JPH11292892A - 修飾ヌクレオチド - Google Patents

修飾ヌクレオチド

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JPH11292892A
JPH11292892A JP11008415A JP841599A JPH11292892A JP H11292892 A JPH11292892 A JP H11292892A JP 11008415 A JP11008415 A JP 11008415A JP 841599 A JP841599 A JP 841599A JP H11292892 A JPH11292892 A JP H11292892A
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residue
polynucleotide
sig
dna
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JP11008415A
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Dean Engelhardt
エンゲルハート デイーン
Elazar Rabbani
ラバニ エラザー
Stanley Kline
クライン スタンレイ
Jannis G Stavrianopoulos
ジー．スタブリアノポウロス ジヤニス
Dollie Kirtikar
カーテイカー ドリー
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Enzo Biochem Inc
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 検出が容易になるようにポリヌクレオチド等
を化学的に修飾又は標識する。 【解決手段】下記一般式 を有するヌクレオチド（式中、Ｐは、リン酸残基であ
り、Ｓは糖または単糖残基であり、Ｂは塩基残基であっ
て、前記のヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドの
場合にはリン酸残基は糖残基の３′および／または５′
位に結合し、前記のヌクレオチドがリボヌクレオチドの
場合には２′，３′および／または５′位に結合し、前
記の塩基はプリンまたはピリミジンであり、前記の塩基
がそれぞれピリミジンまたはプリンの場合には前記の塩
基はＮ１位またはＮ９位から糖残基の１′位に結合し、
前記のＳｉｇは前記のヌクレオチドの糖または単糖残基
Ｓに共有結合している化学残基であり、それ自身が信号
となる、またはそれ自身が自己を検出させる若しくはそ
の存在を知らせることができるものである。）

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の要約 本発明は核酸物質に結合および／又は取り込みされた時
に容易に検出できるようにヌクレオチドおよびＤＮＡを
含むポリヌクレオチドを化学的に修飾或いは標識するこ
とに関する。
【０００２】発明の背景 例えば水素（ 3Ｈ）、りん（32Ｐ）、炭素（14Ｃ）或い
は沃素（ 125Ｉ）同位体などで放射活性標識した核酸或
いはポリ核酸を作ることは知られている。そのような放
射活性標識した化合物は科学的或いは臨床的に興味ある
核酸や他の分子を検出し、追跡し、局在化し、単離する
のに有用である。しかしながら、残念なことに、放射活
性標識した物質は放射能のため災害をもたらす。又、そ
れらの化合物や物質を標識するのに用いた放射活性物質
の半減期が比較的短いため、作られる標識化合物または
物質は対応して比較的短い貯蔵寿命を持つことになる。
【０００３】放射活性標識した化合物や物質に伴なう災
害や問題点を克服し、回避するために、例えば核酸やポ
リ核酸などの興味ある科学的標識化合物も提唱されてい
る。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、
第７８巻、１１号、６６３３−６６３７頁（１９８１年
１１月）に掲載の「Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｓｙｕｔｈｅ
ｓｉｓ ｏｆ Ｂｉｏｔｉｎ−Ｌａｂｅｌｅｄ Ｐｏｌ
ｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ｎｏｖｅｌ Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｒｏｂｅｓ」と題
するＰ．Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ、Ａ．Ａ．Ｗａｌｄｒｏｐお
よびＤ．Ｃ．Ｗａｒｄの論文中に、ピリミジン環のＣ−
５位にアルキルアミンの連結鎖を介してビオチン分子が
結合しているｄＵＴＰおよびＵＴＰのアナログが記載さ
れている。ビオチン標識した核酸は各種ＤＮＡおよびＲ
ＮＡポリメラーゼの試験管内反応の有効な基質である。
低割合でビオチン置換されているポリ核酸（キロベース
当り５０分子以下）は非置換の対照と同様な変性、再構
成およびハイブリダイゼーションの特性を有している。
ビオチン標識のポリ核酸は、一本鎖、二本鎖共、８モル
尿素、６モルのグアニジン塩酸、或いは９９％ホルムア
ミドで十分洗滌した後も、選択的かつ定量的にアビジン
−セファロース上に保持される。さらに、ビオチン標識
した核酸は抗ビオチン抗体およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓたん白Ａの存在下で選択的に免疫
沈降を起すことが出来る。ビオチン標識ポリ核酸のこれ
らの特有の性質からあるＤＮＡおよびＲＮＡ配列を検出
したり単離するのに有用な親和プローブとなり得る。本
論文記載の事項は保留中の米国特許出願に含まれている
ことが論文に示されている。
【０００４】上記記載の論文および上記引用の特許出願
の発表はここに包含され、本発表の一部分を成すもので
ある。
【０００５】前述論文に引用される特許出願は、米国特
許第４，７１１，９５５号に係るものである。この米国
特許第４，７１１，９５５号は本特許に包含され、本発
表の一部を構成する。上記引用の米国特許には上述の論
文の事項が記載され、さらに、次の構造で示される化合
物が生化学研究および組み換えＤＮＡ技術においてプロ
ーブとして広く有用であることが記載されている。
【化３】 但し、Ｂは糖部分のＣ１′位に共有結合したプリン、デ
アザプリン或いはピリミジンを示し、Ｂがプリンまたは
７−デアザプリンである時には糖はプリンまたはデアザ
プリンのＮ９位に結合し、Ｂがピリミジンである時には
Ｎ１位に結合し、Ａは少なくとも３個の炭素原子より成
り、二重鎖ＲＮＡ、二重鎖ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡ
ハイブリッドに取り込まれた時ポリペプチドと検出可能
な複合体を生成することの出来る部分を示し、点線はＢ
とＡを結合する化学結合を示し、Ｂがプリンであれば結
合はプリンの８位と結合し、Ｂが７−デアザプリンであ
ればデアザプリンの７位に結合し、Ｂがビリミジンであ
る場合にはピリミジンの５位に結合し、そして、ｘ、ｙ
およびｚはそれぞれ、Ｈ−、ＨＯ−、
【化４】 を示す。
【０００６】上記構造に包含される化合物で特に有用な
のはさらに次の性質の一つまたはそれ以上を有するもの
である。Ａが非芳香環である；Ａが少なくとも炭素５個
である；ＢとＡとをつなぐ結合がα−オレフィン結合を
含んでいる；Ａがビチオン或いはイミノビチオンであ
る；およびＢがピリミジン或いは７−デアザプリンであ
る。これらの化合物は以下のような方法で製造され得
る。 （ａ）下記の構造を有する化合物を、適当な
【化５】 溶媒中、適当な条件下で水銀塩と反応させ、下記構造を
有する水銀化合物を生成させる。
【化６】
【０００７】（ｂ） 該水銀化合物と、該水銀化合物の
−Ｈｇ+ 部分と反応し、式…Ｎで示される化学基と反応
させ、当該反応を水溶液中、Ｋ2 ＰｄＣｌ4 存在下で適
当な条件下で行ない、下記構造を有する化合物を生成さ
せる。そして、
【化７】
【０００８】但し、Ｎは反応性の末端官能基或いはＡで
ある。 （ｃ） ＮがＡである場合には該修飾ヌクレオチドとし
て化合物を回収し、或いはＮが反応性の末端官能基の場
合には該化合物をＭ−Ａの構造を有する化合物と反応さ
せて修飾ヌクレオチドを生成し、それを回収する。但
し、Ｍは水溶液中適当条件下でＮと反応性のある官能基
を表わす。米国特許第４，７１１，９５５号の発明はま
た下記構造を有する化合物も提供する。
【化８】
【０００９】但し、Ｂ、Ｂ′およびＢ″のそれぞれは糖
部分のＣ１′位に共有結合したプリン、７−デアザプリ
ン或いはピリミジン部分を表わし、Ｂ、Ｂ′或いはＢ″
がプリンまたは７−デアザプリンである時にはプリンま
たは７−デアザプリンのＮ９位に結合し、Ｂ、Ｂ′或い
はＢ″がピリミジンの場合にはＮ１位に結合し、Ａは少
なくとも３個の炭素原子より成り、相補ＲＮＡまたはＤ
ＮＡ分子と形成した二重鎖に取り込まれるとポリペプチ
ドと検出可能な複合体を形成することができる成分を表
わし、点線はＢとＡをつなぐ化学結合を表わし、Ｂがプ
リンである時は結合はプリンの８位につき、Ｂが７−デ
アザプリンの時には結合はデアザプリンの７位に結合
し、そして、Ｂがピリミジンならば結合はピリミジンの
５位に結合し、ｚはＨ−或いはＨＯ−を表わし、そし
て、ｍおよびｎは０からおよそ１００，０００までの整
数を表わす。
【００１０】これらの化合物は米国特許第４，７１１，
９５５号の発明に係る修飾ヌクレオチドを含むヌクレオ
チドの混合物の酵素的重合により調製され得る。別の方
法としては、オリゴ−またはポリヌクレオチドとして存
在するヌクレオチドを化学法を用いて修飾することも出
来る。米国特許第４，７１１，９５５号の発明の実施に
従って修飾されたヌクレオチドおよび該修飾ヌクレオチ
ドから生成するオリゴ−およびポリヌクレオチドは生化
学研究、臨床診断および組換えＤＮＡ技術におけるプロ
ーブとして用いられる。これらの種々の利用は分子がポ
リペプチドと安定な複合体を形成しそれがポリペプチド
固有の性質またはポリペプチドに結合した、或いはポリ
ペプチドと反応する検出可能な成分によって検出され得
るという能力に基づいている。利用例としては例えばバ
クテリアやウイルスのような核酸含有病因物質の検出と
同定；抗生物質耐性細菌のスクリーニング；例えば地中
海貧血および鎌状赤血球貧血症などの遺伝病の診断；染
色体の核型決定；および癌細胞の同定などがある。
【００１１】修飾ヌクレオチドが天然存在ヌクレオチド
の放射活性標識体の代用として一般的に適するにはいく
つか必須基準を満たさねばならない。第一に修飾ヌクレ
オチドは特有の、即ち、通常ヌクレオチドやポリヌクレ
オチドと結合して見られないような置換基或いはプロー
ブを含有していなければならない。第二に、そのプロー
ブは化学試薬或いは生化学試薬と特異的に反応して感度
の高い検出系を提供しなければならない。第三に、多く
の実用応用では同族体が酵素的に代謝されることが要求
される、即ち、同族体が核酸ポリメラーゼの基質として
作用しなければならないから、同族体は通常研究される
核酸酵素に対して比較的効率よい基質でなければならな
い。この目的のため、プローブ部分は塩基の通常ワトソ
ン−クリック水素結合ポテンシャルを立体的或いはその
他で阻害するような環位置の上についてはならない。さ
もないと、置換物質はポリメラーゼ基質として不活性な
化合物を形成することになる。通常の“ａｎｔｉ”ヌク
レオチド配座を変えるような環位置の置換も避けねばな
らない。それはそのような配座変化は普通ポリメラーゼ
基質として受け入れられないようなヌクレオチド誘導体
を与えるからである。通常このような考慮から置換の位
置がピリミジンの５位およびプリン或いは７−デアザプ
リンの７位に制限される。
【００１２】第四番目に、核酸のハイブリダイゼーショ
ン法に用いるために検出方法が一重鎖、二重鎖両方のポ
リヌクレオチドに取り込まれたプローブ置換基と反応す
ることが出来るものでなくてはならない。この基準を満
たすために、プローブ部分はプリン或いはピリミジンと
化学結合または ^リンカー鎖" を通して結合するのが好
ましく、そうすることにより、抗体、他の検出たん白或
いは化学試薬と容易に反応することができる。第五番目
に、現行の放射活性ハイブリダイゼーションプローブを
用いる方法を大きく変更する必要がないように、少数の
プローブ置換を有するポリペプチドの物理的並びに生化
学的性質が有意に変更されるべきでない。この基準はプ
ローブが酵素的に導入されても化学的に導入されても満
たされるべきである。
【００１３】最後に、プローブ部分をつける結合は、通
常のヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが極って受け
る全ゆる実験条件、例えば高温に於いての長時間のハイ
ブリダイゼーション、フェノールおよび有機溶媒抽出、
電気泳動、その他、に耐えられなければならない。本願
に記載の修飾ヌクレオチドはこれら全ての基準を満たし
ている。これらの修飾ヌクレオチドは下記の構造を有
す。
【化９】 但し、Ｂは糖部分のＣ１′位に共有結合したプリン、７
−デアザプリンまたはピリミジンを表わし、Ｂがプリン
或いは７−デアザプリンの時は糖はプリン或いは７−デ
アザプリンのＮ９位に結合し、Ｂがピリミジンの時はＮ
１位に結合する。Ａは少なくとも３個の炭素原子より成
り、二重鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ二重鎖或いはＤＮＡ−ＲＮＡ
ハイブリッドに取り込まれるとポリペプチドと検出可能
な複合体を形成する成分を表わす。点線はＢとＡをつな
ぐ結合グループを表わし、Ｂがプリンであれば結合はプ
リンの８位につき、Ｂが７−デアザプリンであれば結合
はデアザプリンの７位につき、もしＢがピリミジンであ
れば結合はピリミジンの５位につく。
【００１４】そしてｘ、ｙおよびｚのそれぞれはＨ−、
ＨＯ−、
【化１０】 を表わす。これらの化合物は生化学研究およびＤＮＡ組
換え技術のプローブとして広く有用である。基本的には
上記構造式に包含される全ての化合物が米国特許第４，
７１１，９５５号の発明の実施例に従って調製され、使
用されるが、ある化合物がより容易に調製されるか使用
され、或いは調製使用され、従って現在好ましい。この
ように、基本的にはプリン類、ピリミジン類および７−
デアザプリン類が使用され得るが、プリンの８位の置換
はポリメラーゼの基質として効力のないヌクレオチドに
する傾向があるため、ピリミジンおよび７−デアザプリ
ンがより好ましい。従って、修飾プリンはある点で有用
ではあるが、一般にピリミジンおよび７−デアザプリン
のように有用ではない。さらに米国特許第４，７１１，
９５５号の発明で有用なピリミジンおよび７−デアザプ
リンはそれぞれ５位および７位に天然置換があってはい
けない。その結果、チミン、５−メチルシトシン、およ
び５−ヒドロキシメチルシトシンなどのようなある塩基
は有用でない。現在のところ好ましい塩基はシトシン、
ウラシル、デアザアデニンおよびデアザグアニンであ
る。
【００１５】Ａは少なくとも３個の炭素原子を有し、修
飾ヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを含む
二重鎖に取り込まれた時ポリペプチドと検出可能な複合
体を形成することの出来る成分である。従って、Ａは上
記性質を有するいかなるリガンドでもよく、適当な担体
と結合した時のみ免疫性があり、適当な抗体と相互反応
を起して複合体を生成することが出来るハプテンを含
む。有用な成分の例は以下のとおりです。
【化１１】 である。これらの中で好ましいＡとしてはビオチンおよ
びイミノビオチンである。さらに芳香成分は塩基対のら
線構造内に入り込む傾向があるので成分Ａは非芳香であ
ることが好ましい。また小さい成分はポリペプチドと十
分に分子相互作用をし得ないので、Ａは安定な複合体を
形成させるのに十分な相互作用が起こるように、少なく
ともＣ５であることが望ましい。ビオチンおよびイミノ
ビオチンはこれらの両方の基準を満たしている。
【００１６】Ａ部分と塩基Ｂを連結する結合またはグル
ープは、炭素−炭素一重結合、炭素−炭素二重結合、炭
素−窒素単結合または炭素−酸素単結合を含むよく知ら
れているいかなる結合でもよい。しかし、一般にはＢに
対してα−位にオレフィン結合を含む化学結合が望まし
い。α位のオレフィン結合の存在は、よく知られる二重
ら線構造中塩基が他の塩基と対を成す時、Ａ成分をその
塩基から離す役目をもつ。これはポリペプチドとの相互
作用を起すのを容易にし、その結果、複合体形成を促進
する。さらに、回転自由度のより大きい一重結合は、ポ
リペプチドによる認識とポリペプチドとの複合体形成を
可能にするほどＡ部分をら線から必ずしも離さない。さ
らに望ましいのは化学結合グループが一級アミンから誘
導され、−ＣＨ2 −ＮＨ−の構造を有することで、この
ような結合はよく知られるアミン修飾反応を利用して形
成される。アリルアミンおよびアリル−（３−アミノ−
２−ヒドロキシ−１−プロピル）エーテルグループから
誘導される好ましい結合の例としては、それぞれ
【化１２】 がある。これらの結合が望ましいのであるが、特にチオ
ール、カルボン酸およびエポキシド官能基のような他の
修飾官能基をもつオレフィン結合鎖を含む他の結合も使
用される。結合グループは特異的な位置、即ち、ピリミ
ジンの５位、プリンの８位或いはデアザプリンの７位、
に結合する。前述のとおり、プリンの８位における置換
は本明細書に述べる全ての方法で有用な修飾ヌクレオチ
ドを生成しない。窒素原子となっているプリンの７位が
結合位置となり得るかも知れない。しかし、今日まで採
用され、本件で述べられる化学置換方法はこの目的には
適してしない。ｘ、ｙ、ｚの文字は糖の５′位、３′位
および２′位に結合するグループを表わす。これらの結
合は、
【化１３】 のいずれかである。考えとしてはあるが、ｘ、ｙおよび
ｚの全てが同時に同じグループであることはないだろ
う。より適当なのは、ｘ、ｙ、およびｚの少なくとも一
つがモノ−、ジ−或いはトリりん酸のいずれかりん酸含
有基であり、少なくとも一つがＨＯ−またはＨ−である
ことだ。容易に判断できるだろうが、ｚがＨＯ−又はＨ
−である、即ち、それぞれリボヌクレオチド又はデオキ
シリボヌクレオチドであるのが最も適当であろう。その
ようなヌクレオチドの例としては、５′−リボヌクレオ
シドモノフォスフェート、５′−リボヌクレオシドジフ
ォスフェート、５′−リボヌクレオシドトリフォスフェ
ート、５′−デオキシリボヌクレオシドモノフォスフェ
ート、５′−デオキリボヌクレオシドジフォスフェー
ト、５′−デオキシリボヌクレオシドトリフォスフェー
ト、５′−ｐ−リボヌクレオシド−５′ｐおよび５′−
ｐ−デオキシリボヌクレオシド−３′ｐがある。さらに
具体的な例としては、Ａがビオチン或いはイミノビオチ
ンであり、化学結合が
【化１４】 であり、Ｂがウラシル又はシトシンであるようなこの種
の修飾ヌクレオチドである。
【００１７】塩基にリンカー鎖およびプローブ部分を導
入するのに採用される一般的な合成手段は既に述べられ
ている。（特に：Ｊ．Ｌ．ＲｕｔｈおよびＤ．Ｅ．Ｂｅ
ｒｇｓｔｒｏｍ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４３巻、２８
７０頁〔１９８７年〕；Ｄ．Ｅ．Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍお
よびＭ．Ｋ．Ｏｇａｗａ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．１００巻、８１０６頁〔１９７８年〕；および
Ｃ．Ｆ．Ｂｉｇｇｅ、Ｐ．Ｋａｌａｒｉｔｉｓ、Ｊ．
Ｒ．Ｄｅｃｋ、およびＭ．Ｐ．Ｍｅｒｔｅｓ、Ｊ．Ａｍ
ｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０２巻、２０３３頁〔１９
８０年〕）しかしながら、米国特許第４，７１１，９５
５号の発明で採用されるオレフィン置換は過去に用いら
れていない。プローブ部分Ａの結合を促進するため、ア
リルアミン〔ＡＡ〕またはアリル−（３−アミノ−２−
ヒドロキシ−１−プロピル）エーテル〔ＮＡＧＥ〕のよ
うな一級アミン官能基をもつオレフィンを採用すること
が特に望ましく、それにより以下のような標準アミン修
飾反応によりプローブ結合が可能である。
【化１５】 調製が容易であるためプローブ添加にはＮＨＳ−エステ
ルを用いるのが好ましいことがわかっている。しかし、
他の修飾可能な官能基、例えばチオール、カルボン酸、
エポキシド等を有するオレフィンリンカー鎖も利用可能
である。さらに、もし望むならリンカー鎖とプローブの
両方を一段階で導入することができる。
【００１８】具体的には、次の構造を有する修飾ヌクレ
オチドを以下に示す方法で調製することが出来る。
【化１６】 但し、Ｂは糖のＣ１′位に共有結合するプリン、７−デ
アザプリン又はピリミジン部分を表わし、Ｂがプリン又
は７−デアザプリンである時は糖はプリン又はデアザプ
リンのＮ９位に結合し、Ｂがピリミジンである時はＮ１
−位に結合し、Ａは少なくとも３個の炭素原子より成
り、化合物が二重鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ二重鎖、ＤＮＡ−Ｒ
ＮＡハイブリッドに取り込まれると、ポリペプチドと検
出可能な複合体を形成することが出来る成分を表わし、
点線はＢとＡを連結する化学結合を表わし、Ｂがプリン
であれば結合はプリンの８位につき、７−デアザプリン
であればデアザプリンの７位に結合し、Ｂがピリミジン
であれば結合はピリミジンの５位につき、ｘ、ｙ、およ
びｚのそれぞれはＨ−、ＨＯ−、
【化１７】 を表わす。反応は；
【００１９】（ａ） 次の構造を有する化合物と水銀と
を適当な溶媒中、適当条件下で反応させ、
【化１８】 以下の構造を有する水銀化合物を形成し、
【化１９】 （ｂ） 上記水銀化合物を該水銀化合物の−Ｈｇ+ と反
応性があり、式…Ｎで表わされる化学成分と反応させ、
該反応は水溶液中、Ｋ2 ＰｄＣｌ4 存在下、適当な条件
下で行ない、次の構造式を有する化合物を生成させ、そ
して、
【化２０】 但し、Ｎは反応性の末端官能基或いはＡである。 （ｃ） 上記構造中ＮがＡである時は該化合物を修飾ヌ
クレオチドとして回収し、或いはＮが反応性の末端基で
ある時は該化合物をＭ−Ａなる構造を有する化合物と反
応させて修飾ヌクレオチドを形成し、それを回収する。
但し、上記Ｍ−Ａ中のＭは水溶液中適当条件下でＮと反
応性のある官能基を示す。以下の図で実例を示す。
【化２１】
【００２０】反応は水素イオン濃度ｐＨ１の低濃度、或
いはｐＨ１４の高濃度で行なうことも出来るが、約４か
ら８の範囲で行なうのが好ましい。これは特に、ヌクレ
オシドポリフォスフェート、ポリヌクレオチドおよびヌ
クレオチド補酵素などのような上記範囲以外のｐＨでは
加水分解されるような不安定な化合物を扱う場合にそう
である。同様に、不安定な有機化合物の分解を避けるた
め約２０℃から３０℃の範囲内の温度で行なうことが望
ましい。しかし、反応は約５℃から１００℃の温度で行
なうことが可能である。化学反応で一般に普通であるよ
うに、高温では反応速度が促進され、低温では反応が遅
れる。従って反応温度が５℃から１００℃の間で、最適
反応時間も約１０分から９８時間と変化する。望ましい
温度範囲内で反応時間は通常３〜２４時間である。ｐＨ
を望む範囲内に保持する好ましい方法は緩衝液の使用に
よるものである。各種緩衝液が使用可能である。例え
ば、酢酸ナトリウムまたはカリウム、トリス酢酸および
ほう酸−水酸化ナトリウム緩衝液などである。使用する
際の緩衝液の濃度は約２．０モル濃度までの広い範囲に
亘る。
【００２１】水銀化およびパラジウム触媒の添加反応の
利点は特に、反応を水の中で行なうことができる点であ
るが、溶解性助剤として少量の有機溶媒を加えることも
有効である。通常選択される有機溶媒は水と混和できる
ものである。それらはメタノール、エタノール、プロパ
ノール、グリセリン、ジオキサン、アセトン、ピリジン
およびジメチルホルムアミドなどのエーテル類、アルコ
ール類、エステル類、ケトン類、アミド類等から選ばれ
る。しかし、メタノールなどのアルコールの存在でオレ
フィン二重結合にアルコキシ添加が時には見られるの
で、溶解性助剤として使用する有機溶媒は慎重に選ばね
ばならない。α−位又はβ−位環外炭素原子へのアルコ
キシ置換の導入はしばしば酵素基質としてより効率悪く
利用される化合物を生成する。各種水銀塩が利用され得
るが現在望ましい塩は酢酸水銀である。また既に述べた
ように化合物は先ずリンカー鎖を添加し、次にＡ部分を
加えるか或いは既にＡが添加されたものにリンカー鎖を
添加することで調製される。従って式…Ｎにより表わさ
れる化学成分は最終的に望む化合物を形成することの出
来る多くの物質のいずれでもよい。その例としては、
【化２２】 イミノビオチンがある。
【００２２】これらの反応に採用される反応物の量は広
