JPH11221072A - 新規セルロース生産菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 バクテリアセルロースの生産性の向上した新
規な菌を得ること。 【解決手段】 ＵＤＰ、ＵＴＰ又はＵＤＰ−Ｇの菌体内
濃度が高いセルロース生産菌、カルバモイルリン酸合成
酵素の活性が増加したセルロース生産菌、又はＵＴＰに
よるカルバモイルリン酸合成酵素のフィードバック阻害
が抑制されているセルロース生産菌。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規な諸特性を有
するセルロース生産菌、及び該菌を培養することから成
るバクテリアセルロースの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】セルロース生産菌を培養することによっ
て製造されるバクテリアセルロース（ＢＣ）は、木材パ
ルプ等から製造されるセルロースに較べてフィブリル
（又は微細繊維）の断面幅が２ケタ程度小さいことを特
徴とする。従って、この構造的特徴に基づいて、高分
子、特に、水系高分子用補強剤としての各種産業用途が
ある。例えば、かかるバクテリアセルロースの離解物を
紙状シート又は固型形状に固化した物質は高い引っ張り
弾性率を示すので、フィブリルの構造的特徴に基づく優
れた機械特性が期待され、各種産業用素材として利用さ
れている。或いは、製紙工程における填料歩留まり剤と
しても使用されている。また、バクテリアセルロースは
可食性であり、無味無臭であるために、食品分野で多く
利用される他、水系分散性に優れているので、食品、化
粧品、又は塗料等の粘度の保持、食品原料生地の強化、
水分の保持、食品安定性の向上、低カロリー添加物又は
乳化安定化補助剤としての産業上の利用価値がある。

【０００３】

【本発明が解決しようとする課題】さて、ＢＣはグルコ
ース１リン酸とＵＴＰから生合成されるＵＤＰ−グルコ
ース−Ｇ（ＵＤＰ−Ｇ）を前駆体として合成される。従
って、ＵＤＰ、ＵＴＰ又はＵＤＰ−Ｇの菌体内濃度を上
げることが出来ればＢＣの生産性を向上させることが可
能となる。一方、ＵＴＰはピリミジン生合成の最初の段
階で働くカルバモイルリン酸合成酵素(Carbamoyl-phosp
hate synthetase:CPS)の活性をフィードバック阻害して
いることが知られている。本発明者はこのような特質を
有するセルロー生産菌を見出すべく鋭意研究の結果、本
発明を完成させた。

【０００４】

【課題を解決する為の手段】即ち、本発明は、ＵＤＰ、
ＵＴＰ又はＵＤＰ−Ｇの菌体内濃度が高いセルロース生
産菌に係わる。具体的には、本発明のセルロース生産菌
に於いて、培養中のＵＤＰ、ＵＴＰ又はＵＤＰ−Ｇの菌
体内濃度は、従来のものに比べて有意な程度、例えば約
１．５倍ないし約４倍程度も高くなっている。更に、本
発明は、カルバモイルリン酸合成酵素の活性が有意な程
度、例えば約１０％〜約５０％程度増加したセルロース
生産菌、及びＵＴＰによるカルバモイルリン酸合成酵素
のフィードバック阻害が有意な程度に抑制されているセ
ルロース生産菌にも係わる。このようにカルバモイルリ
ン酸合成酵素の活性が増加しているか、又は／及び該酵
素のフィードバック阻害（アロステリック効果）が抑制
されていることが、ＵＤＰ、ＵＴＰ又はＵＤＰ−Ｇの菌
体内濃度が増加する原因の一つであろう。

【０００５】本発明の新規な菌体は、以下に述べるよう
な従来公知のセルロース生産菌に、ＮＴＧ等の従来公知
の変異剤を使用して突然変異を誘発させ、こうして得ら
れた突然変異株のＵＴＰ及びＵＤＰ−Ｇの菌体内濃度等
の性質を調べることによって、当業者であれば容易に得
ることが出来る。また、当業者には周知の方法によっ
て、土壌等の自然界から探索することによっても、容易
に取得することができる。

