JPH11140091A - 生理活性物質ｎａ３２１７６ａ、その製造法およびその用途 - Google Patents
生理活性物質ｎａ３２１７６ａ、その製造法およびその用途Info
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- JPH11140091A JPH11140091A JP10242723A JP24272398A JPH11140091A JP H11140091 A JPH11140091 A JP H11140091A JP 10242723 A JP10242723 A JP 10242723A JP 24272398 A JP24272398 A JP 24272398A JP H11140091 A JPH11140091 A JP H11140091A
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- physiologically active
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Abstract
(57)【要約】
【課題】神経細胞分化能を有する新規生理活性物質を提
供する。 【解決手段】ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ）属に属し、生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａを生産
する能力を有する微生物を培地に培養し、培養液中に生
理活性物質ＮＡ３２１７６Ａを生成蓄積せしめ、これを
採取することにより生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａを得
た。又、ザルコマイシンとパンテテインより生理活性物
質ＮＡ３２１７６Ａを得た。
供する。 【解決手段】ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ）属に属し、生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａを生産
する能力を有する微生物を培地に培養し、培養液中に生
理活性物質ＮＡ３２１７６Ａを生成蓄積せしめ、これを
採取することにより生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａを得
た。又、ザルコマイシンとパンテテインより生理活性物
質ＮＡ３２１７６Ａを得た。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規生理活性物質
ＮＡ３２１７６Ａの製造法及びその用途に関する。本発
明の化合物は、ＰＣ１２細胞に対して神経様突起伸張作
用を有し、例えば抗痴呆剤，末梢神経障害治療剤または
神経細胞保護剤などとして使用される生理活性物質とし
て期待される。
ＮＡ３２１７６Ａの製造法及びその用途に関する。本発
明の化合物は、ＰＣ１２細胞に対して神経様突起伸張作
用を有し、例えば抗痴呆剤，末梢神経障害治療剤または
神経細胞保護剤などとして使用される生理活性物質とし
て期待される。
【０００２】
【従来の技術】神経成長因子（以下ＮＧＦと称する）に
は、神経突起の伸張作用および神経伝達物質の産生を調
節する作用があり、老動物の神経細胞に対し再生作用を
持つことが試験管内で証明されている（エイジ，８巻，
１９頁（１９８５））。しかし、ＮＧＦは脳血管関門
（以下ＢＢＢと称する）透過性を持たないので、末梢か
らの投与では脳内に移行できない。そこで、ＮＧＦと抗
トランスフェリンレセプター抗体の複合体を作成し、Ｎ
ＧＦのＢＢＢに対する透過性を増加させたところ、末梢
からのＮＧＦ投与により、ラットの中枢神経系における
コリン作動性および非コリン作動性ニューロンの再生作
用が認められた（Ｓｃｉｅｎｃｅ,２５９巻,３７３−３
７７頁（１９９３））。しかし、ＮＧＦそれ自体ではＢ
ＢＢ透過作用が無く抗痴呆剤とはなりえない。従って、
ＮＧＦとは異なりＢＢＢ透過作用を持つ化合物が抗痴呆
剤として期待されている。
は、神経突起の伸張作用および神経伝達物質の産生を調
節する作用があり、老動物の神経細胞に対し再生作用を
持つことが試験管内で証明されている（エイジ，８巻，
１９頁（１９８５））。しかし、ＮＧＦは脳血管関門
（以下ＢＢＢと称する）透過性を持たないので、末梢か
らの投与では脳内に移行できない。そこで、ＮＧＦと抗
トランスフェリンレセプター抗体の複合体を作成し、Ｎ
ＧＦのＢＢＢに対する透過性を増加させたところ、末梢
からのＮＧＦ投与により、ラットの中枢神経系における
コリン作動性および非コリン作動性ニューロンの再生作
用が認められた（Ｓｃｉｅｎｃｅ,２５９巻,３７３−３
７７頁（１９９３））。しかし、ＮＧＦそれ自体ではＢ
ＢＢ透過作用が無く抗痴呆剤とはなりえない。従って、
ＮＧＦとは異なりＢＢＢ透過作用を持つ化合物が抗痴呆
剤として期待されている。
【０００３】一方、ラット副腎髄質褐色細胞腫からクロ
ーニングされた株細胞であるＰＣ１２細胞にＮＧＦを添
加することにより、ＰＣ１２細胞は増殖を停止し、神経
突起を持つ交感神経様の細胞へと分化することが知られ
ている。ＰＣ１２細胞はＮＧＦに対して反応し神経様突
起を伸張させることから、現在、多くの研究室におい
て、神経分化のモデル細胞として広く用いられている。
ーニングされた株細胞であるＰＣ１２細胞にＮＧＦを添
加することにより、ＰＣ１２細胞は増殖を停止し、神経
突起を持つ交感神経様の細胞へと分化することが知られ
ている。ＰＣ１２細胞はＮＧＦに対して反応し神経様突
起を伸張させることから、現在、多くの研究室におい
て、神経分化のモデル細胞として広く用いられている。
【０００４】このＰＣ１２細胞を用いて、ＮＧＦの他に
繊維芽細胞成長因子やインターロイキン６も神経様突起
の伸張を促進することが明らかとなった。また、最近、
微生物由来の低分子化合物であるスタウロスポリンも同
様にＰＣ１２細胞に対して神経様突起の伸張をもたらす
ことが示された（神経化学，２６巻，２００−２２０頁
（１９８７））。
繊維芽細胞成長因子やインターロイキン６も神経様突起
の伸張を促進することが明らかとなった。また、最近、
微生物由来の低分子化合物であるスタウロスポリンも同
様にＰＣ１２細胞に対して神経様突起の伸張をもたらす
ことが示された（神経化学，２６巻，２００−２２０頁
（１９８７））。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記のスタウロスポリ
ンはＮＧＦとは異なり低分子化合物であることから、医
療上きわめて貴重であるが、毒性が強いため、実際の使
用にあたっては検討の余地があると考えられる。かかる
実情において、より毒性が低く、低濃度で神経突起伸張
作用を持つ低分子化合物を提供することは、医療上きわ
めて重要であると考えられる。
ンはＮＧＦとは異なり低分子化合物であることから、医
療上きわめて貴重であるが、毒性が強いため、実際の使
用にあたっては検討の余地があると考えられる。かかる
実情において、より毒性が低く、低濃度で神経突起伸張
作用を持つ低分子化合物を提供することは、医療上きわ
めて重要であると考えられる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
微生物の代謝産物について、種々検索した結果、ストレ
プトミセス属に属する一菌株が、神経分化促進作用を有
する新規生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａを産生する事を
見出した。更に、培養液中にパンテテインを添加するこ
とにより生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａの生産性が向上
することを見出した。また、生理活性物質ＮＡ３２１７
６Ａの前駆体と考えられるザルコマイシンは、単離する
とその反応性が高いために、瞬時にジヒドロザルコマイ
シンへと還元されてしまう不安定な物質であるが、本発
明者らは、ザルコマイシンが０．１〜１０規定の食塩水
溶液中においては非常に安定であることを見いだした。
そこでザルコマイシン生産菌を用いてザルコマイシンを
生産し、粗抽出したザルコマイシンにパンテテインを加
えることにより、高収率でＮＡ３２１７６Ａを得ること
ができることを見出した。すなわち、本発明は次の
（１）〜（１１）に関する。
微生物の代謝産物について、種々検索した結果、ストレ
