JPH11221083A - 酸化安定性マレイン酸イソメラーゼをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 酸化安定性マレイン酸イソメラーゼをコード
するＤＮＡを提供する。 【解決手段】 マレイン酸イソメラーゼをコードするＤ
ＮＡであって、前記ＤＮＡを発現させたマレイン酸イソ
メラーゼ遺伝子組換え大腸菌の菌体破砕無細胞抽出液を
３０℃、１時間、３０ｍＭ過酸化水素の条件で酸化処理
した際のマレイン酸イソメラーゼの活性低下率が４０％
未満であることを特徴とするＤＮＡ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、酸化安定性マレイ
ン酸イソメラーゼをコードする遺伝子ＤＮＡ及びその利
用に関し、より詳細には、特定の部位変異型アミノ酸配
列を有し、マレイン酸を異性化してフマル酸を生成する
活性を有する酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを連結
した組換えベクター、該ＤＮＡを保持する形質転換体及
び該形質転換体を用いた前記酵素の製造法並びにフマル
酸の製造法に関する。

【０００２】マレイン酸の異性化物であるフマル酸は、
アスパラギン酸、リンゴ酸等の各種ファインケミカルズ
の原料として利用できる有用な有機酸である。

【０００３】

【従来の技術】マレイン酸を異性化してフマル酸を生成
する方法としては、主に化学的方法が提案されているが
（米国特許第2,816,923号、同第2,955,136号、同第2,33
2,992号）、この方法は高温反応を必要とするためにマ
レイン酸あるいはフマル酸の劣化が起こり、副生物を生
成するため収率が低下するなどの問題点を有している。

【０００４】一方、酵素によるマレイン酸の異性化に関
しては、マレイン酸イソメラーゼ（maleate cis-trans
isomerase）がマレイン酸をフマル酸へと異性化するこ
とが知られている。マレイン酸イソメラーゼを産生する
微生物としては、例えばシュードモナス エスピー．
（Pseudomonas sp.）[K. Otsuka, Agric.Biol.Chem., v
ol.25, No.9, p.726 (1961)]、アルカリゲネス・フェカ
リス（Alcaligenes faecalis）IB-14[Takamura, Agric.
Biol.Chem., Vol.33, p.718(1969)]、シュードモナス・
フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ATCC237
28[Scher, J.Biol.Chem., Vol.244, p.1878(1969)]、セ
ラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens)IFO373
6[T. Kimura, Agri. Biol. Chem., Vol.50, No.1, p.82
(1986)、アルスロバクター・グロビフォルミス（Arthro
bacter globiformis）IAM12102[Y.Kato, J. Ferment. E
ngineer., Vol.80, p.610(1995)]等が知られている。ま
た、これらにより産生されるマレイン酸イソメラーゼの
分子量、サブユニット構造、全アミノ酸配列、ＤＮＡ塩
基配列なども、既に明かにされている[国際公開第WO96/
19571号、特願平8-194961等]。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながらこれまで
に知られているマレイン酸イソメラーゼは、その安定性
が十分とはいえず、酵素的不安定性が指摘されていた
[Y.Kato, J. Ferment. Engineer., Vol.80, p.610(199
5)]。マレイン酸イソメラーゼの酵素的不安定性の要因
の一つとしては、反応液中の酸素の影響が考えられてい
る。そこで酸化不安定性を回避する方法として、マレイ
ン酸イソメラーゼ活性を有する微生物またはマレイン酸
イソメラーゼ活性を有する微生物の調製物とマレイン酸
とを水溶液中で混合し、異性化反応によりマレイン酸か
らフマル酸を製造するに際し、反応液中の溶存酸素濃度
を４ｐｐｍ以下に維持して反応させることを特徴とする
フマル酸の製造法が検討されている[特開平8-332092]。
しかしながら、マレイン酸イソメラーゼの酸化安定性を
抜本的に改変する方法は、これまで、全く知られていな
い。

【０００６】本発明は、酸化安定性の改変されたマレイ
ン酸イソメラーゼ及び該酵素を用いたフマル酸の製造方
法を提供することを主な課題とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】一般的にタンパク質のメ
チオニン、ヒスチジン、シスチン、チロシン、トリプト
ファン残基は、活性酸素等のフリーラジカルにより傷害
を受けやすいアミノ酸残基である（K. A. J. Davis, J.
Biol. Chem., Vol.262, p.9895, 1987等）。この酸化
修飾により、酵素ならば不活性化が引き起こされると同
時に、酵素タンパク質のプロテアーゼによる分解を受け
やすくなる。

【０００８】本発明者らは、まず、マレイン酸イソメラ
ーゼの酸化処理による酵素の不活性化において酸化処理
を受けるアミノ酸残基を解析した結果、メチオニン、ヒ
スチジン、シスチン、チロシン残基が酸化されているこ
とが明らかになった。

【０００９】そこで、本発明者らは、マレイン酸イソメ
ラーゼをコードする遺伝子ＤＮＡ上の特定のメチオニ
ン、ヒスチジン、シスチン、チロシン残基部位にアミノ
酸変異を導入することにより、酸化安定性の改変された
マレイン酸イソメラーゼをコードする遺伝子ＤＮＡの取
得を試みた。アミノ酸残基としては、これまでに本発明
者らによって明らかにされているマレイン酸イソメラー
ゼ遺伝子の塩基配列にもとづくアミノ酸配列相同性比較
により保存性の高いアミノ酸残基を抽出した。例えば、
メチオニン残基ではセラチア属細菌由来のマレイン酸イ
ソメラーゼのアミノ酸配列の１８番目、４６番目、５７
番目、８５番目、１３８番目、２０１番目のメチオニン
残基である。

【００１０】以上のような知見をもとに遺伝子ＤＮＡ上
の特定のメチオニン、ヒスチジン、シスチン、チロシン
残基部位にアミノ酸変異を導入することにより、酸化安
定性の改変されたマレイン酸イソメラーゼをコードする
遺伝子ＤＮＡの取得を目的として鋭意研究を重ねた結
果、同遺伝子のメチオニン残基を他のアミノ酸に置換す
ることにより、特に同遺伝子の２０１位のメチオニン残
基を他のアミノ酸に置換することにより、同酵素の酸化
安定性を向上することに成功し、本発明を完成するに至
った。

