた。

この試料を次に一７０″Ｃで少なくとも２時間凍結させた。

この溶融アガロースの凍結試料を次に３７°Ｃで融解させ、そして低温室内に置 かれたエフペンドルフ遠心機において最高速度で遠心せしめた。この上清液を他 のエンベンドルフ試験管に移し、そして１％のイソアミルアルコールを含む１０ ０ａＪのフェノールクロロホルムの混合物により抽出せしめた。このフェノール は０．１％のＮＥＴＳｉｌ衝液により飽和されている。この水性相を集め、モし てＲＮＡをエタノール沈殿させた。このＲＮＡペレットを２ＭのＬｊ（，１０， １ｍｌその後０．１■Ｉのエタノールにより洗浄した。このＲＮＡを乾燥させ、 その後適量の除菌藁留水〔２〜１００μｍ〕に溶解し、そして逆転写のために準 備された。

Ｃ０のために　したオリゴヌクレオチドオリゴヌクレオチドはバイオサーチ（Ｓ ａｎ　Ｒａｆａｅｌ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）　Ｄ　Ｎ　Ａ合成装置のもとで 合成した。はとんどのプライマーはＲＮＡ−特異性プライマーである。５′プラ イマーは最初の２つのエキソンの結合部にまたがり、そして３′プライマーは次 の２つのエキソンの結合部にまたがる。他方、この５′プライマーは第１及び第 ２エキソンの結合部にまたがり、そしてこの３′プライマーは第２及び第３エキ ソンの結合部にまたがる。これらの配列に関連する遺伝子、及びプライマーを用 いて得られる増幅生成物を表１に示した。

Ｄ、ｃＤＮＡ（７）’　” 既に詳細の方法により（Ｇｅｒａｒｄ、１９８７．　Ｆｏｃｕｓ（Ｂｅｔｈｅｓ ｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ）　９　：　５を参照のこと）、ＲＮＡをｃ ＤＮＡへと逆転写させた。ＩＩＩｇの全細胞ＲＮＡ、１．７７Ｘ１０”〜１．７ ７Ｘ１０”個のＡＷ］０８ｃＲＮＡの分子、ｌＸＰｃＲ１１衝液（２０ｍＭのト リス−ＭＣＩ、ｐＨ８，０，５０−ＭのＫＣＬ、２ｍＭのＭｇ　ＣＩｇ　、　１ 　０　０　ｕ　ｇ／ｍｌのＢＳＡ）　、１ｓＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのｄＮＴＰ 、１０ユニツトのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒ。

ｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ＋　Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、ｏ、１ Ｍｇのオリゴ（ｄＴ）１２〜１Ｂ及び１００ユニツトのＢＲＬモロニー（Ｍｏ　 Ｉ　ｏｎｅｙ）ＭｕＬＶ逆転写酵素（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａ ｂｏｒａｔｏｒｒｅｓ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　Ｍａｒｌｙｌａｎｄ＞を含む逆 転写反応体１０μｍを調製した。この反応体を３７℃で６０分間インキュベート し、９５℃で５〜１０分間加熱し、次いで氷の上で冷却せしめた。

旦−増整工丘 このｃＤＮＡ反応混合物の１／１０を０．１ｌ１ｇ／μｌのｔＲＮＡによって３ 倍希釈系列において希釈し、その後総容量５０ｕ１における最終濃度１ｘＰＣＲ １１衝液、５０ａＭのｄＮＴＰ、０．１ＭＭの各５′及び３′プライマー、１× １０’ｃｐ曽のｊｔｐ末端１ｍ化プライマー並び１ユニツトのＴａ９　ＤＮＡポ リメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅａｇｅｒ　Ｃｅｔｕｓ、　Ｎｏｒｗａｌｋ、　Ｃ 。

ｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）に調整した。蒸発を防ぐためにこの混合物上１００μｍの 鉱油を載せ、その後バーキンーエルマーシータスーサーマル　サイクラ−（Ｐｅ ｒｋｉｎ−Ｅｌｓｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ）を用いて ２５周期にわたり増幅せしめた。他方、上記と同一の条件を用い、周期の回数を 変えながら、このｃＤＮＡ反応混合物のｌ／１０を増幅せしめた。この増幅方法 は９５℃で３０秒間の変性、５５°Ｃで３０秒間のプライマーのアニール化、そ して７２℃で１分間の伸長を含む、オリゴヌクレオチドはポリヌクレオチドキナ ーゼを用いることによってγ−”Ｐ−ＡＴＰによりｆｉｌｌせしめ、そして一体 化されなかったヌクレオチドはパイオーゲル（Ｂ　ｉ　ｏ−Ｇｅ　ｌ）　Ｐ−４ カラムによって除去した。

Ｌ−足ｌ公近 １０μｌの各ＰＣＲ反応混合物を、トリス／ボレート／ＥＤＴＡ緩衝液中で８％ のポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動させた。ゲルを臭化エチジウムによ り染色し、そしてＵＶ−光照射のもとで写真撮影した。適切なハンドをこのゲル から切り出し、そしてセレンコブ　カウンティング（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ　ｃｏｕ ｎｔｉｎｇ）により放射活性を測定した。切り出したゲルバンドから回収される 放射活性の値を該鋳型濃度に対してプロットした。データーはスライド−ライト プラスプログラム（Ｓｌｉｄｅ−Ｗｒｉｔｅ　Ｐｌｕｓｐｒｏｇｒａｍ）（Ａｄ ｖａｎｃｅｄＧｒａｐｈｒｃｓ　５ｏｆｔ１１ａｒｅ＞による指数曲線フィッテ ィングによりプロットした目的ｍＲＮＡの量はＡＷ　Ｉ　ＯＢ　ｃ　ＲＮＡ内標 準曲線に対する外挿によって定量した。

Ｇ、ノーザンブロノト ＲＮＡを、ホルムアルデヒドを含む１．５％のアガロースゲルにおいて電気泳動 させ、そして２０ｘＳＳＣ（ｌｘＳＳＣは０．１５Ｍの塩化ナトリウム及び０． ０１５Ｍのクエン酸ナトリウムを含む）中でニトロセルロースフィルターに移し た。このプロットを、−１当り２Ｘ１０’ｃｐ■の３２Ｐ−末端標識化オリゴヌ クレオチドとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、０．７５Ｍの Ｎ　ａ　ＣＩ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム、９Ｈ７，０１２０＃Ｍのリ ン酸ナトリウム、ｐＨ１，０，５ｍＭのＥＤＴＡ、−１当り２００Ｍｇの酵母Ｒ ＮＡ及び１％のサルコシル（ｓａｒｋｏｓｙｌ）（ｓｉｍｇｍａ）中において５ ５℃で４時間にわたった。このプロットを１ｘｓｓｃ中で５５℃、３０分間洗浄 し、そして〜７０°Ｃにて増悪スクリーンによりオートラジオグラフせしめた。

Ｈマクロフ　−ジ ヒト末梢血液単球を軟膜調製物から、フィコル／ヒバク勾配遠心、その後の１時 間にわたるプラスチックへの吸着により単離した０次に吸着細胞を取り出し、そ して２％の仔牛血清及び２０００ユニツト／■ｌの組換マクロファージ−コロニ ー刺激因子（Ｃｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、 　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）の添加されたＲＰＭＩＩ６４０培地中において、６ウ エルプレート上に１０−細胞数／ウェルで再培養せしめた。１０日後、この半分 の培養物を５μｇ／ｍｌのＬＰＳ　（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）により処理した。核酸単 離のために５時間後に全ての培養物を集成した。