い範囲に亘る。しかし、通常、非水銀化合物、水銀化合
物およびパラジウム含有化合物の量は実質的に化学量論
的なものであり、一方、水銀塩および化合物…Ｎは過剰
モル濃度、即ち、それぞれ水銀化合物又は非水銀化合物
のモル当り５〜２０モルの…Ｎ又は水銀塩、で存在す
る。実際には量は反応条件の差および反応物の詳細差異
に依って変化する。酵素基質として機能することの出来
るヌクレオチド誘導体にビオチンプローブが直接結合し
ていることにより、実施する実験プロトコールおよび分
析に用いる検出方法（顕微鏡的および非顕微鏡的）の両
方に於いてかなり多様性が出来る。例えば、ビオチンヌ
クレオチドは細胞或いは細胞抽出物により合成されてい
る最中のポリヌクレオチド中に導入することが出来、そ
の結果、初期の（生成中の）ポリヌクレオチド鎖を検出
および／または単離することが可能になる。このような
方法は他のどんな直接化学修飾法によっても行なうこと
が出来ない。さらに、ビオチンのようなプローブをポリ
ヌクレオチドの位置に高度に選択的に或いは特異的箇所
に導入するには酵素が試薬として用いられ得る。同じよ
うなプローブで修飾した生成物を化学合成で達成するの
は極度に困難であろう。ビオチン或いはイミノビオチン
を含有するヌクレオチドの合成は以下に詳細に述べる実
施例に従って達成された。これらのプローブのいずれか
をＣ５位炭素原子に結合して有するピリミジンヌクレオ
シドトリフォスフェートは原核細胞および真核細胞の両
方の精製核酸ポリメラーゼの広い種類に対し良好乃至優
秀な基質であった。これらはＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリ
メラーゼＩ、バクテリオファージＴ４のＤＮＡポリメラ
ーゼ、ネズミ（Ａ−９）およびヒト（ＨｅＬａ）細胞か
らのＤＮＡポリメラーゼαおよびβおよびヘルペスシン
プレックスウイルスのＤＮＡポリメラーゼである。Ｅ．
ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩについて確認データを
Ｒｉｇｂｙらのニックトランスレーション条件（Ｐ．
Ｗ．Ｊ．Ｒｉｇｂｙ，Ｍ．Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ，Ｃ．Ｒ
ｈｏｄｅｓおよびＰ．Ｂｅｒｇ；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．１１３巻、２３７頁：１９７７年）或いはＢｏｕｒ
ｇｕｉｇｎｏｎらにより記載されたギャップ修復反応
（Ｇ．Ｊ．Ｂｏｕｒｇｕｉｇｎｏｎ，Ｐ．Ｊ．Ｔａｔｔ
ｅｒｓａｌｌおよびＤ．Ｃ．Ｗａｒｄ；Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．２０巻２９０頁：１９７６年）を用いて得ている。
ビオチン−ｄＵＴＰはまたｍｉｌｌｅｒらの方法（Ｍ．
Ｒ．ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｃ．Ｃａｓｔｅｌｌｏｔ，Ｊ
ｒ．およびＡ．Ｂ．Ｐａｒｄｅｅ；Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ
Ｒｅｓ．１２０巻、４２１頁：１９７９年）に従ってリ
ゾレシチン処理により透過させたＣＨＯ細胞中およびヘ
ルペスシンプレックスウイルスを感染したＢＨＫ細胞か
ら調製した核複製系の両方でポリメラーゼの基質として
機能することもわかっている。ビオチンリボヌクレオチ
ドトリフォスフェートはＥ．ｃｏｌｉ．およびバクテリ
オファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼの基質として働く
ことがわかっているが、対応するデオキシリボヌクレオ
チドトリフォスフェートのように効率よく利用されな
い。事実、これらは調べた真核細胞ＲＮＡポリメラーゼ
（ＨｅＬａ細胞ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、仔牛胸腺Ｒ
ＮＡポリメラーゼＩＩおよびマウス細胞ＲＮＡポリメラ
ーゼＩＩ）による取り込みがあるとしても非常に低い。
この基質作用の範囲が限られていることは生体内或いは
試験管内転写実験における利用性を制限するが、ビオチ
ン標識ＲＮＡプローブはＥ．ｃｏｌｉ又はＴ７ ＲＮＡ
ポリメラーゼを用いてＤＮＡ鋳型から、或いはＲＮＡリ
ガーゼを用いてビオチニル -ｐＣｐのような化合物との
３′末端標識法により酵素的に調製することが出来る。
しかし、ＵＴＰのＡＡ−およびＮＡＧＥ−誘導体は上述
の真核細胞ＲＮＡポリメラーゼの基質となる。これらの
アナログの抗体が入手できれば初期の転写物の単離が免
疫法或いはアフィニティー法により可能である。
【００２３】ビオチン又はイミノビオチン置換を有する
ヌクレオチドの酵素的ポリメリゼーションは、これらの
いずれのプローブも放射標識されていなかったので追跡
出来なかった。しかし、二つの実験的証拠からビオチン
−ヌクレオチドが確かに取り込まれたことが明かであ
る。一つはビオチン−ヌクレオチド存在下で合成された
ポリヌクレオチドはアビジン或いはストレプトアビジン
アフィニティカラムでクロマトグラフを行なうと選択的
に吸着すること。（第１表および第２表）例えば、32Ｐ
−ｄＡＭＰでニック修復した通常のＤＮＡは０．５Ｍ食
塩の添加で定量的に溶出するのに対し、大部分のビオチ
ニルＤＮＡ又はイミノビオチニルＤＮＡは高濃度の塩、
尿素、グアニジン塩酸、ホルムアミドまたは５０ｍＭ水
酸化ナトリウムで十分洗った後も樹脂に結合したままで
ある。これらの洗滌条件下で溶出した僅かの放射標識区
分は再び樹脂に吸着させても結合していないことから、
放射活性はビオチン置換のないＤＮＡ断片に関連してい
ると思われる。二つ目の証拠は、精製抗ビオチンＩｇＧ
および続いてのホルマリン固定Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓによる処理によりビオチン標識ポ
リヌクレオチドのみが免疫沈澱をすることである。（第
３表）これらの表のデータよりこの方法によると非常に
少量のビオチンが検出可能であることが明確である。こ
れらの結果はまた、ビオチン分子がＤＮＡがまだ天然の
二重鎖である時にアビジン、ストレプトアビジン或いは
特異抗体により認識され得ることを示している。このこ
とは、ハイブリダイゼーション技法を用いてプローブの
検出を行なうのに抗体結合またはアビジンアフィニティ
−法を有効に利用するためには絶対的に必須な条件であ
る。
【表１】
【表２】
【表３】このように、以下に示す構造を有する新規化合
物を製造することが可能である 。
【化２３】
【００２４】 但し、Ｂ，Ｂ′およびＢ″のそれぞれは糖部分のＣ１′
−位に共有結合するプリン、デアザプリン或いはピリミ
ジン部を表わし、Ｂ，Ｂ′又はＢ″がプリン或いは７−
デアザプリンである場合には糖はプリン或は７−デアザ
プリンのＮ９位に結合し、Ｂ，Ｂ′或いはＢ″がピリミ
ジンである場合にはＮ１位に結合し、Ａは少なくとも３
個の炭素原子より成り、相補ＲＮＡ又はＤＮＡ分子より
成る二重鎖ら線に取り込まれるとポリペプチドと検出可
能な複合体を形成することのできる成分を表わし、点線
はＢとＡを連結する結合グループを表わし、Ｂがプリン
の時は結合はプリンの８位に連結し、Ｂが７−デアザプ
リンの時は結合はデアザプリンの７位に連結し、Ｂがピ
リミジンである時には結合はピリミジンの５位に連結
し、ＺはＨ−またはＨＯ−を示し、そして、ｍおよびｎ
は０からおよそ１００，０００までの整数を表わす。勿
論、一般にｍとｎが同時に０となることがないのは容易
に理解できよう。それは、もしそうなると化合物は単に
前述のような修飾ヌクレオチドとなるからである。一般
にＢ′とＢ″は同じオリゴ−又はポリヌクレオチドの中
を変化し、交互にウラシル、シトシン、チミン、グアニ
ン、アデニン等々を示す。又、一般にその変化はよく知
られる遺伝暗号に従ったペプチド合成をコードするヌク
レオチドの整った配列に対応する。しかし、示した構造
はまた、仔牛ＤＮＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ又は酵母のリボゾー
ムＲＮＡ、バクテリオファージのＲＮＡおよびＤＮＡ
（Ｒ１７，ｆｄ）、動物ウイルス（ＳＶ ４０ ＤＮ
Ａ）、染色体ＤＮＡなどと共にｐｏｌｙＣ，ｐｏｌｙ
Ｕ，ｐｏｌｙ（Ａ−Ｕ）およびｐｏｌｙｄ（Ａ−Ｕ）な
どのポリヌクレオチドをも、それらが米国特許第４，７
１１，９５５号の発明に従って修飾されている限り、包
含する。又、本構造はオリゴマーまたはポリマー中一個
以上の修飾ヌクレオチドを含むもの、例えば、２個から
３０個の修飾ヌクレオチドを含むものも包含する。これ
に関して限界要因は修飾が多すぎてポリヌクレオチドが
目的の利用に対し効果なくならないということである。
【００２５】最後に、修飾オリゴ−およびポリ−ヌクレ
オチドは結合し、同じ構造を有し、末端基が両立し、或
いは反応性を示す限りより大きい物質を形成することも
出来る。これらの化合物は適当な条件下で合成を指示す
る核酸鋳型の存在下、適当なヌクレオチド、特にヌクレ
オチドトリフォスフェート、の酵素的重合により作製さ
れ得る。そのような条件は使用する酵素、存在するヌク
レオチドの量および他の要因により広く変わる。酵素の
実例としてはＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩ、バ
クテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、、ネズミお
よびヒト（ＨｅＬａ）細胞からのＤＮＡポリメラーゼα
およびβ、Ｅ．ｃｏｌｉのＲＮＡポリメラーゼ、バクテ
リオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼ、ＨｅＬａ細胞
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩを含む真核細胞ＲＮＡポリメ
ラーゼ、仔牛ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび，ネズミ細
胞ＲＮＡポリメラーゼＩＩがある。化合物はまたオリゴ
−およびポリヌクレオチドに末端付加してその付加が
５′側か３′位かによりｍ又はｎが０である化合物を生
成することで調製可能である。さらに、塩基がビオチン
化されたｐＣｐ又はｐＵｐのような化合物を酵素ＲＮＡ
リガーゼを使用して既存分子に付加することも出来る。
修飾オリゴおよびポリヌクレオチドはまた既に個々のヌ
クレオチド修飾としてて述べられた方法を用い、既にあ
るオリゴ又はポリヌクレオチドの化学修飾により調製で
きる。米国特許第４，７１１，９５５号の発明の種々の
修飾ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびポリヌク
レオチドは、該化合物を、複合体を形成するような適当
な条件下でそれと複合体を形成することのできるポリペ
プチドと接触することにより検出される。但し、ポリペ
プチドは複合体を形成すると一般に既知の検出方法によ
り検出され得る成分を一つ以上有しているものとする。
ビオチン型のプローブ用のポリペプチド検出体はアビジ
ンである。アビジン−ビオチン相互作用は天然に見られ
る最も強い非共有結合定数（Ｋｄｉｓ＝１０-1 5 ）を示
す。もしアビジンを潜在的表示指示分子、例えば螢光染
料（フルオレセイン、ロダミン）、電子密度試薬（フェ
リチン、ヘモシアニン、コロイド金）或いは不溶性反応
生成物を放出できる酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリ
フォスファターゼ）と連結するとビオチンプローブの存
在、位置および／又は量が決定できる。
【００２６】残念ながらアビジンは核酸又はクロマチン
と共に用いるとビオチン指示たん白として望ましくない
性質が一つある。報告によると（Ｍ．Ｈ．Ｈｅｇｇｅｎ
ｅｓｓ；Ｓｔａｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌ．５２巻１６５
頁、１９７７年；Ｍ．Ｈ．Ｈｅｇｇｅｎｅｓｓおよび
Ｊ．Ｆ．Ａｓｈ；Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７３巻、７
８３頁、１９７７年；Ｅ．Ａ．ＢａｙｅｒおよびＭ．Ｗ
ｉｌｃｈｅｋ；ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ２６巻、１頁、１９８０
年）アビジンは縮合クロマチンや核酸を多量に含む細胞
分画とビオチン結合とは別の結合で強く結合する。アビ
ジンはｐＩが１０．５である塩基性糖たん白であるの
で、そのヒストン様特質又はその糖部分がこの非特異的
相互作用に関係していると思われる。ビオチン含有ヌク
レオチドおよびその誘導体の望ましいプローブはストレ
プトアビジンで、これは土壌分離菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉにより合成されるアビジン様
たん白である。本物質の調製と精製はＨｏｆｆｍａｎ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７巻、
４６６６頁（１９８０年）に記載されている。ストレプ
トアビジンはより低いＰＩ値（５．０）を有し、糖がつ
いてなく、ＤＮＡに対する非特異的結合がアビジンより
低く、従って核酸検出の方法に関する応用の潜在的利点
を有する。ビオチン様プローブ検出のための最も好まし
いたん白は単特異性ウサギＩｇＧ、抗ビオチン免疫グロ
ブリンである。本化合物は既に報告されているように
（Ｍ．Ｂｅｒｇｅｒ，ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ，６２巻３１９頁：１９７９年）ウサギを
ウシ血清アルブミン結合ビオチンで免疫して調製し、ア
フィニティークロマトグラフィ−により精製する。免疫
グロブリン−ハプテンの会合定数はＫａｓｓｎ１０6 か
ら１０10という値でアビジン−ビオチン複合体に対する
よりかなり低いが、アビジン−イミノビオチン複合体で
観察されるものと実質的に同等である。さらに、抗ビオ
チン抗体はクロマチン物質との非特異的結合があるとし
ても少ないのでその場所でのハイブリダイゼーションに
よる染色体上の特定ポリヌクレオチド配列を検出するの
に非常に有用であることがわかった。
【００２７】米国特許第４，７１１，９５５号の発明の
修飾ポリヌクレオチドはハイブリッド形成プローブとし
ての使用と両立する条件下で変性および再生することが
できる。いくつかのビオチン置換ＤＮＡおよびＲＮＡポ
リマーの熱変性プロフィルおよびハイブリダイゼーショ
ン特質の分析がこれを明確に示している。例えば、キロ
ベース当りおよそ１０〜１００個のビオチン残基を導入
して修復されたｐＢＲ３２２ＤＮＡまたはλＤＮＡはビ
オチン非含有の対照ＤＮＡと本質的に同じＴｍ値を有す
る。さらに、32Ｐ−標識のビオチン置換ｐＢＲ３２２Ｄ
ＮＡはこのプラズミドを含む細胞コロニーを検出するハ
イブリダイゼーションプローブとして用いた時チミジン
含有の対照ＤＮＡと同じ程度の比活性とオートラジオグ
ラフィー信号強度とを示した。一方の鎖の全てのチミジ
ン残基（全体として５ｋｂ当り１２５０）をビオチンヌ
クレオチドで置換した例えばＭＶＭ ＲＦ ＤＮＡのよ
うな二重鎖ＤＮＡに於いて、Ｔｍ値は非置換の対照ＤＮ
ＡのＴｍより５℃低いだけである。各塩基対がビオチン
−ｄＵＭＰ残基を含むポリｄ（Ａ−ビオチンＵ）のＴｍ
はポリｄ（Ａ−Ｔ）対照より１５℃低いが、変性および
再生中に観察される共同性の程度および深色化の度合は
２つのポリマーで同じであった。二重鎖ＲＮＡおよびＤ
ＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの比較分析でポリマー中のビ
オチン含量が増加するにつれてＴｍ値は低下することが
わかる。しかし、ポリマーのハイブリッド形成化の特質
を有意に変えることなくかなりの数のビオチン分子を導
入することが出来るのは明かである。これらの結果はビ
オチン置換ポリヌクレオチドが染色体、固定細胞或いは
組織分画中の特定ポリヌクレオチド配列を検出しそして
／または位置を定めるためのプローブとして利用できる
ことを強く示唆している。ビオチン置換プローブの検出
のための一般的プロトコールを以下に図示する。コロニ
ーハイブリダイゼーションまたはノーザン／サザンハイ
ブリダイゼーション法によるプローブ検出のプロトコー
ル
【化２４】この一般スキームは遺伝子マッピング（細胞
遺伝学）および組換えＤＮＡ技術 に用いられる手法のみを示している。しかし、これは臨
床サンプル中のバクテリア、ウイルス或いは病原菌由来
の核酸配列の検出にも同様に十分応用できるもので、こ
れは放射性同位元素に依存しない臨床診断の強力な新し
いアプローチの基本を成す。ビオチン検出のための免疫
学的および組織化学的方法は、その場のハイブリッド形
成化による遺伝子地図作成の迅速法およびブロットハイ
ブリダイゼーション法による特異核酸配列検出のための
非放射活性法に使用し得る基本的アプローチを提供す
る。本技術を用いて新しい臨床診断方法の開発もできよ
う。本アプローチを用いて特異ＤＮＡ又はＲＮＡ分子、
特に例えば細菌、カビ、ウイルス、酵母または哺乳類な
ど生物から由来する分子の存在を決定することが可能で
ある。
【００２８】さらに、細菌の抗生物質耐性を決定する検
索のための方法も提供する。即ち、例えば、Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはｎｅｉｓｓ
ｅｒｉｓ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのペニシリン耐
性、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ，Ｃ
ａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｒｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ又はｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏ
ｎｏｒｒｈｏｅａｅのテトラサイクリン耐性およびｍｙ
ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの
アミノグリコシド耐性を決定することが出来る。これら
の方法では、その生物の抗生物質耐性を支配する核酸配
列に相補的であり、さらに米国特許第４，７１１，９５
５号の発明による修飾ヌクレオチドを１個又はそれ以上
含むポリヌクレオチドを調製する。このポリヌクレオチ
ドを検査している微生物から得られる核酸とハイブリッ
ド形成する。ハイブリッド形成をしないということはそ
の微生物或いは耐性特質を欠いていることを示す。ハイ
ブリッド形成した核酸二重鎖は検出可能成分をもつ適当
なポリペプチドと複合体を形成させて同定し、適当な検
出方法を用いてその複合体の存在を検出する。陽性で検
出されるということは複合体が、二重鎖が、従って注目
している核酸配列が、存在することを示す。このアプロ
ーチは地中海貧血および鎌状赤血球貧血症のような遺伝
病の診断にも拡大され得る。その存在、非存在（地中海
貧血の場合）がその疾患に関連するＤＮＡ遺伝子配列を
米国特許第４，７１１，９５５号の発明によるポリヌク
レオチドプローブとハイブリダイズした後適当な検出可
能なポリペプチドと複合体形成することに基づく検出を
行なうことができる。
【００２９】遺伝子の地図作成および遺伝子の染色体上
の特定位置決定はこれまで厭な時間のかかる仕事で主に
細胞融合と融合細胞の遺伝学の技術を用いるものであっ
た。その場のハイブリダイゼーションはＤｒｏｓｏｐｈ
ｉｌａのような染色体が多系性の種の単コピー遺伝子配
列の地図作成への使用は成功しているが、ほとんどの高
等真核細胞染色体での特有配列遺伝子の検出は標準ハイ
ブリダイゼーション法を用いて、不可能でないとしても
非常に困難であった。ハイブリダイゼーションの箇所を
効率よくオートラジオグラフィーにより位置決定するに
は非常に高い放射比活性を持つポリヌクレオチドプロー
ブが必要であり、その結果、プローブの放射分解が速
く、同時に銀粒子の付着による地のノイズが増加する。
低比活性乃至中庸の比活性の放射活性を有するハイブリ
ダイゼーションプローブを用いるとリボゾームＲＮＡ遺
伝子や付随ＤＮＡのような多コピー配列を検出するので
さえ多くの日数、或いは週の露出時間が必要である。組
み換えＤＮＡ技術により真核細胞に存在する実際上全て
の単コピー配列の分子クローン化が可能となったためそ
のクローンの遺伝子断片の染色体上の由来を地図作成す
るための迅速かつ鋭敏な方法を持つことは非常に有利で
ある。修飾ヌクレオチドはその場のハイブリダイゼーシ
ョンによる遺伝子地図作成の方法に利用され、これは放
射性同位元素の使用に代わるものである。本法はニック
トランスレーションによりＤＮＡプローブ中に酵素的に
取り込まれ得るビオチン含有チミジンアナログの利点を
利用している。ハイブリッド形成の後、ビオチン分子は
アフィニティー精製ウサギ抗ビオチン抗体のための抗原
として作用する。螢光標識した山羊抗ウサギＩｇＧとで
作成した免疫螢光抗体サンドイッチによりクローン遺伝
子配列の迅速かつ特異的細胞遺伝的位置決定が緑黄帯と
して可能となる。本法は従来のその場の遺伝子位置決定
のオートラジオグラフィー法に比して４つの主な利点が
ある。それは地のノイズの減少；バンド間の分解能の増
加：プローブハイブリッド形成の位置決定のために必要
な時間の短縮；およびハイブリッド形成プローブの化学
的安定性である。本法はＤｒｏｓｏｐａｉｌａ ｍｉｌ
ａｎｏｇａｓｔｅｒの多糸性染色体のくり返しの特有Ｄ
ＮＡ配列およびマウスの中期染色体の付随ＤＮＡの位置
決定にうまく応用されている。
【００３０】このように間接免疫螢光により検出する米
国特許第４，７１１，９５５号の発明による修飾ヌクレ
オチドをその場の遺伝子地図作成に用いてプローブの効
率を確立する試験システムに多糸性染色体を用いること
が出来るということがわかった。プローブとしてはＯｔ
ｔｏ ＳｃｈｍｉｄｔおよびＤｉｅｔｅｒ Ｓｏｅｌｌ
により得られたショウジョウバエの各種クローン配列、
例えば約５から約２２キロベースに亘る大きさの挿入を
もつプラズミッドベクターにクローンされたｔＲＮＡの
遺伝子等、が含まれた。これらのクローンの多くは放射
同位元素を用いた従来のハイブリダイゼーション法によ
りショウジョウバエ染色体地図上の特定バンドに既に決
定されている。ＤＮＡプローブはビオチン−ｄＵＴＰ存
在でニックトランスレーションされる。場合によっては
ニックトンスレーション反応液中に 3Ｈ−ｄＡＴＰおよ
び／又は 3ＨｄＣＴＰを加えた。これにより一つの染色
体展開でオートラジオグラフィーおよび免疫螢光法の両
者による配列の位置決定が可能である。その場のハイブ
リダイゼーションはＭ．Ｌ．ＰａｒｄｕｅおよびＪ．
Ｇ．Ｇａｌｌ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉ
ｏｌ １０巻、１頁（１９７５年）に記載されているよ
うに行なった。ハイブリダイズしなかったプローブの２
×ＳＳＣによる最後の洗滌の後スライドをＰＢＳ（りん
酸緩衝生理食塩水）で洗い、１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ加Ｐ
ＢＳ中２．５μｇ／ｍｌのウサギ抗ビオチンと３７℃、
２〜１６時間反応させる。その後、スライドをＦＩＴＣ
標識のヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ加ＰＢＳ中１：
１００に希釈する。）と１〜４時間インキュベートす
る。染色体を螢光発色で見るために赤色平衡色素として
エバンスブルーを時々必要とする。それぞれ５キロベー
スおよび２２キロベースの挿入を含むプラスミッドｐＢ
Ｒ１７ＤおよびｐＰＷ５３９をこの方法によりハイブリ
ダイズすると、ハイブリッド形成のパターンは展開毎に
再現性があり一つのスライドで染色体展開の９０％以上
で明白に観察される。
【００３１】クローン化された転化可能な因子ｐＡＣ１
０４はショウジョウバエのゲノム上で多くの位置にマッ
プすることが知られる。本プローブのその場のハイブリ
ダイゼーションにより得られるオートラジオグラフと螢
光像とを比較すると、本法の主な利点がわかる。即ち、
オートラジオグラフでは銀粒子の拡散部がみられるのに
対し、免疫螢光標識によると二重線又はいくつかのバン
ドが識別できる。本法の他の直接的はっきりした利点
は、間接の免疫螢光により行なう遺伝子の割当てに要す
る時間が非常に軽減することである。ＤＮＡ断片の特定
バンドへの割付けは６時間以内のハイブリッド形成で行
なうことができる。これはオートラジオグラフィー露出
の何日、何週間に匹敵する。この要因と分解能の増加と
により間接免疫螢光により検出される修飾ヌクレオチド
の利用が古典的方法よりも直ちにより好ましいものとし
ている。この免疫法はまた哺乳動物染色体にも用いられ
