JPH11137265A

JPH11137265A - 新規なパン用食品添加組成物

Info

Publication number: JPH11137265A
Application number: JP10216876A
Authority: JP
Inventors: Beckhoven Rudolf Franciscus W C Van; フランシスクスウィルヘルムスコルネルスファンベックホーヴェンルドルフ
Original assignee: Gist Brocades NV
Current assignee: Gist Brocades NV
Priority date: 1997-07-31
Filing date: 1998-07-31
Publication date: 1999-05-25
Also published as: US20020102327A1; AU744387B2; EP0897667B2; DE69827712D1; CA2239250C; PT897667E; US6656513B2; ES2234067T3; ATE282963T1; DE69827712T3; DK0897667T3; DE69827712T2; EP0897667A2; ES2234067T5; AR013382A1; BR9802800A; DK0897667T4; AU7857598A; CA2239250A1; EP0897667B1

Abstract

(57)【要約】【解決課題】パンを改良する活性を有し、生地に対し
て負の副作用を持たない組成物を得ること。【解決手段】セロビオヒドロラーゼを含むパン改良用
組成物、その製造方法、およびパン製造におけるその使
用。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はパン製造において酵
素をパンの改良活性剤としての使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】パン改良活性とはベーキングされる製品
の何らかの性質（特にパンのパン容積および／又は団粒
構造）を改良するものの一つであり、かつ／又は生地の
何らかの性質を改良するものである。本明細書を通して
「パン容積」は内容が適切である限り「ベーキングされ
た製品の容積」と解されるべきである。パン改良用組成
物(improving composition) は、一般に穀粉、水、酵母
および塩である基本的な成分に加えて生地に添加され
る。酵素によって影響を受ける最も重要なパンの特徴の
ひとつはパン容積である。大きなパン容積を得るために
ヘミセルラーゼおよび／又はデンプン分解酵素を含む組
成物を添加することができる。ヘミセルラーゼは穀粉中
の非- デンプン性多糖を加水分解できる酵素として規定
される。商業的に入手可能な組成物は大部分は、アスペ
ルギルス（Aspergillus)またはトリコデルマ（Trichode
rma)のような真菌類に由来する。これらの組成物は異な
る酵素活性の未精製混合物である。従来、エンド- キシ
ラナーゼおよびアラビノフラノシダーゼがパン改良用組
成物の活性に貢献することが明らかにされている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】パンの製造にヘミセル
ラーゼ調製物を使用すると、最終の焼き上がり製品の膨
らみ(oven spring) 、パン容積および穀粒構造が改良さ
れる。しかしながら、ヘミセルラーゼ調製物が高含量で
使用されると生地が緩くなり、かつ粘るようになる。こ
のためにヘミセルラーゼ調製物の使用が限定される。こ
の問題はグルコースオキシダーゼの添加により解決でき
るが、余分な酵素を加える必要があるのが欠点である。
よりよい状況というのは、パンを改良する活性を有し、
生地に対して負の副作用を持たない酵素が入手できるこ
とであろう。このことは乳化剤を完全に酵素で置き換え
る可能性を高めるものである。化学添加物に対する消費
者の抵抗は大きくなっており、従って乳化剤を酵素のよ
うな消費者フレンドリーな添加物で置き換えることの需
要は常にある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、パンの製造の
ためのパン改良活性のあるセロビオヒドロラーゼ (CBH)
の使用方法を提供する。セロビオヒドロラーゼはCBH-I
が好ましい。もっとも重要な効果は、生地のねばつきに
よる生地の取扱い性の悪化を伴わずにパン容積が改良さ
れ、団粒構造が改良されることである。CBH は微生物起
源であることが好ましく、真菌のCBH の使用がより好ま
しい。例えばCBH はトリコデルマ（Trichoderma)または
アスペルギルス（Aspergillus)から得られる。CBH-I は
Ｔ．レエセイ（T.reesei）、Ｔ．ロンギブラキアタム
（T.longibrachiatum)、Ｔ．ビリデ（T.viride）から得
られる。トリコデルマ・レエセイ（Trichoderma reese
i）のセロビオヒドロラーゼＩおよびIIはそれぞれ欧州
特許公告0 137 280 および米国特許4,894,338 に記載さ
れている。CBH I はまたツクリタケ（Agaricus bisporu
s)、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Phanerochaet
e chysosporium）、トリコデルマ・ビリデ(Trichoderma
viride)およびヒュミコラ・グリセア（Humicolagrise
a)においても同定されている。本発明は、パン改良活性
のある組成物で、他の基本的な生地成分に添加したとき
に充分な量のCBH を含む組成物も開示する。本組成物は
また効果的な量のα- アミラーゼおよび／またはエンド
- キシラナーゼを含む。

【０００５】「効果的な量」とは、目的とする効果につ
いて測定可能な効果を与えるに充分な酵素の量を意味す
る。CBH の場合、この効果とはパン容積の改善または団
粒構造の改善に関する測定可能な効果であろう。CBH は
小麦粉の0.3 ％しか構成しないセルロースに働くので、
CBH がベーキングに影響を与えるという事実は驚くべき
ことである。CBH はセルロースの1,4-β-D- グルコシド
結合を加水分解しセロビオースを遊離させる。可能な説
明は、CBH が胚乳の細胞壁にあるセルロース- キシラン
境界面に働くのであろうということである。