プトミセス属に属する一菌株が、神経分化促進作用を有
する新規生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａを産生する事を
見出した。更に、培養液中にパンテテインを添加するこ
とにより生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａの生産性が向上
することを見出した。また、生理活性物質ＮＡ３２１７
６Ａの前駆体と考えられるザルコマイシンは、単離する
とその反応性が高いために、瞬時にジヒドロザルコマイ
シンへと還元されてしまう不安定な物質であるが、本発
明者らは、ザルコマイシンが０．１〜１０規定の食塩水
溶液中においては非常に安定であることを見いだした。
そこでザルコマイシン生産菌を用いてザルコマイシンを
生産し、粗抽出したザルコマイシンにパンテテインを加
えることにより、高収率でＮＡ３２１７６Ａを得ること
ができることを見出した。すなわち、本発明は次の
（１）〜（１１）に関する。
【０００７】（１）式（１）
【化２】 を有するＮＡ３２１７６Ａまたはその薬学的に許容しう
る塩。 （２）下記の理化学的性質を示す生理活性物質ＮＡ３２
１７６Ａまたはその薬学的に許容しうる塩。 １）外観；白色粉末 ２）分子量；４１８ ３）分子式；Ｃ１８Ｈ３０Ｎ２Ｏ７Ｓ（高分解能マスス
ペクトルにより測定） ４）溶解性；低級アルコール，水，ジメチルスルホキシ
ドに可溶。ヘキサン，石油エーテルに不溶。 ５）シリカゲル薄層クロマトグラフィーによるＲｆ値；
ｎ−ブタノール−酢酸−水（４：１：２）の展開溶媒で
０．７を示す。 ６）紫外部吸収スペクトル；水中で末端吸収を示す。 ７）赤外部吸収スペクトル；臭化カリウム錠剤で測定し
たスペクトルを図１に示す。 ８）水素核磁気共鳴スペクトル；重水中で測定したスペ
クトルを図２に示す。 ９）炭素核磁気共鳴スペクトル；重水中で測定したスペ
クトルを図３に示す。そして、化学シフト値を以下に示
した。 δ（ｐｐｍ）２２３．５（ｓ），１８０．１（ｓ），１
７６．４（ｓ），１７５．１（ｓ）， ７７．０
（ｄ）， ６９．６（ｔ），５３．４（ｄ）， ４７．
７（ｄ）， ３９．８（ｓ），３９．７（ｔ）， ３
８．９（ｔ）， ３６．７（ｔ），３６．５（ｔ），
３２．５（ｔ）， ３１．０（ｔ），２５．７（ｔ），
２１．８（ｑ）， ２０．３（ｑ） １０）呈色反応；リンモリブデン酸，塩化パラジウムに
陽性。 （３）生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａまたはその薬学的
に許容しうる塩を有効成分とする医薬。 （４）ＰＣ１２細胞に対する神経様突起伸張作用を持つ
上記（３）記載の医薬。 （５）神経細胞分化促進剤である上記（３）記載の医
薬。 （６）抗痴呆剤，末梢神経障害治療剤または神経細胞保
護剤のうちいずれかである上記（３）記載の医薬。
る塩。 （２）下記の理化学的性質を示す生理活性物質ＮＡ３２
１７６Ａまたはその薬学的に許容しうる塩。 １）外観；白色粉末 ２）分子量；４１８ ３）分子式；Ｃ１８Ｈ３０Ｎ２Ｏ７Ｓ（高分解能マスス
ペクトルにより測定） ４）溶解性；低級アルコール，水，ジメチルスルホキシ
ドに可溶。ヘキサン，石油エーテルに不溶。 ５）シリカゲル薄層クロマトグラフィーによるＲｆ値；
ｎ−ブタノール−酢酸−水（４：１：２）の展開溶媒で
０．７を示す。 ６）紫外部吸収スペクトル；水中で末端吸収を示す。 ７）赤外部吸収スペクトル；臭化カリウム錠剤で測定し
たスペクトルを図１に示す。 ８）水素核磁気共鳴スペクトル；重水中で測定したスペ
クトルを図２に示す。 ９）炭素核磁気共鳴スペクトル；重水中で測定したスペ
クトルを図３に示す。そして、化学シフト値を以下に示
した。 δ（ｐｐｍ）２２３．５（ｓ），１８０．１（ｓ），１
７６．４（ｓ），１７５．１（ｓ）， ７７．０
（ｄ）， ６９．６（ｔ），５３．４（ｄ）， ４７．
７（ｄ）， ３９．８（ｓ），３９．７（ｔ）， ３
８．９（ｔ）， ３６．７（ｔ），３６．５（ｔ），
３２．５（ｔ）， ３１．０（ｔ），２５．７（ｔ），
２１．８（ｑ）， ２０．３（ｑ） １０）呈色反応；リンモリブデン酸，塩化パラジウムに
陽性。 （３）生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａまたはその薬学的
に許容しうる塩を有効成分とする医薬。 （４）ＰＣ１２細胞に対する神経様突起伸張作用を持つ
上記（３）記載の医薬。 （５）神経細胞分化促進剤である上記（３）記載の医
薬。 （６）抗痴呆剤，末梢神経障害治療剤または神経細胞保
護剤のうちいずれかである上記（３）記載の医薬。
【０００８】（７）ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ）属に属し、生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａ
を生産する能力を有する微生物。 （８）ストレプトミセス エスピー ＮＡ ３２１７６
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ． ＮＡ ３２１７
６）株（工業技術院生命工学工業技術研究所 受託番
号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６４１１）及びその変異株。 （９）ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）
属に属し、生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａを生産する能
力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に生理活性
物質ＮＡ３２１７６Ａを生成蓄積せしめ、これを採取す
る事を特徴とする生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａまたは
その薬学的に許容しうる塩の製造法。 （１０）ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ）属に属し、生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａを生産す
る能力を有する微生物を培地に培養し、パンテテイン(p
antetheine)を培養液に添加することにより、培養物中
に生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａを生成蓄積せしめ、こ
れを採取する事を特徴とする生理活性物質ＮＡ３２１７
６Ａまたはその薬学的に許容しうる塩の製造法。 （１１）ザルコマイシン生産菌を培養する際に、又は、
ザルコマイシン生産菌を培養しザルコマイシンを生産
し、必要により粗抽出したザルコマイシンに、パンテテ
インを加えることにより、生理活性物質ＮＡ３２１７６
Ａを得ることを特徴とする生理活性物質ＮＡ３２１７６
Ａまたはその薬学的に許容しうる塩の製造法。
ｍｙｃｅｓ）属に属し、生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａ
を生産する能力を有する微生物。 （８）ストレプトミセス エスピー ＮＡ ３２１７６
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ． ＮＡ ３２１７
６）株（工業技術院生命工学工業技術研究所 受託番
号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６４１１）及びその変異株。 （９）ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）
属に属し、生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａを生産する能
力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に生理活性
物質ＮＡ３２１７６Ａを生成蓄積せしめ、これを採取す
る事を特徴とする生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａまたは
その薬学的に許容しうる塩の製造法。 （１０）ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ）属に属し、生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａを生産す