【００１１】かくして本発明によれば、マレイン酸イソ
メラーゼをコードするＤＮＡであって、前記ＤＮＡを発
現させたマレイン酸イソメラーゼ遺伝子組換え大腸菌の
菌体破砕無細胞抽出液を３０℃、１時間、３０ｍＭ過酸
化水素の条件で酸化処理した際のマレイン酸イソメラー
ゼの活性低下率が４０％未満であることを特徴とするＤ
ＮＡ（以下、本発明ＤＮＡという）が提供される。

【００１２】本発明ＤＮＡにおいては、好ましくは、マ
レイン酸イソメラーゼのメチオニン残基が酸化処理に対
してより安定な他のアミノ酸残基に置換される。さらに
好ましくは、配列番号２に示すアミノ酸配列の２０１位
のメチオニン残基に相当するメチオニン残基が酸化処理
に対してより安定な他のアミノ酸残基に置換される。好
ましい他のアミノ酸残基はシステイン残基である。ま
た、好ましくは、マレイン酸イソメラーゼがセラチア属
細菌由来である。

【００１３】さらに、本発明によれば、本発明ＤＮＡを
ベクターに連結してなる組換えベクター、本発明ＤＮＡ
が導入されることにより形質転換された形質転換体、こ
の形質転換体を培地で培養し、その培養物からマレイン
酸イソメラーゼを採取することを特徴とするマレイン酸
イソメラーゼの製造法、及び、前記形質転換体またはこ
の形質転換体の培養物から採取したマレイン酸イソメラ
ーゼの粗精製画分もしくは精製酵素を、マレイン酸を含
有する水性溶液に加え、マレイン酸を異性化してフマル
酸を生成せしめることを特徴とするフマル酸の製造法が
提供される。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。本発明の「マレイン酸イソメラーゼ（maleate ci
s-trans-isomerase; EC5.2.1.1）」とは、マレイン酸
（シス型）を異性化してフマル酸（トランス型）を生成
する反応を触媒する酵素を意味する。また、本明細書で
は、マレイン酸イソメラーゼをコードするＤＮＡを、便
宜上「マレイン酸イソメラーゼ遺伝子」ということがあ
る。

【００１５】マレイン酸イソメラーゼの酸化安定性の評
価方法については、酸素の溶解した溶液中にマレイン酸
イソメラーゼ溶液を保存しその安定性を調べる方法、あ
るいは、酸化剤を用いて加速的に酵素を酸化失活させ、
その効果を比較する方法等が知られているが、後者の方
がより迅速に酸化安定性を評価することができ、簡便で
あると考えられる。酸化剤としては、過酸化水素の他、
N-クロロスクシイミド、N-ブロモスクシイミド、クロラ
ミンＴ、過ヨウ素酸等が挙げられるが、過酸化水素がよ
り溶解した酸素による酵素酸化の機構に近いと考えられ
る。

【００１６】そのため、本発明では、３０℃、１時間、
３０ｍＭ過酸化水素の条件で酸化処理した際のマレイン
酸イソメラーゼの活性低下率により評価することとし
た。即ち、本発明ＤＮＡは、本発明ＤＮＡを発現させた
マレイン酸イソメラーゼ遺伝子組換え大腸菌の菌体破砕
無細胞抽出液を３０℃、１時間、３０ｍＭ過酸化水素の
条件で酸化処理した際のマレイン酸イソメラーゼの活性
低下率が４０％未満であり、更に好ましくは、３５％未
満であることを特徴とする。

【００１７】ここで、４０％未満とは、未処理（３０
℃、１時間、０ｍＭ過酸化水素）の場合の活性を１００
％とした場合に酸化処理後にも６０％を超える活性を維
持することを示す。

【００１８】マレイン酸イソメラーゼ遺伝子を発現させ
た組換え大腸菌は、マレイン酸イソメラーゼ遺伝子を大
腸菌用高発現ベクター（例えば、ｐＫＫ２２３−３（フ
ァルマシア社より市販））に結合させ、得られたベクタ
ーにより大腸菌（例えば、エシェリヒア・コリＪＭ１０
９（宝酒造製））を、塩化カルシウム法などの常法によ
り形質転換することによって得られる。酸化処理は、マ
レイン酸イソメラーゼ組換え大腸菌を培養して得られた
菌体を、超音波破砕装置などにより破砕し、菌体破砕物
を遠心分離することによって菌体破砕無細胞抽出液を上
清として得、これに、過酸化水素を濃度が３０ｍＭとな
るように加え、３０℃で１時間保温することによって行
われる。マレイン酸イソメラーゼ活性測定は、公知の方
法で行うことができる。

【００１９】酸化安定性のマレイン酸イソメラーゼをコ
ードするＤＮＡ（本明細書では、「酸化安定性マレイン
酸イソメラーゼ遺伝子ともいう」）は、公知のマレイン
酸イソメラーゼ遺伝子を改変することによって得ること
ができる。

【００２０】このような改変として好ましいものとして
は、コードされるアミノ酸配列中のメチオニン残基の１
以上を酸化処理に対してより安定な他のアミノ酸残基に
置換するものが挙げられる。より好ましくは、配列番号
２に示すアミノ酸配列の２０１位のメチオニン残基に相
当するメチオニン残基を酸化処理に対してより安定な他
のアミノ酸残基に置換する。好ましい他のアミノ酸はシ
ステイン残基である。

【００２１】マレイン酸イソメラーゼ遺伝子のコードす
るアミノ酸配列には、自然突然変異及び人工突然変異で
生じたものも含め、属間、種間、個体間等で相違があり
得るが、配列番号２に示すアミノ酸配列の２０１位のメ
チオニン残基に相当するメチオニン残基を特定すること
は当業者であれば容易である。従って、配列番号２に示
すアミノ酸配列の２０１位のメチオニン残基に相当する
メチオニン残基が酸化処理に対してより安定な他のアミ
ノ酸残基に置換されたマレイン酸イソメラーゼとして、
具体的には、以下の(a)または(b)のタンパク質が挙げら
れる。 (a) ２０１位のアミノ酸がシステイン残基に置換された
配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質 (b) (a)のタンパク質のアミノ酸配列において１もしく
は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミ
ノ酸配列からなり、かつ(a)のタンパク質と同等の酸化
安定性のマレイン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク
質

【００２２】「酸化処理に対してより安定な他のアミノ
酸」とは、そのアミノ酸でメチオニン残基を置換したマ
レイン酸イソメラーゼの酸化安定性が、上記酸化処理に
よる活性低下率に基いて評価したとき、置換前のマレイ
ン酸イソメラーゼの酸化安定性よりも良いアミノ酸を意
味する。