【０００６】上述したように、トリコデルマおよびアス
ペルギルスのエンド- キシラナーゼの商業的調製物の使
用は公知である。このような調製物中には微量のCBH が
存在するが、そのCBH の量は生地またはパンを改良する
のために役立つには不十分である。本発明によりCBH は
単独で、または、パン改良活性のある他の酵素、好まし
くはエンド- キシラナーゼと組み合わせて使用すること
ができる。エンド- キシラナーゼはアスペルギルスまた
はトリコデルマから得ることができる。一般には、本発
明の組成物の使用により生地の取扱い性がよくなり、同
時に最終の焼き上がり製品の容積および団粒構造が改善
されるであろう。CBH の使用によりパン用食品添加物、
すなわち、パン改良用組成物の統制された最適化が可能
である。当業者であれば生地に加えることのできる最適
な量を見つけることができるであろう。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明の組成物は通常のパン改良
用成分および酵素、例えば、キシラナーゼ、α- アミラ
ーゼ、エンド- キシラナーゼ、アラビノフラノシダー
ゼ、β- アミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、プロテ
アーゼまたはリパーゼと組み合わせて用いることができ
る。従って、CBH はパン改良用組成物に含めることがで
きる。「パン改良用組成物」とはベーキングに慣習的に
用いられる物質（すなわち、穀粉、水、酵母、任意的に
塩）以外の物質を含み、生地および／又は焼き上がり製
品の性質を改良するために用いることのできる組成物を
意味する。CBH はプレミックスに含めることもできる。
「プレミックス」とは一般には穀粉を含むベーキング用
材料の混合物であって、生地作りの過程を扱いやすくす
るために調製されるものをいうと解されている。通常プ
レミックスは生地を調製するのに必要な水を含まないで
あろう。本発明の生地は、少なくとも１kgの穀粉あたり
0.5mg のCBH 、好ましくは１kgの穀粉あたり１mg、より
好ましくは１kgの穀粉あたり５mgより多いCBH 、さらに
好ましくは１kgの穀粉あたり10mgより多いCBH を含む。
一般には、CBH の量は１kgの穀粉あたり100mg より少な
く、好ましくは１kgの穀粉あたり50mgよりも少ない。

【０００８】参考文献 Goosen, T., Engelenburg, F. van, Debets, F., Swar
t, K., Bos,K., Briek,H. van den, (1989) Mol. Gen.
Genet. 219: 282-288 Harmsen, J.A.M. et al., (1990) Curr. Genet. 18: 16
1-166 Maniatis T., E. F. Fritsch, J. Sambrook (1982): Mo
lecular cloning,a laboratory manual; Cold Spring H
arbor Laboratory, New York. Murray, N.(1977) Mol. Gen. Genet. 150: 53-58 Saiki R.K. et al. (1988) Science, 239, 487-491 Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989) I
n:Molecular Cloning: a Labatory Manual, 2nd edn.,C
old Spring HarborLabatory Press , NY. Visniac, W. and Santer, M. (1957), Bact. Rev. 21:
195-213

【０００９】

【実施例】実施例１ CBH-1 はトリコデルマの菌株から得た。この菌株はセル
ロース分解酵素を誘導するためセルロースを含む培地で
増殖させた。発酵後、ブロスを濾過し、滅菌濾過し、限
外濾過にかけ噴霧乾燥した。この工程の産物0.5kg を２
Ｌの50mM NaAcpH5 に再懸濁し、その混合物を4000rpm
で15分間遠心した。透明な上清を、伝導度２mSより低く
なるまで限外濾過した。約３グラムのタンパク質を50mM
NaAc pH5 で平衡化したA DEAE(バイオゲル（Biogel)
A) カラムにかけた。CBH I 濃縮分画を、Ａに溶解した
Ｂの０％〜100 ％直線勾配で溶出した。ここで、Ａとは
50mM NaAc pH5 を含むバッファーであり、Ｂはバッファ
ーＡに溶解した１MNaCl であって、pHを５に調整したも
のである。CBH-I 濃縮分画を、10mM NaAc pH3.6 の伝導
度よりも低い伝導度となるまで限外濾過した。CBH I サ
ンプルを10mM NaAc pH3.6 で平衡化したモノＳ（MonoS)
カラムにかけた。Ａに溶解したＢの０％から10％の直線
勾配と、その後Ａに溶解したＢの10％から100 ％の勾配
によりCBH I を溶出した。ここで、Ａとは10mM NaAc pH
3.6 であり、ＢとはＡに溶解した１M NaClである。各溶
離分画中のタンパク質濃度は定量的アミノ酸分析によっ
て決定した。精製した産物はタンパク質を７mg／mlで含
み、SDS-電気泳動の判断では純粋であった。

【００１０】実施例２ CBH-1(実施例１を参照せよ）を以下の配合でフルスケー
ルのベーキング試験でテストした。＊穀粉 2000ｇのKolibri （Meneba）
と500gのIbis(Meneba) ＊水 1305g ＊酵母塊 50g （コーニングスギスト
(Konings gist)）＊塩 50g ＊砂糖 12.5g ＊アスコルビン酸 25ppm ＊フェルミザイムP200 20ppm(Fermizime(TM)) （ギスト・ブロカデス（Gist-brocades)より入手可能な
真菌類α- アミラーゼ）＊任意成分フェルミザイムHS 2000 及び／またはCBH-1(トリコデル
マ）（表１参照）

【００１１】この材料を一緒に混合し、それを用いて90
0gの生地を作った。これらの生地を発酵させた。１次発
酵は30℃で30分間、２次発酵は30℃で40分間とした。生
地の形を整え、最終発酵を35℃で70分間行わせた。次に
250 ℃で30分間このパンを焼いた。焼き上がったパン塊
を冷ましレイプシード置換法（rapeseed displacement)
を用いてパン容積を測定した。他の性質も測定した。得
られた結果は表1 に示した。各ベーキング試験は三重に
行った。これらの３つの試験は並行して行った。パン塊
の評価値は３つの塊について得られた結果の平均とし
た。生地の特徴及び団粒構造は熟練したパン職人が判断
した。

【００１２】

【表１】表１．添加物添加量（mg/kg 穀粉）生地の扱いやすさ ────────────────────────────────── 無添加 0 フェルミザイムHS2000 60 0 フェルミザイムHS2000 120 −− CBH-1 3.5 + CBH-１ 7 +++ フェルミザイムHS2000 60 +++ およびCBH-1 3.5 フェルミザイムHS2000 60 +++ およびCBH-1 7 ──────────────────────────────────

【００１３】

【表２】表１．（続き）添加物体積体積増加（％）団粒構造 ─────────────────────────────────── 無添加 3831 0 −− フェルミザイムHS2000 4099 7 ＋フェルミザイムHS2000 4291 12 − CBH-1 4090 7 + CBH-１ 4215 10 ＋＋フェルミザイムHS2000 4294 12 ＋＋およびCBH-1 フェルミザイムHS2000 4401 15 ＋＋＋およびCBH-1 ─────────────────────────────────── −− ＝非常に乏しい − ＝乏しい０＝普通＋＝良好＋＋＝かなり良好＋＋＋＝優秀

【００１４】フェルミザイムHS2000はギスト・ブロカデ
スから入手可能な黒色こうじ菌（A. niger) エンド- キ
シラナーゼ調製物である。表１の結果から分かるように
CBH-1は、単独で用いてもフェルミザイムHS2000と組み
合わせて用いてもパン生地の取り扱いやすさとパンの団
粒構造を改善する。