る能力を有する微生物を培地に培養し、パンテテイン(p
antetheine)を培養液に添加することにより、培養物中
に生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａを生成蓄積せしめ、こ
れを採取する事を特徴とする生理活性物質ＮＡ３２１７
６Ａまたはその薬学的に許容しうる塩の製造法。 （１１）ザルコマイシン生産菌を培養する際に、又は、
ザルコマイシン生産菌を培養しザルコマイシンを生産
し、必要により粗抽出したザルコマイシンに、パンテテ
インを加えることにより、生理活性物質ＮＡ３２１７６
Ａを得ることを特徴とする生理活性物質ＮＡ３２１７６
Ａまたはその薬学的に許容しうる塩の製造法。
【０００９】上記生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａはスト
レプトミセス属に属するＮＡ ３２１７６株を培養し、
又はパンテテイン(pantetheine)を培地中に添加して培
養し、生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａを生成蓄積せし
め、この培養物より生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａを採
取することにより得られる。生理活性物質ＮＡ３２１７
６Ａの生産菌の代表的な１例は次の菌学的および生理学
的性質を有する。
レプトミセス属に属するＮＡ ３２１７６株を培養し、
又はパンテテイン(pantetheine)を培地中に添加して培
養し、生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａを生成蓄積せし
め、この培養物より生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａを採
取することにより得られる。生理活性物質ＮＡ３２１７
６Ａの生産菌の代表的な１例は次の菌学的および生理学
的性質を有する。
【００１０】１．形態的性質 ２７℃で２週間培養後に観察した結果、気菌糸は単純分
岐し、その先端はらせん状あるいはフック状である。胞
子のう及び輪生糸の形成は認められない。また、遊走子
も認められない。胞子表面は平滑または粗面で、胞子は
シリンダ−型で、大きさ０．７〜０．９×０．９〜１．
３μｍである。また２０個以上の連鎖をなして胞子が形
成される。
岐し、その先端はらせん状あるいはフック状である。胞
子のう及び輪生糸の形成は認められない。また、遊走子
も認められない。胞子表面は平滑または粗面で、胞子は
シリンダ−型で、大きさ０．７〜０．９×０．９〜１．
３μｍである。また２０個以上の連鎖をなして胞子が形
成される。
【００１１】２．各種培地における生育 各種培地上、２７℃、２週間後の生育状態を下記表１に
示す。
示す。
【００１２】
【表１】
【００１３】３．生理学的性質 1 生育適度範囲 ： ２４〜３７℃ 2 硝酸塩の還元 ： 陰性 3 ゼラチンの液化（グルコ−ス・ペプトン・ゼラチン
培地上、２０℃）： 擬陽性 4 スタ−チの加水分解（スタ−チ・無機塩寒天培
地）： 陽性 5 脱脂牛乳の凝固 ： 陰性 6 脱脂牛乳のペプトン化 ： 陽性 7 メラニン様色素の生成 ： 陰性 ４．炭素源の利用性（プリドハム・ゴドリ−ブ寒天培地
上） Ｌ−アラビノ−ス ＋ Ｄ−キシロ−ス ＋ Ｄ−グルコ−ス ＋ Ｄ−フラクト−ス ＋ シュクロ−ス ＋ イノシト−ル − Ｌ−ラムノ−ス − ラフィノ−ス ＋ Ｄ−マンニト−ル ＋
培地上、２０℃）： 擬陽性 4 スタ−チの加水分解（スタ−チ・無機塩寒天培
地）： 陽性 5 脱脂牛乳の凝固 ： 陰性 6 脱脂牛乳のペプトン化 ： 陽性 7 メラニン様色素の生成 ： 陰性 ４．炭素源の利用性（プリドハム・ゴドリ−ブ寒天培地
上） Ｌ−アラビノ−ス ＋ Ｄ−キシロ−ス ＋ Ｄ−グルコ−ス ＋ Ｄ−フラクト−ス ＋ シュクロ−ス ＋ イノシト−ル − Ｌ−ラムノ−ス − ラフィノ−ス ＋ Ｄ−マンニト−ル ＋
【００１４】５．細胞壁中のジアミノピメリン酸 ＬＬ−ジアミノピメリン酸である。以上を要約すると、
本菌株は細胞壁がＬＬ−ジアミノピメリン酸であり、イ
ンタ−ナショナル・ストレプトミセス・プロジェクト
（略称ＩＳＰ）の方法によれば、胞子形成菌糸の形態
は、セクション・スパイラルズ（Spirales）に属し、胞
子表面は平滑あるいは粗面で、成熟した菌糸の色は灰色
系統（Gray color-series)で湿潤性（ハイグロスコピッ
ク）である。また、メラニン様色素は生産しない。基生
菌糸の色は淡黄色あるいは淡褐色を呈する。炭素源とし
てはＬ−アラビノ−ス、Ｄ−グルコ−ス、Ｄ−フラクト
−ス、シュクロ−ス、ラフィノ−ス、Ｄ−マンニト−
ル、Ｄ−キシロ−スを利用する。
本菌株は細胞壁がＬＬ−ジアミノピメリン酸であり、イ
ンタ−ナショナル・ストレプトミセス・プロジェクト
（略称ＩＳＰ）の方法によれば、胞子形成菌糸の形態
は、セクション・スパイラルズ（Spirales）に属し、胞
子表面は平滑あるいは粗面で、成熟した菌糸の色は灰色
系統（Gray color-series)で湿潤性（ハイグロスコピッ
ク）である。また、メラニン様色素は生産しない。基生
菌糸の色は淡黄色あるいは淡褐色を呈する。炭素源とし
てはＬ−アラビノ−ス、Ｄ−グルコ−ス、Ｄ−フラクト
−ス、シュクロ−ス、ラフィノ−ス、Ｄ−マンニト−
ル、Ｄ−キシロ−スを利用する。
【００１５】以上の性質をもとにア−ル・イ−・ブッフ
ァナン・アンド・エヌ・イ−・ギボンズ編、バ−ジ−ズ
・マニュアル・オブ・デタミネ−ティブ・バクテリオロ
ジ−（Bergey's Manual of Determinative Bacteriolog
y）第８版、１９７４年に従って検索を行った結果、上
記ＮＡ ３２１７６株はストレプトミセス属に属するこ
とが判明したので、本菌をストレプトミセス エスピ−
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＮＡ ３２１７
６と命名した。なお、該菌株は通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所に平成９年８月８日に寄託され、
その後平成１０年７月７日にブタペスト条約に基づく国
際寄託に移管され、受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６４１
１が付与されている。
ァナン・アンド・エヌ・イ−・ギボンズ編、バ−ジ−ズ
・マニュアル・オブ・デタミネ−ティブ・バクテリオロ
ジ−（Bergey's Manual of Determinative Bacteriolog
y）第８版、１９７４年に従って検索を行った結果、上
記ＮＡ ３２１７６株はストレプトミセス属に属するこ
とが判明したので、本菌をストレプトミセス エスピ−
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＮＡ ３２１７
６と命名した。なお、該菌株は通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所に平成９年８月８日に寄託され、
その後平成１０年７月７日にブタペスト条約に基づく国
際寄託に移管され、受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６４１
１が付与されている。
【００１６】本発明における神経分化促進作用を有する
生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａ生産菌はストレプトミセ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、例えば本発
明者らが分離したストレプトミセス エスピー ＮＡ
３２１７６（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＮＡ
３２１７６）株（工業技術院生命工学工業技術研究所受
託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６４１１）は、本発明に最も
有効に使用される菌株の一例である。