−り一旦ユＪ■１に粁 頚動脈試料を唖者の同意の上で手術の際に採取した。Ｍ識学的に正常な冠状動蕨 のＲＮＡを心臓移植受容者から回収し叉ＪｉｌＬλ ヒトマクロファージ　ＲＮＡ０テ　における±Ｌ−１ｅ＜ＩＬ１ 本方法の実施例として、ヒトマクロファージのＬＰＳ誘発培養物から単離したＩ Ｌ−１αｍＲＮＡの量を測定するためにＡＷ１０Ｂ内標準品を利用した。この分 析を行うために２通りのプロトコールを利用した。第１の場合において、標準曲 線を作製するために、鋳型及び標準ｍＲＮＡの量を段階希釈によって変更せしめ た。第２の場合において、増幅周期数を変え、そしてＰＣＲ生成物の量に対して プロットした。

Ａ、。の　−えることによるｍＲＮＡの５０ｎｇの全マクロファージＲＮＡと１ ．７７Ｘ１０”個のＡＷ１０８ｃＲＮＡ分子を混ぜ、その後ＣＤＮＡへと逆転写 させた。１／１０のこのＣＤＮＡ混合物の段階的３倍希釈液を表１に挙げたＩＬ −１α特異性プライマーを用いて増幅せしめた。約Ｉ　Ｘ　１０　”　ｃｐｓの ３１ｐ末端標識化５′プライマーをこの増幅に含ませている０反応生成物をゲル 電気泳動により分離させ、そして臭化エチジウム染色によって識別化させた（図 ２Ａ）、切り出したバンドから日収される放射活性の値を鋳型１度に対してプロ ットした（図２Ｂ）、この実験において、標的ｍ　ＲＮ　Ａ及びＡＷ１０８ｃＲ ＮＡを段階的３倍希釈の後に増幅させ、そしてこの結果は、この方法が３倍以下 のＲＮＡｆｉ度における相違を分析できることを示唆した。

ＡＷ　１０８　ｃ　ＲＮＡとＩＬ　１αｍＲＮＡ増幅の反応速度がＰＣＲ反応の 指数期において同一である事実は、ＡＷ１０８ｃＲＮＡについての標準曲線を作 製し、そしてマクロファージ中のＩ　Ｌ−１ｃｒｍＲＮＡに関するコピー数に対 する外挿を可能にする０図２Ｂにおいて示す遺り、ｌｎｇのＬＰＳ−誘発マクロ ファージ全ＲＮＡとｌＸｌ０’個のＡＷ１０８ｃＲＮＡの分子は同量のＩＬ−１ αＰＣＲ生成物を提供した。言い換えるならば、ｌｎｇのＬＰＳ誘発マクロファ ージＲＮＡは１×１０４個のＩＬ−１αｍＲＮＡの分子を含む。

Ｌｌｍ　、　を・えることによるｍＲＮＡの５００ｎｇの全マクロファージＲＮ Ａを１．７７Ｘ１０’個のＡＷ１０８ｃＲＮＡの分子により逆転写せしめた。こ のＣＤＮＡ混合物の１／１０を含むアリコートのそれぞれをプロトコールＥと同 一の条件のもとて１４，１６．１Ｂ、２０゜２２．２４．２６又は２８周期の増 幅にかけた。切り出したハンドから日収される放射活性の値を周期の回数の関数 としてプロットした（図２Ｃ）、増幅の速度は両方の鋳型に関して１４〜２２回 の周期の間にて上敷的であった。２４．２６及び２８回の周期では、速度は劇的 に減少しそしてプラトーに達した。増幅の効率はこれらの曲線の傾きからめ、そ してＡＷ１０８ｃＲＮＡ及びＩＬ−１αｍＲＮＡの両方に関して８８％であるこ とが分った。増幅効率は指数斯において両方の共増幅標的に関して同一であるた め、ＩＬ−１ｃｒｍＲＮＡの絶対値は を採用して、ＡＷ１０８ｃＲＮＡ内標準品との比較によりめられうる（式中Ｎｏ は材料の初期量、そしてＮは増幅の程度である）、この方法によりめられるＩＢ のｔｒ＞ｓ誘発マクロファージ全ＲＮＡ中のＩＬ−１αｍＲＮＡの量は１．１× １０４分子数である。従って、この二通りの択一的な方法のいづれかを利用する 定量についての結果は同しであった。