ることがわかっており、付随ＤＮＡがマウス中期染色体
の動原体地域に位置づけられている。その結果はヒトお
よび他の哺乳動物染色体の単コピー（特異）配列を簡単
に遺伝子マッピングする方法開発のための基礎を提供す
る。そのような方法により染色体の遺伝的構成の理解が
大いに深まり、臨床細胞遺伝的診断がより迅速でかつ実
用的になる。
【００３２】染色体展開にハイブリッド形成後にウサギ
抗ビオチンＩｇＧを反応させる一般抗体サンドウイッチ
法は成功かもしれないがこのプロトコールははっきりし
た遺伝子割付けに十分な蛍光を発生しないかも知れな
い。しかし、１９７２年Ｌａｍｍらにより又１９７４年
Ｗｏｆｓｙらにより記載される“ハプテン−抗体サンド
イッチ法”を用いることによりより強い蛍光信号を達成
することができる。この手法では一次抗体、我々の例で
は単一特異性のウサギ抗ビオチンＩｇＧ、を例えば２，
４−ジニトロフルオロベンゼンのようなハプテン化試薬
で、好ましくは免疫グルブリンが抗原親和カラム（ビオ
チン−セファロースＴＭ）に結合している間に、化学的
修飾を行なう。１５〜２０もの多くのハプテン（ＤＮ
Ｐ）基が抗原結合の親和性や特異性を低下することなく
一次抗体に連結され得る（ＷａｌｌａｃｅおよびＷｏｆ
ｓｙ（１９７９年））。もし試験サンプルの一次抗体処
理の後、蛍光標識した抗ＩｇＧでなく蛍光標識した抗−
ハプテンＩｇＧを反応させると、５〜７倍増加した蛍光
信号が達成できる。単一特異性のモルモット抗−ＤＮＰ
ＩｇＧも又入手可能であるのでこの二次抗体もビオチン
とハプテン化することが出来、その結果、ＤＮＰ−標識
抗ビオチンＩｇＧおよびビオチン標識抗ＤＮＰＩｇＧの
２つの抗ハプテンＩｇＧ集団を得る。もしこれらを交代
に用いてハプテン−抗体サンドイッチの何回かを行な
い、続いて多くの哺乳動物種からのＩｇＧと特異的に結
合するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓか
らの蛍光標識たん白Ａと行なうと一次抗体信号の莫大な
増幅と同時に利用性の増加となる。
【００３３】Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎ
ｉから得られるたん白ストレプトアビジンは連結可視化
システム〔たとえば蛍光プローブ或いは組織化学的試
薬〕をハイブリッド形成したビオチン含有ポリヌクレオ
チドの位置まで特異的に導く運搬役として抗ビオチンＩ
ｇＧの代りとなり得る。ストレプトアビジンの抗ビオチ
ンＩｇＧに対する利点の一つはビオチンに対する親和性
がＫａｓｓｎ＝１０15であり、一方ハプテン−ＩｇＧと
の相互作用の会合定数は１０7 から１０10である点であ
る。反応速度が速いことと親和性が非常に高いというの
はビオチン化したプローブを局在させるのに要する時間
が免疫試薬で数時間であるのに対してストレプトアビジ
ンで数分であることを示す。ストレプトアビジン検出シ
ステムの最初の評価は現在進行中である。ビオチン化Ｄ
ＮＡプローブとハイブリッド形成したポリテン染色体を
ストレプトアビジンと反応させ、続いてビオチンとＦＩ
ＴＣで二重標識したウシ血清アルブミン（ＦＩＴＣ、ビ
オチン−ＢＳＡ）とインキュベートする。ストレプトア
ビジンの４個のサブユニットの内１個のみが各ビオチン
化ＤＮＡ部位との結合に関与しているらしいためストレ
プトアビジン−ビオチンヌクレオチド複合体の残りの３
個の非結合サブユニットのそれぞれに１個の標識ＢＳＡ
分子が潜在的には結合可能である。この１個のストレプ
トアビジン＋ＦＩＴＣ、ビオチンＢＳＡ層からの蛍光シ
グナルを前述の基本的“抗体サンドイッチ法”を用いて
対照と比較する。
【００３４】もし“抗体サンドイッチ法”とストレプト
アビジン＋ＦＩＴＣ、ビオチンＢＳＡ検出の強度が匹敵
するものであれば、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ、ビ
オチンＢＳＡシステムを多重“ハプテン−抗体サンドイ
ッチ”アプローチと同じような方法で単一コピー感度を
高める試みが出来る。ＢＳＡ上のビオチン基のいくつか
はストレプトアビジンの第一層と結合しないので、十分
なシグナルが得られるまでストレプトアビジンの第二層
を加える。例えば、もし第二層でただ２個のストレプト
アビジンサブユニットが各第一層ＢＳＡと結合し、これ
らのストレプトアビジンサブユニットのそれぞれが３個
のＦＩＴＣ−ビオチンＢＳＡ分子と結合するなら、第二
層の強度は第一層のシグナルの２倍の強さとなり、第三
層は類似の結合化学量論で蛍光強度は第一層の１２倍に
なる。従って総強度は連続に加えた層に従って急速に増
加する。結合する蛍光およびビオチンプローブの量を最
大にするためにＢＳＡでなく甲状腺グロブリンのような
より大きい担体たん白を使用する計画もある。さらに、
ビオチンプローブと担体たん白の間により長いリンカー
鎖を使用することも必要かも知れない。長いリンカー鎖
はビオチン化蛍光担体分子をストレプトアビジンの各非
結合サブユニットへの理論的移動を立体的に最適化し、
次の層でビオチン化蛍光担体と結合するストレプトアビ
ジンのサブユニットの数を最大とする。以前と同様に、
担体たん白の蛍光プローブおよびビオチンでの置換が溶
解性および／または非特異的結合の問題を起こさないよ
う適当な調整が成される。ストレプトアビジン担体たん
白の運搬システムはその運搬速度に加えて免疫蛍光法に
くらべて２つの有意な利点を有している。第一に、層形
成にたった２つのたん白成分が必要であること。第二に
担体たん白のみが修飾される必要があり、ビオチン基が
ストレプトアビジンに接触可能である限り、機能上或い
は全構造的完全を維持する必要がない。
【００３５】ハイブリッド形成したプローブの可視化の
ための蛍光法の代用としてペルオキシダーゼ、アルカリ
フォスターゼ又はβ−ガラクトシダーゼのような酵素を
ハイブリッド形成の部位に導き、そこで可溶性基質を不
溶性の着色沈でんに酵素的に変換して光学顕微鏡で見え
るようにすることができる。この技法の重要な利点は組
織化学法が蛍光検出より１０乃至１００倍感度が高いこ
とである。その上、着色沈でん物は過激な露光でも退色
せず、従って蛍光顕微鏡での一般的欠点の一つを避ける
ことができる。これらの酵素は“ハプテン抗体サンドイ
ッチ”法で蛍光プローブの代りに最終抗体と共役し、そ
の際グルタルアルデヒドのような二官能試薬を用い、或
いはペルオキシダーゼの場合にはペルオキシダーゼの炭
水化物部分をアルデヒドに酸化し、そしてこれらの残基
を望むたん白のε−アミノ基と共役させる。ストレプト
アビジン−ビオチン化担体たん白法では、ビオチン基と
共役した酵素は蛍光−ビオチン化担体システムと置き代
えることが出来た。代りとして、酵素はビオチンを通し
てストレプトアビジンの最終層と共役し、ビオチン化Ｂ
ＳＡ或いは甲状腺グロブリンを用いてそれ以前の層でス
トレプトアビジンの部位の増幅ができる。近い将来、必
要な組織化学試薬と、その場のハイブリッド形成の基底
値のない可視化のための適当な基質／不溶性産物の組み
合わせの開発を始める。シグナル増幅の組織化学的アプ
ローチは従って１９８１年の夏には試験できる筈であ
る。非常の低レベルの蛍光を検出しそして／または像形
成することは現在入手可能な像増強装置或いはレーザー
と光電子増倍装置より成るシステムを用いることにより
可能である。これらの方法により個々の光子のレベルも
の低い光の検出が可能である。適合した数字処理システ
ムにより像の各点、即ち、各図がその物の点から放出す
る光子の数に完全に相関しているような像を形成するこ
とが出来る。このようなシステム或いはセル又はセルの
部分がレーザー光線を通って流れるようなフローシステ
ムを用いることにより目で検出できるよりも１００〜１
０００倍で蛍光物質の感度を増加することが出来る。こ
の増加は単コピー遺伝子の蛍光を検出するのに十分なも
のである。望ましい修飾としてピリミジン環のＣ５位に
アリルアミンの連結鎖を通してビオチン分子が共有結合
しているｄＵＴＰおよびＵＴＰのアナログが合成されて
いる。これらのビオチン化ヌクレオチドは試験管内で各
種ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼの基質として効率よ
く働く。低レベルのビオチン置換を有するＤＮＡ（キロ
ベース当り５０分子以下）は非置換の対照ＤＮＡを区別
出来ない変性、再会合およびハイブリッド形成の特性を
有する。
【００３６】さらに米国特許第４，７１１，９５５号の
発明は染色体の核型分析の方法をも提供する。本法では
わかっている遺伝子に対応し、修飾ヌクレオチドを含む
修飾ポリヌクレオチドを調製する。出来たポリヌクレオ
チドを染色体ＤＮＡとハイブリッド形成させ、生成する
二重鎖を適当な条件下で特定のポリペプチドと接触させ
て複合体形成をさせる。ポリペプチドは検出可能な部分
を含有し、そのため複合体の位置が決定でき、それによ
り特定遺伝子の位置が決定できる。米国特許第４，７１
１，９５５号の発明の他の実例としてはウラシル塩基の
いくつかをプローブを含有するように修飾してあるポリ
Ｕを用いてポリＡ含有配列を検出することが挙げられ
る。さらに他の実例として環状修飾ヌクレオチドがあ
り、該環状修飾ヌクレオチドでｘ，ｙ，ｚの中の２つは
次に示す環状部を形成するように反応する。
【化２５】このような環状修飾ヌクレオチドは細胞表層
のホルモン受容体の検出に用いられ 、またガン或いは腫瘍細胞検出法としても利用できる。
最後に、米国特許第４，７１１，９５５号の発明により
修飾され、α−胎児たん白或いは発がん抗原のようなそ
の存在がある腫瘍細胞の診断となるポリペプチド合成に
関与しているＤＮＡ遺伝子配列から合成されるｍＲＮＡ
に相補性のポリヌクレオチドを調製することにより腫瘍
細胞を診断することができる。このようにしてハイブリ
ッド二重鎖のハイブリッド形成と検出により腫瘍細胞の
検出法を提供できる。
【００３７】以下に記載する参考例は米国特許第４，７
１１，９５５号の発明のいろいろな局面の実例を示すも
のであるが、特許請求の範囲に特に述べた範囲を決して
制限するものではない。
【００３８】参考例１及び２ ビオチニル−ＵＴＰ及びビオチニル−ｄＵＴＰの合成 ａ） 水銀化ヌクレオチド類の調製 ＵＴＰ（５７０ｍｇ、１．０ｍ ｍｏｌｅ）又はｄＵＴ
Ｐ（５５４ｍｇ、１．０ｍ ｍｏｌｅ）を１００ｍｌの
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０に溶解し、酢
酸水銀（１．５９ｇｍ、５．０ｍ ｍｏｌｅｓ）を添加
した。溶液を５０℃で４時間加熱し、次いで氷上にて冷
却した。塩化リチウム（３９２ｍｇ、９．０ｍ ｍｏｌ
ｅｓ）を加え、溶液を等量の酢酸エチルで６回抽出し、
過剰のＨｇＣｌ2 を除いた。抽出操作の効率を、４，
４′−ビス（ジメチルアミノ）−チオベンゾフェノン
（Ａ．Ｎ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｅｒ、Ａｎａｌｙｓｔ、９
４、３９２（１９６９））を用いて有機溶媒層中の水銀
イオン濃度を概算することによりモニターした。Ｄａｌ
ｅ等（Ｒ．Ｍ．Ｋ．Ｄａｌｅ、Ｄ．Ｃ．Ｗａｒｄ、Ｄ．
Ｃ．Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ、ａｎｄ Ｅ．Ｍａｒｔｉ
ｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２、９１５
（１９７５））の記載にある如く水溶液の一部のヨード
化の後、分光光度計で決定した、ヌクレオチド、水銀化
の程度は、通常９０から１００％の間であった。しばし
ば、酢酸エチル抽出中に濁って来る、水層中のヌクレオ
チド産物を、三倍量の氷冷エタノールを添加して沈澱さ
せ、遠沈により集めた。沈澱を冷無水アルコールで二
回、エチルエーテルで一回洗滌し、次いで風乾した。こ
れら、この様にして調製した、水銀化ヌクレオチド類
を、さらに精製せずに、アリルアミン−ヌクレオチド類
の合成に使用した。ｂ） アリルアミン−ｄＵＴＰ及びアリルアミン−ＵＴ
Ｐの合成 水銀化ヌクレオチド類（方法ａ）の）を、０．１Ｍ酢酸
ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０に溶解し、濃度を２０ｍＭ
（２６７ｎｍで２００ ＯＤ／ｍｌ）になるように調整
した。新らしい、酢酸水溶液中の酢酸アリルアミン２．
０Ｍ溶液を、８．５ｍｌの氷冷４Ｍ酢酸に１．５ｍｌの
アリルアミン（１３．３ｍ ｍｏｌｅｓ）をゆっくり加
えることにより調製した。３ｍｌ（６．０ｍ ｍｏｌｅ
ｓ）の中和したアリルアミン貯蔵液を２５ｍｌ（０．５
ｍ ｍｏｌｅ）のヌクレオチド溶液に添加した。４ｍｌ
の水に溶解した、１ヌクレオチド等量のＫ2 ＰｄＣｌ4
（１６３ｍｇ、０．５ｍ ｍｏｌｅ）を、次いで加え、
反応を開始した。パラジウム塩（Ａｌｆａ−Ｖｅｎｔｒ
ｏｎ）の添加に伴って、溶液は、反応容器壁に析出し始
める金属（ＨｇとＰｄ）で、次第に黒色を呈するように
なった。室温で１８〜２４時間放置後、反応液を、０．
４５ｍｍメンブレンフィルター（ｎａｌｇｅｎｅ）に掛
け残留する大部分の金属沈澱を除いた。黄色の濾過液を
５倍稀釈し、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＴＭＡ−２
５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の１００ｍｌカラムにかけ
た。１カラム等量の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ
５．０で洗滌後、産物を、酢酸ナトリウムｐＨ〜８〜
９、又はトリエチルアンモニウムバイカーボネート（Ｔ
ＥＡＢ）ｐＨ７．５の１リットル直線勾配法（リニアー
・グラジエント）で溶出した。目的の産物は０．３０と
０．３５Ｍ間の塩濃度で溶出して来る、主要紫外部吸収
部分に存在した。分光分析の結果、このピークには幾つ
かの産物が含まれていて、最終的精製を、Ｐａｒｔｉｓ
ｉｌ−ＯＤＳ２カラムの逆相−ＨＰＬＣクロマトグラフ
ィーで、０．５Ｍ ＮＨ4 Ｈ2 ＰＯ4 緩衝液ｐＨ３．３
（分析用分離）、又は０．５Ｍ酢酸トリエチルアンモニ
ウムｐＨ４．３（調製用分離）を溶出溶媒として、行っ
た。５−（３−アミノプロペン−１−イル）ウリジン
（ウリジンのアリルアミン付加物）の５′−三燐酸化物
が、ＨＰＬＣカラムから溶出されて来る最終部分であ
り、それらは、未同定の三つの汚染物質からは、はっき
りと分離していた。これらのヌクレオチドを、陽子核磁
気共鳴元素分析で特性ずけを分光及びクロマトグラフ法
により行った〔ＡＡ−ｄＵＴＰ（Ｃ12Ｈ16Ｎ3 Ｏ14Ｐ3
Ｎａ4 ・１Ｈ2 Ｏ）：理論値Ｃ，２２．９１；Ｈ，２．
８８；Ｎ，６．６８；Ｐ，１４．７７。実測値Ｃ，２
３．１０；Ｈ，２．８５；Ｎ，６．４９；Ｐ，１４．７
５。ＡＡ−ＵＴＰ（Ｃ12Ｈ16Ｎ3 Ｏ15Ｐ3 Ｎａ4 ・４Ｈ
2 Ｏ）：理論値Ｃ，２０．６１；Ｈ，３．４６；Ｎ，
６．０１；Ｐ，１３．３。実測値Ｃ，２０．６７；Ｈ，
４．１１；Ｎ，５．３９；Ｐ，１３．５４〕。ｃ） ＡＡ−ｄＵＴＰ又はＡＡ−ＵＴＰのビオチン化 ビオチニル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル（Ｎ
ＨＳＢ）を前述の方法に従って（Ｈ．Ｈｅｉｔｚｍａｎ
ｎ ａｎｄ Ｆ．Ｍ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７１、３５３７
〔１９７４〕）ビオチン（Ｓｉｇｍａ）より調製した。
ＡＡ−ｄＵＴＰ・Ｈ2 Ｏ（６３ｍｇ、０．１ｍ ｍｏｌ
ｅ）又はＡＡ−ＵＴＰ・４Ｈ2 Ｏ（７０ｍｇ、０．１ｍ
ｍｏｌｅ）を２０ｍｌの０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩
衝液ｐＨ８．５に溶かし、２ｍｌのジメチルフォルムア
ミドに溶かしたＮＨＳＢ（３４．１ｍｇ、０．１ｍ ｍ
ｏｌｅ）を添加した。反応混液を４時間室温に放置し、
次いで前もって、０．１Ｍ ＴＥＡＢ ｐＨ７．５で平
衡化しておいたＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＴＭ Ａ
−２５の３０ｍｌカラムに直接充てんした。カラムを４
００ｍｌのＴＥＡＢの直線勾配（０．１−０．９Ｍ）法
で溶出した。０．５５と０．６５Ｍ ＴＥＡＢの所で溶
出して来た、ビオチニル−ｄＵＴＰ又はビオチニル−Ｕ
ＴＰを含む画分を、メタノールと再留水の存在下に回転
蒸発を行って脱塩した。時折やや白濁した溶液が得られ
た：或るＴＥＡＢ溶液中の夾雑物に由来する、この濁り
を０．４５ｍｍフィルタを通す濾過により除去した。長
期保存用には、ヌクレオチド類を、Ｄｏｗｅｘ ＴＭ５
０（Ｎａ+ 型）の存在下に短時間攪拌することによりナ
トリウム塩に変換した。濾過後、ヌクレオチドを、３倍
量の冷エタノール添加で沈澱させ、エチルエーテルで洗
い、水酸化ナトリウムペレット上で減圧下乾燥し、−２
０℃で、デシケーターに貯蔵した。すぐに使用する場合
は、ヌクレオチド溶液をトリス−塩酸ｐＨ７．５中で２
０ｍＭとし、最終ヌクレオチド濃度を５ｍＭになるよう
調整した。貯蔵液は、−２０℃で凍結保存した。ビオ−
ｄＵＴＰとビオ−ＵＴＰ産物の元素分析結果は以下の通
りであった。ビオ−ｄＵＴＰ（Ｃ22Ｈ30Ｎ5 Ｏ18Ｐ3 Ｓ
1 Ｎａ4 ・１Ｈ2 Ｏ）。理論値：Ｃ，２９．８０；Ｈ，
３．３８；Ｎ，７．８９；Ｐ，１０．４７；Ｓ，３．６
１。実測値；Ｃ，３０．１４；Ｈ，３．２２；Ｎ，７．
６３；Ｐ，１０．３１；Ｓ，３．７０。ビオ−ＵＴＰ
（Ｃ22Ｈ30Ｎ5 Ｏ19Ｐ3 Ｓ1 Ｎａ4 ・３Ｈ2 Ｏ）；理論
値；Ｃ，２９．１５；Ｈ，３．１９；Ｎ，７．４５；
Ｐ，９．８９；Ｓ，３．４１。実測値；Ｃ，２８．７
６；Ｈ，３．３５；Ｎ，７．６８；Ｐ，９．８１；Ｓ，
３．３２。ｐＨ７．５下のビオ−ｄＵＴＰ及びビオ−Ｕ
ＴＰのスペクトル特性〔λmax 、２８９ｎｍ（ε＝７，
１００）；λmax 、２４０ｎｍ（ε＝１０，７００）；
λmin 、２６２ｎｍ（ε＝４，３００）〕はピリジン環
と共役した、環外二重結合の存在を反映している。これ
らヌクレオチド類は、ビオチン定量に使う方法（Ｄ．
Ｂ．ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ａｎｄ Ｊ．Ａ．Ｒｏｔｈ、
Ａｒａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３４、３２６、１９７
０）である、エタノール性硫酸中、ｐ−ジメチルアミノ
シンナムアルデヒドで処理すると、強い陽性反応（橙−
赤色）を示す。しかしながら、それらは出発物質ＡＡ−
ｄＵＴＰやＡＡ−ＵＴＰに特有の反応である、ニンヒド
リンとは、最早反応しない。
【００３９】参考例３及び４ ビオチニル−ＣＴＰ及びビオチニル−ｄＣＴＰの合成 ＣＴＰ及びｄＣＴＰを、特に参考例１に述べた如く、
ａ）水銀化し、ｂ）アリルアミンと反応させ、そして
ｃ）ＮＨＳ−ビオチンでビオチン化した。ＣＴＰ（５
６．３ｍｇ、０．１ｍ ｍｏｌｅ）又はｄＣＴＰ（５
９．１ｍｇ、０．１ｍｍｏｌｅ）を、２０ｍｌの０．１
Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０に溶解し、酢酸水銀
（０．１５９ｇｍ、０．５ｍ ｍｏｌｅｓ）を添加し
た。溶液を５０℃で４．５時間加熱し、次いで氷上で冷
却した。塩化リチウム（３９．２ｍｇ、０．９ｍ ｍｏ
ｌｅｓ）を加え、その溶液を酢酸エチルで６回抽出し
た。水層のヌクレオチド産物を三倍量の冷エタノールの
添加で沈澱させ、沈澱を遠沈により集めた。沈澱を無水
エタノール、エチルエーテルで洗滌し、次いで乾燥し
た。これら生成物は、それぞれＡＡ−ＣＴＰ及びＡＡ−
ｄＣＴＰの合成に更に精製することなしに使用した。水
銀化ヌクレオチド類を、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ５．０に溶かし、濃度を１０ｍＭ（２７５ｎｍで９
２ ＯＤ／ｍｌ）に調整した。０．６ｍｌ（１．２ｍ
ｍｏｌｅ）の２．０Ｍ酢酸アリルアミン貯蔵液（参考例
１に記載した如く調製）を、１０ｍｌのヌクレオチド溶
液（０．１ｍ ｍｏｌｅ）に加え、次いで１．０ｍｌの
水に溶かしたＫ2 ＰｄＣｌ4 （３２．６ｍｇ、０．１ｍ
ｍｏｌｅ）を添加した。２４時間室温放置後、溶液を
０．４５ｍＭメンブレンで濾過し、金属沈澱物を除い
た。濾液を５−倍稀釈し、前もって５０ｍＭ ＴＥＡＢ
ｐＨ７．５で平衡化した、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ａ−２５の５０ｍｌカラムに充てんした。ヌクレオチ
ド産物を、ＴＥＡＢ ｐＨ７．５の５００ｍｌ直線勾配
（０．０５−０．６Ｍ）法で分画した。目的の産物は、
０．２８と０．３８Ｍ間の塩濃度で溶出する主要紫外部
吸収部分に含まれていた。プールした試料を回転蒸発で
脱塩、０．５Ｍ酢酸トリエチルアンモニウムｐＨ４．２
に溶かし、最終的精製を、０．５Ｍ酢酸トリエチルアン
モニウムを溶出液として、Ｐａｒｔｉｓｉｌ ＯＤＳ−
２のカラムを用いたＨＰＬＣクロマトグラフィーで行っ
た。適当な画分をプールし、凍結乾燥し、そして生成物
をＨ2 Ｏに溶解した。ヌクレオチド類を、Ｄｏｗｅｘ
ＴＭ５０（Ｎａ+ 型）の存在下で短時間攪拌し、Ｎａ+
塩に変換した。濾過してＤｏｗｅｘ樹脂を除去後、ヌク
レオチド類を３倍量の冷エタノールを加えて沈澱させ
た。沈澱をエーテルで洗い、次いで風乾した。分析結
果：ＡＡ−ｄＣＴＰ（Ｃ12Ｈ17Ｎ4 Ｏ13Ｐ3 Ｎａ4 ・２
Ｈ2 Ｏ）：理論値、Ｃ，２２．２９；Ｈ，２．６３；
Ｎ，８．６７；Ｐ，１４．４０。実測値Ｃ，２２．１
６；Ｈ，２．８９；Ｎ，８．７７；Ｐ，１４．１８。 ＡＡ−ＣＴＰ（Ｃ12Ｈ17Ｎ4 Ｏ14Ｎａ4 ・２Ｈ2 Ｏ）：
理論値Ｃ，２１．７５；Ｈ，２．５７；Ｎ，８．４６；
Ｐ，１４．０１。実測値，Ｃ，２２．０３；Ｈ，２．４
７；Ｎ，８．６９；Ｐ，１３．８１；０．１Ｍホウ酸緩
衝液ｐＨ８．０中でのスペクトル特性、λmax ３０１ｎ
ｍ（ε＝６，４００）、λmin ２７１ｎｍ（ε＝３，９
５０）、λmax ２５０ｎｍ（ε＝９，７００）。ＡＡ−
ｄＣＴＵとＡＡ−ＣＴＰは両者共ニンヒドリン試験陽性
だった。ＡＡ−ＣＴＰ（６．６ｍｇ、０．０１ｍ ｍｏ
ｌｅ）又はＡＡ−ｄＣＴＰ（６．４ｍｇ、０．０１ｍ
ｍｏｌｅ）を５ｍｌの０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ８．５に溶かし、０．２ｍｌのジメチルフォルムア
ミドに溶かした。ＮＨＳ−ピオチン（３．４ｍｇ、０．
０１ｍ ｍｏｌｅ）を加えた。４時間室温放置後、試料
を、ＴＥＡＢ ｐＨ７．５を溶出液とした１５０ｍｌ直
線勾配（０．１−０．９Ｍ）法を用いて、ＤＥＡＥ−Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ Ａ−２５の１０ｍｌカラムでクロマト
グラフを行った。０．５０と０．６０Ｍ ＴＥＡＢ間に
溶出して来たビオチニル−ＣＴＰ又はビオチニル−ｄＣ
ＴＰを含む画分を、回転蒸発で脱塩し、そして０．０２
Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５中に、最終濃度が５ｍ
Ｍになる様に調整した後、−２０℃で凍結した。生成物
は、エタノール性硫酸中でｐ−ジメチルアミノシンナム
アルデヒドを用いたビオチン検出反応に強い陽性を示し
たが、ニンヒドリンを噴霧した際の第１級アミン試験に
は陰性を示した。この生産物のより詳細な構造上の特性
につき目下検討中である。
【００４０】参考例５及び６ イミノビオチニル−ＵＴＰとイミノビオチニル−ｄＵＴ
Ｐの合成 イミノビオチンを既報の通り（Ｋ．Ｈｏｆｍａｎｎ、
Ｄ．Ｂ．Ｍｅｌｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｖ．ｄｕ Ｖｉｇ
ｎｅａｕｄ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１４１２０７
−２１１、１９４１；Ｋ．Ｈｏｆｍａｎｎ ａｎｄ
Ａ．Ｅ．Ａｘｅｌｒｏｄ、Ｉｂｉｄ．、１８７、２９−
３３、１９５０）ビオチンから調製した。イミノビオチ
ンのＮ−ヒドロキシサクシニミド（ＮＨＳ）エステル
を、ＮＨＳ−ビオチンの合成法に関する既報（Ｈ．Ｈｅ
ｉｔｚｍａｎｎ ａｎｄ Ｆ．Ｍ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７１、
５５３７、１９７４）のプロトコールを用いて調製し
た。参考例１（ｂ部分）に詳細を述べた方法で調製し
た、ＡＡ−ＵＴＰ（７．０ｍｇ、０．０１ｍ ｍｏｌ
ｅ）又はＡＡ−ｄＵＴＰ（６．３ｍｇ、０．０１ｍ ｍ
ｏｌｅ）を、５ｍｌのホウ酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．
５に溶解し、ジメチルフォルムアミド０．５ｍｌに溶か
したＮＨＳ−イミノビオチン（３．５ｍｇ、０．０１ｍ
ｍｏｌｅ）を加えた。反応混液を１２時間室温に放置
し、次いで前もって０．０５Ｍ ＴＥＡＢ ｐＨ７．５