生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａ生産菌はストレプトミセ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、例えば本発
明者らが分離したストレプトミセス エスピー ＮＡ
３２１７６（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＮＡ
３２１７６）株（工業技術院生命工学工業技術研究所受
託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６４１１）は、本発明に最も
有効に使用される菌株の一例である。
【００１７】本発明に用いるストレプトミセス属に属す
る菌株はストレプトミセス属の他の菌株と同様、その性
状が変化しやすく、例えば、紫外線、エックス線および
薬品などを用いる人工的な変異手段で容易に変異しうる
ものであり、どの様な変異株であっても本発明の対象と
する生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａの生産能を有するも
のは、すべて本発明に使用する事ができる。
る菌株はストレプトミセス属の他の菌株と同様、その性
状が変化しやすく、例えば、紫外線、エックス線および
薬品などを用いる人工的な変異手段で容易に変異しうる
ものであり、どの様な変異株であっても本発明の対象と
する生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａの生産能を有するも
のは、すべて本発明に使用する事ができる。
【００１８】本発明によりＮＡ３２１７６Ａを製造する
方法の一つは、まず前記菌株を菌が利用し得る栄養物を
含有する培地で好気的に培養する。栄養源としては、従
来から菌の培養に利用されている公知のものが使用で
き、例えば炭素源としてはグルコース、フラクトース、
グリセリン、シュクロース、デキストリン、ガラクトー
ス、有機酸などを単独かまたは組み合わせて用いること
ができる。
方法の一つは、まず前記菌株を菌が利用し得る栄養物を
含有する培地で好気的に培養する。栄養源としては、従
来から菌の培養に利用されている公知のものが使用で
き、例えば炭素源としてはグルコース、フラクトース、
グリセリン、シュクロース、デキストリン、ガラクトー
ス、有機酸などを単独かまたは組み合わせて用いること
ができる。
【００１９】無機および有機窒素源としては塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、
硝酸ナトリウム、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾
燥酵母、コーンスチープリカー、大豆粉、綿実油カス、
カザミノ酸、バクトソイトン、オートミールなどを単独
または組み合わせて用いることができる。
ニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、
硝酸ナトリウム、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾
燥酵母、コーンスチープリカー、大豆粉、綿実油カス、
カザミノ酸、バクトソイトン、オートミールなどを単独
または組み合わせて用いることができる。
【００２０】その他必要に応じて食塩、炭酸カルシウ
ム、硫酸マグネシウム、硫酸銅、硫酸鉄、硫酸亜鉛、塩
化マンガン、燐酸塩などの無機塩類を加えることができ
るほか有機物、例えばアミノ酸類、ビタミン類、核酸類
や無機物を適当に添加することができる。培養法として
は液体培養法、特に深部攪拌培養法が最も適している。
培養温度は２０℃〜４５℃、ｐＨは微酸性ないし微アル
カリ性で培養を行うことが望ましい。
ム、硫酸マグネシウム、硫酸銅、硫酸鉄、硫酸亜鉛、塩
化マンガン、燐酸塩などの無機塩類を加えることができ
るほか有機物、例えばアミノ酸類、ビタミン類、核酸類
や無機物を適当に添加することができる。培養法として
は液体培養法、特に深部攪拌培養法が最も適している。
培養温度は２０℃〜４５℃、ｐＨは微酸性ないし微アル
カリ性で培養を行うことが望ましい。
【００２１】液体培養では通常３〜５日間培養を行うと
ＮＡ３２１７６Ａ物質が培養液中に生成蓄積される。更
に、培養２日目及び／又は３日目に培養液中にパンテテ
インを添加することにより生理活性物質ＮＡ３２１７６
Ａの生産性が向上する。添加するパンテテインの量は、
菌の生育に悪影響を及ぼさなければ特に限定されない
が、通常培地に対して１ｍｇ／ｍｌ〜１，０００ｍｇ／
ｍｌが好ましく、１０ｍｇ／ｍｌ〜３００ｍｇ／ｍｌが
更に好ましい。培養液中のＮＡ３２１７６Ａの生成量が
最大に達したときに培養を停止し、菌体と培養液をろ別
し、ろ液より目的物を精製単離する。ろ液から本物質の
精製単離には一般に微生物代謝生産物をその培養ろ液か
ら単離するために、用いられる分離精製の方法が利用さ
れる。
ＮＡ３２１７６Ａ物質が培養液中に生成蓄積される。更
に、培養２日目及び／又は３日目に培養液中にパンテテ
インを添加することにより生理活性物質ＮＡ３２１７６
Ａの生産性が向上する。添加するパンテテインの量は、
菌の生育に悪影響を及ぼさなければ特に限定されない
が、通常培地に対して１ｍｇ／ｍｌ〜１，０００ｍｇ／
ｍｌが好ましく、１０ｍｇ／ｍｌ〜３００ｍｇ／ｍｌが
更に好ましい。培養液中のＮＡ３２１７６Ａの生成量が
最大に達したときに培養を停止し、菌体と培養液をろ別
し、ろ液より目的物を精製単離する。ろ液から本物質の
精製単離には一般に微生物代謝生産物をその培養ろ液か
ら単離するために、用いられる分離精製の方法が利用さ
れる。
【００２２】即ち、培養液は通常のろ過法でろ液と菌体
部に分離する。得られたろ液をアルカリ条件下でダイヤ
イオンＨＰ−２０（商品名；三菱化成製）カラムに通
し、目的物質を吸着せしめ、水洗後、水から８０％メタ
ノール水へ直線勾配で溶出する。その溶出した活性画分
を濃縮し、メタノールを留去し濃縮液を塩酸酸性条件下
でｎ−ブタノールで抽出する。ｎ−ブタノール層の減圧
濃縮物について、セファデックスＬＨ−２０（商品名；
ファルマシアバイオテク製）カラムクロマトグラフィー
（移動層：メタノール）を行い、活性画分を濃縮後、酢
酸エチル−水（１：１）の混合液に溶解し、あらかじめ
前記混合液の下層を固定相とした遠心液液分配クロマト
グラフィー（三鬼エンジニアリング製，ＣＰＣ−ＬＬＢ
−Ｍ）にかけ、前記混合液の上層液で洗浄した後、前記
下層液によって活性画分を反転溶出させる。更にセファ
デックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィー（移動
層：メタノール）を行い、ＮＡ３２１７６Ａを得る。
部に分離する。得られたろ液をアルカリ条件下でダイヤ
イオンＨＰ−２０（商品名；三菱化成製）カラムに通
し、目的物質を吸着せしめ、水洗後、水から８０％メタ
ノール水へ直線勾配で溶出する。その溶出した活性画分
を濃縮し、メタノールを留去し濃縮液を塩酸酸性条件下
でｎ−ブタノールで抽出する。ｎ−ブタノール層の減圧
濃縮物について、セファデックスＬＨ−２０（商品名；
ファルマシアバイオテク製）カラムクロマトグラフィー
（移動層：メタノール）を行い、活性画分を濃縮後、酢
酸エチル−水（１：１）の混合液に溶解し、あらかじめ
前記混合液の下層を固定相とした遠心液液分配クロマト
グラフィー（三鬼エンジニアリング製，ＣＰＣ−ＬＬＢ
−Ｍ）にかけ、前記混合液の上層液で洗浄した後、前記
下層液によって活性画分を反転溶出させる。更にセファ
デックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィー（移動
層：メタノール）を行い、ＮＡ３２１７６Ａを得る。
【００２３】又、別法として、培養液は通常のろ過法で
ろ液と菌体部に分離する。得られたろ液を酸性条件下で
ダイヤイオンＨＰ−２０（商品名；三菱化成製）カラム
に通し、目的物質を吸着せしめ、水洗後、２０％アセト
ン水で溶出する。その溶出した活性画分のアセトンを留
去する。その濃縮液をｐＨ６の条件下ＱＡＥセファデッ
クスＡ２５（商品名；ファルマシアバイオテク製、Cl
型）カラムクロマトグラフィー（移動層：食塩水）を行
い、活性画分を濃縮後、ダイヤイオンＨＰ−２０カラム
に通し、目的物質を吸着せしめ、水洗後、２０％アセト
ン水で溶出する。その溶出した活性画分のアセトンを留
去した後、凍結乾燥を行うことによりＮＡ３２１７６Ａ
を得る。
ろ液と菌体部に分離する。得られたろ液を酸性条件下で