【００２３】マレイン酸イソメラーゼ遺伝子は、既に、
いくつかの微生物由来の酵素の塩基配列が完全に決定さ
れているので[国際公開第WO96/19571号等]、同配列に基
づいて合成することも可能であるが、通常は微生物から
ＰＣＲ等により容易にクローニングすることができる。
その供給源となる微生物としては、マレイン酸イソメラ
ーゼ活性を有する微生物であれば特に制限はないが、具
体的にはアルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes fa
ecalis）IFO13111、同IFO12669、同IAM1473、同IAM1258
8、アルカリゲネス・デニトリフィカンス（Alcaligenes
denitrificans）IAM12370、アルカリゲネス・キシロソ
キシダンス（Alcaligenes xylosoxidans）IAM12686アル
カリゲネス・ユウトロフス（Alcaligenes eutrophus）I
AM12305、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudom
onas fluolescens）ATCC23728、シュードモナス・アル
カリゲネス（Pseudomonas alcaligenes）strain XD-1
[J.Ferment.Bioengineer. Vol.84, p.165-168 (199
7)]、キサントモナス・マルトモナス（Xanthomonas mar
utomonas）ATCC13270、アルスロバクター・グロビフォ
ルミス（Arthrobacter globiformis）IAM12102、アルス
ロバクター・パセンス（Arthrobacter pascens）IAM123
43、アルスロバクター・スルフレウス（Arthrobacter s
ulfureus）IAM1488、アルスロバクター・ウレアファシ
エンス（Arthrobacter ureafaciens）IAM1637、セラチ
ア・マルセッセンス（Serratia marcescens)IFO3736
株、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus ste
arothermophilus）ＭＩ−１０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１
４８０１）、同 ＭＩ−１０２（ＦＥＲＭＢＰ−１４８
０２）、同 ＭＩ−１０５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４８０
５）、同ＭＩ−１１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３３９）、
バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）ＭＩ−１０３
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４８０３）、バチルス・サーキュ
ランス（Bacillus circulans）ＭＩ−１１３（ＦＥＲＭ
Ｐ−１５６４５）、デレヤ・ハロフィラ（Delaya hal
ophila）ＭＩ−１１１（ＦＥＲＭ Ｐ−１６０１８）等
が挙げられる。これらの内では、アルカリゲネス・フェ
カリス（Alcaligensfaecalis）IFO 13111株、セラチア
・マルセッセンス（Serratia marcescens)IFO3736株、
バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearot
hermophilus）ＭＩ−１０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４８
０１）、同 ＭＩ−１０２（ＦＥＲＭＢＰ−１４８０
２）、同 ＭＩ−１０５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４８０
５）、同ＭＩ−１１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３３９）、
バチルス・ブレビス（Bacillus brevis） ＭＩ−１０
３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４８０３）などが好適に用いら
れる。

【００２４】これらの菌株は、財団法人発酵研究所（Ｉ
ＦＯ）、東京大学細胞生物学研究所細胞・機能高分子総
合センターＩＡＭカルチャーコレクション、アメリカン
・タイプ・カルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入
手可能である。さらに、上記のバチルス属菌株は、後記
実施例１に示すようにして本発明者らにより単離された
株であり、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究
所に上記の受託番号で寄託されている。

【００２５】以下に、これらの供給源微生物の中から、
例示の一つとして、セラチア・マルセッセンス（Serrat
ia marcescens)IFO3736株を選び、同株からマレイン酸
イソメラーゼ遺伝子を取得する方法、及び、同遺伝子の
変異株の作成方法の一例を説明する。

【００２６】セラチア・マルセッセンス IFO3736株由来
のマレイン酸イソメラーゼ遺伝子は、供給源微生物の染
色体上に存在し、その塩基配列は既に明らかにされてい
るので[国際公開第WO96/19571号]、その配列をもとに作
成したプライマーＤＮＡを用いて容易に増幅・単離する
ことができる。

【００２７】マレイン酸イソメラーゼ遺伝子は、天然の
細菌の染色体ＤＮＡから分離されたもののみならず、通
常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイ
オシステムズ(Applied Biosystems)社製３９４ＤＮＡ／
ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成されたものであって
もよい。

【００２８】変異の導入法には、ＮＴＧ処理等により非
特異的に変異を導入するランダム変異法(random mutage
nesis)、あるいは、特定のアミノ酸を特定のアミノ酸に
置換する部位特異的変異法がある。結果的に特定の位置
に変異が入ればどちらの方法でも良いが、後者の方がよ
り簡便に目的の変異体を得ることができると考えられ
る。

【００２９】部位特異的変異の手法には、様々な手法
（R. Higuchi et al. Recombinant PCR in "PCR Protoc
ols: A Guide to Methods and Applications" p.177, A
cademic Press, 1990： Sambrook, Fritsch and Maniat
is, "Molecular Cloning" Chapter 15, Site-directed
Mutagenesis of Cloned DNA, Cold Spring Harbor Labo
ratory Press, 1989等）があるが、部位特異的に変異を
導入する手法であれば何れの手法を用いてもよい。

【００３０】具体的には、変異を導入したいアミノ酸残
基部位に変異を導入した２０〜４０塩基程度のオリゴヌ
クレオチドＡを合成し（例えば、セラチア属細菌イソメ
ラーゼの２０１番目のアミノ酸残基をシステインに変換
するために、ＡＴＧのコドンをＴＧＣに変えた配列表の
配列番号５のようなオリゴヌクレオチドを合成す
る。）、酵素のＣ末端部位のアミノ酸配列をもとに作製
したオリゴヌクレオチドＢ（例えば配列表の配列番号
４）と共に、変異を入れたい遺伝子（例えば、セラチア
属細菌の染色体ＤＮＡ）を鋳型としてＰＣＲプライマー
として用い、変異の導入した遺伝子部分断片１を増幅す
る。さらに、オリゴヌクレオチドＡの相補的配列を有す
るオリゴヌクレオチドＣ（例えば配列表の配列番号６）
を合成し、酵素のＮ末端部位のアミノ酸配列をもとに作
製したオリゴヌクレオチドＤ（例えば配列表の配列番号
３）と共にＰＣＲプライマーとして用い、変異の導入し
た遺伝子部分断片２を増幅する。次に、遺伝子部分断片
１および遺伝子部分断片２を鋳型とし、オリゴヌクレオ
チドＢおよびＤをＰＣＲプライマーとして用いることに
より、変異を導入したマレイン酸イソメラーゼ遺伝子を
取得することができる。