【００１５】実施例３黒色こうじ菌のCBH をコードする遺伝子をクローニング
し、実施例５に記載したようにそのクローン化した酵素
を発現させることによってCBH のサンプルを調製した。
実施例２に記載したのと同じ手順によってベーキング試
験を行った。穀粉１kgあたり、発現させた黒色こうじ菌
のCBH を2.5mg 加えた。これにより、パン塊の体積は10
％増加し、CBH を加えなかった対照に対して生地の取り
扱い性が改良され、団粒構造が改良された。

【００１６】実施例４実施例２に記載したベーキング試験を行った。ただし、
使用する穀粉はクルート（Kluut)粉（Meneba）とし、異
なる型の混合機を用いた。トリコデルマのCBH-1 （実施
例１参照）を商業的に入手可能なトリコデルマ調製物
（ヘミセルラーゼ）に加えて添加した。このヘミセルラ
ーゼ調製物は15ppm(推奨されている添加量は３〜20ppm
であった）で試験した。図３に示すように、ヘミセルラ
ーゼ調製物による増加に加えて有意な体積増加を得るこ
とができた。ヘミセルラーゼもCBH-1 も加えない対照の
体積は2554mlであった。

【００１７】実施例５菌株大腸菌LE392（Murray、1977）：e14^-(mcrA)、hsdR514
、supE44、supF58、lacY1 または△(lac1ZY)、galK2、
galT22、metB、 trpR55

【００１８】実施例5.1 黒色こうじ菌セロビオヒドロ
ラーゼの同定黒色こうじ菌 N402 をアスペルギルス最少培地（MM)(１
リットルあたり以下を含む：6.0g NaNO₃、1.5g KH₂P
O₄、0.5g MgSO₄・7H₂O 、0.5g KCl、pH6.0 および１ml
ビシュニアック（Vishniac）溶液（1 リットルあたり、
10g EDTA、4.4g ZnSO₄・7H₂O 、1.0g MnCl₂・4H₂O 、0.32
g CoCl₂・6H₂O 、0.32g CuSO₄・5H₂O 、0.22g (NH₄)₆Mo
₇O₂₄ ・4H₂O、1.47g CaCl₂・2H₂O 、1.0g FeSO₄・7H₂O を
含みpH4.0 ）(Vishniac とSanter))に1.5 ％コムギアラ
ビノキシランを添加した培地）で増殖させた。この培地
に１mlあたり1*10⁶の胞子を接種し30℃、96時間、ニュ
ー・ブランスウィック（New Brunswick)オービタルシェ
ーカー中250rpmで菌糸体を増殖させた。ブフナー漏斗を
用いて軽く吸引してミラクロス（Myracloth)（ナイロン
ガーゼ）で菌糸体を濾過した後、培養濾液を集めた。こ
の培養濾液のpHを0.1M NaOH でpH6.0 に調整し、その後
培養濾液を２容積のミリポア水(Millipore water) を加
えて希釈した。

【００１９】DEAE- セファデックスA-50（DEAE-Sephade
x A-50）を50mM酢酸ナトリウムバッファーpH5.0 で平衡
化し培養濾液に加えた。４℃で30〜60分撹拌後、DEAE-
セファデックスを培養濾液と共にガラスフィルターホル
ダーのついた漏斗を通し、DEAE- セファデックス A-50
をカラムに移した。このカラムを最初に50mM酢酸ナトリ
ウムバッファーpH5.0 、次に、50mM酢酸ナトリウムバッ
ファーpH5.0 ＋0.5M NaCl で溶出した。発色基質4-メチ
ルウンベリフェリル- α-L- アラビノフラノシド（α-
アラビノフラノシダーゼを検出する）（シグマ（Sigma)
M-9519）で検出されるα- アラビノフラノシダーゼ活性
を含む画分を集めミリポア水に対して透析することによ
り脱塩し、次に20mMピペラジン-HClバッファーpH5.0 に
対して透析した。透析後、サンプルをDEAE- セファロー
ス・ファストフロー（DEAE-Sepharose Fast Flow）カラ
ムにのせ、このカラムをまず３容積の20mMピペラジン-H
ClバッファーpH5.0 で溶出し、次に20mMピペラジン-HCl
バッファーpH5.0 中の0.5MNaCl の直線勾配によって溶
出した。溶出されるタンパク質の検出は280nm のUV吸収
の連続測定によって行った。10mlの画分を集め、パラ-
ニトロフェニル- α-L- アラビノフラノシド（PNP-A)
（シグマ N-3641）に対するα- アラビノフラノシダー
ゼの活性をアッセイすると、α- アラビノフラノシダー
ゼ活性は画分11-27 、41-47 および52-61 に見られた。
画分41-47 を集め、続いて100mM ピペラジン-HClバッフ
ァーpH5.0 に対して透析し、サンプル全体（200ml)をDE
AEセファロース FF カラム（ファルマシア（Pharmaci
a)）にのせ、200mM ピペラジン-HClpH5.0バッファー中
の1M NaCl 勾配を用いて、単一ピークにタンパク質を濃
縮した。タンパク質を含む画分を集め(20ml)まずミリポ
ア水に対して透析し、次に20mMピペラジン-HCl pH5.0に
対して透析し、最後にスピードバック（Ｓpeed Vac）濃
縮機で6ml に濃縮した。この調製物をセファクリル S-3
00(Sephacryl S-300)カラムにかけ、20mMピペラジン-HC
l pH5.0、0.1M NaCl で溶出した。PNP-A に対して活性
を有する画分を集め、10mMピペラジン-HCl pH5.0 に対
して透析し、スピードバック濃縮機で２mlに濃縮した。
このサンプルを20mMピペラジン-HCl pH5.0、0.1M NaCl
で平衡化したスーパーデックス75（Superdex 75)（ハイ
ロードカラム（Hiload column)16/60)（ファルマシア）
カラムにのせ、20mMピペラジン-HCl pH5.0、0.1M NaCl
で溶出した。α- アラビノフラノシダーゼ活性を有する
分画を10mM酢酸ナトリウムバッファーpH3.5 に対して透
析した。最終的な精製はモノＳ（Mono S）陽イオン交換
カラム（HR 5/5、ファルマシア）で行った。このカラム
はサンプルが溶解している10mM酢酸ナトリウムバッファ
ーpH3.5 で平衡化した。27mlの10mM酢酸バッファーpH3.
5 中の1M NaCl 直線勾配によりタンパク質を溶出した。
酵素は約100mM NaClで溶出された。