ダイヤイオンＨＰ−２０（商品名；三菱化成製）カラム
に通し、目的物質を吸着せしめ、水洗後、２０％アセト
ン水で溶出する。その溶出した活性画分のアセトンを留
去する。その濃縮液をｐＨ６の条件下ＱＡＥセファデッ
クスＡ２５（商品名；ファルマシアバイオテク製、Cl
型）カラムクロマトグラフィー（移動層：食塩水）を行
い、活性画分を濃縮後、ダイヤイオンＨＰ−２０カラム
に通し、目的物質を吸着せしめ、水洗後、２０％アセト
ン水で溶出する。その溶出した活性画分のアセトンを留
去した後、凍結乾燥を行うことによりＮＡ３２１７６Ａ
を得る。
【００２４】又、ＮＡ３２１７６Ａのもう一つの製造法
としては、ザルコマイシン生産菌を用いて、文献（住木
諭介著 抗生物質 下巻 ９０８〜９２１頁（１９６
１））に記載の方法に従い、液体培養により培養を行い
ザルコマイシンを培養液中に生成蓄積し、培養を停止
後、菌体と培養液をろ別し、ろ液より同文献に記載の方
法を適用してザルコマイシンを抽出精製し、その粗精製
したザルコマイシン食塩水溶液にパンテテインを加える
ことにより高収率で生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａを得
る方法がある。この際、パンテテインは、生成したザル
コマイシンに対して、通常１〜３倍当量、好ましくは
１．０〜１．５倍当量用いる。反応温度は通常０℃〜５
０℃で行い、好ましくは１０℃〜３０℃である。反応時
間は反応温度にもよるが、通常５分から２時間、好まし
くは１０分から１時間程度である。ザルコマイシン食塩
水溶液は上記反応条件で安定であり、分解物は生じな
い。反応により得られるＮＡ３２１７６Ａは、培養濾液
から単離する方法を適用して精製しうる。なお、パンテ
テインは上記の通り、ザルコマイシンの粗精製物に加え
ても良いが、代わりにザルコマイシン生産菌を培養する
際に、又は培養後、ザルコマイシンを粗精製する前に加
えても良く、これらの方法でも同様に目的とするＮＡ３
２１７６Ａを得ることができる。
としては、ザルコマイシン生産菌を用いて、文献（住木
諭介著 抗生物質 下巻 ９０８〜９２１頁（１９６
１））に記載の方法に従い、液体培養により培養を行い
ザルコマイシンを培養液中に生成蓄積し、培養を停止
後、菌体と培養液をろ別し、ろ液より同文献に記載の方
法を適用してザルコマイシンを抽出精製し、その粗精製
したザルコマイシン食塩水溶液にパンテテインを加える
ことにより高収率で生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａを得
る方法がある。この際、パンテテインは、生成したザル
コマイシンに対して、通常１〜３倍当量、好ましくは
１．０〜１．５倍当量用いる。反応温度は通常０℃〜５
０℃で行い、好ましくは１０℃〜３０℃である。反応時
間は反応温度にもよるが、通常５分から２時間、好まし
くは１０分から１時間程度である。ザルコマイシン食塩
水溶液は上記反応条件で安定であり、分解物は生じな
い。反応により得られるＮＡ３２１７６Ａは、培養濾液
から単離する方法を適用して精製しうる。なお、パンテ
テインは上記の通り、ザルコマイシンの粗精製物に加え
ても良いが、代わりにザルコマイシン生産菌を培養する
際に、又は培養後、ザルコマイシンを粗精製する前に加
えても良く、これらの方法でも同様に目的とするＮＡ３
２１７６Ａを得ることができる。
【００２５】上記のようにして得られた生理活性物質Ｎ
Ａ３２１７６Ａの構造式及び理化学的性質を下記に示
す。 １）構造式（１）
Ａ３２１７６Ａの構造式及び理化学的性質を下記に示
す。 １）構造式（１）
【化３】 ２）外観；白色粉末 ３）分子量；４１８ ４）分子式；Ｃ１８Ｈ３０Ｎ２Ｏ７Ｓ（高分解能マスス
ペクトルにより測定） ５）溶解性；低級アルコール，水，ジメチルスルホキシ
ドに可溶。ヘキサン，石油エーテルに不溶。 ６）シリカゲル薄層クロマトグラフィーによるＲｆ値；
ｎ−ブタノール−酢酸−水（４：１：２）の展開溶媒で
０．７を示す。 ７）紫外部吸収スペクトル；水中で末端吸収を示す。 ８）赤外部吸収スペクトル；臭化カリウム錠剤で測定し
たスペクトルを図１に示す。 ９）水素核磁気共鳴スペクトル；重水中で測定したスペ
クトルを図２に示す。 １０）炭素核磁気共鳴スペクトル；重水中で測定したス
ペクトルを図３に示す。そして、化学シフト値を以下に
示した。 δ（ｐｐｍ）２２３．５（ｓ），１８０．１（ｓ），１
７６．４（ｓ），１７５．１（ｓ）， ７７．０
（ｄ）， ６９．６（ｔ），５３．４（ｄ）， ４７．
７（ｄ）， ３９．８（ｓ），３９．７（ｔ）， ３
８．９（ｔ）， ３６．７（ｔ），３６．５（ｔ），
３２．５（ｔ）， ３１．０（ｔ），２５．７（ｔ），
２１．８（ｑ）， ２０．３（ｑ） １０）呈色反応；リンモリブデン酸，塩化パラジウムに
陽性。
ペクトルにより測定） ５）溶解性；低級アルコール，水，ジメチルスルホキシ
ドに可溶。ヘキサン，石油エーテルに不溶。 ６）シリカゲル薄層クロマトグラフィーによるＲｆ値；
ｎ−ブタノール−酢酸−水（４：１：２）の展開溶媒で
０．７を示す。 ７）紫外部吸収スペクトル；水中で末端吸収を示す。 ８）赤外部吸収スペクトル；臭化カリウム錠剤で測定し
たスペクトルを図１に示す。 ９）水素核磁気共鳴スペクトル；重水中で測定したスペ
クトルを図２に示す。 １０）炭素核磁気共鳴スペクトル；重水中で測定したス
ペクトルを図３に示す。そして、化学シフト値を以下に
示した。 δ（ｐｐｍ）２２３．５（ｓ），１８０．１（ｓ），１
７６．４（ｓ），１７５．１（ｓ）， ７７．０
（ｄ）， ６９．６（ｔ），５３．４（ｄ）， ４７．
７（ｄ）， ３９．８（ｓ），３９．７（ｔ）， ３
８．９（ｔ）， ３６．７（ｔ），３６．５（ｔ），
３２．５（ｔ）， ３１．０（ｔ），２５．７（ｔ），
２１．８（ｑ）， ２０．３（ｑ） １０）呈色反応；リンモリブデン酸，塩化パラジウムに
陽性。
【００２６】ＮＡ３２１７６Ａ又はその薬学的に許容し
うる塩は、通常知られている方法によって製造すること
ができ、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよ
び塩酸、硫酸などを含む溶液でＮＡ３２１７６Ａ又はそ
の薬学的に許容しうる塩を処理することによって得るこ
とができる。
うる塩は、通常知られている方法によって製造すること
ができ、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよ
び塩酸、硫酸などを含む溶液でＮＡ３２１７６Ａ又はそ
の薬学的に許容しうる塩を処理することによって得るこ
とができる。
【００２７】医薬品として使用する場合の製剤化および
投与方法は従来公知の種々の方法が適用できる。すなわ
ち、投与方法としては注射、経口、直腸投与などが可能
である。製剤形態としては注射剤、粉末剤、顆粒剤、錠
剤、坐剤などの形態をとり得る。製剤化の際にＮＡ３２
１７６Ａに悪影響を与えない限り、医薬用に用いられる
種々の補助剤、すなわち、担体やその他の助剤、例えば
安定剤、防腐剤、無痛化剤、乳化剤等が必要に応じて使
用され得る。製剤において、ＮＡ３２１７６Ａの含量は
製剤形態等により広範囲に変えることが可能であり、一
般にはＮＡ３２１７６Ａを０．０１〜１００％（重
量）、好ましくは０．１〜７０％（重量）含有し、残り
は通常医薬用に使用される担体その他の補助剤からな
る。
投与方法は従来公知の種々の方法が適用できる。すなわ
ち、投与方法としては注射、経口、直腸投与などが可能
である。製剤形態としては注射剤、粉末剤、顆粒剤、錠
剤、坐剤などの形態をとり得る。製剤化の際にＮＡ３２
１７６Ａに悪影響を与えない限り、医薬用に用いられる
種々の補助剤、すなわち、担体やその他の助剤、例えば
安定剤、防腐剤、無痛化剤、乳化剤等が必要に応じて使
用され得る。製剤において、ＮＡ３２１７６Ａの含量は
製剤形態等により広範囲に変えることが可能であり、一
般にはＮＡ３２１７６Ａを０．０１〜１００％（重
量）、好ましくは０．１〜７０％（重量）含有し、残り
は通常医薬用に使用される担体その他の補助剤からな
る。
【００２８】ＮＡ３２１７６Ａの投与量は症状等により
異なるが、成人１人１日当り０．０１〜８００ｍｇ程度
である。連投を必要とする場合には１日当りの使用量を
おさえることが好ましい。
異なるが、成人１人１日当り０．０１〜８００ｍｇ程度
である。連投を必要とする場合には１日当りの使用量を
おさえることが好ましい。
【００２９】
【作用】以下に実験例を挙げて、ＮＡ３２１７６Ａの神