【００３１】本発明の実施例においては、セラチア・マ
ルセッセンス由来のマレインイソメラーゼの２０１位の
メチオニン残基に変異を導入したが、同残基は国際公開
第WO96/19571号において明らかなとおり、アルカリゲネ
ス・フェカリス IFO13111、バチルス・ステアロサーモ
フィラス ＭＩ−１０１、同 ＭＩ−１０２、同 ＭＩ
−１０５、同 ＭＩ−１１０、バチルス・ブレビス Ｍ
Ｉ−１０３においても同等の位置に保存されており、そ
のアミノ酸に同様の変異を導入することにより酸化安定
性を向上させることが可能であることは、容易に推察さ
れる。

【００３２】本発明の酸化安定性マレイン酸イソメラー
ゼ遺伝子はまたはこれを含むＤＮＡ断片は、これらを適
当なベクターに連結して組換えベクターを調製し、この
組換えベクターで適当な宿主微生物を形質転換すること
により、発現させることができる。従って、本発明は、
酸化安定性マレイン酸イソメラーゼ遺伝子をベクターに
連結してなる組換えベクター及び同遺伝子が導入される
ことにより形質転換された形質転換体も提供する。

【００３３】組換えベクターを調製する際には、通常、
マレイン酸イソメラーゼ遺伝子を宿主微生物に適したプ
ロモーターとともに、このプロモーターの下流に該遺伝
子のコード領域の５’末端側が連結されるようにして、
ベクターに挿入する。あるいはプロモーターを含む発現
ベクターを用い、これにマレイン酸イソメラーゼ遺伝子
を挿入してもよい。

【００３４】このような発現ベクターを用いた発現方法
の他に、プロモーターを連結したマレイン酸イソメラー
ゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主微生物の染色体中に
直接導入する相同組換え技術［A.A.Vertes, et al., Bi
osci.Biotechnol.Biochem.,Vol.57, p.2036 (1993)、
等］、あるいはトランスポゾンや挿入配列等を用いて導
入する技術［A.A.Vertes et al., Molecular Microbio
l., Vol.11, p.739 (1994)、等］によっても発現させる
ことができる。

【００３５】発現ベクターとしては、宿主微生物内で複
製増殖可能であれば特に制限されるものではないが、プ
ラスミドベクター、ファージベクターのいずれかを用い
ることができる。具体的なプラスミドベクターとして
は、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９８、ｐＵ
Ｃ１１８、ｐＳＴＶ２８、ｐＴＷＶ２２８、ｐＨＹ３０
０ＰＬＫ（以上のプラスミドベクターは、例えば宝酒造
（株）から購入できる）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＴｒｃ
９９Ａ（以上は、例えばファルマシア社から購入でき
る）、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ、ｐＣＲＹ３ＫＸ
（米国特許第５，１８５，２６２号）、あるいはこれら
の誘導体等を挙げることができる。

【００３６】また、ファージベクターとしては、（λＦ
ｉｘＩＩベクタ−（Stratagene社から購入できる）等を
挙げることができる。本発明のマレイン酸イソメラーゼ
遺伝子を発現させるためのプロモーターは、宿主微生物
が保有するプロモーターを一般に用いることができる
が、それに限られるものではなく、マレイン酸イソメラ
ーゼ遺伝子の転写を開始させるための原核生物由来の塩
基配列であればいかなるプロモーターであっても良い。
具体的には、ラクトースオペロンのプロモーター、トリ
プトファンオペロンのプロモーター、λファージ由来の
ＰLプロモーター、トリプトファンラクトース雑種（ｔ
ａｃ） プロモーター［H.A.Bose et al., Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A., Vol.80, p.21 (1983)］等が挙げられる。ま
た、得られたマレイン酸イソメラーゼ遺伝子固有のプロ
モーターが機能可能な微生物を宿主として用いる場合に
は、該プロモーターをそのまま使用してもよい。更に
は、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばアプライド
・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製３９４Ｄ
ＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成されたもので
あってもよい。

【００３７】これらのプロモーターのうち、誘導性のあ
るプロモーターでは、その誘導因子（物質あるいは温度
等の生育環境、等）により発現効率を向上させることも
できる。たとえば、上記ラクトースオペロンのプロモー
ターの場合には、ラクトースやイソプロピル-β-D-チオ
ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより遺伝子
発現を誘導することができる。

【００３８】酸化安定性マレイン酸イソメラーゼ遺伝子
を導入する宿主としては、特に限定されるものではない
が、エシェリヒア（Escherichia）属細菌、バチルス（B
acillus）属細菌、セラチア（Serratia）属細菌、シュ
ードモナス（Pseudomonas）属細菌、コリネバクテリウ
ム（Corynebacterium）属細菌、ブレビバクテリウム（B
revibacterium）属細菌、ロドコッカス（Rhodococcus）
属細菌、ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌、ス
トレプトマイセス（Streptomyces）属細菌、サーマス
（Thermus）属細菌、ストレプトコッカス（Streptococc
us）属細菌等を好適に用いることができる。

【００３９】具体的には、エシェリヒア・コリ（Escher
ichia coli）、バチルス・サチリス（Bacillus subtili
s）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチル
ス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermop
hilus）、セラチア・マルセッセンス（Seratia marcesc
ens）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putid
a）、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aer
uginosa）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Coryn
ebacterium glutamicum）、ブレビバクテリウム・フラ
バム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermen
tum）、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus e
rythropolis）、サーマス・サーモフィラス（Thermus t
hermophilus）、ストレプトコッカス・ラクティス（Str
eptococcus lactis）、ラクトバチルス・カゼイ（Lacto
bacillus casei）、ストレプトマイセス・リビダンス
（Streptomyces lividans）等を用いることができる。

【００４０】上記宿主微生物への遺伝子の導入法として
はコンピテントセル法［Journal ofMolecular Biolog
y，Vol.53, p.159 (1970)］、パルス波通電法[J.Indus
t.Microbiol., Vol.5, p.159 (1990)]等による形質転換
法、ファージを用いた形質導入法［E.Ohtsubo, Genetic
s, Vol.64, p.189 (1970)］、接合伝達法［J.G.C.Otto
w, Ann.Rev.Microbiol., Vol.29, p.80 (1975) ］、細
胞融合法［M.H.Gabor, J.Bacteriol., Vol.137, p.1346
(1979)］等を用いることができる。