で平衡化しておいた、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ
−２５の１０ｍｌカラムに直接充てんした。カラムをＴ
ＥＡＢの１５０ｍｌ直線勾配法（０．０５−０．６Ｍ）
により溶出した。ＴＥＡＢ０．３５と０．４０Ｍの間で
溶出して来た、イミノビオチン−ＵＴＰ又はイミノビオ
チン−ｄＵＴＰを、メタノールの存在下で回転蒸発によ
り脱塩し、Ｈ2 Ｏに溶解した。生産物は、ニンヒドリン
試験で弱い陽性を示す結果から判断して、少量のアリル
アミン−ヌクレオチド付加物を不純物として含んでい
た。最終的精製は、アビデイン−セファロースの親和
（アフィニティ）クロマトグラフィーにより行った。ホ
ウ酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．５中、０．１Ｍにした、
不純物を含む画分をアヴィディン−セファロースの５ｍ
ｌカラムにかけ、２５ｍｌの同緩衝液で洗滌した。次い
でカラムを５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ４．０
で洗滌し、目的のイミノビオチン−ヌクレオチド産物
を、鋭いピークとして溶出した。ヌクレオチドを３倍量
の冷エタノール添加で沈澱させ、エチルエーテルで洗
い、水酸化ナトリウムペレット上で減圧下に乾燥し、−
２０℃でデシケーターに保存した。生産物を元素分析、
スペクトル及びクロマトグラフよりの性質より、特性化
した。
【００４１】参考例７及び８ ＮＡＧＥ−ＵＴＰ及びＮＡＧＥ−ｄＵＴＰの合成 アリル（３−アミノ−２−ヒドロキシ−）プロピルエテ
ール、ＮＡＧＥと略記、をアリルグリシディルエーテル
（Ａｇｅ）（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ
より入手）から調製した。１０ｍｌのＡｇｅ（８４ｍ
ｍｏｌｅ）を９Ｍ水酸化アンモニウムに徐徐に添加（ド
ラフト中で）し、混合液を、６時間、室温に放置した。
余剰アンモニアを減圧下回転蒸発で除去し、粘ちょうな
黄色油状物質を得た。この生産物を陽子核磁気共鳴で分
析した結果、目的の構造を有することが示された。５−
水銀−ｄＵＴＰ（０．１ｍ ｍｏｌｅ）又は５−水銀−
ＵＴＰ（０．２ｍｍｏｌｅ）を２−４ｍｌの０．２Ｍ酢
酸ナトリウム緩衝液に溶かし、使用前酢酸で、ｐＨ５．
０に調整した、１６倍モル濃度過剰のＮＡＧＥを添加し
た。最終的な反応液量（４．３及び８．４ｍｌ）中のヌ
クレオチド濃度はそれぞれ、４３及び４２ｍＭであっ
た。１当量のＫ2 ＰｄＣｌ4 （０．１又は０．２ｍ ｍ
ｏｌｅｓ）を、反応を開始するために添加した。１８時
間室温放置後、反応混液を０．４５μｍＭメンブレンを
通して濾過し、試料を５倍稀釈し、酢酸ナトリウムの直
線勾配法（０．１−０．６Ｍ）を用いて、ＤＥＡＥ−Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ Ａ−２５のカラムでクロマトグラフィ
ーを行った。ＵＶスペクトル及びＰａｒｔｉｓｉｌ Ｏ
ＤＳ−２での特徴的なＨＰＬＣ溶出像（プロフィール）
から判定した、目的生産物を含む画分をプールし、稀釈
し、ｐＨ８．５のアンモニウムビカーボネートの皮相
（シャロー）勾配（０．１−０．５Ｍ）を用いたＤＥＡ
Ｅ−Ｓｅｐｈａｄｅｘでの再クロマトグラフィーによ
り、更に精製した。この条件下でＮＡＧＥ−ｄＵＴＰ
（又はＮＡＧＥ−ＵＴＰ）の大部分を、残りの不純物か
らきれいに分離出来た。陽子核磁気共鳴スペクトルを、
この精製段階でヌクレオチドを凍結乾燥し、Ｄ2 Ｏに再
溶解後、得た。元素分析のため、生産物を相当するナト
リウム塩型に変換した。 典型的分析結果：Ｎａｇｅ−ｄＵＴＰ（Ｃ15Ｈ22Ｎ3 Ｏ
16Ｐ3 Ｎａ4 ・２Ｈ2 Ｏ）、理論値，Ｃ，２４．９９；
Ｈ，３．６３；Ｎ，５．８３；Ｐ，１２．８８：実測
値，Ｃ，２５．３９；Ｈ，３．７１；Ｎ，５．６３；
Ｐ，１２．８８。
【００４２】参考例９ 標識ＤＮＡ配列の利用 Ｉ 核型分析 （ａ） 人間遺伝子ライブラリーから、約１００から２
００のクローンを選択する。それらを前述の如く標識
し、各クローンには、そのハイブリダイゼーション部位
を視覚的に、或いは低光レベルのヴィディオ系で位置決
めをする。特異的配列遺伝子に相当するクローンでは、
これが特定の人間染色体上のクローン化ＤＮＡの位置を
決定する。各染色体につき幾つかのクローンを得る。そ
れぞれ標識したクローンを特定の染色体の同定に使用出
来る。これらを又共同して、４６染色体のそれぞれを、
２２常染色体ペアの１つか又はＸかＹかを同定するのに
使用出来る。標識した一組のクローンを染色体と交配
（ハイブリダイズ）させ、次いで標識に蛍光着色を施す
ことにより、そのクローンセットとその位置を視覚化で
き、特定の色と蛍光を発するようになる。次いで、標識
クローンの第二のセットを使って、第二の蛍光染料を反
応させることが出来る。同じ工程を何回も繰返すことが
できる。この様にしても、もし希望すれば、染色体のそ
れぞれの上の異った、しかし特定の位置の細胞ＤＮＡに
幾組もの蛍光標識を付けることが出来る。これらの標識
を、視覚的、或いはコンピュータ化した自動核型分析に
利用出来る。 （ｂ） 自動核型分析には核染色体上の標識部位の数に
相当するスポットのセットを見出すことにより、４６染
色体のそれぞれの、おおよその位置を同定する目的で、
或るセットのクローンを利用出来る。この様にして、も
し染色体が適当に広がって、さらに解析可能なら、ディ
ジタル化した像のコンピューター解析により、決定する
ことが出来る。もし染色体が適度に広がっていれば、次
いでコンピューター解析を使って、各染色体上の標識し
たスポットの位置ぎめと、配置により、個個の染色体の
それぞれを同定出来る。蛍光スポットを各染色体の特定
の位置に付けることが出来る事実を利用して、その様な
標識のない場合に比し極めて効果的に、手動又は自動核
型分析を行うことが出来る。ＩＩ． 遺伝的疾患の診断 特定の染色体、例えば第２３番目、に特異的に結合する
クローンを選択することにより、例え染色体が中期（メ
タフェース）に濃縮されていなくても、細胞中の特定の
染色体のコピー数を、数えることが出来る。この様に、
胎児細胞を、トリソミ−２１の出生前診断用に取得すれ
ば、万一染色体が中期に濃縮されていなくても診断出来
る。もし必要なら、二組の標識を利用出来る−１つは染
色体２３に特異的で他はその外の、ある染色体というよ
うに。多分、色の違う、二つの標識の比を各細胞で測定
することにより、異常な数の染色体第２３番を示す細胞
を同定出来る。この方法を低光レベルヴィデオ系を用い
たスライド上でも、又はレーザー励起を利用した流動血
球計算器にも利用出来る。如何なる異常染色体数の決定
にも利用出来る。ＩＩＩ． 微生物検出及び同定 上述の如く、ＤＮＡの特定の配列を標識することにより
各細菌の同定と計数が可能である。特定のＤＮＡ切片が
ハイブリダイゼーションする個々の細菌を同定するに
は、感度が単一の標識構造を検出できるほどでなければ
ならない。このことは低光レルビデオ系と像のコンピュ
ーター集計、又は光像を増強する何らかの他の装置を使
って行うことができる。流動系も又、もし感度を充分大
きく出来れば利用可能である。もし細菌をスライド上に
固定すれば、それらの位置を定め、その様な蛍光スポッ
トの計数が出来る。このことから用いた特定のクローン
とハイブリダイズ出来るＤＮＡを含む細菌の計数が可能
である。もしクローンを特定の細菌株に特異的なものと
して選定すれば、その菌株数を数えることが出来る。更
に特定の遺伝子が同定されている様な抗生物質耐性菌株
の性質を、抗生物質耐性遺伝子に含まれているＤＮＡ配
列を、プローブとして使い、同様の方法で特性づけるこ
とができる。更に、１つか又は多くの耐性遺伝子を含ん
でいる耐性プラスミドで、どれが特異的な耐性遺伝子か
を調らべるのにプローブを利用出来る。個々の細菌に加
えて、もしそれらが小さいスポットとして局在し、その
スポット中でハイブリダイズしたＤＮＡに特異的な全蛍
光体を測定出来れば特定菌株の細菌細胞群を検出し菌数
の概算も可能である。
【００４３】このようにして、特定のＤＮＡ配列を含む
微生物の数を細菌の混合物中で測定可能である。上述で
確認したＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
ＡのＬａｎｇｅｒ等の論文のビオチン−ポリヌクレオチ
ドの利用に関する背景として、“Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ
多糸性染色体上の遺伝子マッピングのための免疫学的方
法”の題でＧｅｎｅｔｉｃｓに発表のあるＰ．Ｒ．Ｌａ
ｎｇｅｒ−Ｓａｆｅｒ、Ｍ．Ｌｅｖｉｎｅ及びＤ．Ｃ．
Ｗａｒｄによる報告は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ多糸性染
色体にその場でハイブリダイズしたＤＮＡ配列の位置決
定にビオチン化したヌクレオチドをプローブとして利用
する方法を記載している。この応用例では、これらのプ
ローブを、アフィニティクロマトグラフィーで精製した
うさぎの抗ビオチン抗体を一次の抗体として、又蛍光化
したひつじの抗うさぎ抗体を二次抗体として用いて、検
出している。このＬａｎｇｅｒ−Ｓａｆｅｒ等のＧｅｎ
ｅｔｉｃｓの文献発表もまた、この公告に含まれ、一部
分を成している。アビジン又は酵素標識したアビジン試
薬と共にビオチン標識試薬を用いる、他の技法が、液体
培地中で、配位子（リーガンド）の検出及び決定法とし
て知られている。米国特許４，２２８，２３７参照。
又、アビジン−ビオチン相互作用に基づき遺伝子濃縮
（エンリッチメント）を行うことが、特にＤｒｏｓｏｐ
ｈｉｌａ（しょうじょうばえ）のリボゾームＲＮＡ遺伝
子に応用されている様に、知られている。Ｊ．Ｍａｎｎ
ｉｎｇ、Ｍ．Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ及びＮ．Ｄａｖｉｄ
ｓｏｎのＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｖｏｌ．１６、Ｎ
ｏ．７、１３６４−１３６９頁（１９７７）の発表文献
参照。米国特許第４，７１１，９５５号の発明の実施に
関連した背景として重要な他の文献は、Ｄ．Ｊ．ＥｃＫ
ｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｒ．Ｈ．Ｓｙｍｏｎｓの論文
で、題は「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｔ ｔｈｅ ｓｉｔｅ
ｏｆ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ Ａｆｆｉ
ｎｉｔｙ−Ｌａｂｅｌ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｏｆ Ｐ
ｕｒｏｍｙｃｉｍ ｏｎ ２３−Ｓ Ｒｉｂｏｓｏｍａ
ｌ ＲＮＡ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
Ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ」、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ８２、
２２５−２３４（１９７８）；Ｓ．Ｂ．Ｚｉｍｍｅｒｍ
ａｎ、Ｓ．Ｒ．Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ａ．Ｋｏｒ
ｎｂｅｒｇの論文で、題は「Ｇｌｕｃｏｓｙｌａｔｉｏ
ｎ ｏｆ Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄ−ＩＩ−Ｇｌｕｃｏｓｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ
ｓ ｆｒｏｍ Ｔ２− ａｎｄ Ｔ６−Ｉｎｆｅｃｔｅ
ｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」、Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ、ｖｏｌ．２３７、Ｎｏ．２、２月号、１９６２、並
びにＪ．Ｊｏｓｓｅ ａｎｄ Ａ．Ｋｏｒｎｂｅｒｇの
論文で「ＩＩＩ、α−ａｎｄ β−Ｇｌｕｃｏｓｙｌ
Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ｆｒｏｍ Ｔ４−ｉｎｆｅ
ｃｔｅｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ」、これも
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ、ｖｏｌ．２３７、Ｎｏ．６、６月号、１
９６２に出たものである。米国特許第４，７１１，９５
５号の発明と関連し更に重要なものは、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．、ｖｏｌ、２３６、Ｎｏ．５、５月号１９６
１、１４８７−１４９３頁に出た発表文献、同じ雑誌の
ｖｏｌ、２３７、Ｎｏ．４、１２５１−１２５９頁（１
９６２）、同じ雑誌のｖｏｌ、２３９、Ｎｏ．９、２９
５７−２９６３頁（１９６４）である。特に重要なのは
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｖｏｌ、２
７、Ｎｏ．８ １１３１−１１３９頁（１９７９）並び
にＮｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、ｖｏ
ｌ、５、Ｎｏ．９、１９７７、２９６１−２９７３頁に
出た論文である。同じく重要なものは、Ｂｉｏｃｈｉｍ
ｉｃａｌ ｅｔ ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａにＡ
Ｄｅ Ｗａａｒｄにより発表された「Ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｉｔｙＤｉｆｆｅｒｅｎｃｅ Ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ
Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｆｏｓｉｎｅ β−
Ｇｌｕｃｏｓｙｌ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ Ｉｎｄ
ｕｃｅｄ ｂｙ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ Ｔ
２、Ｔ４ ａｎｄ Ｔ６」と題する論文の２８６−３０
４頁、そして又、Ｔ．Ｗ．Ｎｏｒｔｈ ａｎｄＣ．Ｋ．
Ｍａｔｈｅｗｓによる、「Ｔ４ Ｐｈａｇｅ−Ｃｏｄｅ
ｄ Ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｙｌａｔｅ Ｈｙｄｒｏｘｙ
ｍｅｔｈｙｌａｓｅ：Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎ
ｄ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」と題する、Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓより出版された論文、１９７７、
８９８−９０４頁、そしてＥ．Ａ．Ｂａｙｅｒ ａｎｄ
Ｍ．Ｗｉｌｃｈｅｋによる「Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａ
ｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ ａｓ ａ
Ｔｏｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ」と題する論文でＭｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ、ｖｏｌ、２６、１−
４５頁（１９８０）に発表されたものである。米国特許
第４，７１１，９５５号の発明の実施に有用な他の技術
としては、ＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡのニック
トランスレーションを含む。ニックトランスレーション
を実施する技法はＰ．Ｗ．Ｒｉｇｂｙ、Ｍ．Ｄｉｅｃｋ
ｍａｎｎ、Ｃ．Ｒｈｏｄｅｓ及びＰ．Ｂｏｒｇによる
「Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄ ｔｏ Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａ
ｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ Ｎｉｃｋ
Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｗｉｔｈ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍ
ｅｒａｓｅ」と題する、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９
７７）、１１３、２３７−２５１に発表されている。ス
トレプトアビジンの回収、例えばＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉの培養液からの回収に関して
は、Ｋ．Ｈｏｆｍａｎｎ、Ｓ．Ｗ．Ｗｏｏｄ、Ｃ．Ｃ．
Ｂｒｉｎｔｏｎ、Ｊ．Ａ．Ｍｏｎｉｂｅｌｌｅｒ ａｎ
ｄ Ｆ．Ｍ．Ｆｉｎｎによる「Ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ
Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｏｌｕｍｎｓａｎｄ ｔｈｅｉ
ｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｒｅｔｒｉｅｖａ
ｌ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ」と題する、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、ｖｏｌ
７７、Ｎｏ．８、４６６６−４６６８頁（１９８０）の
論文に、ストレプトアビジン−含有物質、例えば培養
液、からストレプトアビジンを回収するための適当な研
究方法が発表されている。ストレプトアビジンは米国特
許第４，７１１，９５５号の発明の参考例の或るものに
試薬として有用である。前述の発表文献類は米国特許第
４，７１１，９５５号の発明に取入れられており、その
一部を成している。
【００４４】
【発明の概要】本発明の実施に伴い、ヌクレオチド、例
えば、ピリミジンの５位、又はプリンの７位、を修飾
し、これはＤＮＡ又は他の核酸材料へ付加、又は取り込
ませるのに適したヌクレオチドプローブを調製する予備
段階である。本発明の実施にあたり、ヌクレオチド、即
ち核酸を、好ましくは、非解裂的方法で修飾し、出来た
修飾ヌクレオチドが核酸に取込まれ、一旦、核酸に取込
まれた後では、修飾ヌクレオチドがこの修飾ヌクレオチ
ドを含む核酸の二重らせん構造の形成又は安定化に著し
い妨げにならないようにする。ヌクレオチドの非解裂的
修飾及びその様な修飾ヌクレオチドを取り込んだ核酸を
作ることは、解裂的修飾として特性づけされるヌクレオ
チドの修飾方法とは対照的である。解裂的に修飾したヌ
クレオチドとそれを含む核酸は適当な二重らせん形成を
阻害する。本発明の実施にあたっては、ヌクレオチド類
を、ピリミジンの５位、又はプリンの７位を修飾するの
が望ましい。そのように修飾されたヌクレオチド類は、
非解裂的に修飾を受けていて、その様なヌクレオチドを
含む核酸は二重らせん配列を形成出来る。本発明の広
く、他の実施分野として、種々の方法を、非解裂的方法
でＤＮＡのタッグ付け又は標識化に利用出来る。例え
ば、ビオチンを、ＤＮＡ又はＲＮＡの末端に付加する。
ビオチンの付加はリボヌクレオチドの付加で行う。
３′，４′ビシナル水酸基を過沃素酸酸化で酸化し、次
いで、ビオチンヒドラジドの存在下で、水素化ホウ素で
還元する。他の可能性として、カルボジイミドも、又ビ
オチンをアルデヒド基と結合するために利用する。ＤＮ
ＡやＲＮＡの様な核酸材料にタッグ付けをする他の技術
としては、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子の末端に大きなマーカ
ーを付加する方法がある。この技術の一例としてアミノ
基にビオチンのタグを付けた、リシルグリシンの様な分
子の付加がある。他の例は上述の方法に従うが、カルボ
ジイミドを橋架結合剤として使用することである。更に
この技術を使う他の例としては、ビオチン化したｄＡ：
ｄＵ二重らせんポリマーを作り、本発明に従って、この
ポリマーをプローブに結合させることを挙げられる。
【００４５】非解裂的方法でＤＮＡにタグを付ける他の
技術としては、ＰＳ１６又はファージ感染細胞から、５
位にプトリシン又はスペルミジンを持ったｄＰｙｒＴＰ
を分離することを挙げられる。望むならば、ｄＰｙｒＴ
ＰをファージＤＮＡより調製し、ｄＰｙｒＴＰにリン酸
化し、通常の求核性試薬ＮＨＳ−ビオチンで、ポリアミ
ン側鎖の修飾をする。
【００４６】非解裂的方法でＤＮＡにタグを付ける他の
技術としては、Ｔ４ファージグリコシル化酵素を用いて
ＤＮＡ中の５−ヒドロキシ−メチルシトシン（５ＨＭ
Ｃ）にグルコースを付加し、レクチンに基づいた分析で
スクリーニングすることがある。更に、非解裂的方法で
ＤＮＡにタグを付ける他の技術としては、Ｔ４−ＤＮＡ
の加水分解後５ＨＭＣＭＰを５ＨＭＣＴＰにリン酸化し
て調製した５−ＨＭＣ−３リン酸を用いることがある。
次いで５ＨＭＣＴＰをポリメラーゼ１を利用してＤＮＡ
中に取り込ませる。この様にして、如何なるＤＮＡで
も、５ＨＭＣをその中に、非解裂的に取込んだ形に修飾
出来る。温和に解裂的方法でＤＮＡにタグを付ける方法
としては、二重らせん形の中の核酸を、例えばベンゾピ
レンジオールエポキシド又はアフラトキシンの様なアル
キル化剤と反応させる事をあげられる。適当な条件下
で、グアニンのＮ2 基、アデニンのＮ4 基、又はシトシ
ンのＮ4 基をアルキル化する。これら修飾ヌクレオチド
類を、抗体で直接検出出来るし、又、ビオチンの如きレ
ポーター分子を付加する結合腕として利用出来る。
【００４７】以下の実施例は、本発明実施に係る種種の
具体化した例をあげたものである。
【実施例】実施例Ｉ ビオチニル−Ｎ−ヒドロキシサクシニドエステル（ＢＮ
ＨＳ）をＢｅｃｋｅｒ等Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．６８ ２６
０４（１９７１）の方法に従って調製した。ビオチン
（０．２４ｇ、１．０ｍ ｍｏｌ）を脱水ジメチルホル
ムアミド５ｍｌに溶かした。ジシクロヘキシルカルボジ
イミド（０．２１ｇ、１．０ｍ ｍｏｌ）とＮ−ヒドロ
キシサクシニミド（０．１２ｇ、１．０ｍ ｍｏｌ）を
加え、溶液を１５時間室温で攪拌した。得られる沈澱を
濾過後、濾液を減圧下で蒸発し、残渣をエタノールで二
回洗浄し熱イソプロピルアルコールから回収し融点２１
６−２１８℃の白色結晶製品を得た。実施例ＩＩ ビオチニル−１，６−シアミノヘキサンアミドを以下の
如く調製した。１，６−ジアミノヘキサン（３２０ｍ
ｇ、２．０ｍ ｍｏｌ）溶液を５０ｍｌの水に溶かした
ものを、二酸化炭素の添加でｐＨ８．５に調整した。１
０ｍｌのジメチルフォルムアミドに溶かした、ビオチニ
ル−Ｎ−ヒドロキシ−サクシニミドエステル（１００ｍ
ｇ、０．２９ｍ ｍｏｌ）を加えた。室温で１８時間放
置後、混合液を蒸発し、残渣をエーテルで洗い、次いで
デシケーター中で乾燥した。
【００４８】実施例ＩＩＩ ポリビオチン化したポリ−Ｌ−リジンを次の方法で調製
した。２ｍｌの０．１Ｍホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．５
に溶かしたポリリジン（１００μ ｍｏｌリジン）を、
０．５ｍｌのジメチルフォルムアミドに溶かしたビオチ
ニル−Ｎ−ヒドロキシサクシミドエステル（１７．５ｍ
ｇ、５０μ ｍｏｌ）に加えた。室温で１８時間攪拌
後、混合液を１０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．５に対し
透析を行った。
【００４９】実施例ＩＶ オリゴデオキシリボヌクレオチド類を、下記の如く、シ
チジン−５′−３リン酸及び末端トランスフェラーゼを
用いて末端標識した。０．２Ｎ水酸化ナトリウムでアル
カリ切断し、カコデイル酸カリウム（０．１Ｍ）、トリ
ス塩基（ベース）（２５ｍｍ）、塩化コバルト（１ｍ
Ｍ）及びジチオスレイトール（０．２Ｍ）中で２Ａ260
ユニット／ｍｌに稀釈した、精製ファージＤＮＡを用い
た。このＤＮＡ溶液に対し、シチジン−５′−３リン酸
（１０ｍ ｍｏｌ）及び末端トランスフェラーゼ（２０
０ユニット）を加えた。３７°で５〜８時間インキュベ
ート（温置）後、中和したフェノール（１００μｌ）。