経分化促進作用について述べる。 実験例
経分化促進作用について述べる。 実験例
【００３０】生理活性物質ＮＡ３２１７６ＡのＰＣ１２
細胞に対する神経様突起伸張作用は、グリーン（Ｇｒｅ
ｅｎ）らの方法（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃ
ｉ．，３巻，３５３頁（１９８０））を一部改変して形
態変化によって判定した。
細胞に対する神経様突起伸張作用は、グリーン（Ｇｒｅ
ｅｎ）らの方法（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃ
ｉ．，３巻，３５３頁（１９８０））を一部改変して形
態変化によって判定した。
【００３１】即ち、１０％牛胎児血清と１０％馬血清を
添加したダルベッコ変法イーグル培地にＰＣ１２細胞を
２×１０４／ｍｌになるように植え、コラーゲンコート
９６穴マルチプレートで一晩，３７℃，５％ＣＯ２下で
培養した。ここにサンプルを添加して形態変化を観察す
る。
添加したダルベッコ変法イーグル培地にＰＣ１２細胞を
２×１０４／ｍｌになるように植え、コラーゲンコート
９６穴マルチプレートで一晩，３７℃，５％ＣＯ２下で
培養した。ここにサンプルを添加して形態変化を観察す
る。
【００３２】その結果、生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａ
のＰＣ１２細胞に対する神経様突起伸張を引き起こす有
効濃度は、２５μｇ／ｍｌから１．５６μｇ／ｍｌと広
範囲に渡った。対照として同様の作用を示すスタウロス
ポリンの活性を上記の方法で測定したところ、０．６３
μｇ／ｍｌから０．０８μｇ／ｍｌの範囲で神経様突起
の伸張が観察された。
のＰＣ１２細胞に対する神経様突起伸張を引き起こす有
効濃度は、２５μｇ／ｍｌから１．５６μｇ／ｍｌと広
範囲に渡った。対照として同様の作用を示すスタウロス
ポリンの活性を上記の方法で測定したところ、０．６３
μｇ／ｍｌから０．０８μｇ／ｍｌの範囲で神経様突起
の伸張が観察された。
【００３３】また、ＮＡ３２１７６Ａが、上記の方法に
より、ＰＣ１２細胞を細胞毒性によって死滅させる濃度
は、５０μｇ／ｍｌ以上であり、一方スタウロスポリン
は１．２５μｇ／ｍｌ以上であった。したがって、ＮＡ
３２１７６Ａはスタウロスポリンより低毒性であること
がわかった。
より、ＰＣ１２細胞を細胞毒性によって死滅させる濃度
は、５０μｇ／ｍｌ以上であり、一方スタウロスポリン
は１．２５μｇ／ｍｌ以上であった。したがって、ＮＡ
３２１７６Ａはスタウロスポリンより低毒性であること
がわかった。
【００３４】
【実施例】以下に本発明の実施例を示すが、これは単な
る一例であって何等本発明を限定するものではなく、種
々の変法が可能である。
る一例であって何等本発明を限定するものではなく、種
々の変法が可能である。
【００３５】製造法１ ロータリー型振とう機用５００ｍｌ三角フラスコにグリ
セリン２．０％、グルコース１．０％、大豆粉０．５
％、ペプトン０．３％、酵母エキス０．５％、炭酸カル
シウム０．２％、燐酸水素２カリウム０．０５％、硫酸
マグネシウム０．０５％の培地（ｐＨ７．０）１００ｍ
ｌを分注し、１２０℃、２０分間オートクレーブ滅菌し
た。これにＮＡ ３２１７６株（工業技術院生命工学工
業技術研究所 ＦＥＲＭ ＢＰ−６４１１）の１白金耳
を接種し、２７℃、２２０回転／分、の条件で２日間振
とう培養し種培養とした。引き続きロータリー型振とう
機用５００ｍｌ三角フラスコにグルコース１．０％、水
飴４．０％、コーンスチープリカー１．０％、酵母エキ
ス０．２％、グルテンミール１．０％、硫酸鉄・７水和
物０．０００１１％、硫酸銅・５水和物０．０００６４
％、硫酸亜鉛・７水和物０．０００１５％、塩化マンガ
ン・４水和物０．０００７９％、塩化コバルト０．００
０１％、炭酸カルシウム０．２％の培地（ｐＨ７．０）
１００ｍｌを分注し、１２０℃、２０分間オートクレー
ブ滅菌した後に、前記の種培養液１ｍｌを移植し、２７
℃、２２０回転／分、の条件で４日間振とう培養した。
得られた培養液（１０リットル）は通常のろ過方法でろ
液と菌体に分離した。得られたろ液を４Ｎ苛性ソーダで
ｐＨ８に合わせ、ダイヤイオンＨＰ−２０カラム（１リ
ットル）に吸着せしめ、水洗浄し、水（２リットル）か
ら８０％メタノール（２リットル）への直線勾配で溶出
した。その溶出画分をメタノール留去後、１Ｎ塩酸でｐ
Ｈ２に合わせ、ｎ−ブタノールで抽出した。ｎ−ブタノ
ール層の減圧濃縮物（４９１ｍｇ）について、セファデ
ックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィー（φ３．５
×９０ｃｍ、移動相：メタノール）を行い、活性画分
（２６７ｍｇ）を得た。この活性画分を酢酸エチル−水
（１：１）の混合溶液に溶解した後、あらかじめ前記混
合液の下層を固定相とした遠心液液分配クロマトグラフ
ィー（２５０ｍｌ容量，１５００回転／分，流速３ｍｌ
／分）にかけ、前記混合液の上層液で洗浄した後、前記
下層液によって活性画分を反転溶出させ、粗活性物質
（１６ｍｇ）を得た。更にセファデックスＬＨ−２０カ
ラムクロマトグラフィー（φ１．８×８５ｃｍ、移動
層：メタノール）を行い精製することでＮＡ３２１７６
Ａ（１３ｍｇ）を得た。精製したＮＡ３２１７６Ａを用
いて、外観、分子量、溶解性、シリカゲル薄層クロマト
グラフィーによるＲｆ値、紫外部吸収スペクトル、赤外
部吸収スペクトル、1Ｈ−ＮＭＲスペクトル、13Ｃ−Ｎ
ＭＲスペクトルを測定した。ＮＡ３２１７６Ａの理化学
的性質は前記した通りの値を示した。
セリン２．０％、グルコース１．０％、大豆粉０．５
％、ペプトン０．３％、酵母エキス０．５％、炭酸カル
シウム０．２％、燐酸水素２カリウム０．０５％、硫酸
マグネシウム０．０５％の培地（ｐＨ７．０）１００ｍ
ｌを分注し、１２０℃、２０分間オートクレーブ滅菌し
た。これにＮＡ ３２１７６株（工業技術院生命工学工
業技術研究所 ＦＥＲＭ ＢＰ−６４１１）の１白金耳
を接種し、２７℃、２２０回転／分、の条件で２日間振
とう培養し種培養とした。引き続きロータリー型振とう
機用５００ｍｌ三角フラスコにグルコース１．０％、水
飴４．０％、コーンスチープリカー１．０％、酵母エキ
ス０．２％、グルテンミール１．０％、硫酸鉄・７水和
物０．０００１１％、硫酸銅・５水和物０．０００６４
％、硫酸亜鉛・７水和物０．０００１５％、塩化マンガ
ン・４水和物０．０００７９％、塩化コバルト０．００
０１％、炭酸カルシウム０．２％の培地（ｐＨ７．０）
１００ｍｌを分注し、１２０℃、２０分間オートクレー
ブ滅菌した後に、前記の種培養液１ｍｌを移植し、２７
℃、２２０回転／分、の条件で４日間振とう培養した。
得られた培養液（１０リットル）は通常のろ過方法でろ
液と菌体に分離した。得られたろ液を４Ｎ苛性ソーダで
ｐＨ８に合わせ、ダイヤイオンＨＰ−２０カラム（１リ
ットル）に吸着せしめ、水洗浄し、水（２リットル）か
ら８０％メタノール（２リットル）への直線勾配で溶出
した。その溶出画分をメタノール留去後、１Ｎ塩酸でｐ
Ｈ２に合わせ、ｎ−ブタノールで抽出した。ｎ−ブタノ
ール層の減圧濃縮物（４９１ｍｇ）について、セファデ
ックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィー（φ３．５
×９０ｃｍ、移動相：メタノール）を行い、活性画分
（２６７ｍｇ）を得た。この活性画分を酢酸エチル−水
（１：１）の混合溶液に溶解した後、あらかじめ前記混
合液の下層を固定相とした遠心液液分配クロマトグラフ
ィー（２５０ｍｌ容量，１５００回転／分，流速３ｍｌ
／分）にかけ、前記混合液の上層液で洗浄した後、前記
下層液によって活性画分を反転溶出させ、粗活性物質
（１６ｍｇ）を得た。更にセファデックスＬＨ−２０カ
ラムクロマトグラフィー（φ１．８×８５ｃｍ、移動
層：メタノール）を行い精製することでＮＡ３２１７６
Ａ（１３ｍｇ）を得た。精製したＮＡ３２１７６Ａを用
いて、外観、分子量、溶解性、シリカゲル薄層クロマト
グラフィーによるＲｆ値、紫外部吸収スペクトル、赤外
部吸収スペクトル、1Ｈ−ＮＭＲスペクトル、13Ｃ−Ｎ
ＭＲスペクトルを測定した。ＮＡ３２１７６Ａの理化学
的性質は前記した通りの値を示した。
【００３６】製造法２ ロータリー型振とう機用５００ｍｌ三角フラスコにグリ
セリン２．０％、グルコース１．０％、大豆粉０．５
％、ペプトン０．３％、酵母エキス０．５％、炭酸カル