【００２０】精製した酵素をユーローシーケンス（EURO
SEQUNCE)（オランダ、グロニンゲン）に送った。そこで
生成した酵素をSDS-PAGEゲルにかけタンパク質の内部配
列解析を本質的にRosenfeld らによって記載（Rosenfel
d,J., Cadevielle, J., Guillemot, J., Ferrara, P.(1
992) Anal. Biochem. 203:173-179)されたように行っ
た。アミノ酸シーケンシングはフェニルチオヒダントイ
ン(PTH) アミノ酸分析のためにHPLC（モデル120A ABI)
に繋がった自動シークエネータ（モデル477A、アプライ
ドバイオシステムズ（Applied Biosystems））を用いて
行った。以下の内部配列を決定した。

【００２１】Leu-Tyr-Leu-Met-Ser-Asp-Asp-Ser-Asn-Ty
r-Glu-Leu-Phe-Lys( 配列番号１) Leu-Gly-Asn-Thr-Asp-Phe-Tyr-Gly-Pro-Gly-Leu-Thr-Va
l-Asp-Thr-Asn-Ser-Pro-Phe-Thr-Val-Val-Thr-Gln（配
列番号２）

【００２２】驚くべきことに、単離した酵素の内部断片
の部分アミノ酸配列（配列番号１）はツクリタケ（Agar
icus bisporus)CBH I と高い同一性を示した。すなわ
ち、13残基のうち11が同一であった。これはアスペルギ
ルスのセロビオヒドロラーゼの第１の指標である。

【００２３】実施例5.2 黒色こうじ菌セロビオヒド
ロラーゼをコードするcDNAクローンの単離実施例5.2.1 プローブの作製ツクリタケ CBH I酵素はcel2遺伝子によってコードされ
ている（EMBLアクセッション番号Z50094）。cel2コーデ
ィング領域をPCR にかけるため以下の２本のオリゴヌク
レオチドを設計した。 5'-gtc ggt acc aac atg gcc g-3' (19-mer) (配列番
号3) 5'-act cag aaa cat tgg cta tag-3' (21-mer) (配列
番号4) 配列番号３および４で表されるこれらのオリゴヌクレオ
チドをツクリタケのcel2配列を含むプラスミドDNA をテ
ンプレートにするPCR に用いた（Saiki ら、1988）。

【００２４】PCR のために2ng のプラスミドDNA を５μ
l の10＊反応バッファー（200mM Tris-HCl、pH8.4 ；50
0mM KCl)，３μl 50mM MgCl₂、４μl ずつの1.25mMデ
オキシヌクレオシド三リン酸４種および50pmolのオリゴ
ヌクレオチドと混合し、最終体積を50μl とした。この
反応混合物を混ぜ、0.5 μl のTAQ ポリメラーゼ（５U/
μl ）（ライフテクノロジー（Life Technologies)）を
加えた。DNA を95℃で5 分間インキュベーションして熱
変性させ、続いて、95℃１分、52℃１分、72℃１分を25
サイクル行った。この25サイクルの後、反応混合物を72
℃で５分間インキュベーションした。反応生成物を解析
すると、1.5kb の明瞭な産物が1 つ明らかになり、これ
は期待した大きさのものであった。

【００２５】配列表フリーテキスト配列番号：３：黒色こうじ菌セロビオヒドロラーゼのコ
ーディング領域のPCR 用に設計したオリゴヌクレオチ
ド。配列番号：４：黒色こうじ菌セロビオヒドロラーゼのコ
ーディング領域のPCR 用に設計したオリゴヌクレオチ
ド。

【００２６】実施例5.2.2 1.5kb PCR 断片の³²P-ラベ
ル PCR で得られた1.5kb の断片を単離して、欧州特許公開
- 0 463 706 実施例2.2 および7.1 に記載したようにラ
ベルした。

【００２７】実施例5.2.3 セロビオヒドロラーゼcD
NAクローンに対する黒色こうじ菌 N400 cDNAライブラリ
ーのスクリーニング黒色こうじ菌cDNAライブラリーの構築はWO 96/06935 に
記載されている（実施例３）。cbh cDNAクローンについ
て黒色こうじ菌N400 cDNA ライブラリーのスクリーニン
グをするため、プレートあたり５＊１０³pfuを、Maniat
isら、（1982, pp.64）に記載されたように直径85mmのN
ZYCM （1.5 ％アガー）プレート上の0.7 ％アガロース
を含むNZYCM トップアガロース中に、大腸菌LE392 を指
示菌としてプレーティングした。

【００２８】このプレートを37℃で一晩インキュベーシ
ョンした後、Maniatisら（1982, pp.320-321)に記載さ
れたように、それぞれについて2 枚のレプリカをハイボ
ンドNフィルター(Hybond N filter) （アマシャム（Ame
rsham））で作った。このフィルターを、６ｘSSC 、0.5
％SDS 、５ｘデンハルト(Denhardt)溶液、0.01M EDTA
および100 μg/ml熱変性ニシン精子DNA （ベーリンガー
・マンハイム(Bhoerhinger Mannheim)）を含むプレハイ
ブリダイゼーションバッファー中で65℃、2 時間、プレ
ハイブリダイズさせた。2 時間のプレハイブリダイゼー
ションの後、プレハイブリダイゼーションバッファーを
ハイブリダイゼーションバッファーに交換した。ハイブ
リダイゼーションバッファーはプレハイブリダイゼーシ
ョンバッファーと同じであるが、実施例5.2.2 に記載し
たように調製した、³²P−ラベルしたツクリタケcel2配
列を含む1.5kb のPCR 断片を含んでいる。フィルターを
60℃で18時間ハイブリダイズさせた。

【００２９】ハイブリダイゼーション後、フィルターを
まず４＊SSC/0.5% SDSで60℃、30分間洗い、次に２＊SS
C/0.5% SDSで60℃，30分間、2 回洗浄した。風乾したフ
ィルターをワットマン 3MM濾紙シートにテープで留め、
放射性インクで位置合わせの印をつけ、ワットマン濾紙
とフィルターをサランラップで覆った。ハイブリダイズ
するプラークは増感スクリーンを使ってコダックXAR Ｘ
線フィルムを−70℃、72時間露光させることによって同
定した。