０．５Ｍ ＥＤＴＡ（１００μｌ）及び１％ドデシル硫
酸ナトリウムを添加して反応を停止した。ＤＮＡをエタ
ノール沈澱後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００を通すゲ
ル濾過クロマトグラフィーで精製した。実施例Ｖ ビオチンとポリビオチン化したポリ−Ｌ−リジンをＨａ
ｌｌｏｒａｎ ａｎｄＰａｒｋｅｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．、９６ ３７３（１９６６）記載のカルボジミドカ
ップリング法を用いて結合しオリゴリボヌクレオチドに
した。一例として、０．１Ｎ水酸化ナトリウムで切断し
たトリス緩衝液ｐＨ８．２中のＤＮＡ（１μｇ／ｍｌ、
１ｍｌ）を１０分間煮沸してた後、氷浴中で急冷して変
性した。ビオチニル−１，６−ジアミノヘキサンアミド
（２ｍｇ、６μ ｍｏｌ）又はポリビオチン化したポリ
−Ｌ−リジン（２ｍｇ）と１−エチル−３−ジイソプロ
ピルアミノカルボイミド塩酸（１０ｍｇ、６４μ ｍｏ
ｌ）を添加し、ｐＨを、８．２に再調整した。室温、暗
所で２４時間放置後、混合物を生理食塩水を基にして調
製した１０ｍＭトリス緩衝液に対して透析した。ＤＮＡ
をエタノールで沈澱した。
【００５０】実施例ＶＩ チトクロームＣに結合したビオチンを次の方法で調製し
た。０．１Ｍホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．５、１ｍｌ中
に、チトクロームＣ（１０ｍｇ）溶けた溶液に、１ｍｌ
ジメチルフォルムアミドに溶かしたビオチニル−Ｎ−ヒ
ドロキシサクシニミドエステル（１０ｍｇ、２９μ ｍ
ｏｌ）を添加した。室温で４時間放置後、ビオチン化し
たたん白をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０カラムを通すゲ
ル濾過クロマトグラフィーで精製した。実施例ＶＩＩ チトクロームＣ−ビオチンとポリビオチン化ポリ−Ｌ−
リジンをフォルムアルデヒドカップリング法で結合して
オリゴデオキシリボヌクレオチドを作る事をＭａｎｎｉ
ｎｇ等がＣｈｒｏｍｏｓｏｍａ、５３、１０７（１９７
５）に記載したと同様の方法を用いて行なった。精製Ｄ
ＮＡ（１０ｍＭトリエタノールアミン、ｐＨ７．８中で
１００μｇ／ｍｌ）の水酸化ナトリウム切断により調製
したオリゴデオキシリボヌクレオチド断片（フラグメン
ト）を、１０分間煮沸後氷中で急冷により変性した。チ
トクロームＣビオチン０．０５ｇ ｍｌ又は１ｍｌの１
０ｍＭトリエタノールアミンｐＨ７．８に溶かした３ｍ
ｇのポリビオチン化：ポリ−Ｌ−リジン溶液（０．０５
ｍｌ）を、１０ｍＭトリエタノールアミン、ｐＨ７．８
中で６％ホルムアルデヒド溶液の０．１ｍｌと共に、１
ｍｌの変性オリゴデオキシリボヌクレオチド溶液に加え
た。４０°で３０分間攪拌後、混合液を同じ緩衝液に対
して透析した。オリゴデオキシリボヌクレオチド−ビオ
チン複合体を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００のゲル濾
過クロマトグラフィーで最後の精製を行い、次いでエタ
ノールより沈澱させた。
【００５１】実施例ＶＩＩＩ 二重鎖ポリデオキシアデニン酸：ポリビオチン化デオキ
シウリジン酸を以下の如く合成した。トリス−塩酸ｐＨ
８．０（７０ｍＭ）；塩化マグネシウム（１．０ｍＭ）
及びジチオスレイトール（１０ｍＭ）を含む、２００μ
ｌエキソヌクレアーゼＩＩＩ緩衝液に溶解した、３００
塩基対の長さの、二重鎖オリゴヌクレオチドポリデオキ
シアデニン酸：ポリチミジル酸（２０μｇ）を、１００
単位のエキソヌクレアーゼＩＩＩと、２０分間、２０℃
でインキュベートした。一部分分解したオリゴヌクレオ
チドを、フェノールで直ちに抽出し、ＤＮＡを７０％水
性エタノールで沈澱した。部分分解したオリゴヌクレオ
チドを、２０μｌの５ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．６に再
溶解し、２′−デオキシ−アデノシン−５′−３リン酸
（１５μＭ）チミジン−５′−３リン酸（置換度を決定
する量）及びビオチン化５−（３−アミノ−１−プロペ
ン）２′−デオキシウリジン−５′−３リン酸（５μ
Ｍ）、０．１ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８．０に０．２
単位１μｌの濃度になるように調整したＫｌｅｎｏｗ
ＤＮＡポリメラーゼＩ（２００単位）を含む反応液中で
２０℃２時間インキュベートした。ビオチン化ポリｄ
Ａ：ポリｄＴ、ビオチニルｄＵをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ
−１００のゲル濾過クロマトグラフィーで精製した。Ｄ
ＮＡをエタノール沈澱し、酢酸ナトリウムｐＨ４．６
（３０ｍＭ）、塩化ナトリウム（５０ｍＭ）、硫酸亜鉛
（１ｍＭ）及びグリセロール（５％）を含む、２０μｌ
の溶液に再溶解した。Ｓ1 ヌクレアーゼ（２００単位）
を添加し、反応液を３７℃で１０分間インキュベートし
た。反応を、１ｍｌの酢酸アンモニウムと６ｍｌのエタ
ノールを加えて止めた。ＤＮＡをＧ−１００ゲル濾過ク
ロマトグラフィー及びエタノール沈澱で再精製した。実施例ＩＸ ポリｄＡ：ポリｄＴ、ビオチニルｄＵのオリゴデオキシ
リボヌクレオチドへの結合を次の様にして行った。アル
カリ切断した精製ＤＮＡ（実施例ＶＩＩＩで述べた如
く）のＤＮＡ切片をＳ1 ヌクレアーゼで分解し、フェノ
ール抽出とエタノール沈澱で再精製した。切断末端（ｂ
ｌｕｎｄ ｅｎｄ）を持ったＤＮＡ切片（１μｇ）とポ
リｄＡ：ポリｄＴ、ビオチニルｄＵ（２μｇ）を、塩化
マグネシウム（６．６ｍＭ）、アデノシン３リン酸（２
４ｍＭ）及びジチオスレイトール（１．０ｍＭ）を含む
トリス−塩酸ｐＨ７．４（６６ｍＭ）緩衝液、６μｌに
溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（５０単位）を加え、全量
を水で２０μｌとした。反応液を３７℃で３時間インキ
ュベートした。ＤＮＡをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００
を通すゲル濾過クロマトグラフィー精製し、エタノール
で沈澱した。
【００５２】実施例Ｘ ５−ヒドロキシメチル−２′−デオキシシチブル酸を、
非グリコシル化ファージＴ４ＤＮＡの酵素的加水分解に
より調製した。１ｍｌの５０ｍＭトリスｐＨ７．４及び
１０ｍＭ塩化マグネシウムに溶解した、精製ファージＤ
ＮＡ（２ｍｇ）を、デオキシリボネクレアーゼＩと３７
°で２０時間インキュベートした。ｐＨを９．０に調整
し、塩化ナトリウム（２０ｍＭ）を加えた。蛇毒液フォ
スフォジエステラーゼ（０．５ｍｌの水に０．０５ｇ単
位を含む）を加え、３７°で５時間インキュベートを継
続した。更に０．０５単位のフォスフォジエステラーゼ
を添加し、インキュベーションを１８時間続けた。ヌク
レオチドをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０のゲル濾過クロ
マトグラフィーで分離した。５−ヒドロキシメチル−
２′−デオキシシチゲル酸を、逆相高速液体クロマトグ
ラフィーで精製した。実施例ＸＩ ５−（４−アミノブチルアミノメチル）−２′−デオキ
シウリジル酸を、ファージφＷ−１４由来ＤＮＡの酵素
加水分解で取得した。ファージを、Ｋｒｏｐｉｎｓｋｉ
ａｎｄ Ｗａｒｒｅｎ，Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６、８
５（１９７０）記載の方法に従ってＰｓｅｎｄｏｍｏｎ
ａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ ２９に生育させ、Ｋｒ
ｏｐｉｎｓｋｉ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２、１５１（１
９７３）の方法に従って、ファージＤＮＡを精製した。
ＤＮＡをデオキシリボヌクレアーゼＩ及び蛇毒液フォス
フォジエステラーゼで、他に（実施例Ｘ）記述の方法を
用いて、酵素的に加水分解した。５−（４−アミノブチ
ルアミノメチル）−２′−デオキシウリジル酸を逆相高
速液体クロマトグラフィーで精製した。実施例ＸＩＩ ビオチニル化−５−（４−アミノブチルアミノメチル）
−２′−デオキシ−ウリジル酸を以下の如く調整した：
１ｍｌのジメチルフォルムアミドに溶かした、ビオチニ
ル−ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル（７０ｍｇ、
０．２ｍ ｍｏｌ）を２０ｍｌの０．１Ｍホウ酸ナトリ
ウムｐＨ８．５中の５−（４−アミノブチルアミノメチ
ル）−２′−デオキシウリジル酸に添加した。４時間
後、溶液を蒸発で０．５ｍｌまで濃縮し、ビオチニル化
ヌクレオチドを逆相高速液体クロマトグラフィーで精製
した。
【００５３】実施例ＸＩＩＩ Ｍｅｒｔｅｓ ａｎｄ Ｓｈｉｐｃｈａｎｄｌｅｒ、
Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ １、７５１
（１９７０）の方法に従って、５−フォルミル−２′−
デオキシウリジンを調製した。５−ヒドロキシメチルウ
ラシル（１ｍ ｍｏｌ）を２０ｍｌのジメチルスルフォ
ネートに溶かし、二酸化マンガンと共に１００℃で１５
分間加熱した。溶媒を減圧下で蒸発した。残渣熱エタノ
ールに取り、５−フォルミルウラシルをエタノールより
再結晶化した。５−フォルミルウラシル（０．１０ｇ）
をシリル化し、脱水アセトニトリル（２．５ｍｌ）、２
−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−Ｐ−トリイル−Ｄ−リボ
フラノシルクロリド（Ｂｈａｔ、Ｓｙｎ．Ｐｒｏｃ．ｉ
ｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍ．、Ｖｏｌ．
１、５２１頁（１９６８）（０．２２ｇ）と分子ふるい
（０．２ｇ）を加え、混合物を無水条件下、２５℃で４
０時間攪拌した。混合物を濾過し蒸発した。生成する油
状物質を、無水エタノール（２ｍｌ）で処理し、シリカ
ゲルのクロマトグラフィーを行うと部分的に純粋なアノ
マーが得られ、これをエタノールから再結晶化した（融
点１９５−１９６℃）。トルイル基を、生成物をメタノ
ールベンゼン中、メトキシドナトリウムと反応させるこ
とにより除去した。混合物をＤｏｗｅｘ ５０（Ｈ+ ）
で中和した。５−フォルミル−２′−デオキシウリジン
を、エタノールから再結晶化した、融点１７５−１７６
℃。実施例ＸＩＶ ビオチンを以下の如く、５−フォルミル−２′−デオキ
シウリジンにカップルさせた。３００ｍｌの０．０５Ｍ
ホウ酸ナトリウムに溶解した５−フォルミル−２′−デ
オキシウリジン（０．３２０ｇ、１．０ｍ ｍｏｌ）
を、ビオチニル−１，６−ジアミノヘキサンアミド
（０．７４ｇ、２ｍ ｍｏｌ）に加えた。１時間攪拌
後、ボロヒドリドナトリウム（０．２ｇ、５ｍ ｍｏ
ｌ）を加え、攪拌を更に４時間継続し、次いで８ｍｌの
１Ｍギ酸を添加した。ビオチン化化合物を、逆相ＨＰＬ
Ｃでメタノール：０．５Ｍ酢酸トリエチルアンモニウ
ム、ｐＨ4.0 を溶出液として精製した。
【００５４】実施例ＸＶ ビオチンを５−アミノ−２′−デオキシウリジンに以下
の如くカップルさせた。５−アミノ−２′−デオキシウ
リジン（０．２４ｇ、１ｍ ｍｏｌ）、ビオチン（０．
２５ｇ、１ｍ ｍｏｌ）及びジシクロヘキシルカルボイ
ミド（０．２１ｇ、１ｍ ｍｏｌ）を脱水ジメチルフォ
ルムアミドに溶かし、一夜室温で攪拌した。濾過と溶媒
の蒸発後、残渣をエーテルで洗滌した。ビオチンのカッ
プルした生成物を水メタノール勾配法を用いて、逆相高
速液体クロマトグラフィーにより精製した。実施例ＸＶＩ ５−（オキシ）酢酸−２′−デオキシウリジンをＤｅｓ
ｃｈａｍｐｓ ａｎｄＤｅＣｌｅｒｑ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃ
ｈｅｍ．、２１、２２８（１９７８）の方法に従って調
整した。５−ヒドロキシ−２−デオキシウリジン（２８
２ｍｇ、１．１５ｍ ｍｏｌ）を、１．１６ｍｌ、１Ｎ
水酸化カリウムに溶かし、次いで１ｍｌの水中のヨード
酢酸（６０３ｍｇ、３．４ｍ ｍｏｌ）を加えた。室温
で４８時間反応後、１Ｎ塩酸（１．０６ｍｌ）を加え
た。この溶液を濃縮しエタノールを添加して生ずる沈澱
を濾過し、冷エタノールで洗い、熱エタノールから再結
晶化した。実施例ＸＶＩＩ ビオチニル−１，６−ジアミノヘキサンアミドを、以下
の様に、５−（オキシ）酢酸−２′−デオキシウリジン
にカップルした。ビオチニル−１，５−ジアミノヘキサ
ンアミド（０．７４ｇ、０．２ｍ ｍｏｌ）、５−（オ
キシ）酢酸−２′−デオキシウリジン（０．６０ｇ、
０．２ｍ ｍｏｌ）及びジシクロヘキシルカルボイミド
（０．４１ｇ、０．２ｍ ｍｏｌ）を、５ｍｌの脱水ジ
メチルフォルムアミドに溶かし、室温で一夜放置した。
次いで反応液を濾過し、溶媒を蒸発により除去した。残
渣を０．１Ｎ塩酸とエーテルで洗滌した。ビオチン化し
たウリジン誘導体を、水−メタノール勾配法を用いて、
逆相高速液体クロマトグラフィーで精製した。
【００５５】実施例ＸＶＩＩＩ ５位置換ピリミジンヌクレオチド類のリン酸化は下記に
ビオチン化−５−（オキシ）酢酸−２′−デオキシウリ
ジン用に記述した一般法により行った。ヌクレオチド
（０．１６ｇ、０．５ｍ ｍｏｌ）を脱水ピリジンから
の蒸発を繰り返えして乾燥し、１０ｍｌの脱水ピリジン
に再溶解した。モノメトキシトリチルクロリド（０．３
０ｇ、０．８ｍ ｍｏｌ）を加え、混合物を室温暗所で
１８時間攪拌した。溶液をクロロホルム（２００ｍｌ）
で希釈し、０．１Ｎ重炭酸ナトリウムで抽出した。有機
溶媒層を脱水し、蒸発した。トリチル化ヌクレオシドを
脱水ピリジン（２０ｍｌ）に再溶解し、無水酢酸（０．
１ｍｌ、２０ｍ ｍｏｌ）と室温で反応させてアセチル
化した。混合液を４℃まで冷却しメタノール（４０ｍ
ｌ）を添加した。室温で１０時間攪拌後、反応液を蒸発
濃縮した。化合物を、クロロホルム（２０ｍｌ）中、１
％ベンゼンスルフォン酸に溶解して脱トリチル化を行っ
た。溶媒の蒸発後、ヌクレオシドを、２％メタノール：
クロロホルムを溶出溶媒系としたシリカゲルのクロマト
グラフィーで精製した。３′−アセチル化したヌクレオ
シドを脱水ピリジンの蒸発を繰り返えして乾燥した。亜
リン酸フォスフォクロリド（１００μｌ、１ｍ ｍｏ
ｌ）、（１−Ｈ）。１，２，４−トリアゾイック（１４
０ｍｇ、２．２ｍ ｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２
６０μｌ、２．０ｍ ｍｏｌ）の混合物を５ｍｌの無水
ジオキサン中で１０°−１５℃で３０分間、そして室温
で１時間攪拌した。これに３′−アセチル化ヌクレオシ
ドを加えて、混合物を室温で１時間攪拌後０℃まで冷却
した。水（５ｍｌ）を加え、反応液を室温で１８時間攪
拌した。塩化バリウム（１００ｍｇ、５ｍ ｍｏｌ）を
加え、ヌクレオチドのバリウム塩を濾過により集めた。
塩を水とエーテルで洗った。バリウム塩を、Ｄｏｗｅｘ
５０（Ｎａ+ 型）と、１０ｍｌの水中で室温４時間攪
拌してナトリウム塩に変換した。２Ｎ水酸化ナトリウム
（２Ｎ、１０ｍｌ）を加え、反応液を室温で１５分間攪
拌し、次いで過剰のＤｏｗｅｘ ５０（Ｈ+ ）型を加え
て中和した。脱アセチル化したヌクレオチドを蒸発によ
り濃縮し、逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製
した。
【００５６】実施例ＸＩＸ ５位置換ピリミジン３リン酸を、Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．９１、
１、（１９６４）の方法を用いて、相当する５′−モノ
リン酸塩から化学的に調製した。５−ヒドロキシメチル
−２′−デオキシシチジン−５′−３リン酸の実施例を
下記に示す。他のものは、同様にして調製した。５−ヒ
ドロキシル−２′−デオキシシチジル酸（遊離酸）
（０．６３ｇ、０．２ｍ ｍｏｌ）を、メタノールに懸
濁しトリ−ｎ−オクチルアンモニウムヒドロキシド
（０．７４ｇ、０．２ｍ ｍｏｌ）添加により、相当す
るトリ−ｎ−オクチルアンモニウム塩に変換した。懸濁
液を、清澄液になるまで還流し、溶媒を減圧下で除去す
る。塩を脱水ピリジンに溶解し、次いで脱水ピリジンよ
り数度蒸発することにより乾燥した。脱水ジメチルフォ
ルムアミド（０．１ｍｌ）及びジオキサン（１ｍｌ）に
溶かした塩に、ジフェニルフォスフォクロリデート
（０．１ｍｌ）とトリ−ｎ−ブチルアミン（０．２ｍ
ｌ）を添加した。室温で２５時間放置後、溶媒を除去
し、エーテルを加えて、ヌクレオシド−５′−ジフェニ
ルピロフォスフェートを沈澱させた。この沈澱をジオキ
サン（０．５ｍｌ）に溶かし、１ｍｌピリジン中のジ
（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロフォスフェート
（０．５ｍ ｍｏｌ）溶液を加えた。室温で４５分間放
置後、混合液を減圧下で少量になるまで濃縮した。粗生
成物を、エーテルで沈澱させた。沈澱を０．１Ｍリン酸
緩衝液ｐＨ８．０に溶かした。３リン酸塩を、重炭酸ト
リエチルアンモニウムｐＨ７．５の０．１から０．６Ｍ
への勾配溶出系を用いたＤＥＡＥセルロースのクロマト
グラフィーによって精製した。
【００５７】実施例ＸＸ ＤＮＡを、適当な３リン酸の存在下に、ニックトランス
レートを行うＤＮＡにより、５位置換ピリミジン３リン
酸で標識した。以下に示すのはビオチン化５−フォルミ
ル−２′−デオキシウリジンで、精製ＤＮＡを標識した
一例を述べたものである。ＤＮＡ（２０μｇ／ｍｌ）
を、塩化マグネシューム（５ｍＭ）、２′−デオキシ−
シチジン−５′−３リン酸（１５ｍＭ）、２′−デオキ
シアデノシン−５′−３リン酸（１５μＭ）、２′−デ
オキシグアノジン−５′−３リン酸（１５μＭ）ビオチ
ン化−５−フォルミル−２′−デオキシウリジン−５′
−３リン酸（２０μＭ）、活性化膵臓デオキシリボヌク
レアーゼＩ（１３ｍｇ／ｍｌ）、大腸菌ＤＮＡポリメラ
ーゼＩ（４０単位／ｍｌ）及びトリス塩酸、ｐＨ７．４
（５０ｍＭ）の存在下に１４℃でインキュベートした。
２時間後に、０．３ＭＥＤＴＡ（０．０５ｍｌ）を添加
し、次いで６５°で５分間加熱することにより、反応を
停止した。標識したオリゴヌクレオチドをＳｅｐｈａｄ
ｅｘ Ｇ−１００のゲル濾過クロマトグラフィー並びに
冷エタノールからの沈澱により精製した。
【００５８】実施例ＸＸＩ グリコシル化ＤＮＡのコンカナバリンＡによる沈澱方法 反応混合液（１．０ｍｌ）を１．５ｍｌエッペンドルフ
管に、以下の如く調製した。 リン酸ナトリウムカリウム、ｐＨ６．５ １０ｍＭ ＮａＣｌ １５０ｍＭ ＭｇＳＯ4 ５ｍＭ ＣａＣｌ2 １ｍＭ ＤＮＡ（仔牛胸腺のＴ４） ５０μｇ コンカナバリンＡ（１０ｍｇ／ｍｌ） ５０−５００μｇ 反応を、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）の添加により
開始した。溶液を混合し、室温で６０分放置した。管を
１２００ｇで１５〜２０分間遠心した。上澄液を希釈
し、Ａ２６０を測定した。Ｃｏｎ Ａは２６０ナノメー
タに吸収を示すのでＤＮＡを欠くが、ＣｏｎＡを含む標
準液を調製した。完全反応混液の吸収値より、Ｃｏｎ
Ａの吸収値を引いた。この反応の結果を、添付の第１図
に示した。実施例ＸＸＩＩ グリコシル化ＤＮＡのコンカナバリンＡへの結合 ファージＴ４ＤＮＡ及びファージＤＮＡを、Ｒｉｇｂｙ
等の方法に従って、ニックトランスレーションで、Ｈ3
−デオキシアデノシン３リン酸をＤＮＡ中に取り込ませ
ることにより、標識した。Ｔ４ＤＮＡを比活性５×１０
5 ｃｐｍ／ミクログラムで、平均二重鎖サイズ５キロベ
ースになるように、ニックトランスレーションした。ラ
ムダＤＮＡを、比活性３×１０5 ｃｐｍ／ミクログラム
で平均二重鎖サイズを、アガロースゲル電気泳動で測っ
て６．０キロベースになるようにニックトランスレーシ
ョンした。取込まれなかったヌクレオチド類をＢｉｏ−
Ｇｅｌ Ｐ−６０クロマトグラフィーにより、反応混液
から除去した。Ｃｏｎ Ａセファロースを、製造者（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）の記述する方法に従って調製した。
１ｍｌの調製済みゲルには１８ｍｇの結合型Ｃｏｎ Ａ
が含まれていた。滅菌パスツールピペット中に、１ｍｌ
のカラムを作り、ＰＢＳ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ：０．
０１Ｍリン酸ナトリウムカリウム、ｐＨ６．５）で平衡
化した。Ｈ3 −ＤＮＡ試料を０．５ｍｌの緩衝液（実施
例ＸＸＩにＣｏｎ Ａを含まない緩衝液として記述）に
調製した。Ｔ４ＤＮＡ溶液は１７６，０００ｃｐｍ／
０．５ｍｌ含み、ＤＮＡ溶液は１０８，０００ｃｐｍ／
０．５ｍｌ含有していた。０．５ｍｌの試料をカラムに
かけた。１０．５ｍｌ量の緩衝液をカラムに通し、溶出
画分（０．３３ｍ）を採り、Ｂｅｃｋｍａｎ ＬＳＣ−
１００シンチレーションカウンター、３．５ｍｌリーフ
ルアコクティル（Ｂｅｃｋｍａｎ）中で測数した。その
結果（第２Ａ及び２Ｂ図）から、非グルコシル化ＤＮＡ
は結合しないが、グルコシル化Ｔ４ＤＮＡはカラムに結
合した事がわかった。結合したＴ４ＤＮＡを、高ｐＨ緩
衝液（トリス−塩酸、ｐＨ７．２−８．２）でカラムを
洗滌することにより除去した。更に、グリコースとＣｏ
ｎ Ａの相互作用に対応して、マンノースは、ＤＮＡを
カラムに掛ける際の緩衝液中に含まれていると、グルコ
シル化ＤＮＡのＣｏｎＡセファロースへの結合を阻止す
る。同じく、マンノース含有緩衝液（０．０５６Ｍマン
ノース含有ＰＢＳ）は結合Ｔ４ＤＮＡをＣｏｎ Ａセフ
ァロースから遊離させてしまう（第３Ａ及び３Ｂ図）。
さらに非放射能的方法、又は、特定の核酸を分析する技
術を指向した本発明実施例としては、以下の例で糖−レ
クチン系を利用している。この例では、実際、グルコシ
ル化するのではなくて、これから述べる如く、ニックト
ランスレーションでＤＮＡにマルトトリオース基を付加
したＤＮＡを利用する。マルトトリオース修飾ｄＵＴＰ
及び、それに由来する修飾を受けたＤＮＡは、セファロ
ースに共有結合したコンカナバリンＡのカラムに特異的
に結合する。この技術により、そして、本発明の実施例
に従って、如何なる核酸をも糖で、特異的に標識する方
法が提示されている。前述の如く、ニックトランスレー
ションは、本発明による、修飾核酸の生産を可能にする
ための多数の技術並びに研究方法の１つに過ぎない。
【００５９】実施例ＸＸＩＩＩ ラムダＤＮＡを、本発明記述の如く、マルトトリオース
のカップルした５−（３−アミノ−１−プロペニル）−
２′−デオキシウリジン−５′−３リン酸及び3 Ｈ−
２′−デオキシアデノシン−５′−３リン酸とニックト
ランスレーションした。当条件下で、ＤＮＡは、そのチ
ミジン残基の４０％まで、マルトトリオースヌクレオチ
ドで置換され、ＤＮＡミクログラムあたり、８×１０5
ｃｐｍの比活性を有していた。3 Ｈ−ｄＡＴＰでのみ置
換されたＤＮＡの標準サンプルの比活性は、ＤＮＡミク
ログラム当り、６×１０5 ｃｐｍだった。ニックトラン
スレーションを施したＤＮＡサンプルを、本発明記述の
如く、Ｂｉｏｇｅｌ Ｐ−６０クロマトグラフィーで精
製し、反応混液の他の成分を除去した。精製したサンプ
ルを、第２Ａ及び２Ｂ図に述べた如く、Ｃｏｎ Ａ−セ
ファロースカラムにかけた。マルトトリオース標識ＤＮ
ＡはＰＢＳで洗滌時はカラムに保持されるが、次いで、
１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．２（第４Ａ図）で溶出
すると、除去された。非置換トリチウム化ＤＮＡはｐＨ
７．４（第４Ｂ図）ではカラムに結合しなかった。実施例ＸＸＩＶ 潜在的に免疫原性のハプテン類を、既報の種々の方法に
より、ウリジンの５位に導入可能である。５−（パーフ
ルオロブチル）−２′−デオキシウリジンを、Ｃｅｃｈ
等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２、２１８３（１
９７９）の方法を用いて合成した。銅−青銅を硫酸銅
（５ｇ、２０ｍ ｍｏｌ）と亜鉛粉末（２ｇ）を２０ｍ
ｌの水中で反応させて調製した。混液をデカントし、残
渣を水で、次いで５％塩酸と水で洗滌した。使用直前
に、固体（２ｇ）を、アセトン（２０ｍｌ）中、２％ヨ
ードで活性化した。濾過後、残渣をアセトン：濃塩酸
で、次いで純アセトンで洗った。活性化銅−青銅（１３
０ｍｇ、２ｍ ｍｏｌ）及び、１−ヨード−１′，２，
２′，３，３′，４，４′−ヘプタフルオロブタン
（１．３ｍｇ、４ｍ ｍｏｌ）を３ｍｌのジメチルスル
フォキシド中で１１０℃、１時間攪拌した。冷却と濾過
後、２′−デオキシウリジン（２４５ｍｇ、１ｍ ｍｏ
ｌ）を加え、混液を１１０℃で１時間加熱した。水（５
ｍｌ）を加え、混液をエーテルで抽出した。エーテル抽
出物を乾燥し、減圧下で蒸発した。残渣をシリカゲルカ