シウム０．２％、燐酸水素２カリウム０．０５％、硫酸
マグネシウム０．０５％の培地（ｐＨ７．０）１００ｍ
ｌを分注し、１２０℃、２０分間オートクレーブ滅菌し
た。これにＮＡ ３２１７６株（工業技術院生命工学工
業技術研究所 ＦＥＲＭ ＢＰ−６４１１）の１白金耳
を接種し、２７℃、２２０回転／分の条件で２日間振と
う培養し種培養とした。引き続きロータリー型振とう機
用５００ｍｌ三角フラスコにグルコース１．０％、水飴
４．０％、コーンスチープリカー１．０％、酵母エキス
０．２％、グルテンミール１．０％、硫酸鉄・７水和物
０．０００１１％、硫酸銅・５水和物０．０００６４
％、硫酸亜鉛・７水和物０．０００１５％、塩化マンガ
ン・４水和物０．０００７９％、塩化コバルト０．００
０１％、炭酸カルシウム０．２％の培地（ｐＨ７．０）
１００ｍｌを分注し、１２０℃、２０分間オートクレー
ブ滅菌した後に、前記の種培養液１ｍｌを移植し、２７
℃、２２０回転／分の条件で４日間振とう培養した。パ
ンテテイン（50mg/ml）は培養を開始して２日目と３日
目（計２回）添加した。
セリン２．０％、グルコース１．０％、大豆粉０．５
％、ペプトン０．３％、酵母エキス０．５％、炭酸カル
シウム０．２％、燐酸水素２カリウム０．０５％、硫酸
マグネシウム０．０５％の培地（ｐＨ７．０）１００ｍ
ｌを分注し、１２０℃、２０分間オートクレーブ滅菌し
た。これにＮＡ ３２１７６株（工業技術院生命工学工
業技術研究所 ＦＥＲＭ ＢＰ−６４１１）の１白金耳
を接種し、２７℃、２２０回転／分の条件で２日間振と
う培養し種培養とした。引き続きロータリー型振とう機
用５００ｍｌ三角フラスコにグルコース１．０％、水飴
４．０％、コーンスチープリカー１．０％、酵母エキス
０．２％、グルテンミール１．０％、硫酸鉄・７水和物
０．０００１１％、硫酸銅・５水和物０．０００６４
％、硫酸亜鉛・７水和物０．０００１５％、塩化マンガ
ン・４水和物０．０００７９％、塩化コバルト０．００
０１％、炭酸カルシウム０．２％の培地（ｐＨ７．０）
１００ｍｌを分注し、１２０℃、２０分間オートクレー
ブ滅菌した後に、前記の種培養液１ｍｌを移植し、２７
℃、２２０回転／分の条件で４日間振とう培養した。パ
ンテテイン（50mg/ml）は培養を開始して２日目と３日
目（計２回）添加した。
【００３７】得られた培養液（２００ｍｌ）は遠心分離
により上清液と菌体に分離した。得られた上清液を６Ｎ
塩酸でｐＨ３に調整し、ダイヤイオンＨＰ−２０カラム
（三菱化成製；φ1.2×20cm）に吸着せしめ、水洗後、
２０％アセトン水で溶出した。この溶出液のアセトンを
留去後、残査をｐＨ６に調製し、ＱＡＥ−セファデック
ス（ファルマシアバイオテク製、Cl型、φ1.8×100cm）
に吸着せしめ、水洗浄し、水（６００ｍｌ）から０．５
Ｍ塩化ナトリウム水溶液（６００ｍｌ）への直線勾配で
溶出した。その溶出画分をダイヤイオンＨＰ−２０カラ
ム（三菱化成製；φ1.2×20cm）に吸着せしめ、水洗
後、２０％アセトン水で溶出した。その溶出した活性画
分のアセトンを留去した後、凍結乾燥を行うことにより
ＮＡ３２１７６Ａ（２０ｍｇ）を得た。精製したＮＡ３
２１７６Ａを用いて、外観、分子量、溶解性、シリカゲ
ル薄層クロマトグラフィーによるＲｆ値、紫外部吸収ス
ペクトル、赤外部吸収スペクトル、１Ｈ−ＮＭＲスペク
トル、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した。ＮＡ３２
１７６Ａの構造式及び理化学的性質は前記した通りの値
を示した。
により上清液と菌体に分離した。得られた上清液を６Ｎ
塩酸でｐＨ３に調整し、ダイヤイオンＨＰ−２０カラム
（三菱化成製；φ1.2×20cm）に吸着せしめ、水洗後、
２０％アセトン水で溶出した。この溶出液のアセトンを
留去後、残査をｐＨ６に調製し、ＱＡＥ−セファデック
ス（ファルマシアバイオテク製、Cl型、φ1.8×100cm）
に吸着せしめ、水洗浄し、水（６００ｍｌ）から０．５
Ｍ塩化ナトリウム水溶液（６００ｍｌ）への直線勾配で
溶出した。その溶出画分をダイヤイオンＨＰ−２０カラ
ム（三菱化成製；φ1.2×20cm）に吸着せしめ、水洗
後、２０％アセトン水で溶出した。その溶出した活性画
分のアセトンを留去した後、凍結乾燥を行うことにより
ＮＡ３２１７６Ａ（２０ｍｇ）を得た。精製したＮＡ３
２１７６Ａを用いて、外観、分子量、溶解性、シリカゲ
ル薄層クロマトグラフィーによるＲｆ値、紫外部吸収ス
ペクトル、赤外部吸収スペクトル、１Ｈ−ＮＭＲスペク
トル、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した。ＮＡ３２
１７６Ａの構造式及び理化学的性質は前記した通りの値
を示した。
【００３８】製造法３ ロータリー型振とう機用５００ｍｌ三角フラスコにグリ
セリン２．０％、グルコース１．０％、大豆粉０．５
％、ペプトン０．３％、酵母エキス０．５％、炭酸カル
シウム０．２％、燐酸水素２カリウム０．０５％、硫酸
マグネシウム０．０５％の培地（ｐＨ７．０）１００ｍ
ｌを分注し、１２０℃、２０分間オートクレーブ滅菌し
た。これにザルコマイシン生産菌株（財団法人 発酵研
究所 IFO3304）の１白金耳を接種し、２７℃、２２０
回転／分の条件で２日間振とう培養し種培養とした。引
き続きロータリー型振とう機用５００ｍｌ三角フラスコ
にグルコース１．０％、水飴４．０％、コーンスチープ
リカー１．０％、酵母エキス０．２％、グルテンミール
１．０％、硫酸鉄・７水和物０．０００１１％、硫酸銅
・５水和物０．０００６４％、硫酸亜鉛・７水和物０．
０００１５％、塩化マンガン・４水和物０．０００７９
％、塩化コバルト０．０００１％、炭酸カルシウム０．
２％の培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを分注し、１２０
℃、２０分間オートクレーブ滅菌したフラスコに前記の
種培養液１ｍｌを移植し、２７℃、２２０回転／分の条
件で４日間振とう培養した。
セリン２．０％、グルコース１．０％、大豆粉０．５
％、ペプトン０．３％、酵母エキス０．５％、炭酸カル
シウム０．２％、燐酸水素２カリウム０．０５％、硫酸
マグネシウム０．０５％の培地（ｐＨ７．０）１００ｍ
ｌを分注し、１２０℃、２０分間オートクレーブ滅菌し
た。これにザルコマイシン生産菌株（財団法人 発酵研
究所 IFO3304）の１白金耳を接種し、２７℃、２２０
回転／分の条件で２日間振とう培養し種培養とした。引
き続きロータリー型振とう機用５００ｍｌ三角フラスコ
にグルコース１．０％、水飴４．０％、コーンスチープ
リカー１．０％、酵母エキス０．２％、グルテンミール
１．０％、硫酸鉄・７水和物０．０００１１％、硫酸銅
・５水和物０．０００６４％、硫酸亜鉛・７水和物０．
０００１５％、塩化マンガン・４水和物０．０００７９
％、塩化コバルト０．０００１％、炭酸カルシウム０．
２％の培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを分注し、１２０
℃、２０分間オートクレーブ滅菌したフラスコに前記の
種培養液１ｍｌを移植し、２７℃、２２０回転／分の条
件で４日間振とう培養した。
【００３９】得られた培養液（５リットル）は遠心分離
により上清液と菌体に分離した。得られた上清液を６Ｎ
塩酸でｐＨ４．５に調整し、活性炭カラム（５００ｍ
ｌ）に吸着せしめ、水洗後、２０％アセトン水で溶出し
た。この溶出液のアセトンを留去後、凍結乾燥を行うこ
とにより粗ザルコマイシン（２２．２ｇ）を得た。その
うちの５．０ｇをＱＡＥ−セファデックス（ファルマシ
アバイオテク製、Cl型、φ1.8×100cm）に吸着せしめ、
水洗浄し、水（６００ｍｌ）から０．５Ｍ塩化ナトリウ
ム水溶液（６００ｍｌ）への直線勾配で溶出し、ザルコ
マイシンを含有する画分８０ｍｌを得た。そのうちの４
０ｍｌに対して撹拌下パンテテイン（２２０ｍｇ/２.２
ｍｌ）を添加し、２０分間撹拌した。その反応溶液を塩
酸を用いてｐＨ６に調製し、ＱＡＥ−セファデックス
（ファルマシアバイオテク製、Cl型、φ1.8×100cm）に
吸着せしめ、水による洗浄後、水（６００ｍｌ）から
０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液（６００ｍｌ）への直線
勾配で溶出した。ＮＡ３２１７６Ａの溶出画分をダイヤ
イオンＨＰ−２０カラム（三菱化成製；φ1.2×20cm）
に吸着せしめ、水洗後、２０％アセトン水で溶出した。