【００４１】本発明のマレイン酸イソメラーゼの製造方
法は、上記のようにして得られる形質転換体を培養し、
その培養物からマレイン酸イソメラーゼを採取すること
を特徴とする。また、本発明のフマル酸の製造方法は、
マレイン酸のフマル酸への酵素的異性化反応に基づくも
のであり、上記のようにして得られる形質転換体または
この形質転換体の培養物から採取したマレイン酸イソメ
ラーゼの粗精製画分もしくは精製酵素をマレイン酸を含
有する水性溶液に加えることにより、マレイン酸を異性
化してフマル酸を生成せしめることを特徴とする。ここ
で培養物とは、形質転換体の菌体又は／及び培養後の培
地（培養に液体培地を用いた場合にはその培養上清）を
いう。

【００４２】本発明のフマル酸の製造法において水性溶
液に加えられるものは、マレイン酸イソメラーゼ活性を
有する物またはマレイン酸活性を有する物を生成する物
であればよく、例えば、該形質転換体を培養した培養液
から分離した菌体はもちろんのこと、培養液も用いるこ
とができる。また、形質転換体より得られる、菌体の破
砕物もしくは抽出物等や部分精製標品などの粗酵素標品
である粗精製画分を用いてもよく、さらに精製した酵素
標品である精製酵素を使用してもよい。さらに、上記形
質転換体、その破砕物もしくは抽出物、または精製酵素
などは担体に固定化したものであってもよい。なお、菌
体からの破砕物または抽出物の調製や酵素の採取ないし
精製は公知の方法に従って行うことができる。

【００４３】上記形質転換体の培養は、炭素源、窒素
源、無機塩、各種ビタミン等を含む通常の栄養培地で行
うことができ、炭素源としては、例えばブドウ糖、ショ
糖、果糖、麦芽糖等の糖類、エタノール、メタノール等
のアルコール類、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、マレ
イン酸、フマル酸等の有機酸類、廃糖蜜等が用いられ
る。窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等が
それぞれ単独もしくは混合して用いられる。また、無機
塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二水
素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他
にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープ
リカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄
養素を培地に添加することができる。

【００４４】培養は、通常、通気攪拌、振とう等の好気
条件下で行う。培養温度は、宿主微生物の生育し得る温
度であれば特に制限はなく、また、培養途中のｐＨにつ
いても宿主微生物が生育し得るｐＨであれば特に制限は
ない。培養中のｐＨ調整は、酸またはアルカリを添加し
て行うことができる。

【００４５】かくして得られる培養物から遠心分離等に
より菌体を集めることにより、マレイン酸イソメラーゼ
遺伝子の発現産物、すなわちマレイン酸イソメラーゼを
含有する菌体を取得することができる。

【００４６】形質転換体を担体に固定化する場合には、
培養物から回収されたまま、あるいは適当な緩衝液、例
えば０．０２〜０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐＨ６〜
１０）等で洗浄された菌体を使用することができる。ま
た、培養物から回収された菌体を、超音波、圧搾等の手
段で破砕して得られる破砕物、該破砕物を水等で抽出し
て得られるマレイン酸イソメラーゼを含有する抽出物、
該抽出物を更に硫安塩析、カラムクロマトグラフィー等
の処理を行って得られるマレイン酸イソメラーゼの部分
精製成分等を担体に固定化したものも、本発明のフマル
酸の製造に使用することができる。

【００４７】これら菌体、菌体破砕物、抽出物または精
製物の固定化は、それ自体既知の通常用いられている方
法に従い、アクリルアミドモノマー、アルギン酸、また
はカラギーナン等の適当な担体に菌体等を固定化させる
方法により行うことができる。

【００４８】反応に用いる水性溶液は、マレイン酸を含
有する水溶液または適当な緩衝液、例えば０．０２〜
０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐＨ６〜１０）とするこ
とができる。この水性溶液には、更に菌体の細胞膜の物
質透過性を高める目的で、トルエン、キシレン、非イオ
ン性界面活性剤等を０．０５〜２％（ｗ／ｖ）添加する
こともできる。

【００４９】水性溶液中の反応原料となるマレイン酸濃
度は、０．１〜２Ｍ程度が適当である。マレイン酸の形
態は、酸あるいは塩の形態のみならず、その無水物を用
いることもできる。無水マレイン酸は水溶液とすること
により容易にマレイン酸に変換する。マレイン酸の塩と
しては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等を挙げるこ
とができる。

【００５０】上記の水性溶液における酵素反応温度およ
びｐＨは特に限定されないが、通常１０〜６０℃、好ま
しくは２０〜５０℃が適当であり、反応液中のｐＨは５
〜１０、好ましくは６〜９付近とすることができる。ま
た、ｐＨの調整は、酸またはアルカリを添加して行うこ
とができる。

【００５１】かくして得られるフマル酸を含有する水性
溶液は、そのままリンゴ酸、アスパラギン酸等の製造原
料として用いることができる。また、フマル酸を含有す
る水性溶液からのフマル酸の回収は公知の方法に従って
行うことができる。

【００５２】

【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例により更に具体的に説明する。しかしながら、実施例
は本発明の具体的な認識を得る一助とみなすべきのもの
であり、本発明の範囲を何等限定するものではない。

【００５３】

【実施例１】セラチア・マルセッセンスＩＦＯ３７３６
由来のマレイン酸イソメラーゼの部位特異的変異体をコ
ードするＤＮＡの作製 （Ａ） セラチア・マルセッセンスＩＦＯ３７３６株の
染色体ＤＮＡの調製 セラチア・マルセッセンスＩＦＯ３７３６株を、ＬＢ培
地［組成：トリプトン１０ｇ、酵母エキス ５ｇ、Ｎａ
Ｃｌ １０ｇ、蒸留水 １０００ｍｌ（ＮａＯＨで、ｐ
Ｈ７に調整）］を用いて３０℃で対数増殖期後期まで振
とう培養し、菌体を集めた。

【００５４】得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にな
るよう、リゾチームを含む１０ｍＭＮａＣｌ−２０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ８.０）− １ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎ
ａ溶液１５ｍｌに懸濁した。次にプロテナーゼＫ（宝酒
造製）を最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加
し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）を最終濃度が０.５％になるように添
加し、５０℃で６時間保温して溶菌させた。この溶菌液
に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し、室
温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離
（５,０００×ｇ， ２０分間，１０〜１２℃）し、上清
画分を分取した。この上清に酢酸ナトリウムを０.３Ｍ
となるよう添加した後、２倍量のエタノールをゆっくり
と加えた。水層とエタノール層の間に存在するＤＮＡを
ガラス棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄した後、
風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐ
Ｈ７.５）−１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加
え、４℃で一晩静置し染色体ＤＮＡ溶液を得た。