ラムでクロマトグラフィーにかけ、酢酸エチルで溶出し
た。
【００６０】実施例ＸＸＶ ツベリジンの５位を、５−シアノ化合物、トコカマイシ
ンの誘導体を作って置換した。一例として、４−アミノ
−５（テトラゾル）−５−イル−７−（β−Ｄ−リボフ
ラノシル）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジンを、Ｓｃｈ
ｒａｍ ａｎｄＴｏｗｎｓｅｎｄ、Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙ
ｄｒａｔｅ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ：Ｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅｓ １、３８（１９７４）の方法を用いて合成し
た。水（１００ｍｌ）と氷酢酸（１３ｍｌ）に溶かした
トヨカマイシン（１．０ｇ）を加熱して還流した。アジ
ド・ナトリウム（７．５ｇ）を１０時間にわたって１．
２５ｇ部分づつに分けて添加した。溶液を５℃まで冷却
し、沈澱生成物を集めた、融点２７６−２７７℃。実施例ＸＸＶＩ ５−シアノ−２′−デオキシウリジンをＢｌｅｃｋｌｅ
ｙ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２、６８３（１
９７５）の方法に従って調製した。５−ヨード−２′−
デオキシウリジン（１．０ｇ、２．８２ｍ ｍｏｌ）を
還流中のヘキサメチルジシリザン（ＨＭＤＳ）（１０ｍ
ｌ）に溶解した。過剰のＨＭＤＳを減圧下に除去し、生
ずる油状物質を脱水ピリジン（５０ｍｌ）に溶かした。
シアン化第１銅（３５０ｍｇ、３．８ｍ ｍｏｌ）を加
え、溶液を１６０℃で２０時間加熱した。ピリジンを減
圧下で除去し、残渣をトルエン中に抽出し、次いでトル
エンを蒸発させた。残渣を５０％水性エタノール中で１
００℃２時間加熱した。生産物を、逆相高速液体クロマ
トグラフィーで精製し、エタノールから再結晶化した。
融点１６１℃。
【００６１】実施例ＸＸＶＩＩ ４−アミノ−５−アミノメチレン−７−（β−Ｄ−２−
デオキシフラノシル）ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン
ジヒドロクロリドを以下の如く調製した。４−アミノ−
５−シアノ−７−（β−Ｄ−２−デオキシフラノシル）
ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン（トヨカマイシン）
（０．２ｇ）を塩酸（１０ｍｌ）に溶かした。混合物を
４０ｐｓｉで室温、５時間水素化している間に、木炭
（０．１ｇ）上１０％パラジウムを添加した。濾過後水
を減圧下で蒸発した。残渣をエタノールと共に粉砕し、
生成物を５０％エタノールより再結した。実施例ＸＸＶＩＩＩ ５−アミノ−２′−デオキシウリジンを５−ブロモ−
２′−デオキシウリジンから、Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ
Ｖｉｓｓｅｒ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１４：
６６５−６６９（１９５２）の方法により調製した。液
体アンモニア（２０ｍｌ）に溶解した５−ブロモ−２′
−デオキシウリジン（２ｇ、６．２ｍ ｍｏｌ）を、ガ
ラス管にスケール（ｓｃａｌｅ）５０℃で５日間加熱し
た。管を開き、アンモニアを蒸発した。５−アミノ−
２′−デオキシウリジンを５ｍｌの水と７５ｍｌの熱イ
ソプロピルアルコールより再結した。実施例ＸＸＩＸ ５−（メチルアミノ）−２′−デオキシウリジン（０．
２ｇ）を次の如く調整した。５−シアノ−２′−デオキ
シウリジン（０．２ｇ、０．０５ｍ ｍｏｌ）を１Ｎ塩
酸（１０ｍｌ）に溶解した。木炭上１０％パラジウムを
加え、混合物を室温で１０時間４０ｐｓｉで水素化し
た。混合物を濾過し、水を減圧下で蒸発した。残渣をエ
ーテルと粉砕し、生成物を８０％エタノールから再結し
た。実施例ＸＸＸ マルトーストリオースを、以下の方法により、酸化して
相当するカルボキシル酸にした。マルトーストリオース
（０．５ｇ、０．９４ｍ ｍｏｌ）を水（５ｍｌ）に溶
かした。カルボン酸鉛（０．４２ｇ、１．１ｍ ｍｏ
ｌ）とブロミン（０．１７ｍｌ、３．３ｍ ｍｏｌ）を
加え、混合物を６日間室温で反応させた。反応後、還元
糖は少しも残存していなかった。混合物を濾過し、カル
ボン酸銀（０．２ｇ）を加えた。再濾過後、濾液をＤｏ
ｗｅｘ ５０（Ｈ+ 型）を通して溶出することにより脱
イオン化を行った。水を蒸発し、５酸化亜リン酸の存在
下に乾燥して、目的とする生成物を得た。
【００６２】実施例ＸＸＸＩ マルトーストリオースを以下の方法で５−（３−アミノ
−１−プロペニル）−２′−デオキシウリジン−５′−
３リン酸にカップルした。酸化マルトース（１９０ｍ
ｇ、０．１８ｍ ｍｏｌ）をジメチルホルムアミド
（０．８ｍｌ）に溶かし、４℃に冷却した。イソブチル
クロロフォルマート（２５ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）と
トリ−ｎ−ブチルアミン（４３μｌ、０．３８ｍ ｍｏ
ｌ）を加え、溶液を４℃で１５分間反応させた。ジメチ
ルフォルムアミド（１．２ｍｌ）と、０．１Ｍホウ酸ナ
トリウムに溶かし、４℃に冷却した。５−（３−アミノ
−１−プロペニル）−２′−デオキシウリジン−５′−
３リン酸（９．０μｍｏｌ）を上記溶液に加えた。混合
液を４℃で１時間そして室温で１８時間インキュベート
した。次いで反応液をＤＥＡＥ−セルロースカラムにか
け、０．１から０．６Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウ
ム、ｐＨ７．５の勾配法により溶出した。生産物を、最
後に、逆相高速液体クロマトグラフィーで精製した。以
下は実施例ＸＸＸＩＩ及びＸＸＸＩＩＩである。実施例
ＸＸＸＩＩはアリルアミンで修飾したｄＵＴＰを、フル
オレシン置換体で標識（タグを付ける）する方法であ
る。これは核酸プローブの自己検出法の一例を示したも
のである。実施例ＸＸＸＩＩＩは、二重らせん核酸中グ
アニンのＮ2 位及びアデニンのＮ6 位に標識する方法で
ある。実施例ＸＸＸＶＩＩは、プローブに結合した、検
出分子を有する例である。Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ ８
４：１−１８（１９８１）及びＥｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅ
ｓ １２８：４８５−４９０には、ＲＮＡをローダミン
で末端標識する方法の発表がある。しかしながら、本発
明の方法は、解裂が少なく、内部のヌクレオチドを標識
する。
【００６３】実施例ＸＸＸＩＩ フルオレシンを以下の方法で５−（３−アミノ−１−プ
ロピル）−２′−デオキシウリジン−５′−３リン酸
（ＡＡ−ｄＵＴＰ）にカップルした。２ｍｌのホウ酸ナ
トリウム緩衝液（０．１ｍ）、ｐＨ９．０に溶かした、
ＡＡ−ｄＵＴＰ（１０μ ｍｏｌ）を、１ｍｌジメチル
フォルムアミドに溶かした、フルオレシンイソチオシア
ネートに加えた。室温に４時間放置後、混合液を、重炭
酸トリエチルアンモニウム緩衝液、ｐＨ７．５で平衡化
した、ＤＥＡＥ−セルロースカラムに充てんした。フル
オレシンのカップルしたＡＡ−ｄＵＴＰを、０．１から
０．６ｍ重炭酸、トリエチルアンモニウム、ｐＨ７．５
の勾配法により溶出、精製した。実施例ＸＸＸＩＩＩ ＤＮＡを化学的アルキル化剤と反応させて修飾可能であ
る。ラムダＤＮＡを、芳香族炭化水素、７−ブロモメチ
ルベンズ〔ａ〕アントラセンと、反応させることによ
り、グアニンのＮ2 位とアデニンのＮ6 位にアルキル化
を行った。７−ブロモメチルベンズ〔ａ〕アントラセン
を以下の様にして取得した。二硫化炭素溶液中の７−メ
チル〔ａ〕アントラセンを凍結混液中で冷却し、モル等
量の臭素を滴下して反応させた。３０分後、懸濁した生
成物を集め、脱水エーテルで洗滌し、ベンゼンより再結
した。収量は６６％で融点は１９０．５−１９１．５℃
であった。ファージラムダより精製したＤＮＡ（１．６
ｍｇ）を５．０ｍｌの２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ
６．５に可溶化した。４．０ｍｌのＤＮＡ溶液に、脱水
アセトン中の５００ミクログラムの７−ブロモメチルベ
ンズ〔ａ〕アントラセンを加えた。２０°で３０分後、
ＤＮＡを二倍量の冷エタノールで沈澱させた。沈澱を連
続して、エタノール、アセトン、エーテルで洗い、未結
合７−ブロモメチルベンズ〔ａ〕アントラセンを除去し
た。ＤＮＡを酵素的加水分解でヌクレオシドにし、次い
で生成物のＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムを用い
たクロマトグラフィーで検討した所、ＤＮＡ中のアデニ
ンの１８％及びグアニンの４８％が、それぞれＮ6 及び
Ｎ2 位に修飾を受けていた。修飾したＤＮＡを次の何れ
かの方法で一重鎖にした。 （１） ＤＮＡを１００°で５分間加熱し、急冷する。 （２） ＤＮＡを等量の０．１Ｍ ＮａＯＨと１０分間
インキュベートし、次いで、０．５ｍｌのＥＤＴＡを含
む、１ｍｌのトリス−塩酸ｐＨ８．０に対し４時間、溶
液の透析を行って、ＤＮＡを一重鎖形に維持した。
【００６４】実施例 ＸＸＸＩＶ ＤＮＡプローブを大腸菌のｌａｃオペレーターＤＮＡ配
列を繰り返えして含む合成ＤＮＡに結合させた。アンチ
プローブ配列を検出するハイブリダイゼーションの後、
ハイブリダイズしたＤＮＡをビオチン化したｌａｃレプ
レッサーとの反応により検出し、ビオチン化ｌａｃレプ
レッサーの方は、ビオチンと反応するやぎのアンチビオ
チン１ＧＧと、わさびのペルオキシダーゼにカップルし
た、第二の抗体とを利用した酵素結合免疫吸着検定法に
より検出した。ｌａｃポリオペレーターＤＮＡに関して
は、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（Ｓｅｃｏｎｄ Ａｎｎｕａｌ
Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｆｏｒ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，
１９８２）による報告があり、ｌａｃポリオペレーター
ＤＮＡを、Ｔ４リガーゼを利用した、ブラントエンド結
合で、アデノヴイールスのＤＮＡプローブに結合した。
ポリオペレーター標識プローブＤＮＡのその場所での
（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリディゼーションを、Ｇｅｒ
ｈａｒｄ等（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，７８，３７５５（１９８１））らの報告に従っ
て行った。ビオチン化ｌａｃレプレッサーをＭａｎｎｉ
ｎｇ等（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，５３，１０７−１１７
（１９７５））の報告に従って調製し、ガラススライド
に固定した、アデノヴイルス感染細胞に、結合緩衝液中
で作用させた。結合緩衝液は、下記成分を含有する、
０．０１Ｍ ＫＣｌ、０．０１Ｍトリス（ｐＨ７．
６）、０．０１Ｍ ＭｇＳＯ4 、１０-4Ｍ ＥＤＴＡ、
１０-4Ｍ ＤＴＴ、５％ＤＭＳＯ（ジエチルスルフォキ
シド）及びＪ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ（１９７２）による５０μｇ／ｍｌ牛血清アルブミ
ン。スライドを結合緩衝液で洗滌して未結合ビオチン化
ｌａｃレプレッサーを除去し、次いでわさびペルオキシ
ダーゼ結合二重抗体法を用いてビオチンを検定した。本
法は、プローブを固定化レプレッサー蛋白に結合し、次
いで特定のインデューサー、例えば、イソプロピルチオ
ガラクトシド又は、チオメチルガラクトシド、での溶出
で除去するような、アフィニティカラムの創設に利用で
きる。レプレッサーオペレーター複合物の親和度は極め
て高く、１０-11 Ｍである。特定のインデューサーがレ
プレッサーに結合するとオペレーターレプレッサー複合
体は崩解する。実施例 ＸＸＸＶ ２−ブロモ−２′−デオキシウリジン−５′−フォスフ
ェートを以下の如く調製した。２′−デオキシウリジン
−５′−フォスフェート（６．２ｇ）を６０ｍｌのピリ
ジンと３０ｍｌ酢酸の混液に懸濁した。臭素（０．８４
ｍｌ）を氷水浴槽中で攪拌し、攪拌を室温で２０時間継
続した。溶液を減圧濃縮した。最少量の水に再溶解後、
粗生成物を、エタノールを加えて沈澱させた。粗生成物
をＤｏｗｅｘ５０（Ｈ+ ）でクロマトグラフィーを行
い、水で溶出した。遊離酸生成物を、溶出液を濃縮後、
エタノールを添加して沈澱させた。
【００６５】実施例 ＸＸＸＶＩ 仔牛腸アルカリフォスファターゼを以下の如くビオチン
化した。酵素（１ｍｇ、７．７ｍ ｍｏｌ）をＧ−５０
カラムでクロマトグラフィーを行い、０．１Ｍ塩化ナト
リウム含有０．１Ｍ Ｈｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ８．０で溶
出した。プールした画分を、１０ｍｌジメチルフォルム
アミドに室温で１時間溶解したＮ−ビオチニル−６−ア
ミノ−カプロイン酸−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエス
テル（０．６７５ｍｇ、０．７７μ ｍｏｌ）と反応さ
せた。過ヨード酸ナトリウム（０．１Ｍ、１２５μｌ）
を加え、２時間攪拌を続けた。混合液を４°で一夜、
０．１Ｍ ＮａＣｌと共に０．１Ｍ Ｈｅｐｅｓ緩衝液
ｐＨ８．０中で透析し、次いでｐＨを７．４に調整し
た。０．１Ｍ Ｈｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７．４と０．１Ｍ
ＮａＣｌに溶かしたビオチンヒドラジド（０．１Ｍ、
０．５ｍｌ）を加え、反応液を室温で３０分間攪拌し
た。ｐＨを０．２Ｍ炭酸ナトリウムで８．０に調整し水
に新らしく調製した０．５ｍｌの０．１Ｍボロヒドリド
ナトリウムを加え、溶液を０．１Ｍ ＮａＣｌを含む
０．１Ｍトリス緩衝液ｐＨ８．０に対して透析した。実施例 ＸＸＸＶＩＩ ６−シアノ−２′−デオキシウリジン−５′−フォスフ
ェートをＶｅｄｅｒ等、Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｎｕ
ｃｌｅｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，５，２６
１（１９７８）記載と同様の方法で調製した。ピリジン
からの連続蒸発で乾燥した５−ブロモ−２′−デオキシ
ウリジン−５′−リン酸（２．０ｇ、１５ｍ ｍｏｌ）
を５０ｍｌのジメチルスルフィドに溶解した。シアン化
ナトリウム（４９０ｍｇ、１０ｍ ｍｏｌ）を加え、溶
液を２日間室温で攪拌した。溶液を４００ｍｌの水で稀
釈しｐＨを７．５に調整した。溶液をＤＥＡＥ−セルロ
ースカラム（ＨＣＯ3 - 型）にかけ、２０００ｍｌの
０．０２Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウムで洗滌し目的
の生産物を得た。
【００６６】実施例 ＸＸＸＶＩＩＩ ６−（メチルアミノ）−２′−デオキシウリジン−５′
−リン酸を次の様にして調製した。６−シアノ−２′−
デオキシウリジン−５′−リン酸（０．２ｇ、６０ｍ
ｍｏｌ）を０．１Ｍ塩酸に溶かした。木炭（０．１ｇ）
上１０％パラジウム添加後、混合物を室温で２０時間４
０ｐｓｉで水素化した。混合液を濾過し水酸化リチウム
で中和し凍結乾燥した。生産物の残りをエタノールで抽
出した。実施例 ＸＸＸＩＸ ５ｍｌの蒸溜水に溶かしたわさびペルオキシダーゼ（２
０ｍｇ）を新らしく調製した０．１Ｍ過ヨード酸ナトリ
ウム液に加えた。室温で２０分間攪拌した後で、１ｍＭ
酢酸ナトリウムｐＨ４．４に対し４℃で一夜透析した。
０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む、０．１Ｍ Ｈｅｐｅｓ
緩衝液ｐＨ７．４の２ｍｌに溶かしたビオチンヒドラジ
ド（２．６ｍｇ、５×１０-2ｍ ｍｏｌ）を、０．２Ｍ
炭酸ナトリウムでｐＨ８．０にし、水に新らしく調製し
た０．１Ｍボロヒドリドナトリウムを加えた。４℃で２
時間放置後、その蛋白をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０カ
ラムにかけ、０．１Ｍ Ｈｅｐｅｓと０．１Ｍ ＮａＣ
ｌで溶出して精製した。
【００６７】実施例 ＸＬ 人参の酸性フォスファターゼはＢｒｕｎｎｇｒａｂｅｒ
ａｎｄ Ｃｈａｒｇａｆｆ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，（１９６７）２４２，４８３４−４８４０にフォ
スフォトランスフェラーゼ精製の際の副産物として述べ
られていて、パラニトロフェニルフォスフェートを基質
として３７℃、４６０μＭ／ｍｇ／ｍｉｎの比活性まで
精製されている。精製には次の工程が関与している。即
ち、（ａ）ＤＥＡＥセルロースによる非特異的蛋白の吸
着；（ｂ）酸性下での酵素精製；（ｃ）アセトン分画；
（ｄ）コンカナバリンＡアフィニティクロマトグラフィ
ー；（ｅ）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーそ
して（ｆ）ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１００分画。Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘ Ｇ−１００分画に供した酵素の比活性は、前
段階のアフィニティクロマトグラフィー工程（ｄ）での
活性減量のため１７０μＭ／ｍｇ／ｍであった。（ｄ）
段階での溶出条件を変えることにより、これらの減量
（ロス）を避け、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００分画前
の酵素の比活性を３４０μＭ／ｍｇ／ｍまで改良出来
る。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００分画工程で、比活性
８００μＭ／ｍｇ／ｍか或いはもっと高い酵素が得る必
要がある。人参酸性フォスファターゼを、Ｗｉｌｃｈｅ
ｋ等Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６、２４７（１９６
７）の方法を用いてビオチン化した。０．１Ｍ ＮａＣ
ｌ、ｐＨ５に溶かした酵素（２０ｍｇ）にビオチンヒド
ラジド（２．０ｍｇ、７×１０-3ｍ ｍｏｌ）と０．１
Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５に溶かした１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジミド塩酸（１ｍ
ｇ、７×１０-3ｍ ｍｏｌ）を添加した。４℃にて２時
間放置後、酵素をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０でクロマ
トグラフィーを行い、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ
５．０で溶出した。
【００６８】本発明実施にあたり、特に重要且つ有意義
な点は、自己−信号発信、自己−指示又は自己−検出核
酸を利用することであり、しかも二重鎖ＤＮＡ及び同類
のものに取り込まれる様な核酸を利用することにある。
その様な自己−信号発信又は自己−検出核酸は、アリル
アミン置換体に共有結合で付加させ、本発明に従って、
特定のイオン類、即ち重金属、希土類とキレートする様
な分子である修飾ヌクレオチドを形成することにより作
り出すことが出来る。一般にキレートしたイオンを
（ａ）放射活性放出か又は（ｂ）そのイオンを利用して
色素形成又は蛍光発生反応を触媒させることにより検出
出来る。例として、３，４−ジニトロフェノールを還元
して３，４−ジアミノシクロヘキサンにする。
【化２６】次いでこの物を臭素化して
【化２７】３，４−ジアミノ−ブロモ−シクロヘキサン
（ｄＡＢＣＨ）を作る。この化合 物を、ハロゲン（Ｕ，Ｂｒ，Ｉ）に置換したカルボキシ
メチル化合物と反応させて、テトラカルボキシメチル化
合物又はｄＡＢＣＨ（ＴＣＭ−ｄＡＢＣＨ）を生成す
る：
【化２８】この臭素を、可溶性アンモニアを用いてアミ
ノ基と置換する：
【化２９】次いでこの化合物をクロロチオフォスゲンと
反応させて（ＴＣＭ−ｄＡＮＣＨ ）のイソチオシアネート誘導体を生成する。
【化３０】最後に、この化合物をｄＵＴＰ−アリルアミ
ン誘導体と反応して修飾ｄＵＴＰ を作る。
【化３１】コバルトや他の重金属イオン又は他の希土類
イオンを上記第３ステップ以後で 、この化合物にキレートさせることが出来る。或いは核
酸を、この付加物に置き替え、次いでイオンを付加する
ことも出来る。（例、コバルトを結合恒数が１０-19 Ｍ
であるｐＨ６で付加する）。
【００６９】コバルトは放射活性で検定出来る。コバル
トは又、分子状酸素の存在下でメチレンブルーを酸化し
てロイコ（ｌｅｕｃｏ）形にする能力によっても検出で
きる。コバルトを利用して、これも分子状酸素の存在下
で可溶性スルフヒドロ基を、酸化して二硫酸結合を形成
出来る。この型の自己−信号発信分子を、如何なる核酸
のハイブリディゼーション反応のモニターにも利用出来
る。特にゲル中、（例えばシ−クエンシングゲル）で核
酸を検出することは特に重要である。放射活性の利用に
関しては、必要とするアイソトープを調製出来る。即
ち、もし弱い、又は強いβ又はα放射体が必要な場合、
そのアイソトープをキレートできる。
【００７０】利用出来るアイソトープの例を以下に表示
した。 アンチモン−１２４ ガドリニウム−１５３ アンチモン−１２５ 金 −１９５ 砒 素−７４ 金 −１９９ バリウム−１３３ ハフニウム−１７５ バリウム−１４０ ハフニウム−１７５＋１８１ ベリリウム−７ ハフニウム−１８１ ビスマス−２０６ 水素−３ トリチウム参照 ビスマス−２０７ 沃 素−１２５ カドミウム−１０９ 沃 素−１３１ カドミウム−１１５ｍ 沃 素−１３２ カルシウム−４５ イリジウム−１９２ 炭 素−１４ 鉄 −５５ セリウム−１３９ 鉄 −５９ セリウム−１４１ セリウム−１４４ クリプトン−８５ セシウム−１３４ セシウム−１３７ 鉛 −２１０ 塩 素−３６ ルテシウム−１７７ クロミウム−５１ コバルト−５６ マンガン−５４ コバルト−５７ 水 銀−１９７ コバルト−５８ 水 銀−２０３ コバルト−６０ モリブテン−９９ エルビウム−１６９ ユーロピウム−１５２ ネオジミウム−１４７ タンタル−１８２ ネプッニウム−２３７ テクネチウム−９９ ニッケル−６３ テルル−１２５ｍ ニオビウム−９５ テルル−１３２ テルビウム−１６０ オスミウム−１８５＋１９１ タリウム−２０４ トリウム−２２８ パラジウム−１０３ トリウム−２３２ ツリウム−１７０ プラチナ−１９５ｍ 錫 −１１３ プラセオジミウム−１４３ チタニウム−４４ プロメチウム−１４７ トリチウム プロトアクチニウム−２３３ タングステン−１８５ ラジウム−２２６ バナジウム−４８ レニウム−１８６ バナジウム−４９ ルビジウム−８６ ルテニウム−１０３ イッテルビウム−１６９ ルテニウム−１０６ イットリウム−８８ イットリウム−９０ スカンジウム−４４ イットリウム−９１ スカンジウム−４６ セレニウム−７５ 亜 鉛−６５ 銀 −１１０ｍ ジルコニウム−９５ 銀 −１１１ ナトリウム−２２ ストロンチウム−８５ ストロンチウム−８９ ストロンチウム−９０ 硫 黄−３５
【００７１】Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎ
ｉｉによって生産される蛋白、ストレプトアビジンは、
相乗作用を示す一組の化合物の中の大分子量成分であ
り、両成分共に本微生物の培養濾液中に存在する。この
組のそれぞれは不活性だが、組合わせるとグラム−陰性
の微生物に対して活性を示す。この抗生物質の小さい成
分がビタミンのビオチンのｄｅ ｎｏｖｏ合成を阻害
し、従って、少くとも合成培地中では、抗菌活性を示す
ことが知られている。しかしながら、複雑な培地中で
は、同じ抗菌効果を示すには、大きな成分の存在が必要
である。この事は、複雑な培地中では外部からのビオチ
ンの持込みのためであることが示されている。大分子成
分は外部からのビオチンに結合し、卵子や産卵中の鳥の
輸卵管由来のアビジンと同様の活性を示すことが知られ
ている。ストレプトアビジンは精製し、６０，０００タ
ルトンのポリペプチドであることが示されている。アビ
ジンと同様に、ストレプトアビジンは４つのサブユニッ
トを含み、４分子のビオチンと固く結合する。しかしな
がら、アビジンとは異なり、ストレプトアビジンは、グ
リコシル化されていず、Ｐ１は、アビジンのＰ１＝１
０．５に比して５．０である。Ｐ１の差により、ストレ