【００３０】プレートあたり約50の陽性プラークが重複
する２枚のプレートに見いだされた。パスツールピペッ
トを用いて１２の陽性プラークをプレートから拾い上
げ、Maniatisら（1982、pp.64)に記載されたように、20
μl のクロロフォルムを含む１mlのSMバッファー中でフ
ァージを寒天塊から溶出させた。孤立したファージプラ
ークを50〜100 含むプレートのフィルターレプリカを用
いて上述の方法を繰り返すことにより、得られたファー
ジを純化した。純化した後、NZYCM 培地上に５ｘ10³の
ファージをプレーティングすることによってファージを
増殖させた。37℃で一晩インキュベーションした後、コ
ンフルエントなプレートが得られた。このプレートに５
mlのSMバッファーを加え、時々揺すりながら4 ℃で２時
間プレートを保存することによりファージをプレートか
ら溶出した。ピペットを用いて上清を集めた後、4 ℃で
10分間、4,000xｇで遠心してバクテリアを溶液から除い
た。上清に0.3 ％のクロロフォルムを加えpfu 数を測定
した。このファージストックは１mlあたり約10⁷pfuを含
んでいた。

【００３１】実施例5.2.4 cbh cDNAクローンの制限切
断解析 cbh cDNAを含む組換えUni-ZAP XRクローンを、使用説明
書に従ってストラタジーン（Stratagene）のZAP-cDNA合
成キットに含まれている繊維状ヘルパーファージEXAssi
stを重感染させることによりBluescriptファージミドに
変換した。次に、このファージミドDNA をSambrookら
（1989,pp.1.25-1.28)に記載されたように単離した。

【００３２】８つのcbh cDNAクローンから単離したDNA
を以下の制限酵素を用いて制限切断解析にかけた。その
制限酵素とはEcoRI とXhoIである。DNA を以下の溶液か
らなる反応混合物中で37℃、2 時間消化した。その溶液
は、２μl （>>１μｇ）のDNA 溶液、２μl の適切な10
＊反応バッファー（ライフテクノロジー）、10U の各制
限酵素（ライフテクノロジー）および、蒸留水を含み、
全量を20μl とした。４μl のDNA 泳動バッファーを加
えた後サンプルを0.7 ％TAE-アガロースゲルにのせた。
DNA 断片を80Ｖで1.5 時間、電気泳動して分離した。単
離したcDNAクローンの制限切断解析により２つの型のプ
ラスミドが明らかにされた。１つは1.2kb のインサート
を含んでおり、もう一つは1.8kb のインサートを含んで
いた。

【００３３】実施例5.2.5 黒色こうじ菌cbh cDNAクロ
ーンCBHA-C9の配列解析黒色こうじ菌のcbh cDNAクローンの配列は、CBHA-C9 と
呼んでいる、pBluescript SK^-中に1.8kb インサートを
有する実施例5.2.4 の陽性クローンの一つの断片をサブ
クローニングすることによって決定した（配列番号
５）。シーケンシング反応はサーモシークエナーゼ（Th
ermoSequenase)蛍光ラベルプライマー・サイクルシーケ
ンシングキット（アマシャム）を用い、ユニバーサルシ
ーケンシングプライマーで行った。シーケンシング反応
物はALF エクスプレスシーケンサー(ALFexpress sequen
cer)（ファルマシア) で解析した。配列解析はウインス
ター（Winstar)プログラム（レーザージーン（Laser Ge
ne））を用いて行い、図１／配列番号５に示す配列を得
た。塩基番号49から1404に対応するコーディング領域の
アミノ酸配列を図２／配列番号８に示した。このコーデ
ィング領域は天然の酵素（アミノ酸18から452 ）とその
プレ配列（アミノ酸１から17）をコードしている。この
タンパク質はリンカーペプチドもセルロース結合領域も
含まない。

【００３４】実施例5.2.6 cbhA遺伝子に対する黒色こ
うじ菌ゲノムライブラリーのスクリーニング Harmsen ら（1990）に記載されているように構築した黒
色こうじ菌ゲノムライブラリ−をcbhA遺伝子に対してス
クリーニングするために、Maniatisら（1982、pp.320-3
21）に記載されたように、プレートあたり３x10³pfu を
直径85mmのNZYCM （1.5 ％アガー）プレート上の0.7 ％
アガロースを含むNZYCM トップアガロース中に、大腸菌
LE392 を指示菌として５枚プレーティングした。このプ
レートを37℃で一晩インキュベーションした後、Maniat
isら、（1982、pp.320-321）に記載されたように、それ
ぞれについて2 枚のレプリカをハイボンドＮフィルター
（アマシャム）上に作った。

【００３５】このフィルターを、６ｘSSC 、0.5 ％ SD
S、５ｘデンハルト(Denhardt)溶液、0.01M EDTAおよび1
00 μg/ml熱変性ニシン精子DNA(ベーリンガー・マンハ
イム）を含むプレハイブリダイゼーションバッファー中
で68℃、2 時間、プレハイブリダイズさせた。2 時間の
プレハイブリダイゼーションの後、プレハイブリダイゼ
ーションバッファーをハイブリダイゼーションバッファ
ーに交換した。ハイブリダイゼーションバッファーはプ
レハイブリダイゼーションバッファーと同一であるが、
実施例5.2.2 に記載したように調製した、cDNAクローン
CBHA-C9 の、³²P −ラベルした1.8kb のインサートを
含んでいる。フィルターを68℃で18時間ハイブリダイズ
させた。ハイブリダイゼーション後、このフィルターを
まず４＊SSC/0.1 ％ SDSで68℃、30分間洗い、続いて２
＊SSC/0.1 ％ SDSで68℃、30分間第２の洗浄を行った。
このフィルターを0.1 ＊SSC/0.1 ％SDS で68℃、30分
間、２回洗浄した。風乾したフィルターをワットマン3M
M 濾紙シートにテープで留め、位置合わせの印を放射性
インクで付け、ワットマン濾紙とフィルターをサランラ
ップで覆った。ハイブリダイズするプラークを増感スク
リーンを用いてコダックXAR Ｘ線フィルムに-70 ℃で72
時間露光することにより同定した。