Ｃ，ＰＣＲとノーザン　との　、 定量的ＰＣＲ方法により測定されたｔ、ｐｓｇ発マダマクロファージ中Ｌ−１α ｍＲＮＡの量をノーザンプロット分析によって確認した。このＰＣＲ分析（上記 参照）は、ｌｎＨのマクロファージＲＮＡとＩＸ］、Ｏ’個のＡＷＬＯ８ｃＲＮ Ａ分子が同量のＩＬ−１αＰＣＲ生成物を作り出すことを示した。

マクロファージＲＮＡ及びＡＷ１０８ｃＲＮＡの２倍段階希釈物を、ＩＬ−１α ３′プライマーによるプローブ化によるノーザンプロット分析にかけた。標的Ｒ ＮＡ分子のサイズは、マクロファージ中のＩＬ−１αｍＲＮＡに関しては〜２， ２００ヌクレオチド、そしてＡＷ１０８ｃＲＮＡに関しては１０２６ヌクレオチ ドと予測される０図３において示す通り、マクロファージＲＮＡ及びＡＷＩ０８ ｃＲＮＡの全ての希釈物にて同等の強さのハイブリダイゼーションシグナルが検 出された。この結果は、定量ＰＣＲ方法により予測されたｍＲＮＡの量がノーザ ン分析の結果と相互関係を有すことを示した。

スｍ ブーイマー力　の　の六 ＰＣＲ増幅の効率に影響することができる変異要因は多数ある。容易にコントロ ールできるいくつかのパラメーターには鋳型、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ□、プライマ ー、ポリメラーゼの濃度及びＰＣＲ周期プロフィールが含まれる。しかしながら 、プライマー効率における相違は定量分析のための制御が困難なパラメーターで ある。定量ＰＣＲ方法におけるプライマー効率を分析するため、７種のプライマ ーセット：ＩＬ−１β、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｒ，ｒＬ−２ 、ＬＰＬ及びａｐｏ−ＥのＰＣＲ増幅のための鋳型としてＡＷ１０８ｃＲＮＡを 利用した０図４において示す通り、同−ＰＣＲ増幅条件のもとてのこれら異なる プライマーセットによる増幅の効率は、数段の桁の範囲にわたって変化した。

例えば［Ｌ−１βプライマーはａｐｏ−Ｅプライマーよりも１０’倍より効率的 であった。従って、ＰＣＲによるｍＲＮＡ発現性の定量のためあらゆる試みにお いて標的ｍＲＮＡ及び内積本島の増幅のためには同一のプライマーを利用するこ とが重要である。

ＩＪＬ炎土 びＬＰＳ＝　マクロファージ　の特　の二且Ｎへ■足１ 零ＰＣＲ定量技術の主なる利点は、本方法が平行して複数の標的ｍＲＮＡの種類 の分析を可能にすることにある０表■は、ＬＰＳ処理に応答したヒトマクロファ ージ中の６種のサイトカインの発現レベルの定置からの結果を示す。Ｌｐｓ誘発 後のＩＬ−１β及びｆＬ−１αｍｆ？ＮＡのレベルばおよそ５０倍上昇した。Ｐ ＤＧＦ−Ａ、Ｍ−Ｃ５Ｆ及びＴＮＦに関するｍＲＮＡのレベルは５〜１０倍上昇 した。しかしながら、ＰＤＧＦ−ＢｍＲＮＡのレベルはコントロールとＬＰＳ− 処理細胞に関して一定であり続けた。各ｍＲＮＡの絶対量を測定したため、この 手法はマイクロダラム程度の全ＲＮＡを用いて、休息中及び誘発状態の両方にお ける転写表現型の詳細な、且つ多面的な情況を提供する。