プトアビジンはＤＮＡと非特異的に相互作用をしない。
【００７２】ストレプトアビジンの調製 塩、１％グルコース、０．１％アスパラギン、０．０５
％酵母抽出物及び微量元素を含む、半合成培地を調製し
た。培養物を２６℃で３日間生育させた。菌体を遠心分
離で除き、上澄液の蛋白を、１Ｍ ＨＣｌでｐＨ７．２
に調整した後、バッチ操作でＤＥＡＥ−セルロースに吸
着させた。ＤＥＡＥ−セルロースを濾別し、２８０ｎｍ
で吸収がなくなるまで、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．２）で洗滌した。ストレプトアビジンを、０．５Ｍ
ＮａＣｌ含有の２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
２）で溶出した。硫酸アンモニウム沈澱を利用して、ス
トレプトアビジンを更に濃縮した（４℃で５０％ｗ／
ｖ）。沈澱を水に溶かし、１．０Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍ
Ｍ Ｎａ2 ＣＯ3 に対して透析した。次のステップとし
て、イミノビオチンセファロースのアフィニティカラム
クロマトグラフィーを用いた。イミノビオチンセファロ
ースカラムから溶出したストレプトアビジンは、非−変
性アガロース−ゲル電気泳動でクロマトグラフィー的に
純粋であった。ストレプトアビジンの最終精製を、イミ
ノビオチン−セファロースカラムを通す、アフィニティ
精製で行った。イミノビオチンはビオチンの同族体（ア
ナログ）であり、ビオチンの尿素部分のカルボニルが、
イミン官能基で置換されている。イミノビオチンは、塩
基性ｐＨではアビジン及びストレプトアビジンと結合す
るが、複合体は酸性ｐＨで解離する。イミノビオチン
を、何段階かの工程でビオチンから調製する。ビオチン
を水酸化バリウムで加水分解してシス−３，４−ジアミ
ノ−２−テトラヒドロチオフェン−ヴァレリン酸にし、
それを臭化シアノジエンと反応させてイミノビオチンに
する。イミノビオチンを、その臭化水素塩のＮ−ヒドロ
キシサクシニミドエステルとしてアミノセファロースに
カップルする。ＤＥＡＥが溶出したＳｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ培養液の粗蛋白混合物を、５
０ｍＭ炭酸ナトリウムと、１．０Ｍ塩化ナトリウム（ｐ
Ｈ１１）に溶かし、当液で前処理して平衡化した、イミ
ノピオチンカラムに充てんする。カラムをｐＨ１１で溶
出する。ストレプトアビジンを次いで０．５Ｍ塩化ナト
リウムを含む、５０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ４．０
で溶出する。溶出物を１ｍＭトリスｐＨ７．４に対し３
回透析し、凍結乾燥する。本発明実施に当り、アビジン
は、ビオチン標識ＤＮＡの如き、標識ＤＮＡの検出機構
として有用である。しかしながら、中性附近のｐＨ下で
は、アビジン自体がＤＮＡと複合体を形成し、その結
果、ビオチン標識ＤＮＡとアビジン間で形成されている
複合体由来の信号（シグナル）が、アビジンと標識して
いないＤＮＡ間で複合体の形成があるために、消滅する
か或いは検出不能になる可能性がある。本発明実施中、
アビジンを利用する際のこの欠点をストレプトアビジン
は持っていない、即ち、ストレプトアビジンは中性附近
のｐＨでＤＮＡと複合体を作らず、ビオチン標識ＤＮＡ
のビオチン部分と複合体を形成出来る。ＤＮＡ以外の標
識化合物の検出に巾広くアビジン及びストレプトアビジ
ンを利用する事を目的とした他の応用面では、アビジン
とストレプトアビジンが標識した蛋白類、多糖類及び脂
質類の検出機構として、特に有効だということである。
例として、固体基材（マトリックス）に特定の抗原を固
定し、この抗原にビオチン化した抗体を働かせることが
出来る。次いで、酵素、例えば、仔牛腸アルカルフォス
ファターゼ、又は蛍光分子、例えばフルオレシンを結合
して作ったアビジン又はストレプトアビジン複合体と反
応させて、このビオチン化抗体の存在を検定する。抗原
或いは抗体を検出するために、抗原−抗体系を利用する
ことは、よく知られている。これに匹敵する系として
は、グリコシル化した基質又は分子とレクチンを適合さ
せる（マッチング）か或いはレクチンを充当することに
基づく系がある。この系ではレクチンが、フルオレシン
や適当な酵素のような標識を担うことになる。このグリ
コシル−レクチン系では、標識したレクチンが、グリコ
シル部分と、抗原−抗体複合体に相当する、複合体を形
成する。グリコシル化した分子と、適当な標識をしたレ
クチンを含み、かつ必要なグリコシル又は糖部特異性を
有するこの複合体は、次いで、標識レクチンの標識部分
から目的の反応を自動的に引き出して、グリコシル−レ
クチン複合体を作りあげる。
【００７３】本発明を実施する上で特に有利な他の応用
面としては、検出されるべきＤＮＡとそのＤＮＡを検出
するプローブとの間に液相中でハイブリディゼーション
を起こさせて検出することである。この液相系では検出
されるＤＮＡも、適当なＤＮＡ検出プローブも、両者
共、如何なる不溶性基質又は不溶性化学的分子にも附着
しているわけではない。液相検出系の利点は、被検出Ｄ
ＮＡと適当なＤＮＡ検出プローブ間で、ハイブリディゼ
ーション、即ち、ハイブリド形成の起るスピードにあ
る。例えば、固相−液相系では確認とハイブリディゼー
ション形成に要する時間は、万一それが完全な液相系の
み、即ち、被検出ＤＮＡも検出ＤＮＡも共に不溶性部分
に固着していない場合に比し約１０倍もの時間が掛る。
本発明の実施方法によって調製するプローブ類は上述の
如く、液体中のヴイルスや細菌の検出に適用し利用でき
る。被検液体中に大量の蛋白が含まれていない場合、液
中のヴイルスをハイドロキシアパタイトに吸着させ、少
量のリン酸緩衝液で溶出できる。被検液に多量の蛋白が
含まれている場合には、ヴイルスを高速遠心で濃縮でき
る。もし抗体が利用可能なら、アフィニティカラムに吸
着させ酸で溶出するのが望ましい、というのも本発明の
実施により、多くのプローブを同時に処理できるからで
ある。被検細菌を通常、容易に遠心により濃縮する。本
発明実施方法に従って、分離した粒子、ヴイルスや細菌
の同定や特性化をするには、特性化する、或いは同定す
べきＤＮＡと本発明の実施方法に従って調製した特異的
単鎖ＤＮＡプローブとハイブリダイブさせることであ
る。ハイブリディゼーションの後、余剰の非ハイブリデ
ィゼーションプローブＤＮＡを、Ｓ1 ヌクレアーゼのニ
ック活性を抑制するため高塩濃度下で、Ｓ1 ヌクレアー
ゼと大腸菌エクソヌクレアーゼＩで分解する、Ｖｏｇ
ｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖ
ｏｌ．６５，２４８−２５５頁（１９８０）参照。この
ヌクレアーゼ処理で、余剰の非ハイブリディゼーション
単鎖ＤＮＡプローブからモノヌクレオチド類が生成する
が、二重鎖のハイブリダイズしたＤＮＡは無疵で残る。
この反応液を、次いで、高塩濃度下でＤｏｗｅｘ陰イオ
ン交換樹脂に吸着させる（ヌクレオチド類と、少量のオ
リゴヌクレオチドは、高塩濃度下では樹脂に結合しな
い）。得られる、ハイブリダイズしたＤＮＡを、次い
で、本発明実施に際し、適用可能な各種方法で、同定又
は特性づけを行う。
【００７４】本発明に係る特別なヌクレオチド類として
は、リン酸のＰ部分、糖又はモノサッカライドのＳ部
分、塩基のＢ部分、プリン又はピリミジン並びに、Ｐ，
Ｓ又はＢ部分に、共有結合で付いた、信号（シグナル）
発信する化学的部分のＳｉｇが含まれている。以下に各
種塩基Ｂ部分の構造式並びに、本発明の実施方法に従っ
て修飾を受けるヌクレオチド類を示してある。主要プリン類 アデニン グアニン （６−アミノプリン） （２−アミノ−６−オキシプリン）
【化３２】二つのマイナープリン類 ２−メチルアデニン １−メチルグアニン
【化３３】主要ピリミジン類 シトシン ウラシル （２−オキシ−４−アミノピリミジン） （２，４−ジオキシピリミジン）
【化３４】 チミン （５−メチル−２，４−ジオキシピリミジン）
【化３５】
【００７５】 二つのマイナーピリミジン類 ５−メチルシトシン ５−ヒドロキシメチルシトシン
【化３６】
【化３７】 主要リボヌクレオチド並びにデオキシリボヌクレオチド リボヌクレオシド ２′−デオキシリボヌクレオシド ５′−モノリン酸 ５′−モノリン酸
【化３８】
【００７６】 一般構造式 一般構造式 アデノシン５′−リン酸 デオキシアデノシン５′−リン酸 （アデニル酸；ＡＭＰ） （デオキシアデニル酸；ｄＡＭＰ） グアノシン５′−リン酸 デオキシグアノシン５′−リン酸 （グアニル酸；ＧＭＰ） （デオキシグアニル酸；ｄＧＭＰ） シチジン５′−リン酸 デオキシシチジン５′−リン酸 （シチジル酸；ＣＭＰ） （デオキシシチジル酸；ｄＣＭＰ） ウリジン５′−リン酸 デオキシチミジン５′−リン酸 （ウリジル酸；ＵＭＰ） （デオキシチミジル酸；ｄＴＭＰ）
【００７７】本発明により、上述の如く、特別のヌクレ
オチド類とは、Ｐ，Ｓ及びＢ部分の外に、Ｐ，Ｓ、及び
／又はＢ部分に共有結合で付着している化学的部分Ｓｉ
ｇを含む。本発明の実施に際し特に重要なのは、Ｐ−Ｓ
−Ｂ−Ｓｉｇの一般式で表わされるヌクレオチド類であ
る。ここでＰとはモノ−、ジ−、トリ−、テトラリン酸
を含む、リン酸部分、Ｓは糖又はモノサッカライド部
分、Ｂは塩基部分でプリンかピリミジンを表わす。リン
酸部分のＰは、ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチ
ドの場合、Ｓ部分の３′及び／又は５′位に付き、ヌク
レオチドがリボヌクレオチドの場合、２′，３′及び／
又は５′位に付く。塩基Ｂ部分は、塩基がピリミジンの
時はＮ1 位から、プリンの時はＮ9 位から、それぞれＳ
部分の１′位に付いている。Ｓｉｇ部分は、ヌクレオチ
ドのＢ部分に共有結合で付いている。そして、その様な
付き方で、自己信号発信能力を有するか、自己−検出又
はその存在を明らかに出来、願わくば、又は望むらく
は、生成するヌクレオチドＰ−Ｓ−Ｂ−Ｓｉｎを二重鎖
らせんＤＮＡ又はＲＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリド
に取込ませるか又はそれらを形成することができ、そし
て／又は、そこで検出可能なことである。
【００７８】本発明に係る他の特別ヌクレオチドは一般
式
【化３９】 で特性づけられる。本発明に係るその様なヌクレオチド
類は、リボヌクレオチドとして特性づけられる。りん酸
部分は、糖Ｓ部分の２′，３′及び／又は５′位に付い
ていて、塩基Ｂは、塩基がピリミジンの時はＮ1 位か
ら、プリンの場合はＮ9 位から、それぞれ糖Ｓ部分の
１′位に付いている。Ｓｉｇ化学的部分は糖Ｓ部分に共
有結合で付き、そのＳｉｇ化学的部分が、そのＳ部分に
付いている時、自己信号発信能力を有するか、自己−検
出又は、その存在を明らかにでき、そして望むらくは、
そのリボヌクレオチドを相当する二重鎖ＲＮＡ又はＤＮ
Ａ−ＲＮＡハイブリドに取り込ませることができる。
【化４０】 この様なヌクレオチドでは、願わくば、Ｓｉｇ化学的部
分が、Ｓ部分のＣ２′位又はＳ部分のＣ３′位にあるこ
とが望ましい。更に、本発明実施に係る他のヌクレオチ
ドとしては、
【化４１】 式を有するヌクレオチド類を含む。ここで、Ｐはリン酸
部分、Ｓは糖部分そしてＢは塩基部分である。これら特
別のヌクレオチド類ではＰ部分が、ヌクレオチドがデオ
キシリボヌクレオチドの時は、Ｓ部分の３′及び／又は
５′位に付き、ヌクレオチドがリボヌクレオチドの時
は、２′，３′及び／又は５位に付いている。塩基Ｂは
プリン又はピリミジンで、Ｂ部分は、そのＢ部分がピリ
ミジンの時はＮ1 から、プリンの時にはＮ9 位から、そ
れぞれ糖部分の１′位に付いている。Ｓｉｇ化学的部分
は化学結合
【化４２】 を通してリン酸Ｐ部分に、共有結合で付いていて、当該
Ｓｉｇが、当該Ｐ部位に付いる時は、自己信号発信能力
を有するか、自己−検出又は、その存在を明らかにで
き、そして願わくば、ヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ
又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリドの様な二重鎖ポリヌクレ
オチドに取込まれることができ、そしてそのように取込
まれた時でも、まだ自己−検出能力を有する。一般式Ｐ
−Ｓ−Ｂ−Ｓｉｇで、上記の通り表わした、又は定義し
た、本発明実施に係る特別ヌクレオチド類は、又、Ｓｉ
ｇ化学部分が、Ｂ部分がアデニンの場合Ｂ部分のＮ6 又
は６−アミノ基位に、或いはＢ部分がグアニンの場合に
は、Ｎ2 又は２−アミノ基位、又はＢ部分がシトシンの
場合、Ｎ4 又は４−アミノ基位に、共有結合で付いたヌ
クレオチド類を含む。それらに付いたＳ部分を有する、
生成ヌクレオチド類は、自己信号発信能力を有するか、
自己−検出、又は自己の存在を明らかにする能力を有
し、二重鎖又はＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイ
ブリド中で検出可能である。
【００７９】要約として、本発明記載の各種特定のヌク
レオチドの組立方に関して上述の如く、特定のヌクレオ
チド類は、リン酸部分Ｐ、糖部分Ｓ及びプリン又はピリ
ミジンである塩基部分Ｓを含有し、その結合物Ｐ−Ｓ−
Ｂは、デオキシリボヌクレオチド類及びリボヌクレオチ
ド類の両者のヌクレオチドに関して、よく知られ又、定
義づける結合様式である。次いでヌクレオチド類は、本
発明実施により化学部分Ｓｉｇを共有結合で、Ｐ部分及
び／又はＳ部分及び／又はＢ部分に付けて修飾する。ヌ
クレオチドＰ−Ｓ−Ｂに、その様に付着した化学部分Ｓ
ｉｇは、すでにＳｉｇ部分が他部分の１つ又はそれ以上
に付加したＰ−Ｓ−Ｂ構造を含む、生成ヌクレオチド
に、ポリヌクレオチド、二重鎖ＤＮＡ、二重鎖ＲＮＡ又
は二重鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリドの如き、特に二重鎖
ポリヌクレオチドに取込まれた時、自己−検出、又は信
号発信又は、それ自体、自己の存在を明らかにさせ又は
することができる。Ｓｉｇ部分は、願わくはヌクレオチ
ドが、本発明記載の特定のＳｉｇ−含有ヌクレオチドを
含む二重鎖ポリヌクレオチドを形成する能力を阻害せ
ず、又その様に取り込まれた場合には、Ｓｉｇ−含有ヌ
クレオチドは、検出、局在化及び観察が可能である。本
発明の特定のヌクレオチド類の組立てに使用するＳｉｇ
部分は、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシ
ダーゼ、わさびペルオキシダーゼ又はリボヌクレアーゼ
の如き酵素又は酵素素材を含有できる。
【００８０】Ｓｉｇ部分は、又、フルオレシン又はロー
ダミン又はダンシルの様な蛍光成分を含有できる。望む
ならばＳｉｇ部分は磁気酸化物や磁気酸化鉄の如き、磁
気成分を結合又は付着して含むことができ、この様な磁
気含有Ｓｉｇ部分を含むヌクレオチド又はポリヌクレオ
チドを、磁気的方法で検出可能にする。Ｓｉｇ部分は
又、フェリチンの如き、電子稠密な成分を含み、観察に
よる利用ができる。Ｓｉｇ部分は又、放射性コバルトの
如き、放射性同位元素成分を含み、生成するヌクレオチ
ドを放射線検出装置で観察可能にできる。Ｓｉｇ部分は
又、ハプテン成分又はそれ自体を含み、それに対する特
異的抗体と複合体を形成さすこともできる。最も有用な
のは、Ｓｉｇ部分が多糖又はオリゴ糖又は単糖でレクチ
ン即ちコンカナバリンＡの如き糖や多糖に結合する蛋白
と複合体を形成するか又は付加することである。本発明
記載のＳｉｇ成分又は特定のヌクレオチド類は又、化学
ルミネッセント成分を含有できる。
【００８１】本発明実施により示された如く、Ｓｉｇ成
分は、直接又は化学結合又は結合腕を通じて、ヌクレオ
チド例えばその中の塩基Ｂ成分、又はその中の糖Ｓ成
分、又はリン酸Ｐ成分に付着可能な如何なる化学的部分
をも包含する。本発明に記載したヌクレオチド類のＳｉ
ｇ成分及びＳｉｇ成分を含む、本発明のヌクレオチド類
を取り込んだヌクレオチド類やポリヌクレオチド類は、
上記確認の米国特許第４，７１１，９５５号記載のヌク
レオチド類と同じ目的に相当しそして有用である。より
明確にすると、米国特許第４，７１１，９５５号記載の
化学部分Ａは機能的にはＳｉｇ成分、又は本発明の特定
のヌクレオチドの化学的部分と同等である。従ってＳｉ
ｇ成分、或いは本発明のヌクレオチド類の化学的部分は
直接Ｐ、Ｓ又はＢ部分に共有結合で付加し、又は米国特
許第４，７１１，９５５号のヌクレオチド類のＢとＡを
結ぶ点線で示される如く、米国特許４，７１１，９５５
号に記載の如き化学結合又は結合腕を通してそれらに付
加出来る。米国特許第４，７１１，９５５号中で確認し
た各種結合腕或いは結合は、本発明の特定ヌクレオチド
類に適用でき、そしてその調製に有用である。
【００８２】本発明の特定ヌクレオチド類の特に重要で
有用な面は、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブ類の調製にその
様なヌクレオチド類を利用することにある。その様なプ
ローブ類は、実質的にＤＮＡとマッチするヌクレオチド
配列や、局在化及び／又は同定する遺伝材料のＲＮＡ配
列を含む。プローブは１つ又はより多くの本発明の特定
ヌクレオチド類を含む。一重鎖ポリヌクレオチドの如き
目的のヌクレオチド配列を有するプローブで、ＤＮＡか
又はＲＮＡプローブは、次いで同定するＤＮＡ又はＲＮ
Ａ遺伝材料と接触させる。プローブの局在化やプローブ
を含む二重鎖ポリヌクレオチドの形成し、同定すべきＤ
ＮＡ又はＲＮＡ材料とマッチさせるに際し、生成した二
重鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ含有材料は次いで観察可能で同定
できる。本発明記載のプローブは、必要に応じて約５ヌ
クレオチドから約５００又はより多くの如何なる数のヌ
クレオチド単位をも実質的に含有できる。１２のマッチ
する、望ましくは連続したヌクレオチド単位は、もしプ
ローブの１２ヌクレオチド配列が、検査する又は同定す
べきＤＮＡ又はＲＮＡ材料中の相当する協調的配列にマ
ッチすれば検査する又は同定するＤＮＡ又はＲＮＡ材料
の大部分の同定を行うのに充分であろう。提示の如く、
その様なプローブは、本発明記載の特定Ｓｉｇ含有ヌク
レオチドを１つか又はそれ以上含み、望ましくは少くと
も、プローブ中のヌクレオチド５〜１０につき１つの特
定ヌクレオチドを含む。
【００８３】上記に提示した如く、種々の技術を本発明
の特定ヌクレオチドのＤＮＡ及び関連構造体中への取込
みのために本発明実施にあたり使用できる。上述した１
つの特に有用な技術は、ポリピリミジンの３′末端や単
鎖ＤＮＡにビオチン化したｄＵＭＰを付加するために末
端トランスフェラーゼを利用することである。３′末端
に付加したビオチン化ｄＵＭＰを有する単鎖又はクロー
ン化ＤＮＡの如き、生成する生産物をアビジンがＤＮＡ
の末端にあるビオチン化ｄＵＭＰと複合体を形成した後
回収するようなＳｅｐｈａｒｏｓｅ−アビジンカラムク
ロマトグラフィにより回収出来る。本発明実施により、
ｍＲＮＡへのハイブリディゼーションを溶液中で行なわ
せ、生成するハイブリドをＳｅｐｈａｒｏｓｅ−アビジ
ンカラムで回収しそれからｍ−ＲＮＡを回収できる。同
様の技術を使って、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリドを分離で
きる。本発明記載の特定ヌクレオチドの付加に末端トラ
ンスフェラーゼを利用するこの技術は広範に応用可能で
あり、特定のビオチン化ヌクレオチドや特定のグリコシ
ル化ヌクレオチドを含む、本発明記載の特定ヌクレオチ
ドを含む生成修飾ヌクレオチドをＳｅｐｈａｒｏｓｅ−
アビジンカラム処理でアビジンと複合体を形成するか又
はコンカナバリンＡの如き、レクチンと複合体を形成す
るか或いはセファロース−コンカナバリンＡカラムで選
択的に回収出来る。本発明実施の実例として、ビオチン
化したｄＵＴＰを末端トランスフェラーゼを利用してｄ
ＵＴＰの３′末端に付加し、生成する生産物をＧ−５０
セファロースで精製しセファロース−アビジンアフィニ
ティカラムで分離した。その結果ｄＵＴＰ分子の６９％
をビオチン化し、セファロース−アビジンカラムで回収
した。本実験の結果により、末端トランスフェラーゼが
ポリピリミジンの３′末端にビオチン化ｄＵＭＰを付加
する事実が確立された。特定の分子が共有結合で付加し
た核酸の検出を小分子が特異的に結合することが知られ
ている、天然に存在する蛋白を使って行うことが出来
る。この方法では小分子がアリルアミン側鎖を用いてヌ
クレオチドに結合する。これらのヌクレオチド類は、次
いでＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼ、又はリガーゼ反
応、又は化学結合を利用して特定のヌクレオチドに取込
ませる。このプローブを相補性アンチプローブ配列とア
ニーリングの後、プローブの存在をプローブに共有結合
したリガンドに対する蛋白の特異的結合により検出す
る。
【００８４】この様な型の検出体系に適当な蛋白−リガ
ンド反応の例としては：１．酵素とアロステリック作働
子（エフェクター）又はモジュレーター分子。この例と
してはヘテロトロピック酵素のスレオニンデヒドラター
ゼ酵素で、この系ではエフェクター分子が基質のＬ−ス
レオニンとは異なる、Ｌ−イソロイシンである、Ｊ．Ｍ
ｏｎｏｄ，Ｊ．Ｗｙｍａｎ ａｎｄ Ｊ．Ｐ．ｃｈａｎ
ｇｅｕｘ（１９６５）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：
８８−１１８。２．調節に関与するエフェクター分子。
この例としてはサイクリックＡＭＰ受容体に対する
３′，５−サイクリックアデノシンモノフォスフェート
の特異的結合がある、Ｉ．Ｐａｓｔａｎ ａｎｄ Ｒ．
Ｐｅｒｌｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １６９：３３９−３
４４（１９６９）。他の例としては、乳糖レプレッサー
分子と誘導物質のイソプロピルチオガラクトシド、又は
チオメチルガラクトシドがある。この２つの誘導分子は
それらが誘導する酵素により代謝されない事から無償性
誘導分子と呼ばれている、Ｗ．Ｇｉｌｂｅｒｔ ａｎｄ
Ｂ．Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｉｌｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳ），７０：３５８１−３５８
４、（１９７３）。３．ホルモン受容体、又は有機分子
が特異的に結合する細胞表面の他の受容体。この１例と
してはエピネフリンが、受容体に高い親和性を持ち立体
特異的方法で結合するエピネフリン−エピネフリン受容
体系がある。この系では、受容体蛋白が水に不溶性なの
で、例えばリポゾームの如きリピドの様な二層膜構造中
に封埋する。適当な検出体系としては、特異的酵素、又
はリピド二層膜の内側又は中の蛍光分子を含む。４．小
分子の輸送に際して含まれる、特異的リガンド結合蛋
白。この例としては多くのアミノ酸、グルコース、ガラ
クトース、リボース及び他の糖類に結合する、細菌のペ
リプラスミック結合蛋白Ｐａｒｄｅｅ，Ａ．Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，１６２：６３２−６３７、（１９６８）；Ｇ．
Ｌ．Ｈａｚｅｌｂａｕｒ ａｎｄ Ｊ．Ａｄｌｅｒ，Ｎ
ａｔｕｒｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏ．２３０：１０１−１０
４、（１９７１）。
【００８５】上述の例では、核酸に結合したリガンド
は、天然に存在する蛋白と反応する。この反応の特異性
は蛋白のリガンド−結合部位に存在する。天然に存在す
る蛋白と相互作用をする小分子の更に１つの例としては
酵素に対する補酵素又は他の補欠分子の特異的結合があ
る。これら補酵素の例としてはチアミンピロリン酸、フ
ラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオ
チド、ニコチナミドアデニンジヌクレオチド、ニコチン
アデニンジヌクレオチドリン酸、コエンザイムＡ、ピリ
ドキサールリン酸、ビオチン、テトラヒドロ葉酸コエン
ザイムＢ12、リポイック酸及びアスコルビン酸がある。
これら分子の多くはそれらのアポ酵素と共有結合を形成
する。しかしながら或るもの例えばコエンザイムＡ、コ
エンザイムＢ12及びテトラヒドロ葉酸は、非共有結合だ
が、それらの同類のアポ酵素と特異的方法で結合する。
本系で利用する特定の補酵素−アポ酵素系としては、大
腸菌より分離した、フラビンアデニンジヌクレオチド
（ＦＡＤ）とフラビンアデニンジヌクレオチドリダクタ
ーゼがある。この系では、ＦＡＤの結合が充分に強く、
検出が可能である。リン酸部分Ｐ、糖又は単糖部分Ｓ、
プリン又はピリミジンの塩基部分Ｂ、そしてＰ、Ｓ又は
Ｂ部分に共有結合で付加した、信号発信又は自己−検出
部分、Ｓｉｇ等の成分を含む本発明の特定ヌクレオチド