【０００６】本発明の菌体の好適例として、以下の実施
例に詳しく記載したように、アセトバクター・キシリナ
ム・サブスピーシーズ・ノンアセトオキシダンス（A.xy
linum subsp. nonacetoxidans)に属する７５７−３−５
−１１株を突然変異処理して得られたＵ−３５株を挙げ
ることが出来る。この株は、１９９８年１月１６日付で
通産省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄
託センターに寄託され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６５
８４を付されている。尚、７５７−３−５−１１株の取
得方法及び菌学的性質は、ＰＣＴ／ＪＰ９７／００５１
４に詳しく記載されており、該株は１９９６年４月１２
日付で通産省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微
生物寄託センターに寄託され（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１５５６４）、その後、１９９７年２月１０日付で特許
手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト
条約に基づく寄託（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５８１
５）に移管されている。

【０００７】更に、本発明は、本発明のバクテリアセル
ロース生産菌を培養し、培地中に蓄積したバクテリアセ
ルロースを回収することから成る本発明に係わるバクテ
リアセルロースの製造方法に係わる。バクテリアセルロ
ース生産菌の培養自体は、以下に述べるように、当業者
には公知の方法で行うことが出来る。

【０００８】本発明における新規なセルロース生産菌の
創製の為に使用される公知のセルロース生産菌は、例え
ば、ＢＰＲ２００１株に代表されるアセトバクター・キ
シリナム・サブスピーシーズ・シュクロファーメンタン
ス（Acetobacter xylinum subsp. sucrofermentans）、
アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）
ＡＴＣＣ２３７６８、アセトバクター・キシリナムＡＴ
ＣＣ２３７６９、アセトバクター・パスツリアヌス（A.
pasteurianus ）ＡＴＣＣ１０２４５、アセトバクター
・キシリナムＡＴＣＣ１４８５１、アセトバクター・キ
シリナムＡＴＣＣ１１１４２及びアセトバクター・キシ
リナムＡＴＣＣ１０８２１等の酢酸菌（アセトバクター
属）、その他に、アグロバクテリウム属、リゾビウム
属、サルシナ属、シュードモナス属、アクロモバクター
属、アルカリゲネス属、アエロバクター属、アゾトバク
ター属及びズーグレア属並びにそれらをＮＴＧ（ニトロ
ソグアニジン）等を用いる公知の方法によって変異処理
することにより創製される各種変異株である。

【０００９】尚、ＢＰＲ２００１株は、平成５年２月２
４日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特
許微生物寄託センターに寄託され（受託番号ＦＥＲＭ
Ｐ−１３４６６）、その後１９９４年２月７日付で特許
手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト
条約に基づく寄託（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４５４
５）に移管されている。

【００１０】ＮＴＧ等の変異剤を用いての化学的変異処
理方法には、例えば、Bio Factors,Vol. l, p.297−302
(1988)及び J. Gen. Microbiol, Vol. 135, p.2917−2
929(1989) 等に記載されているものがある。従って、当
業者であればこれら公知の方法に基づき本発明で用いる
変異株を得ることができる。また、本発明で用いる変異
株は他の変異方法、例えば放射線照射等によっても得る
ことができる。

【００１１】培養に用いる培地の組成物中、炭素源とし
てはシュクロース、グルコース、フラクトース、マンニ
トール、ソルビトール、ガラクトース、マルトース、エ
リスリット、グリセリン、エチレングリコール、エタノ
ール等を単独或いは併用して使用することができる。更
にはこれらのものを含有する澱粉水解物、シトラスモラ
セス、ビートモラセス、ビート搾汁、サトウキビ搾汁、
柑橘類を始めとする果汁等をシュクロースに加えて使用
することもできる。 また、窒素源としては硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のア
ンモニウム塩、硝酸塩、尿素等有機或いは無機の窒素源
を使用することができ、或いはＢａｃｔｏ−Ｐｅｐｔｏ
ｎｅ、Ｂａｃｔｏ−Ｓｏｙｔｏｎｅ、Ｙｅａｓｔ−Ｅｘ
ｔｒａｃｔ、豆濃などの含窒素天然栄養源を使用しても
よい。有機微量栄養素としてアミノ酸、ビタミン、脂肪
酸、核酸、２，７，９−トリカルボキシ−１Ｈピロロ
〔２，３，５〕−キノリン−４，５−ジオン、亜硫酸パ
ルプ廃液、リグニンスルホン酸等を添加してもよい。