ｊＬ ｌｐＳｉｌｌ−び　逢　ヒトマクロファージ゛　ののｍＲＮＡレベル　１ 可へｍ腫　末透光　ｎ　透虜しク１え発ＩＬ−１α　１．４　６９　４９ ｒＬ−１β　５１　２，９５０　５８ ＰＤＧＦ−Ａ　Ｏ，０５０，４８１０ ＰＤＧＦ−Ｂ　Ｏ，４７０，４７１ Ｍ−Ｃ３Ｆ　Ｏ，０６０，４７Ｂ ＴＮＦ　１．８　８．４　４．７ 本分子数／細胞＝分子数／μｇＲＮＡ（図２において計算の通り）×細胞毒り単 離されたμｇＲＮＡ十単球由来マクロファージを１０日間培養した。収集の５時 間前に培養物の半分を５Ｍｇ　／　ｓ　ＩのＬＰＳにさらした。

１１１１足 びアテローマ　ヒト　の 少量の材料によってさえも本技術によって正確な定量結果を得ることができるた め、本発明は未処理な、又は限られた量の試料、例えばインビボ由来生検断片の 分析のための重要な手段である０例として、表■はアテローマ硬化症預動脈及び 正常頚動脈の、ヒト由来の６種のｍＲＮＡの定置結果の比較を示す、これらのデ ーターはアテローマ硬化症血管において、ＰＤＧＦ−Ａ及びＰＤＧＦ−ＢｍＲＮ Ａのレベルにおいて３〜５倍の上昇を示し、β型ＰＤＣ，Ｆリセブタ−（ＰＤＧ Ｆ−Ｒ）においては変化は示されず、そしてＬＤＬリセプターにおいて１／３へ の減少を示した。疾病組織においてＩＬ−１α及びＩＬ−１αｍＲＮＡのレベル の上昇があった。

ｌ一度 びアテローマ　にお）る　の ｍＲＮＡ１ｚベル　ＲＮＡ　１ １凡ｍ鼠　１迂」≧ゴｊ４匿虜　Ｊ ＰＤＧＦ−Ａ　１．８　Ｘ　１０’　３．３　Ｘ　１０’ＰＤＧＦ−Ｂ　７．６ 　Ｘ　１０’　２．２　Ｘ　１０’ＰＤＧＦ−Ｃ１，Ｉ　Ｘ　１０’　１．４　 Ｘ　１０’ＬＤＬ−Ｒ４，ＯＸ　１０’　１．３　Ｘ　１０’ＩＬ−１α　１． ＯＸ　１０”　ＮＯ”ＩＬ−１β　６．４　ｘ　１０’　１．０　ｘ　１０”＊ 図２において計算の通り ÷ＮＤ、検出不能 分子生物学、医療診断技術、生化学、ウィルス学、遺伝子学及び関連する分野に おける当業者によってなされる本発明のＵ様のその他の改良は、添付する請求の 範囲に含まれるであろう。

特表平５−５０４８８６　（１２） ”０．２Ａ　Ｍｌ　２３４５６７ ＦＩＧ、　２Ｂ ＰＭ ＦＩＧ、　２Ｃ 周期数 ＦＩＧ、　３ マク。ファージＲＮＡ　ＡＷ１０８ｃＲＮＡｂ −−−１０２６ｎｔ− 国際調査報告 ｌＩＩｌｅｍｓｌ＋ｅｅｔｌｓｖｅｓ１０−１＋ｍＩＩＬＰＣＴ／ＵＳ９０１０ ４７０７国際調査報告 ｙｈ＋＋ＩＭＲｔｔ’ｌ■ＩＩＩＩｓａＩｊｌｅＩＩＩＩＩＭ＋１９ｍｅｍｍｍ −當瑠ｅｌ＋ｅｔｈｅｅｓ１Ｍｌｄｅｃ＋＋ｌ内−ｔマｖ菅|ｃ１電ｅｄｉｓ＋ ｗｅ−−ｍｅ＊＋＋ｅ＋＋＊鴫１ｉ１１１Ｑ１１−一電購自１１１１１１ヂｙ＋ ｔｒｅｐローｒ電。