その溶出した活性画分のアセトンを留去した後、凍結乾
燥を行うことによりＮＡ３２１７６Ａ（６０ｍｇ）を得
た。
により上清液と菌体に分離した。得られた上清液を６Ｎ
塩酸でｐＨ４．５に調整し、活性炭カラム（５００ｍ
ｌ）に吸着せしめ、水洗後、２０％アセトン水で溶出し
た。この溶出液のアセトンを留去後、凍結乾燥を行うこ
とにより粗ザルコマイシン（２２．２ｇ）を得た。その
うちの５．０ｇをＱＡＥ−セファデックス（ファルマシ
アバイオテク製、Cl型、φ1.8×100cm）に吸着せしめ、
水洗浄し、水（６００ｍｌ）から０．５Ｍ塩化ナトリウ
ム水溶液（６００ｍｌ）への直線勾配で溶出し、ザルコ
マイシンを含有する画分８０ｍｌを得た。そのうちの４
０ｍｌに対して撹拌下パンテテイン（２２０ｍｇ/２.２
ｍｌ）を添加し、２０分間撹拌した。その反応溶液を塩
酸を用いてｐＨ６に調製し、ＱＡＥ−セファデックス
（ファルマシアバイオテク製、Cl型、φ1.8×100cm）に
吸着せしめ、水による洗浄後、水（６００ｍｌ）から
０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液（６００ｍｌ）への直線
勾配で溶出した。ＮＡ３２１７６Ａの溶出画分をダイヤ
イオンＨＰ−２０カラム（三菱化成製；φ1.2×20cm）
に吸着せしめ、水洗後、２０％アセトン水で溶出した。
その溶出した活性画分のアセトンを留去した後、凍結乾
燥を行うことによりＮＡ３２１７６Ａ（６０ｍｇ）を得
た。
【００４０】
【発明の効果】以上より明らかなように、本発明の生理
活性物質ＮＡ３２１７６Ａまたはその薬学的に許容しう
る塩は神経突起伸張促進作用を有し、例えば抗痴呆剤，
末梢神経障害治療剤または神経細胞保護剤等の有効成分
として期待できる。
活性物質ＮＡ３２１７６Ａまたはその薬学的に許容しう
る塩は神経突起伸張促進作用を有し、例えば抗痴呆剤，
末梢神経障害治療剤または神経細胞保護剤等の有効成分
として期待できる。
【図１】ＮＡ３２１７６Ａの臭化カリウム錠剤で測定し
た赤外部吸収スペクトル
た赤外部吸収スペクトル
【図２】ＮＡ３２１７６Ａの重水中で測定した水素核磁
気共鳴スペクトル
気共鳴スペクトル
【図３】ＮＡ３２１７６Ａの重水中で測定した炭素核磁
気共鳴スペクトル
気共鳴スペクトル
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 13/00 Ｃ１２Ｒ 1:465）
Claims (11)
- 【請求項１】式（１） 【化１】 を有するＮＡ３２１７６Ａまたはその薬学的に許容しう
る塩。 - 【請求項２】下記の理化学的性質を示す生理活性物質Ｎ
Ａ３２１７６Ａまたはその薬学的に許容しうる塩。 １）外観；白色粉末 ２）分子量；４１８ ３）分子式；Ｃ１８Ｈ３０Ｎ２Ｏ７Ｓ（高分解能マスス
ペクトルにより測定） ４）溶解性；低級アルコール，水，ジメチルスルホキシ
ドに可溶。ヘキサン，石油エーテルに不溶。 ５）シリカゲル薄層クロマトグラフィーによるＲｆ値；
ｎ−ブタノール−酢酸−水（４：１：２）の展開溶媒で
０．７を示す。 ６）紫外部吸収スペクトル；水中で末端吸収を示す。 ７）赤外部吸収スペクトル；臭化カリウム錠剤で測定し
たスペクトルを図１に示す。 ８）水素核磁気共鳴スペクトル；重水中で測定したスペ
クトルを図２に示す。 ９）炭素核磁気共鳴スペクトル；重水中で測定したスペ
クトルを図３に示す。そして、化学シフト値を以下に示
した。 δ（ｐｐｍ）２２３．５（ｓ），１８０．１（ｓ），１
７６．４（ｓ），１７５．１（ｓ）， ７７．０
（ｄ）， ６９．６（ｔ），５３．４（ｄ）， ４７．
７（ｄ）， ３９．８（ｓ），３９．７（ｔ）， ３
８．９（ｔ）， ３６．７（ｔ），３６．５（ｔ），
３２．５（ｔ）， ３１．０（ｔ），２５．７（ｔ），
２１．８（ｑ）， ２０．３（ｑ） １０）呈色反応；リンモリブデン酸，塩化パラジウムに
陽性。 - 【請求項３】生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａまたはその
薬学的に許容しうる塩を有効成分とする医薬。 - 【請求項４】ＰＣ１２細胞に対する神経様突起伸張作用
を持つ請求項３記載の医薬。 - 【請求項５】神経細胞分化促進剤である請求項３記載の
医薬。 - 【請求項６】抗痴呆剤，末梢神経障害治療剤または神経
細胞保護剤のうちいずれかである請求項３記載の医薬。 - 【請求項７】ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ）属に属し、生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａを生産
する能力を有する微生物。 - 【請求項８】ストレプトミセス エスピー ＮＡ ３２
１７６（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ． ＮＡ ３
２１７６）株（工業技術院生命工学工業技術研究所 受
託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６４１１）及びその変異株。 - 【請求項９】ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ）属に属し、生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａを生産
する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に生
理活性物質ＮＡ３２１７６Ａを生成蓄積せしめ、これを
採取する事を特徴とする生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａ
またはその薬学的に許容しうる塩の製造法。 - 【請求項１０】ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ）属に属し、生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａを生
産する能力を有する微生物を培地に培養し、パンテテイ
ン(pantetheine)を培養液に添加することにより、培養
物中に生理活性物質ＮＡ３２１７６Ａを生成蓄積せし
め、これを採取する事を特徴とする生理活性物質ＮＡ３
２１７６Ａまたはその薬学的に許容しうる塩の製造法。 - 【請求項１１】ザルコマイシン生産菌を培養する際に、
又は、ザルコマイシン生産菌を培養しザルコマイシンを
生産し、必要により粗抽出したザルコマイシンに、パン
テテインを加えることにより、生理活性物質ＮＡ３２１
７６Ａを得ることを特徴とする生理活性物質ＮＡ３２１
７６Ａまたはその薬学的に許容しうる塩の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10242723A JPH11140091A (ja) | 1997-08-29 | 1998-08-28 | 生理活性物質ｎａ３２１７６ａ、その製造法およびその用途 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9-247534 | 1997-08-29 | ||
| JP24753497 | 1997-08-29 | ||
| JP10242723A JPH11140091A (ja) | 1997-08-29 | 1998-08-28 | 生理活性物質ｎａ３２１７６ａ、その製造法およびその用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11140091A true JPH11140091A (ja) | 1999-05-25 |
Family
ID=26535893
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10242723A Pending JPH11140091A (ja) | 1997-08-29 | 1998-08-28 | 生理活性物質ｎａ３２１７６ａ、その製造法およびその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11140091A (ja) |
-
1998
- 1998-08-28 JP JP10242723A patent/JPH11140091A/ja active Pending
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