【００１２】生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変
異株を使用する場合には、要求される栄養素を補添する
ことが必要である。無機塩類としてはリン酸塩、マグネ
シウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、コバルト
塩、モリブデン酸塩、赤血塩、キレート金属類等が使用
される。更に、イノシトール、フィチン酸、ピロロキノ
リンキノン（ＰＱＱ）（特公平５−１７１８号公報；高
井光男，紙パ技協誌，第４２巻，第３号，第２３７〜２
４４頁）、カルボン酸又はその塩（特開平７−３９３８
６号公報）、インベルターゼ（特開平７−１８４６７７
号公報）及びメチオニン（特開平７−１８４６７５号公
報）等のセルロース生成促進因子を適宜培地中に添加す
ることもできる。例えば、本発明の培養に際しては、例
えば、培養のｐＨは３ないし７に、好ましくは５付近に
制御する。培養温度は１０〜４０℃、好ましくは２５〜
３５℃の範囲で行う。培養装置に供給する酸素濃度は１
〜１００％、望ましくは２１〜８０％であれば良い。こ
れら培地中の各成分の組成割合及び培地に対する菌体の
接種等は培養方法に応じて当業者が適宜選択し得るもの
である。本発明方法では、従来より、微生物を培養する
培養形式として公知の形式、即ち、静置、振盪もしくは
通気攪拌培養等、また、培養操作法として公知の、いわ
ゆる回分発酵法、流加回分発酵法、反復回分発酵法及び
連続発酵法等を用いることができる。尚、攪拌手段とし
ては、例えばインペラー（攪拌羽根）、エアーリフト発
酵槽、発酵ブロスのポンプ駆動循環、及びこれら手段の
組合せ等が使用されている。

【００１３】尚、攪拌培養とは、培養液を攪拌しながら
行なう培養法であり、当該攪拌培養中に受ける攪拌作用
によって、バクテリアセルロースの構造が、例えば、結
晶化指数が低下して非晶部が増すように変化する。攪拌
手段としては、例えばインペラー、エアーリフト発酵
槽、発酵ブロスのポンプ駆動循環、及びこれら手段の組
合せ等を使用することができる。培養操作法としては、
いわゆる回分発酵法、流加回分発酵法、反復回分発酵法
及び連続発酵法等がある。更に、本出願人名義の特開平
８−３３４９４号公報に記載された培養装置と分離装置
の間で菌体を含む培養液を循環させるセルロース性物質
の製造方法であって、該分離装置に於いて、生産物であ
るセルロース性物質を菌体及び培養液から分離すること
を特徴とする前記方法や、同じく、本出願人名義の特開
平８−３３４９５号公報に記載されたセルロース生産菌
を培養してセルロース性物質を製造する方法であって、
培養期間中、培養系からの培養液の引き抜き及び該引き
抜き量とほぼ等容量の新たな培養液の供給を連続的に行
なうことによって、培養中の培養液に於けるセルロース
性物質の濃度を低く維持することを特徴とする前記製造
方法がある。

【００１４】前記攪拌培養を行なうための槽としては、
例えば、ジャーファーメンター及びタンク等の攪拌槽、
並びにバッフル付きフラスコ、坂口フラスコ及びエアー
リフト型の攪拌槽が使用可能であるがこの限りではな
い。本発明でいう攪拌培養においては、攪拌と同時に、
必要に応じて、通気を行なっても良い。ここでいう通気
とは、例えば空気等の酸素を含有するガス、並びに例え
ばアルゴン及び窒素等の酸素を含有しないガスのいずれ
を通気しても良く、これらガスは培養系の条件に合わせ
て当業者により適宜、選択されよう。例えば、嫌気性の
微生物の場合は、不活性ガスを通気をすれば、その気泡
によって培養液を攪拌することができる。好気性の微生
物の場合には、酸素を含有するガスを通気することで微
生物の成育に必要な酸素を供給すると同時に、培養液を
攪拌することができる。

【００１５】攪拌培養により得た本発明バクテリアセル
ロースは遠心分離法又は濾過法等により培養液から分離
した後に、菌体と一緒に回収してもよく、さらに本物質
中に含まれる菌体を含むセルロース性物質以外の不純物
を取り除く処理を施すことが出来る。不純物を取り除く
ためには、水洗、加圧脱水、希酸洗浄、アルカリ洗浄、
次亜塩素酸ソーダ及び過酸化水素などの漂白剤による処
理、リゾチームなどの菌体溶解酵素による処理、ラウリ
ル硫酸ソーダ、デオキシコール酸などの界面活性剤によ
る処理、常温から２００℃の範囲の加熱洗浄などを単独
及び併用して行い、セルロース性物質から不純物をほぼ
完全に除去することができる。