Ｔｍｍｅｍｏ−Ｐ啼−ミＮｎＩＩｅ６１１＋ａ＋Ｍ喝−−−−１畷ｈｅ［υ１□ １１コー、、Ｐ−、、ｌ０１１１−−ｔｏｐ＋：贈−２８／P１／９０ ＴｈＩＩ［ｗｍｅｅａｅＰａｎｓ＋ａ＋Ｉｌｃ＊＋ｉ＋ｎｓｅ１−ｒｌｒｌｒｍ ｌ−・・１ｍ＋＋ｗ＋酵＊ＨデＩｌｅｗｌｓｒｗ＋ｈ＋＋＋qａｍ□ｇｔ１−曙 デ＋＋１ｍ１％ｅｐｖ＋１−−シ１１ｅａｌｉ＊Ｉａｒ＋＋＋ｍ＋Ｉｅ＋ｗ

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．試料中の標的核酸セグメントの定量のための方法であって、以下の段階： （ａ）該試料に一定量の標準核酸セグメントを加え；（ｂ）該試料をポリメラー ゼ連鎖反応を実施するために適する条件のもとで処理し（ここで該核酸を一本鎖 にし、そして重合のための試薬、デオキシヌクレオシド５′三リン酸及び一対の オリゴヌクレオチドプライマーに暴露せしめ、ここで該プライマーは該標的及び 該標準核酸セグメントの両方とハイプリダイズすることができ、これによって該 プライマーそれぞれは該標的及び該標準核酸セグメントのそれぞれのＤＮＡ鎖に 基づく伸長生成物の合成を開始せしめるために働くことができ、これによって該 プライマーの一方の伸長生成物が鋳型として分離される際に該対の他方のプライ マーの伸長生成物の合成のための鋳型として働くことができる）；（ｃ）一本鎖 分子を提供するために、該プライマー伸長生成物を、それらが合成された鋳型か ら分離させ；（ｄ）段階（ｃ）において作られる該一本鎖分子に基づいて少なく とも１回、段階（ｂ）及び（ｃ）を繰り返し（ここで段階（ｂ）及び（ｃ）は増 幅の１周期とする）；（ｅ）段階（ｄ）において作られる増幅せしめた該標的及 び該標準セグメントの量を測定し；そして（ｆ）増幅前に該試料中に存在する該 標的核酸セグメントの量を、段階（ｄ）において作られる増幅せしめた該標的及 び該標準セグメントから計算すること；を含んで成る方法。
2. ２．請求項１に記載の方法であって、前記の標的核酸セグメントがｍＲＮＡ分子 であり；前記の標準核酸がｃＲＮＡ分子であり；そして前記のＲＮＡを段階（ａ ）の後且つ段階（ｂ）の前にｃＤＮＡ分子へと逆転写せしめる方法。
3. ３．請求項２に記載の方法であって、前記の標的核酸セグメントがｍＲＮＡ配列 の中に含まれ、ここで該ｍＲＮＡ配列はリンホカインをコードする、方法。
4. ４．請求項２に記載の方法であって、ここで前記の標的核酸セグメントがＴＮＦ 、Ｍ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ａｐｏ−Ｅ、ＬＤ Ｌ−Ｒ、ＨＭＧ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＬＰＬ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ａ ＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ｃ−ｆｍｓ、ＴＧＦ−β、ＬＦＡ−１、ＩＬ−２Ｒα、α− アクチン、デスミン、β−アクチン、ＩＬ−６、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ −６Ｒ、ＰＤＧＦ−αＲ、ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−３、ＩＬ−４及びＨＩＶタンパ ク質より成る群から選ばれるタンパク質をコードする核酸配列において含まれる 方法。
5. ５．請求項２に記載の方法であって、前記のｃＲＮＡ分子の核酸配列が、ｐＡＷ １０８及びｐＡＷ１０９より成る群がら選ばれるプラスミド鋳型を利用して合成 される方法。
6. ６．請求項２に記載の方法であって、前記の試料がヒト血液細胞試料又はヒト動 脈血管試料である方法。
7. ７．標的核酸の定量のための内標準品を提供するためのプラスミドであって、こ こで該プラスミドは該標的核酸セグメントにおいて含まれている核酸配列と同一 のＤＮＡ配列の並んだ列を含んで成り、これにより、一対のオリゴヌクレオチド プライマーがＰＣＲ反応において該プラスミドＤＮＡ配列及び該標的核酸セグメ ントのそれぞれに含まれている核酸のセグメントを増幅せしめることが可能であ り、これによって該増幅標的核酸及び該増幅標準核酸セグメントが区別されるこ とができる、プラスミド。