【００３６】プレートあたり２から３のハイブリダイズ
する陽性のプラークが、重複する2枚のプレートに見ら
れた。Maniatisら（1982、pp.64)に記載されたように、
パスツールピペットを用いて５つの陽性プラークをプレ
ートから拾いこのファージを20μl のクロロフォルムを
含む１mlのSMバッファー中で寒天塊から溶出した。孤立
したファージプラークをプレートあたり50〜100 含むプ
レートのフィルターレプリカを用いて上述の方法を繰り
返すことにより、得られたファージを、純化した。

【００３７】実施例5.3 ツクリタケ中でのcbhA cDNAの発現実施例5.3.1 cbhA発現カセットの構築実施例5.2.5 のCBHA-C9 cDNAクローンを用いて発現プラ
スミドを構築した。すべての消化は、１〜３μg のDNA
、２μl の適切な10＊反応バッファー（ライフテクノ
ロジー）、10U の制限酵素（ライフテクノロジー）およ
び蒸留水を用い、最終体積20μl で行った。消化は37℃
で１〜２時間行なった。消化したサンプルをTAE バッフ
ァー中の0.7 ％アガロースに載せ、次にDNA 断片を80V
の電気泳動によって分離した。電気泳動後適切なバンド
を切り出し、取扱説明書に従ってジーンクリーン（Gene
Clean)キット（バイオゲル101 社）を用いてDNA 断片を
単離した。ライゲーションは、10＊ライゲーションバッ
ファー（プロメガ）、50〜100ng のベクターDNA 、３倍
過剰分子数のインサートDNA 、１U のT4- ライゲースを
用い、最終体積10μl で行なった。15℃で一晩インキュ
ベーションした後、混合物の４μl を用いて以下のよう
に調製した大腸菌DH5 αコンピーテント細胞を形質転換
した：LB培地（LB培地1000mlあたり：10g トリプシン分
解ペプトン（ライフテクノロジー）、５g イーストエキ
ストラクト（ライフテクノロジー）、10g NaCl、0.5mM
Tris-HCl pH7.5）で前培養した大腸菌DH5 α一晩培養物
200 μlを100ml のLB培地に接種した。この培養物をオ
ービタルシェーカー中37℃で濃度が0.15〜0.2 のO.D.60
0 となるまでインキュベーションした。次に菌を４℃、
3000rpm の遠心で集めた。上清を捨てた後、細胞を常に
氷中に維持した。菌体ペレットを40mlの K-MESトランス
ファーバッファー（100ml あたり：6ml 1M CaCl₂、0.5m
l 1M MgCl₂、4ml 0.5M K-MES pH6.0、0.5ml 1M MnCl₂）
に再懸濁し続いて上述のように遠心することにより洗浄
した。最後に細胞を10mlのK-MES/グリセロール（＝K-ME
S トランスファーバッファー＋15％グリセロール）に再
懸濁した。一定量（50μl)を直ちに形質転換に使用する
か又は-70 ℃で凍結した。

【００３８】大腸菌DH5 αコンピーテント細胞を形質転
換実験に用い、50μl 細胞懸濁液を4.5 μl のライゲー
ション混合物と混ぜることにより行なった。氷中で30分
間インキュベーションした後、細胞を42℃で２分間イン
キュベーションした。次に1ml のLB培地を加え、細胞を
37℃で1 時間インキュベーションした。次に菌体を14,0
00g で20秒間遠心して集め、上清を捨てた後細胞を100
μl のLB培地に再懸濁した。生じた菌懸濁液を100 μg/
mlアンピシリンと、青／白スクリーニングの場合には、
50μg/mlのX-gal と60μg/mlのIPTGを含むLB培地上にプ
レーティングした。生じたコロニーを２〜12選択し、10
0 μg/mlアンピシリンを含むLB培地で一晩増殖させた。
この培養物からManiatisら（1982、pp.368-369）に記載
されたようにアルカリ溶菌法によってプラスミドDNA を
単離し、実施例5.2.4 に記載したように制限切断解析に
使用し、目的のプラスミドを保持するクローンを選択し
た。

【００３９】上述した方法を用いて、cbhA発現プラスミ
ドを構築し、pIM3006 と名付けた。黒色こうじ菌pkiAプ
ロモーターを含むプラスミドpromH をSstIおよびNsiIで
消化し、SstI-NsiI 消化したpCBHA-C9にライゲーション
した。pkiA-cbhA の融合を含むこのプラスミドをSstIを
用いて直線状にした後、この構築物をBglII を用いて部
分消化した。2.4kb のSstI-BglII断片をBamHI-SstI消化
した、アスペルギルス・ニズランスtrpC遺伝子のターミ
ネーターを含むBamHI-HindIII 断片を保持するプラスミ
ドにライゲーションした。BglII 制限部位は推定される
停止コドンの約150bp 下流にある。生じた構築物をpIM3
006 と名付けた。

【００４０】100 μg/mlのアンピシリンを含むLB培地で
増殖させた、最終的な発現プラスミドpIM3006 を含む大
腸菌DH5 α 100ml培養物から、ヌクレオボンド（Nucleo
bond）PC-100キット（ナゲル（Nagel)）を用い取扱説明
書に従って大スケールでプラスミドDNA を単離した。

【００４１】実施例5.3.2 共形質転換による黒色こ
うじ菌752.1 へのcbhA発現構築物の導入および黒色こう
じ菌cbhA遺伝子を発現している形質転換体のスクリーニ
ングプラスミドpGW635（Goosenら、1989）上の黒色こうじ菌
pyrAを選択マーカーとし、プラスミドpIM3006 を共形質
転換プラスミドとして用いて、黒色こうじ菌752.1 の共
形質転換により黒色こうじ菌に実施例3.1 で得られたプ
ラスミドpIM3006 を導入した。黒色こうじ菌752.1 を0.
5 ％イーストエキストラクト、0.2 ％カザアミノ酸、50
mMグルコース、1.5mM ロイシンおよび10mMウリジンを添
加した最少培地で30℃18時間増殖させて菌糸体よりプロ
トプラストを調製した。黒色こうじ菌752.1 のプロトプ
ラスト調製と形質転換手順はGoosenら（1987）に記載さ
れたように行なった。生じたPYR ⁺形質転換体を黒色こ
うじ菌cbhA遺伝子の発現についてSDS-PAGEによって解析
した。