【００１６】尚、ＢＣ蓄積量（ｇ／ｌ）は、培養終了
後、培養液中の固形物を集積し、水洗して培地成分を除
去した後、０．２Ｎ ＮａＯＨ水溶液中で８０℃、２０
分間処理して菌体を除去した。さらに、洗浄液が中性付
近になるまで生成セルロースを水洗した後、８０℃で１
２時間真空乾燥して乾燥重量を測定することで求めた。
又、糖濃度は当業者には公知の方法でHPLCによって測定
した。（消費糖）収率（％）は以下のようにして求め
た。

【００１７】

【数１】消費糖収率（％）の計算 Ｙ_BC＝ＢＣ／（ＲＣ_MF−ＲＣ_BF）＊１００ Ｙ_BC ：対消費糖収率（％） ＢＣ ：ＢＣ蓄積量（ｇ／ｌ） ＲＣ_MF：培地の糖濃度（ｇ／ｌ） ＲＣ_BF：培養後の培地の糖濃度（ｇ／ｌ）

【００１８】

【発明の実施の形態】本発明を、以下の実施例を参照し
ながら詳しく説明する。かかる実施例が本発明の範囲を
何等制限するものでないことは、当業者には周知のこと
である。

【００１９】

【実施例】実施例１：Ｕ−３５株の取得 使用菌株 ７５７−３−５−１１株Ｕ−３５株の取得方法 （１）７５７−３−５−１１株の変異処理 菌体をＣＳＬ−Ｓｕｃ培地（１％セルラーゼ含有）で２
８℃、３時間培養し、この培養液を集菌後１０ｍＭ燐酸
緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄した。得られた菌体を４０
μg/mlＮＴＧ（１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．０））中
で３０℃、３０分間処理した。変異処理した菌体を集菌
し、前記のように洗浄しＣＳＬ−Ｓｕｃ培地（１％セル
ラーゼ含有）で２８℃、一夜培養し変異を固定した。 （２）Ｕ−３５株の取得 変異処理した７５７−３−５−１１株を以下のＡＡＳ培
地プレートで塗抹培養（２８℃、７日間）し、得られた
コロニーの各菌について、以下の通り、ＵＤＰ、ＵＴＰ
及びＵＤＰ−Ｇの菌体内濃度を測定した。

【００２０】

【表１】ＡＡＳ培地組成 シュクロース ５％、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．３％、ＭｇＳ
Ｏ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．２４％、硫安 ０．１％、総合ア
ミノ酸 ０．５％、５０％フィチン酸 ０．０２％、ｐ
Ｈ５．０、寒天２％

【００２１】ＵＤＰ、ＵＴＰ及びＵＤＰ−Ｇの菌体内濃
度の測定 ＣＳＬ−Ｓｕｃ培地（１％セルラーゼ含有）で２８℃、
２４時間、１５０ｒｐｍで振盪培養して得られた菌体を
集菌し、これを５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗
浄後に、同緩衝液に再懸濁した。得られた懸濁液をフレ
ンチプレスで破砕し、遠心分離にかけ、遠心上清を菌体
破砕液として調製した。こうして得られた遠心上清に等
量のアセトニトリルを添加し、再び遠心分離にかけて除
蛋白を行い、それを測定用試料とした。ＵＤＰ、ＵＴＰ
及びＵＤＰ−Ｇの実際の測定はHPLCを用いて当業者には
公知の方法で実施した。試験した菌体のなかで、ＵＤ
Ｐ、ＵＴＰ及びＵＤＰ−Ｇの菌体内濃度が従来の菌に比
べて有意に高かった株の中からＵ−３５株を選択し、そ
の結果を表２に示した。尚、表２中の各濃度は菌体破砕
液中総蛋白質濃度当たりで示した。