8. ８．請求項７に記載のプラスミドであって、ここで該プラスミドがＴ７ポリメラ ーゼプロモーターを更に含んで成り、これによりｃＲＮＡ分子が前記の並んだ列 を鋳型として用いて製造されることができるプラスミド。
9. ９．請求項８に記載のプラスミドであって、該プラスミドがポリアデニル化配列 を更に含んで成り、これにより前記のｃＲＮＡ分子がオリゴ（ｄＴ）プライム化 逆転写反応における鋳型として利用できるプラスミド。
10. １０．請求項９に記載のプラスミドであって、ここで前記の内標準品が２〜３２ 種の標的核酸セグメントの定量に適するプラスミド。
11. １１．請求項１０に記載のプラスミドであって、前記の標的核酸セグメントがＴ ＮＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ａｐｏ−Ｅ、 ＬＤＬ−Ｒ、ＨＭＧ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＬＰＬ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ 、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ｃ−ｆｍｓ、ＴＧＦ−β、ＬＦＡ−１、ＩＬ−２Ｒα、 α−アクチン、デスミン、β−アクチン、ＩＬ−６、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、 ＩＬ−６Ｒ、ＰＤＧＦ−αＲ、ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−３、ＩＬ−４及びＨＩＶタ ンパク質より成る群から選ばれるタンパク質をコードする核酸配列の中に含まれ ている、プラスミド。
12. １２．請求項１１に記載のプラスミドであって、ここで該プラスミドがｐＡＷ１ ０８及びｐＡＷ１０９より成る群から選ばれるプラスミド。
13. １３．生物試料中の特定の標的核酸セグメントの定量のためのキットであって、 内標準品；及び 少なくとも１組のオリゴヌクレオチドプライマー（ここで該プライマーの組は該 内標準品に含まれている核酸セグメントを増幅せしめるために働くことができる ）；を有する独立の容器を含んで成るキット。
14. １４．逆転写酵素を更に含んで成る請求項１３に記載のキット。
15. １５．請求項１４に記載のキットであって、ここで前記の内標準品がｃＲＮＡ分 子であるキット。
16. １６．請求項１５に記載のキットであって、ここで前記のｃＲＮＡが２〜３２腫 の標的核酸セグメントの定量に適するキット。
17. １７．請求項１６に記載のキットであって、前記の標的核酸セグメントがＴＮＦ 、Ｍ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ａｐｏ−Ｅ、ＬＤ Ｌ−Ｒ、ＨＭＧ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＬＰＬ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ａ ＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ｃ−ｆｍｓ、ＴＧＦ−β、ＬＦＡ−１、ＩＬ−２Ｒα、α− アクチン、デスミン、β−アクチン、ＩＬ−６、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ −６Ｒ、ＰＤＧＦ−αＲ、ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−３、ＩＬ−４及びＨｌＶタンパ ク質より成る群から選ばれるタンパク質をコードする核酸配列に含まれているキ ット。
18. １８．請求項１６に記載のキットであって、前記のｃＲＮＡがｐＡＷ１０８ｃＲ ＮＡ又はｐＡＷ１０９ｃＲＮＡであるキット。
19. １９．請求項１４に記載のキットであって、熱安定性ポリメラーゼ及びポリメラ ーゼ直鎖反応に適切な緩衝剤を更に含んで成るキット。