【００５５】（Ｂ）ＰＣＲプライマーの設計 セラチア・マルセッセンスＩＦＯ３７３６株由来のマレ
イン酸イソメラーゼへの部位特異的変異の導入には、リ
コンビナントＰＣＲ法（R. Higuchi et al. Recombinan
t PCR in "PCR Protocols: A Guide to Methods and Ap
plications" p.177, Academic Press, 1990）を用い、
同マレイン酸イソメラーゼの２０１番目のメチオニン残
基をシステインに置換した変異酵素、Ｍ２０１Ｃを作製
した。

【００５６】セラチア・マルセッセンスＩＦＯ３７３６
株由来のマレイン酸イソメラーゼの２０１番目のメチオ
ニン残基をシステインに置換するため、セラチア・マル
セッセンスＩＦＯ３７３６株由来のマレイン酸イソメラ
ーゼ遺伝子の塩基配列６０１〜６０３位のＡＴＧコドン
（Ｍｅｔをコード）を、部位特異的変異によりＴＧＣコ
ドン（Ｃｙｓをコード）に変換した。リコンビナントＰ
ＣＲに用いたオリゴＤＮＡの配列は以下の通り設計し
た。

【００５７】 配列ＳＭＡ３７３６ TTTCCCGGGA TGAGCAACCA CTACCGCATC （配列番号３） 配列ＰＳＴ３７３６ CCCCTGCAGT CAATAAGCGC CGGACAGCAG （配列番号４） 配列ＳＭ２０１ＣＦ CGCCTGCGTG CAGTGCCCTT CGCTGCCGGC （配列番号５） 配列ＳＭ２０１ＣＲ GCCGGCAGCG AAGGGCACTG CACGCAGGCG （配列番号６）

【００５８】（Ｃ）１ｓｔＰＣＲ反応 上記（Ｂ）のプライマーを用いて、表１の組み合わせ
で、（Ａ）で調製したセラチア・マルセッセンスＩＦＯ
３７３６株由来の染色体を鋳型としてＰＣＲを行うと、
セラチア・マルセッセンスＩＦＯ３７３６株由来の染色
体上のマレイン酸イソメラーゼ遺伝子部分の増幅によ
り、各々表１に示す大きさのＰＣＲ反応産物が得られる
と期待される。

【００５９】

【表１】 番号 プライマー１ プライマー２ 断片の大きさ ──────────────────────────────────── ＳＭＷ ＳＭＡ３７３６ ＰＳＴ３７３６ 約 ７７０ｂｐ ＭＣ１Ａ ＳＭＡ３７３６ ＳＭ２０１ＣＲ 約 ６２０ｂｐ ＭＣ１Ｂ ＳＭ２０１ＣＦ ＰＳＴ３７３６ 約 １６０ｂｐ ────────────────────────────────────

【００６０】実際のＰＣＲ反応はパーキンエルマーシー
タス社製のＤＮＡサーマルサイクラーを用いて下記の条
件で行った。 反応液： ５０ｍＭ ＫＣｌ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４） １．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 鋳型ＤＮＡ ５μｌ 上記（Ａ）で作製したプライマー 各々０．２５μＭ ｄＮＴＰｓ 各々２００μＭ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造） ２．５ｕｎｉｔ
ｓ 以上を混合し、１００μｌとした。

【００６１】ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程：６０℃ １２０秒 エクステンション過程：７２℃ １８０秒 以上を１サイクルとし、３０サイクル行った。

【００６２】上記で生成した反応液１０μｌを２％アガ
ロースゲルにより電気泳動を行ったところ表１に示した
大きさのＤＮＡ断片が検出された。

【００６３】（Ｄ）２ｎｄＰＣＲ反応 次に、プライマーとしてＳＭＡ３７３６およびＰＳＴ３
７３６を用いて、上記（Ｃ）で調製したＰＣＲ反応産物
ＭＣ１およびＭＣ２を鋳型として、ＰＣＲ反応を行う
と、セラチア・マルセッセンスＩＦＯ３７３６株由来の
染色体上のマレイン酸イソメラーゼ遺伝子全体が連結さ
れた状態で増幅することにより、約７７０ｂｐの変異型
マレイン酸イソメラーゼ遺伝子がＰＣＲ反応産物が得ら
れると期待される。ＰＣＲの条件は、上記（Ｃ）に準じ
た。但し、鋳型ＤＮＡは、上記（Ｃ）で生成したＰＣＲ
産物をＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＫＩＴ（BIO 101, INC.
製）を用いゲルから切り出し精製したものを用いた。

【００６４】上記で生成した反応液１０μｌを２％アガ
ロースゲルにより電気泳動を行ったところいずれも約７
７０ｂｐの大きさのＤＮＡ断片が検出された。

【００６５】（Ｅ）増幅断片の発現ベクターへの導入、
および、大腸菌での発現 上記（Ｃ）項で得たＰＣＲ産物ＳＭＷ、上記（Ｄ）項で
得たＰＣＲ産物ＭＣ１、および、大腸菌用高発現ベクタ
ーｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社より市販）をそれ
ぞれ制限酵素ＳｍａＩおよびＰｓｔＩで切断した後、切
断した個々のＰＣＲ産物とベクターとを混合し、５０ｍ
Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイ
トール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 及び
Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成
分の濃度は最終濃度である）、４℃で１５時間反応さ
せ、結合させた。

【００６６】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー（Journal of Molecular Biology）、53、159 （19
70）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造
製）を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含む培地
〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、Ｎ
ａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１１に溶解〕に塗
抹した。

【００６７】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素ＳｍａＩおよびＰｓｔＩにより切断し、挿
入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＫＫ２２３
−３の長さ４．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、ＳＭＷ、Ｍ
Ｃ１の長さ約７６０ｂｐの挿入断片が認められた。それ
ぞれのプラスミドの名前をｐＫＫ−ＳＭＷ、ｐＫＫ−Ｍ
Ｃ１と命名し、該プラスミドを含有したエシェリヒア・
コリＪＭ１０９をそれぞれエシェリヒア・コリＥＣＳＭ
Ｗ、ＥＣＭＣ１と命名した。