【００２２】

【表２】 ─────────────────────────────────── 菌株 ＵＤＰ（μmol/g) ＵＴＰ（μmol/g) ＵＤＰ−Ｇ（ｎmol/g) ─────────────────────────────────── 757-3-5-11株 ６．７４ ０．９９ ８．３ Ｕ−３５株 １１．３３ ２．１５ ３０．３ ───────────────────────────────────

【００２３】実施例２：ＵＴＰによるＣＰＳのフィード
バック阻害 ＣＳＬ−Ｓｕｃ培地（１％セルラーゼ含有）で２８℃、
２４時間、１５０ｒｐｍで振盪培養して得られた菌体を
集菌し、これを５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗
浄後に、同緩衝液に再懸濁した。得られた懸濁液を超音
波処理し、遠心分離し、遠心上清を酵素液として調製し
た。ＣＰＳの活性測定は、T. J. Paulus等の方法(J. Ba
cteriol Vol. 187, p82-91(1979))に従って実施した。

【００２４】

【表３】 ─────────────────────────────── ＵＴＰ（ｍＭ） 757-3-5-11株 Ｕ−３５株 ─────────────────────────────── ０ ０．００７１ ０．００９９ １ ０．００７６ ０．０１０７ ３ ０．００５２ ０．０１０７ ５ ０．００４２ ０．００８３ ────────────────────────────── ＣＰＳ酵素活性の単位： U/mg

【００２５】

【表４】 培地組成 ＣＳＬ−Ｓｕｃ培地 シュクロース ４．０ （％） ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．１ ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．０２５ （ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ ０．３３ ビタミン混合液 １．０ 塩類混合液 １．０ ＣＳＬ（コーンステープリカー） ４．０ ｐＨ ５．０

【００２６】

【表５】ビタミン混合液 化合物 mg／Ｌ イノシトール ２００ ナイアシン ４０ ピリドキシンＨＣｌ ４０ チアミンＨＣｌ ４０ パントテン酸カルシウム ２０ リボフラビン ２０ ｐ−アミノ安息香酸 ２０ 葉 酸 ０．２ ビオチン ０．２

【００２７】

【表６】塩類混合液 ＦｅＳＯ₂ ・７Ｈ₂ Ｏ ３６０mg／Ｌ ＣａＣｌ₂ ・２Ｈ₂ Ｏ １４７０mg／Ｌ Ｎａ₂ ＭｏＯ₂ ・２Ｈ₂ Ｏ ２４２mg／Ｌ ＺｎＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ １３９mg／Ｌ ＭｎＳＯ₄ ・５Ｈ₂ Ｏ ５mg／Ｌ ＣｕＳＯ₄ ・５Ｈ₂ Ｏ ２００mg／Ｌ

【００２８】実施例３：フラスコ培養方法 前培養：菌保存液０．５mlを５０mlＣＳＬ−Ｓｕｃ培地
（２５０ml容量ルーフラスコ）に植菌し、２８℃、３日
間静置培養した。 本培養：前培養の菌液７．５mlを６８mlＣＳＬ−Ｓｕｃ
培地（３００ml容量三角フラスコ）に植菌し、２８℃、
４日間、１５０ｒｐｍで振盪培養した。得られた結果を
表７に示す。

【００２９】

【表７】 ───────────────────── 菌株 ＢＣ（g/l) 収率(%) ───────────────────── 757-3-5-11株 ６．５ １６．３ Ｕ−３５株 ７．９ ２１．３ ─────────────────────

【００３０】

【発明の効果】以上の結果から、本発明の新規セルロー
ス生産菌は、バクテリアセルロースの生産性が高いこと
が判った。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｒ 1:02）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＵＤＰ、ＵＴＰ又はＵＤＰ−Ｇの菌体内
   濃度が高いセルロース生産菌。
2. 【請求項２】 カルバモイルリン酸合成酵素の活性が増
   加したセルロース生産菌。
3. 【請求項３】 ＵＴＰによるカルバモイルリン酸合成酵
   素のフィードバック阻害が抑制されているセルロース生
   産菌。
4. 【請求項４】Ｕ−３５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６５８４）
   である請求項１、２又は３のいずれか一項に記載された
   セルロース生産菌。
5. 【請求項５】 請求項１ないし４のいずれか一項に記載
   のセルロース生産菌を培養し、培地中に蓄積したバクテ
   リアセルロースを回収することから成る、バクテリアセ
   ルロースの製造方法。