【００４２】形質転換体を黒色こうじ菌cbhA遺伝子産
物、CBHAタンパク質の形成について解析した。これらの
形質転換体のうちの１２をCBHA発現を解析するための増
殖実験に用いた。形質転換体は、４％D-フルクトース、
0.1 ％イーストエキストラクトおよび1.5mM ロイシンを
含む50ml最少培地中（１リットルの培地あたり：15g KH
₂PO₄、0.5g KCl、0.5g MgSO₄・7H₂O 、6g NaNO₃、1ml ヴ
ィシュニアック溶液（VishniacとSanter,1957 ）pH6.0)
で30℃、30時間増殖させた。増殖後、菌糸体を濾過して
除き、培養濾液をSDS-PAGEで解析した。形質転換体752.
1::pIM3006-55 はもっともよくCBHAを産生した（約20μ
g/ml）。

【００４３】実施例 5.3.3 CBHA酵素の精製 300ml の培地（１リットルの培地あたり：４g NH₄Cl 、
1.5g KH₂PO₄、0.5g KCl 、0.5g MgSO₄・7H₂O 、１mlの
ヴィシュニアック塩溶液（1 リットルあたり、10g EDT
A、4.4g ZnSO₄・7H₂O 、1.0gMnCl₂・4H₂O 、0.32g CoC
l₂・6H₂O 、0.32g CuSO₄・5H₂O 、0.22g (NH₄)₆Mo₇O₂₄
・4H₂O、1.47g CaCl₂・2H₂O 、1.0g FeSO₄・7H₂O 、pH4.0
（VishniacとSanter、1957））、pH5.0 に0.2 ％の限
外濾過したイーストエキストラクト（ライフテクノロジ
ー）、0.5 ％カザミノ酸（ライフテクノロジー）、１０
ｍＭロイシンおよびＣ源として５％ショ糖を添加した培
地）を入れた１Ｌのエーレンマイヤーフラスコに752.
1::pIM3006-55 株の２＊10⁹の胞子を接種し、30℃で６
時間増殖させた。この培養液全体をバイオプロセッサー
ユニットADI 1020（アプリコン（Applikon））で制御さ
れた、アプリコン３リットル発酵槽（BTS06)中の1.7 リ
ットルの培地に添加した。発酵は30℃に温度制御し、pH
は3.0 まで下がるままにしてそこで5N NaOH の添加によ
って維持した。接種から30時間後1.9 リットルの培養ブ
ロスを発酵槽から抜きだした。菌糸体は濾過により培養
ブロスから分離した。発酵槽を再び２リットルの新しい
培地で満たし、上述のようにしてさらに30時間培養し
た。この２回目の運転後、菌糸体を濾過により培養ブロ
スから分離した。両方の運転による培養濾液を一緒に
し、ピペラジンを最終濃度が10mMになるように添加し
た。pHは10N NaOHでpH5.5 に調整した。培養濾液は次に
ストリームライン（Streamline）陰イオン交換カラム
（ファルマシア）にかけた。のせたあと、カラムを10mM
ピペラジン-HCl（pip-HCl)pH5.5 で洗浄した。10mM pip
-HCl pH5.5／１M NaClを用いた塩パルス（salt pulse）
をかけることにより酵素をカラムから溶出した。15mlの
画分を集め、CBH 活性を発色基質4-メチルウンベリフェ
リル- β-D- セロビオシド（セロビオヒドロラーゼを検
出する（シグマM-6018））を用いて検出した。CBH 活性
の大部分は画分２，３および４に存在していた。これら
の画分を集め10mM pip-HCl pH5.5に対して透析した。