【００６８】なお、上記で得られたマレイン酸イソメラ
ーゼ遺伝子の挿入断片については、その塩基配列を、Dy
e Terminator Cycle Sequencing FS Core Kit（ＡＢＩ
社製）を用いた、ジデオキシヌクレオチド酵素法（dide
oxychain termination法）［Sanger，F.et al.，プロシ
−デフィング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・
サイエンス・オブ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・ア
メリカ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）Vol.74,p.5463,(197
7)］により確認した。

【００６９】

【実施例２】セラチア・マルセッセンスＩＦＯ３７３６
株由来のマレイン酸イソメラーゼの部位特異的変異体の
酸化安定性評価 実施例１で作製したエシェリヒア・コリＥＣＳＭＷ、Ｅ
ＣＭＣ１株を、アンピシリン ５０μｇ／ｍｌを含むＬ
Ｂ（トリプトン １０ｇ，イーストエキストラクト ５
ｇ，ＮａＣｌ ５ｇ）培地に植菌し、３０℃で１５時間
好気的に振とう培養した。得られた培養物を遠心分離
（３，０００×ｇ、４℃、２０分間）して菌体を回収
後、緩衝液Ａ［２０ｍＭ リン酸カリウム、０．５ｍＭ
ジチオスレイトール、ｐＨ７．２］で洗浄した。

【００７０】得られた菌体１ｇを２ｍｌの緩衝液Ａに懸
濁し、超音波破砕装置により菌体を破砕した後、菌体破
砕物を遠心分離（１０、０００×ｇ、４℃、３０分間）
し、上清の可溶性画分を無細胞菌体抽出液として得た。

【００７１】次いで、各無細胞菌体抽出液０．５ｍｌ
に、０ｍＭ、６ｍＭ、２０ｍＭ、６０ｍＭ、２００ｍＭ
の過酸化水素溶液を０．５ｍｌ加え（最終処理濃度：０
ｍＭ、３ｍＭ、１０ｍＭ、３０ｍＭ、１００ｍＭ過酸化
水素）、それぞれ３０℃で１時間保温し、マレイン酸イ
ソメラーゼ酸化処理とした。次に、マレイン酸反応液
［組成：マレイン酸 ３０８ｇ、Triton X-100 ２ｇ、２
５％アンモニア水により、ｐＨ８．５に調製 ／ 脱イ
オン水 ９００ｍｌ］９ｍｌを添加後、３０℃で反応さ
せた。２０分、６０分、２４０分反応後の反応液を、１
００℃で２分間処理し反応を停止させた後、遠心分離
（３，０００×ｇ、４℃、２０分間）し、得られた上清
液について有機酸カラム（島津製作所製ＳＣＲ−１０１
Ｈカラム）、ＵＶ検出器（２１０ｎｍ）を用いた高速液
体クロマトグラフィー分析（島津社製、ＬＣ-５Ａ）に
供した。

【００７２】ＨＰＬＣにより検出されるマレイン酸の減
少よりマレイン酸イソメラーゼの残存活性を測定したそ
の結果を表２に示す。活性はＥＣＭＣ１株において過酸
化水素の濃度０ｍＭで処理時の活性を１００とする相対
値で示す。なお、３０℃、１時間、３０ｍＭ過酸化水素
の条件で酸化処理した際の活性低下率は、ＥＣＳＭＷ株
では８０％、ＥＣＭＣ１株では３０％であった。

【００７３】

【表２】 組換え大腸菌無細胞抽出液酸化処理後のマレイン酸イソメラーゼの残存活性 ──────────────────────────────────── 過酸化水素処理濃度 ０ｍＭ １０ｍＭ ３０ｍＭ １００ｍＭ ３００ｍＭ ──────────────────────────────────── ＥＣＳＭＷ ３００ １２０ ６０ ３０ １０ ＥＣＭＣ１ １００ ８０ ７０ ６０ ３０ ────────────────────────────────────

【００７４】この結果より、セラチア・マルセッセンス
ＩＦＯ３７３６株由来のマレイン酸イソメラーゼの２０
１番目のメチオニン残基をシステインに置換することに
より、同酵素の酸化安定性が向上することが示された。

【００７５】

【発明の効果】本発明によれば、酸化安定性に優れたマ
レイン酸イソメラーゼをコードするＤＮＡが提供され
る。

【００７６】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：７５３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：セラチア・マルセッセンス 株名：ＩＦＯ３７３６ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：1..753 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATG AGC AAC CAC TAC CGC ATC GGC CAG ATC GTG CCC AGC TCC AAC ACC 48 Met Ser Asn His Tyr Arg Ile Gly Gln Ile Val Pro Ser Ser Asn Thr 1 5 10 15 ACG ATG GAA ACC GAG ATC CCG GCG ATG CTG GGC GCG CGC CAG CTG ATA 96 Thr Met Glu Thr Glu Ile Pro Ala Met Leu Gly Ala Arg Gln Leu Ile 20 25 30 CGC CCG GAG CGT TTC ACC TTT CAC TCC AGC CGC ATG CGC ATG AAA CAC 144 Arg Pro Glu Arg Phe Thr Phe His Ser Ser Arg Met Arg Met Lys His 35 40 45 GTC AAT AAA GAA GAA TTG GCG GCG ATG GAC GCC GAG TCC GAT CGC TGC 192 Val Asn Lys Glu Glu Leu Ala Ala Met Asp Ala Glu Ser Asp Arg Cys 50 55 60 GCG CTG GAG CTG TCC GAC GCG CGG GTC GAC GTG CTC GGC TAC GCC TGC 240 Ala Leu Glu Leu Ser Asp Ala Arg Val Asp Val Leu Gly Tyr Ala Cys 65 70 75 80 CTG GTG GCC ATC ATG GCG ATG GGG CTG GGC TAC CAC CGC GAA TCG CAG 288 Leu Val Ala Ile Met Ala Met Gly Leu Gly Tyr His Arg Glu Ser Gln 85 90 95 GCC CGG CTG GCG CAG GTG ACG AAA GAC AAT CAG GCC GCC GCG CCG GTC 336 Ala Arg Leu Ala Gln Val Thr Lys Asp Asn Gln Ala Ala Ala Pro Val 100 105 110 ATC AGC AGC GCC GGC GCG CTG GTC AAC GGC CTG AAG GTG ATC GGC GCC 384 Ile Ser Ser Ala Gly Ala Leu Val Asn Gly Leu Lys Val Ile Gly Ala 115 120 125 AAA CGC ATC GCG CTG GTG GCG CCC TAC ATG AAA CCG CTG ACC CAG CTG 432 Lys Arg Ile Ala Leu Val Ala Pro Tyr Met Lys Pro Leu Thr Gln Leu 130 135 140 GTG GTG GAC TAC ATC CAG CAC GAA GGC ATC GAG GTC AAG GTA TGG CGC 480 Val Val Asp Tyr Ile Gln His Glu Gly Ile Glu Val Lys Val Trp Arg 145 150 155 160 GCG CTG GAG ATC CCG GAC AAC CTC GAC GTC GGC CGG CAC GAT CCG GCC 528 Ala Leu Glu Ile Pro Asp Asn Leu Asp Val Gly Arg His Asp Pro Ala 165 170 175 AGG CTG CCG GGG ATC GTC GCC GAG ATG GAC TTA CGC GAG GTC GAT GCT 576 Arg Leu Pro Gly Ile Val Ala Glu Met Asp Leu Arg Glu Val Asp Ala 180 185 190 ATC GTG CTG TCC GCC TGC GTG CAG ATG CCT TCG CTG CCG GCC GTC CCG 624 Ile Val Leu Ser Ala Cys Val Gln Met Pro Ser Leu Pro Ala Val Pro 195 200 205 ACG GTG GAG GCC CAA ACC GGC AAA CCG GTG ATC ACC GCC GCC ATC GCC 672 Thr Val Glu Ala Gln Thr Gly Lys Pro Val Ile Thr Ala Ala Ile Ala 210 215 220 ACC ACT TAC GCG ATG CTG ACC GCG CTG GAG CTG GAA CCG ATC GTT CCC 720 Thr Thr Tyr Ala Met Leu Thr Ala Leu Glu Leu Glu Pro Ile Val Pro 225 230 235 240 GGC GCC GGC GCC CTG CTG TCC GGC GCT TAT TGA 753 Gly Ala Gly Ala Leu Leu Ser Gly Ala Tyr 245 250

【００７７】配列番号：２ 配列の長さ：２５０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Ser Asn His Tyr Arg Ile Gly Gln Ile Val Pro Ser Ser Asn Thr 1 5 10 15 Thr Met Glu Thr Glu Ile Pro Ala Met Leu Gly Ala Arg Gln Leu Ile 20 25 30 Arg Pro Glu Arg Phe Thr Phe His Ser Ser Arg Met Arg Met Lys His 35 40 45 Val Asn Lys Glu Glu Leu Ala Ala Met Asp Ala Glu Ser Asp Arg Cys 50 55 60 Ala Leu Glu Leu Ser Asp Ala Arg Val Asp Val Leu Gly Tyr Ala Cys 65 70 75 80 Leu Val Ala Ile Met Ala Met Gly Leu Gly Tyr His Arg Glu Ser Gln 85 90 95 Ala Arg Leu Ala Gln Val Thr Lys Asp Asn Gln Ala Ala Ala Pro Val 100 105 110 Ile Ser Ser Ala Gly Ala Leu Val Asn Gly Leu Lys Val Ile Gly Ala 115 120 125 Lys Arg Ile Ala Leu Val Ala Pro Tyr Met Lys Pro Leu Thr Gln Leu 130 135 140 Val Val Asp Tyr Ile Gln His Glu Gly Ile Glu Val Lys Val Trp Arg 145 150 155 160 Ala Leu Glu Ile Pro Asp Asn Leu Asp Val Gly Arg His Asp Pro Ala 165 170 175 Arg Leu Pro Gly Ile Val Ala Glu Met Asp Leu Arg Glu Val Asp Ala 180 185 190 Ile Val Leu Ser Ala Cys Val Gln Met Pro Ser Leu Pro Ala Val Pro 195 200 205 Thr Val Glu Ala Gln Thr Gly Lys Pro Val Ile Thr Ala Ala Ile Ala 210 215 220 Thr Thr Tyr Ala Met Leu Thr Ala Leu Glu Leu Glu Pro Ile Val Pro 225 230 235 240 Gly Ala Gly Ala Leu Leu Ser Gly Ala Tyr 245 250

【００７８】配列番号：３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TTTCCCGGGA TGAGCAACCA CTACCGCATC 30

【００７９】配列番号：４ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 CCCCTGCAGT CAATAAGCGC CGGACAGCAG 30

【００８０】配列番号：５ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 CGCCTGCGTG CAGTGCCCTT CGCTGCCGGC 30

【００８１】配列番号：６ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GCCGGCAGCG AAGGGCACTG CACGCAGGCG 30

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 寺沢 真人 茨城県稲敷郡阿見町中央八丁目３番１号 三菱化学株式会社筑波研究所内 (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央八丁目３番１号 三菱化学株式会社筑波研究所内

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 マレイン酸イソメラーゼをコードするＤ
   ＮＡであって、前記ＤＮＡを発現させたマレイン酸イソ
   メラーゼ遺伝子組換え大腸菌の菌体破砕無細胞抽出液を
   ３０℃、１時間、３０ｍＭ過酸化水素の条件で酸化処理
   した際のマレイン酸イソメラーゼの活性低下率が４０％
   未満であることを特徴とするＤＮＡ。
2. 【請求項２】 マレイン酸イソメラーゼのメチオニン残
   基が酸化処理に対してより安定な他のアミノ酸残基に置
   換された請求項１記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列番号２に示すアミノ酸配列の２０１
   位のメチオニン残基に相当するメチオニン残基が酸化処
   理に対してより安定な他のアミノ酸残基に置換された請
   求項２記載のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 他のアミノ酸残基がシステイン残基であ
   る請求項３記載のＤＮＡ。
5. 【請求項５】 マレイン酸イソメラーゼがセラチア属細
   菌由来であることを特徴とする請求項４記載のＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡ
   をベクターに連結してなる組換えベクター。
7. 【請求項７】 請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡ
   が導入されることにより形質転換された形質転換体。
8. 【請求項８】 請求項７記載の形質転換体を培地で培養
   し、その培養物からマレイン酸イソメラーゼを採取する
   ことを特徴とするマレイン酸イソメラーゼの製造法。
9. 【請求項９】 請求項７記載の形質転換体またはこの形
   質転換体の培養物から採取したマレイン酸イソメラーゼ
   の粗精製画分もしくは精製酵素を、マレイン酸を含有す
   る水性溶液に加え、マレイン酸を異性化してフマル酸を
   生成せしめることを特徴とするフマル酸の製造法。