【００４４】

【配列表】

SEQUENCE LISTING <110> Gist-Brocades <120> Novel bread improving composit <130> X1F1186 <150> EP 97202386.5 <151> 1997-07-31 <150> EP 97202387.3 <151> 1997-07-31 <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 1 Leu Tyr Leu Met Ser Asp Asp Ser Asn Tyr Glu Leu Phe Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 24 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 2 Leu Gly Asn Thr Asp Phe Tyr Gly Pro Gly Leu Thr Val Asp Thr Asn 1 5 10 15 Ser Pro Phe Thr Val Val Thr Gln 20 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide designed for PCR the coding
region of A.nigercellobiohydrolase. <400> 3 gtccgtacca acatggcc 18 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide designed for PCR the coding
region of A.nigercellobiohydrolase. <400> 4 actcagaaac attggctata g 21 <210> 5 <211> 1701 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 5 cgaaatcact aaaaggagac gactagagtc ttatacaatc tcattacaat gcatcaacgt 60 gcccttctct tctcagccct gctgacggct gttcgcgccc agcaagccgg aacgctcacg 120 gaggaagtcc atccttcctt gacctggcag aaatgcactt ctgaaggcag ctgcactgaa 180 cagagtggct cagttgtcat tgactcgaac tggcgctgga cccattccgt caatgacagc 240 accaattgct acactggcaa cacctgggat gcaactctct gccctgatga tgagacctgt 300 gcggccaact gcgccctgga cggagcagac tacgagtcca cctacggtgt caccactgac 360 ggtgattcat tgacactgaa attcgtcact ggctccaatg ttggctcgcg gttgtatcta 420 atggacacga gcgacgaggg ataccagacg ttcaacttgc ttgacgcaga gttcactttc 480 gacgttgatg tgtctaacct cccatgtggg ctaaacggcg cgttgtactt cactgcaatg 540 gacgccgatg gtggagtctc aaaataccct gccaataagg ctggagccaa gtacggaaca 600 ggatactgtg actcccaatg cccccgggac ctgaaattca tcgacggaca agccaacgtc 660 gatggctggg aaccttctag caacaatgac aacacaggta tcggcaatca cggttcttgc 720 tgccctgaaa tggatatctg ggaggcaaac aagatctcga ccgcattgac accccatcct 780 tgtgacagca gcgaacagac catgtgtgag ggtaacgact gcggtggaac ctactcggat 840 gatcgctacg gaggaacctg cgaccctgac ggctgcgact tcaaccctta tcgcatgggc 900 aacgactctt tctacggtcc tggcaagacc atcgacaccg gatccaagat gacggttgtg 960 acccagttca tcactgatgg ctctggctcc ctcagcgaga tcaagcgtta ctacgtgcag 1020 aacggaaatg ttatagcgaa cgctgattcc aacatctctg gagtgactgg aaactcgatc 1080 acaacggact tctgcactgc gcagaagaag gcctttggcg acgaggatat attcgctgag 1140 cacaatggac ttgctggaat cagtgatgcc atgtcttcca tggttctcat cttgagcttg 1200 tgggatgatt actatgccag catggagtgg ctcgacagcg actatcccga gaacgctacc 1260 gctaccgacc caggtgttgc acgcggaaca tgcgactcgg aatcaggcgt ccctgcgaca 1320 gtcgaggggg cgcatcccga ttcttcggtg accttctcaa acatcaagtt cggtcccatc 1380 aactcgacct tcagcgcttc cgcataaggg gaagtgcagg gttcagagcc tcaattacat 1440 cccacaagcc gaacacaaca ggacaggttc ctggaacgga atatgggaga gttgcgggct 1500 tgtaaatagt ccgaaaagtg gtcactgctt ttgtgtatcg ggctgtcttc ccattttatt 1560 ttcattcact ccagattgat tgatgcagat cttgtttgtt gattctttca cttcgtgctg 1620 tgactttttg tacctaactt cacattcgtt tcttttctgt ttttgagtcc actcaatcca 1680 agagacagtt gttcctttgc t 1701 <210> 6 <211> 452 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 6 Met His Gln Arg Ala Leu Leu Phe Ser Ala Leu Leu Thr Ala Val Arg 1 5 10 15 Ala Gln Gln Ala Gly Thr Leu Thr Glu Glu Val His Pro Ser Leu Thr 20 25 30 Trp Gln Lys Cys Thr Ser Glu Gly Ser Cys Thr Glu Gln Ser Gly Ser 35 40 45 Val Val Ile Asp Ser Asn Trp Arg Trp Thr His Ser Val Asn Asp Ser 50 55 60 Thr Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Thr Trp Asp Ala Thr Leu Cys Pro Asp 65 70 75 80 Asp Glu Thr Cys Ala Ala Asn Cys Ala Leu Asp Gly Ala Asp Tyr Glu 85 90 95 Ser Thr Tyr Gly Val Thr Thr Asp Gly Asp Ser Leu Thr Leu Lys Phe 100 105 110 Val Thr Gly Ser Asn Val Gly Ser Arg Leu Tyr Leu Met Asp Thr Ser 115 120 125 Asp Glu Gly Tyr Gln Thr Phe Asn Leu Leu Asp Ala Glu Phe Thr Phe 130 135 140 Asp Val Asp Val Ser Asn Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Leu Tyr 145 150 155 160 Phe Thr Ala Met Asp Ala Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr Pro Ala Asn 165 170 175 Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln Cys Pro 180 185 190 Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asp Gly Gln Ala Asn Val Asp Gly Trp Glu 195 200 205 Pro Ser Ser Asn Asn Asp Asn Thr Gly Ile Gly Asn His Gly Ser Cys 210 215 220 Cys Pro Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Lys Ile Ser Thr Ala Leu 225 230 235 240 Thr Pro His Pro Cys Asp Ser Ser Glu Gln Thr Met Cys Glu Gly Asn 245 250 255 Asp Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Asp Asp Arg Tyr Gly Gly Thr Cys Asp 260 265 270 Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn Pro Tyr Arg Met Gly Asn Asp Ser Phe 275 280 285 Tyr Gly Pro Gly Lys Thr Ile Asp Thr Gly Ser Lys Met Thr Val Val 290 295 300 Thr Gln Phe Ile Thr Asp Gly Ser Gly Ser Leu Ser Glu Ile Lys Arg 305 310 315 320 Tyr Tyr Val Gln Asn Gly Asn Val Ile Ala Asn Ala Asp Ser Asn Ile 325 330 335 Ser Gly Val Thr Gly Asn Ser Ile Thr Thr Asp Phe Cys Thr Ala Gln 340 345 350 Lys Lys Ala Phe Gly Asp Glu Asp Ile Phe Ala Glu His Asn Gly Leu 355 360 365 Ala Gly Ile Ser Asp Ala Met Ser Ser Met Val Leu Ile Leu Ser Leu 370 375 380 Trp Asp Asp Tyr Tyr Ala Ser Met Glu Trp Leu Asp Ser Asp Tyr Pro 385 390 395 400 Glu Asn Ala Thr Ala Thr Asp Pro Gly Val Ala Arg Gly Thr Cys Asp 405 410 415 Ser Glu Ser Gly Val Pro Ala Thr Val Glu Gly Ala His Pro Asp Ser 420 425 430 Ser Val Thr Phe Ser Asn Ile Lys Phe Gly Pro Ile Asn Ser Thr Phe 435 440 445 Ser Ala Ser Ala 450

【図面の簡単な説明】

【図１】配列番号５の配列である。

【図2 】配列番号８の配列である。

【図３】CBH-1 の添加量の関数としてパン容積を示し
た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:885）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】セロビオヒドロラーゼ（CBH)を効果的な
量で含むパン改良活性のある組成物。
【請求項２】本質的に他の真菌類物質を含まない形態
でCBH を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】クローニングされた遺伝子の発現による
CBH を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】 CBH がアスペルギルス又はトリコデルマ
のCBH である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組
成物。
【請求項５】更にα- アミラーゼおよび／又はエンド
- キシラナーゼを効果的な量で含む、請求項１〜４のい
ずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】真菌類からCBH を精製することを含む、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物を得る方
法。
【請求項７】クローニングされた遺伝子によりCBH を
発現させることを含む、請求項１〜５のいずれか１項に
記載の組成物を得る方法。
【請求項８】 CBH 、請求項１〜５のいずれか１項に記
載の組成物または請求項６又は７に記載の方法により製
造された組成物の使用であって、（ｉ）生地の取扱い性、（ii）パン容積及び／又は（iii)パンの団粒構造を改良するための使用。
【請求項９】 CBH 、請求項１〜５のいずれか１項に記
載の組成物または請求項６又は７に記載の方法により製
造された組成物の使用であって、小麦粉中の細胞壁多糖
類に作用させるための使用。
【請求項１０】穀粉１kgあたりCBH を少なくとも0.5m
g 、好ましくは少なくとも５mg含む生地。
【請求項１１】請求項１０に記載の生地を製造する方
法であって、（ｉ）穀粉と（ii）水と（iii ）酵母と（iv）効果的な
量のCBH とを混合ずることを含む、生地を作る又は生地
にCBH を添加する方法。
【請求項１２】更にエンド- キシラナーゼ及び／又は
α- アミラーゼを添加することを含む、請求項１１に記
載の方法。