やそのようなヌクレオチド、一重鎖又は二重鎖ポリヌク
レオチド、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含むポリヌクレオ
チドは、上述の如く、多くの利用方法や用途がある。例
えば、本発明のヌクレオチドや、本発明のヌクレオチド
を含むポリヌクレオチドは、免疫促進剤として、ワクチ
ンのアジュバントとして、リンパ球の様な感能細胞の誘
導、リンフォカイン、サイトカインやサイトキニン、イ
ンターフェロンや他の細胞性生産物の生産に有用であ
る。
【００８６】二重鎖ポリＡ：Ｕは、活性は弱いが、イン
ターフェロン生産の促進剤又は誘導剤としてよく知られ
ている。同様に、ポリＩ：Ｃも、インターフェロン生産
の促進剤又は誘導剤として知られている。本発明記載の
１つ又はより多くのヌクレオチドを含む、二重鎖ポリヌ
クレオチドの様な、ポリヌクレオチドの利点は、実際、
この様なポリヌクレオチドが、インターフェロンや関連
物質の細胞からの生産に関しより効果的でより強力な誘
導又は促進剤であることだろう。例えば、上記の成分
Ｐ、Ｓ、Ｂ及びＳｉｇを含む、本発明記載のヌクレオチ
ドを、それから調製したヌクレオチドやポリヌクレオチ
ドがヌクレアーゼ類に対しより耐性である様に適当に調
製する。同様に上記同成分を含むヌクレオチドやポリヌ
クレオチドを、リンパ球の細胞表面や膜又は、インター
フェロンの如き、目的の細胞生産物の生産のために細胞
を刺激するような他の細胞表面や膜に、接触し、刺激
し、浸透するより強い能力を持つ様に適当に調製する。
【００８７】本発明記載の、Ｐ−Ｓ−Ｂ式で表わされる
これら特定のヌクレオチド類で格別に有用であり、特に
有用なものは、Ｓｉｇ成分が、ピリミジンの５位又はプ
リン又はデアザプリンの７位又はグアニンのＮ2 位又は
アデニンのＮ6 位にあるものである。その様なヌクレオ
チド及び、それを含むポリヌクレオチドで一重鎖と二重
鎖の両方のＤＮＡ及び／又はＲＮＡを二重鎖らせんＤＮ
Ａ又はＲＮＡ又はそれを含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリド
の安定性を増加するため本発明に従って調製する。ヌク
レアーゼに耐性を増加することや疎水性の変更又は有利
な変化や、ヌクレオチドやそれを含むポリヌクレオチド
の電気的又は荷電性状の変化を達成出来る。又、本発明
記載のヌクレオチド及びポリヌクレオチドを、人間を投
与する際に、発熱性を減少する、或いはその他の全身毒
性反応の発現を減少せしめる様に調製する。更に、ヌク
レオチド及びポリヌクレオチドを、特定のポリペプチド
が結合してＲＮＡ複合体形成を作り出すか生むために結
合できるＳｉｇ成分の如きリガンドを提供する。従って
本発明のヌクレオチドはＰ、Ｓ、Ｂ及びＳｉｇがＰ、Ｓ
又はＢ成分に共有結合で付加するようなＳｉｇ成分を含
み、治療効果や細胞毒性効果を含む特定の生物学的効果
を有する総勢の化学的作用剤を開発又は提供する。イン
ターフェロン、リンフォカイン及び／又はサイトカイン
の如き、細胞材料や生産物の生産に刺激又は誘導剤とし
て働くことに加えて、本発明の特定のヌクレオチドと、
これらヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、又それ
らの化学療法上の効果の由に、そしてそれに基づく化学
療法剤の調製の由にしかし又、それらの細胞毒性効果と
それに基づく細胞傷害剤の生産に有用である。他の成分
即ち成分Ｐ、Ｓ、Ｂを含む、本発明の特定のヌクレオチ
ドに付加したＳｉｇ部分は、既知の化学療法、或いは細
胞毒性効果を有する特定の作用剤のＳｉｇ成分に付加す
るための場所をそれ自体で提供している。そのようなヌ
クレオチド類を体或いは細胞ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの
合成を阻害するか、癌を攻撃して、実際殺すか又はさも
なくば、不必要な細胞の生育を阻害するために、体や細
胞のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ成分に取込ませるように、
被処置体、即ち人体又は動物に導入又は投与出来る。ヌ
クレオチド及び／又はヌクレオチド含有ポリヌクレオチ
ドを体、人体や動物に投与するには幾つかの適当な方法
がある。特に有効な方法は、本発明のヌクレオチド含有
標品や適当な生理的に受け入れ可能な担体を静注して導
入することであり、又ヌクレオチドを、皮下や、経皮的
に或いは筋注、又はヌクレオチド類の化学療法的又は細
胞毒性的な効果を発揮させたい部位に直接導入すること
により投与できる。目的の化学療法的又は細胞毒性効果
を、全身的又は局所的に発現させ得るのみならず、上述
の如く、本発明の特定のＰ、Ｓ、Ｂ及びＳ−含有ヌクレ
オチド並びにそれらをヌクレオチドを含む、ポリヌクレ
オチドは免疫促進剤及びその補助剤として有用である。
従って、特定のヌクレオチド及び本発明に従ったポリヌ
クレオチド含有ワクチン類を、効果や融通性を改良して
調製出来る。
【００８８】本発明の特定のヌクレオチドを含む、改良
型ポリヌクレオチドの本発明実施に際し特に重要なのは
インターフェロンの誘導物質又は促進物質として使うこ
とである。そのようなポリヌクレオチドは一重鎖又は二
重鎖リボヌクレオチド、ｄＳＲＮＡで次の構造を有し、
【化４３】又は
【化４４】 で、Ａ及びＢは相補的塩基対で、例えば上述の如くピリ
ミジンの５位又はプリンの７位又はグアニンのＮ2 、又
はアデニンのＮ6 又はシトシンのＮ4 に、本発明記載の
有機部分Ｓｉｇで修飾したプリン、７−デアザプリンや
ピリミジンである。これらの部位に修飾を受けたポリヌ
クレオチド類は、会合率や融点測定結果から、比較的非
解裂的又は非解裂二重鎖核酸分子になるのがわかる。イ
ンターフェロンや、他の細胞の又は液性の因子やリンフ
ォカインやサイトカイン類の如き成分の誘導物質として
使用する本発明の特定のポリヌクレオチド類では、次の
式で示す基を付加する。
【化４５】 インターフェロン生産の誘導工程に本発明の特定ｄＳＲ
ＮＡの如き、本発明の特定ポリヌクレオチドを利用する
に際し、ＤＥＡＥ−デキストランがこの工程を促進する
ことが知られている。ＤＥＡＥ−デキストランはｄＳＲ
ＮＡと複合体を形成し、ヌクレアーゼ分解から保護し、
それによりインターフェロンの誘導を促進すると思われ
る。ポリｒｃ：ｒｌはＤＥＡＥ−デキストランと複合体
を形成するとより効率よく細胞に取り込まれることも知
られている。従って本発明の実施に際し、本発明の特定
ｄＳＲＮＡの疎水性やイオン又は荷電性状が重要な因子
であり、このものをインターフェロン生産の誘導に応用
可能にしている。インターフェロンの誘導を促進するこ
の様な条件や因子は又リンフォカインやサイトカインな
どの他の細胞性及び液性成分の誘導をし又は促進する。
従って、特定ヌクレオチドや本発明の特定のヌクレオチ
ド含有ポリヌクレオチドは単にインターフェロン生産の
誘導物質として有効というよりも免疫調節物質及び促進
物質として作用する。本発明実施に従った上記目的のた
めの優れた作用剤としてはヌクレオチドを含み、その中
のＳｉｇ部分がビオチン又はストレプトアビジン又はア
ビジンを取込む。ポリｒｌ：ポリｒｃ複合ホリレーリジ
ンは補助活性を示し、その作用は、ポリｒｌとポリｒｃ
成分が本発明に従った特定ヌクレオチドを１つかもっと
多く含む時には、本発明実施に従って、促進及び改良さ
れる。
【００８９】本発明に従ったＤＮＡプローブ調製を、本
明細書記載の特定ヌクレオチドの調製又は利用を要しな
い方法で行うことができる。例えば二重鎖ＤＮＡは発癌
物質やアルキル化剤と反応する。発癌物質が二重鎖ＤＮ
Ａと反応したり又アルキル化した後、生成した修飾ＤＮ
Ａを融かしＤＮＡと発癌物質又はアルキル化剤の反応生
成物を含むＤＮＡハイブリド形成プローブを作る。この
様に修飾又は反応したＤＮＡを、ハイブリド形成プロー
ブとして使う時には生成した二重らせん又は二重鎖ＤＮ
Ａを二重抗体法により検定又は検査する。主要抗体は抗
発癌物質で二次抗体はわさび−ペルオキシダーゼ共役抗
ペルオキシダーゼ抗体である。この技術の長所は二重鎖
ＤＮＡを標識するのが容易であるということである。こ
の方法を本発明記載の例で示し、これは一般に二重鎖又
は二重らせんＤＮＡからＤＮＡプローブを調製すること
に応用出来る。しかしながら、この方法は二重らせんデ
オキシリボヌクレオチドポリマー又はＤＮＡの修飾を伴
う解裂的方法である。本発明実施中用いた又は開発した
特定のヌクレオチド及び修飾ＤＮＡに関する記述で、モ
ノ、オリゴ、及びポリサッカライドに関し述べてきた。
モノ、オリゴ及びポリサッカライド誘導体が又本発明の
特定ヌクレオチドの調製に有用である。例えば、特定ヌ
クレオチドの組立てに使う各糖部分を修飾でき、生成す
る修飾糖部分を使って、更に多くの化学反応を起す或い
は行わせることができる。この様な修飾モノ、オリゴ及
びポリサッカライドを、本発明の特定ヌクレオチド調製
の際のＳｉｇ部分として用いれば、糖Ｓ又はそれに由来
するＳｉｇ部分として、その様な修飾サッカライドを含
むヌクレオチドや他の成分の検出に関し、融通性が追加
される。
【００９０】本発明の他の面として、Ｓｉｇ部分をヌク
レオチドに付加させる代りに、蛋白に付加しても使用で
きる。その様な蛋白をヌクレオチドやポリヌクレオチド
に付加できるのみならず、それがヌクレオチド又はポリ
ヌクレオチドに付加するかしないかに拘らず、その様な
蛋白それ自体を確認できる。本発明をこの方面に関し実
施する上で適当な上述の如き蛋白付加物としては次式の
如き式を有するものが挙げられる。
【化４６】 ここでＲ1 はＯＨ又はアミノ酸又は酸、Ｒ2 はアミノ酸
側鎖、そしてＲ3 はＨ又はアミノ酸又は酸で、Ｓｉｇは
Ｒ1 及び／又はＲ2 及び／又はＲ3 に付加する。酸又は
酸で、ＳｉｇはＲ1 及び／又はＲ2 及び／又はＲ3 に付
加する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はグリコシル化ＤＮＡとコンカナバリンＡ
との結合による沈でん生成をコンカナバリンＡ濃度に対
して調べた結果を示す。
【図２】図２（Ａ）、（Ｂ）はラムダＤＮＡおよびＴ４
ＤＮＡのコンカナバリンＡ−セファロースとの結合の結
果を示す。
【図３】図３（Ａ）、（Ｂ）はＴ４ＤＮＡとコンカナバ
リンＡ−セファロースとの結合に対するマンノースの影
響を示す。
【図４】図４（Ａ）、（Ｂ）はマルトトリオース置換ラ
ムダＤＮＡのコンカナバリンＡ−セファロースへの結合
を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１１年２月１５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【化１】 （式中、Ｐはリン酸残基であり、Ｓはリボースまたはデ
オキシリボース糖残基であり、Ｂはピリミジン、プリン
または７−デアザプリン残基であって、前記のヌクレオ
チドがリボヌクレオチドの場合にはリン酸残基Ｐは糖残
基Ｓの２’位、３’位および５’位から独立に選ばれる
位置に結合し、前記のヌクレオチドがデオキシリボヌク
レオチドの場合にはリン酸残基Ｐは糖残基Ｓの３’位お
よび５’位から独立に選ばれる位置に結合し、前記の塩
基Ｂがピリミジンの場合にはＮ1位から糖残基Ｓの１’
位に結合し、前記の塩基Ｂがプリンまたは７−デアザプ
リンの場合には前記の塩基ＢはＮ9位から糖残基Ｓの
１’位に結合し、前記のＳｉｇは前記の糖残基Ｓに直接
にまたは結合基を介して共有結合している検出可能な残
基である。）を有するヌクレオチドを少なくとも一つ含
んでなるオリゴまたはポリヌクレオチド。
【化２】 （式中、Ｐはリン酸残基であり、Ｓはリボースまたはデ
オキシリボース糖残基であり、Ｂはピリミジン、プリン
または７−デアザプリン残基であって、前記のヌクレオ
チドがリボヌクレオチドの場合にはリン酸残基Ｐは糖残
基Ｓの２’位、３’位および５’位から独立に選ばれる
位置に結合し、前記のヌクレオチドがデオキシリボヌク
レオチドの場合にはリン酸残基Ｐは糖残基Ｓの３’位お
よび５’位から独立に選ばれる位置に結合し、前記の塩
基Ｂがピリミジンの場合にはＮ1位から糖残基Ｓの１’
位に結合し、前記の塩基Ｂがプリンまたは７−デアザプ
リンの場合には前記の塩基ＢはＮ9位から糖残基Ｓの
１’位に結合し、前記のＳｉｇは前記の糖残基Ｓに直接
にまたは結合基を介して共有結合している検出可能な残
基である。）を有するヌクレオチドを少なくとも一つ含
んでなるオリゴまたはポリヌクレオチド、Ｓｉｇと複合
体を形成することができるポリペプチドおよびそのよう
な複合体が形成されると検出することができる残基を含
んでなる組成物。
【化４９】 （式中、Ｐはリン酸残基であり、Ｓはリボースまたはデ
オキシリボース糖残基であり、Ｂはピリミジン、プリン
または７−デアザプリン残基であって、前記のヌクレオ
チドがリボヌクレオチドの場合にはリン酸残基Ｐは糖残
基Ｓの２’位、３’位および５’位から独立に選ばれる
位置に結合し、前記のヌクレオチドがデオキシリボヌク
レオチドの場合にはリン酸残基Ｐは糖残基Ｓの３’位お
よび５’位から独立に選ばれる位置に結合し、前記の塩
基Ｂがピリミジンの場合にはＮ1位から糖残基Ｓの１’
位に結合し、前記の塩基Ｂがプリンまたは７−デアザプ
リンの場合には前記の塩基ＢはＮ9位から糖残基Ｓの
１’位に結合し、前記のＳｉｇは前記の糖残基Ｓに直接
にまたは結合基を介して共有結合している検出可能な残
基である。）を有する少なくとも一つのヌクレオチドに
直接または間接に結合したポリマー化合物を含んでなる
組成物。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 スタンレイ クライン アメリカ合衆国ニユーヨーク州ブルツクリ ン，リンカーン プレース 235 (72)発明者 ジヤニス ジー．スタブリアノポウロス アメリカ合衆国ニユーヨーク州ニユーヨー ク，ウエスト フイフテイナイン ストリ ート 515 (72)発明者 ドリー カーテイカー アメリカ合衆国ニユーヨーク州エルムハー スト，エイテイ ストリート 42−72

Claims (44)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】一般式 【化１】 （式中、Ｐはリン酸残基であり、Ｓはリボースまたはデ
    オキシリボース糖残基であり、Ｂはピリミジン、プリン
    または７−デアザプリン残基であって、前記のヌクレオ
    チドがリボヌクレオチドの場合にはリン酸残基Ｐは糖残
    基Ｓの２’位、３’位および５’位から独立に選ばれる
    位置に結合し、前記のヌクレオチドがデオキシリボヌク
    レオチドの場合にはリン酸残基Ｐは糖残基Ｓの３’位お
    よび５’位から独立に選ばれる位置に結合し、前記の塩
    基Ｂがピリミジンの場合にはＮ1 位から糖残基Ｓの１’
    位に結合し、前記の塩基Ｂがプリンまたは７−デアザプ
    リンの場合には前記の塩基ＢはＮ9 位から糖残基Ｓの
    １’位に結合し、前記のＳｉｇは前記の糖残基Ｓに直接
    にまたは結合基を介して共有結合している検出可能な残
    基である。）を有するヌクレオチドを少なくとも一つ含
    んでなるオリゴまたはポリヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 ＳｉｇがＳのＣ２’位またはＣ３’位に
    結合している請求項１記載のオリゴまたはポリヌクレオ
    チド。
  3. 【請求項３】 ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチ
    ドを含んでなる請求項１記載のオリゴまたはポリヌクレ
    オチド。
  4. 【請求項４】 ヌクレオチドがリボヌクレオチドを含ん
    でなる請求項１記載のオリゴまたはポリヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 Ｓｉｇが少なくとも３個の炭素原子を含
    む残基を含んでなる請求項１記載のオリゴまたはポリヌ
    クレオチド。
  6. 【請求項６】 Ｓｉｇが単糖、オリゴ糖および多糖から
    なる群から選ばれる請求項１記載のオリゴまたはポリヌ
    クレオチド。
  7. 【請求項７】 Ｓｉｇが三糖、四糖、五糖、六糖、七糖
    および八糖からなる群から選ばれる請求項６記載のオリ
    ゴまたはポリヌクレオチド。
  8. 【請求項８】 Ｓｉｇがグリコシド結合残基を含む請求
    項１記載のオリゴまたはポリヌクレオチド。
  9. 【請求項９】 Ｓｉｇが糖残基を含んでなり、該糖残基
    がその結合タンパクと複合体を形成している請求項１記
    載のオリゴまたはポリヌクレオチド。
  10. 【請求項１０】 前記結合タンパクがレクチンを含んで
    なる請求項９記載のオリゴまたはポリヌクレオチド。
  11. 【請求項１１】 前記レクチンがコンカナバリンＡを含
    んでなる請求項１０記載のオリゴまたはポリヌクレオチ
    ド。
  12. 【請求項１２】 Ｓｉｇがビオチン、イミノビオチン、
    電子濃密成分、磁気成分、酵素、ホルモン成分、放射活
    性成分、金属含有成分、蛍光成分、化学発光成分、抗
    原、ハプテンおよび抗体成分からなる群から選ばれる成
    分を含んでなる請求項１記載のオリゴまたはポリヌクレ
    オチド。
  13. 【請求項１３】 前記電子濃密成分がフェリチンを含ん
    でなる請求項１２記載のオリゴまたはポリヌクレオチ
    ド。
  14. 【請求項１４】 Ｓｉｇがその結合タンパクと複合体を
    形成しており、該結合タンパクがフェリチンに複合化さ
    れている請求項１２記載のオリゴまたはポリヌクレオチ
    ド。
  15. 【請求項１５】 前記レクチンがフェリチンに複合化さ
    れている請求項１０記載のオリゴまたはポリヌクレオチ
    ド。
  16. 【請求項１６】 前記コンカナバリンＡがフェリチンに
    複合化されている請求項１１記載のオリゴまたはポリヌ
    クレオチド。
  17. 【請求項１７】 前記Ｓｉｇが放射活性同位体を含んで
    なる請求項１２記載のオリゴまたはポリヌクレオチド。
  18. 【請求項１８】 前記放射活性同位体が放射活性コバル
    トを含んでなる請求項１７記載のオリゴまたはポリヌク
    レオチド。
  19. 【請求項１９】 Ｓｉｇが酵素を含んでなる請求項１２
    記載のオリゴまたはポリヌクレオチド。
  20. 【請求項２０】 前記酵素がアルカリホスファターゼ、
    酸ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレ
    アーゼ、西洋ワサビパーオキシダーゼ、グルコースオキ
    シダーゼおよびパーオキシダーゼからなる群から選ばれ
    る請求項１９記載のオリゴまたはポリヌクレオチド。
  21. 【請求項２１】 Ｓｉｇが蛍光成分を含んでなる請求項
    １２記載のオリゴまたはポリヌクレオチド。
  22. 【請求項２２】 前記蛍光成分がフルオレセイン、ロダ
    ミンおよびダンシルからなる群から選ばれる請求項２１
    記載のオリゴまたはポリヌクレオチド。
  23. 【請求項２３】 Ｓｉｇが磁気成分を含んでなる請求項
    １２記載のオリゴまたはポリヌクレオチド。
  24. 【請求項２４】 前記磁気成分が磁性酸化物を含んでな
    る請求項２３記載のオリゴまたはポリヌクレオチド。
  25. 【請求項２５】 該磁性酸化物が酸化第二鉄（ｆｅｒｒ
    ｉｃ ｏｘｉｄｅ）を含んでなる請求項２４記載のオリ
    ゴまたはポリヌクレオチド。
  26. 【請求項２６】 Ｓｉｇが特異的な抗体と複合体を形成
    することができるハプテン成分を含む請求項１２記載の
    オリゴまたはポリヌクレオチド。
  27. 【請求項２７】 Ｓｉｇが金属含有成分を含んでなる請
    求項１２記載のオリゴまたはポリヌクレオチド。
  28. 【請求項２８】 Ｓｉｇが触媒的金属含有成分を含む請
    求項１記載のオリゴまたはポリヌクレオチド。
  29. 【請求項２９】 Ｓｉｇが化学発光成分を含んでなる請
    求項１２記載のオリゴまたはポリヌクレオチド。
  30. 【請求項３０】 前記オリゴまたはポリヌクレオチドが
    ポリペプチドの末端に結合しているか、または付着して
    いる請求項１記載のオリゴまたはポリヌクレオチド。
  31. 【請求項３１】 一般式 【化２】 （式中、Ｐはリン酸残基であり、Ｓはリボースまたはデ
    オキシリボース糖残基であり、Ｂはピリミジン、プリン
    または７−デアザプリン残基であって、前記のヌクレオ
    チドがリボヌクレオチドの場合にはリン酸残基Ｐは糖残
    基Ｓの２’位、３’位および５’位から独立に選ばれる
    位置に結合し、前記のヌクレオチドがデオキシリボヌク
    レオチドの場合にはリン酸残基Ｐは糖残基Ｓの３’位お
    よび５’位から独立に選ばれる位置に結合し、前記の塩
    基Ｂがピリミジンの場合にはＮ1 位から糖残基Ｓの１’
    位に結合し、前記の塩基Ｂがプリンまたは７−デアザプ
    リンの場合には前記の塩基ＢはＮ9 位から糖残基Ｓの
    １’位に結合し、前記のＳｉｇは前記の糖残基Ｓに直接
    にまたは結合基を介して共有結合している検出可能な残
    基である。）を有するヌクレオチドを少なくとも一つ含
    んでなるオリゴまたはポリヌクレオチド、Ｓｉｇと複合
    体を形成することができるポリペプチドおよびそのよう
    な複合体が形成されると検出することができる残基を含
    んでなる組成物。
  32. 【請求項３２】 前記ポリペプチドがポリリシンを含ん
    でなる請求項３１記載の組成物。
  33. 【請求項３３】 前記ポリペプチドがアビジン、ストレ
    プタビジンおよび抗Ｓｉｇ免疫グロブリンからなる群か
    ら選ばれる少なくとも一つを含んでなる請求項３１記載
    の組成物。
  34. 【請求項３４】 Ｓｉｇがリガンドを含んでなり、前記
    ポリペプチドがその抗体を含んでなる請求項３１記載の
    組成物。
  35. 【請求項３５】 前記検出することができる残基が、ビ
    オチン、イミノビオチン、電子濃密成分、磁気成分、酵
    素、ホルモン成分、放射活性成分、金属含有成分、蛍光
    成分、化学発光成分、抗原、ハプテンおよび抗体成分か
    らなる群から選ばれる請求項３１記載の組成物。
  36. 【請求項３６】 前記Ｓｉｇが、前記ヌクレオチドがオ
    リゴまたはポリヌクレオチドに取り込まれるか、含まれ
    るか、または会合する時に検出することができる残基を
    含んでなる請求項３記載のオリゴまたはポリデオキシリ
    ボヌクレオチド。
  37. 【請求項３７】 前記Ｓｉｇが、前記リボヌクレオチド
    がオリゴまたはポリヌクレオチドに取り込まれるか、含
    まれるか、または会合する時に検出することができる残
    基を含んでなる請求項４記載のオリゴまたはポリデオキ
    シリボヌクレオチド。
  38. 【請求項３８】 一本鎖の形態の請求項１記載のオリゴ
    またはポリヌクレオチド。
  39. 【請求項３９】 リボ核酸またはデオキシリボ核酸を含
    んでなる請求項３８記載の一本鎖オリゴまたはポリヌク
    レオチド。
  40. 【請求項４０】 二本鎖の形態の請求項１記載のオリゴ
    またはポリヌクレオチド。
  41. 【請求項４１】 リボ核酸またはデオキシリボ核酸を含
    んでなる請求項４０記載の二本鎖オリゴまたはポリヌク
    レオチド。
  42. 【請求項４２】 前記共有結合が 【化４７】 を含んでなる請求項１記載のオリゴまたはポリヌクレオ
    チド。
  43. 【請求項４３】 前記化学結合が、Ｐに対してα位の位
    置に、オレフィン結合または下記の基 【化４８】 のいずれかを含んでなる請求項１記載のオリゴまたはポ
    リヌクレオチド。
  44. 【請求項４４】 一般式 【化４９】 （式中、Ｐはリン酸残基であり、Ｓはリボースまたはデ
    オキシリボース糖残基であり、Ｂはピリミジン、プリン
    または７−デアザプリン残基であって、前記のヌクレオ
    チドがリボヌクレオチドの場合にはリン酸残基Ｐは糖残
    基Ｓの２’位、３’位および５’位から独立に選ばれる
    位置に結合し、前記のヌクレオチドがデオキシリボヌク
    レオチドの場合にはリン酸残基Ｐは糖残基Ｓの３’位お
    よび５’位から独立に選ばれる位置に結合し、前記の塩
    基Ｂがピリミジンの場合にはＮ1 位から糖残基Ｓの１’
    位に結合し、前記の塩基Ｂがプリンまたは７−デアザプ
    リンの場合には前記の塩基ＢはＮ9 位から糖残基Ｓの
    １’位に結合し、前記のＳｉｇは前記の糖残基Ｓに直接
    にまたは結合基を介して共有結合している検出可能な残
    基である。）を有する少なくとも一つのヌクレオチドに
    直接または間接に結合したポリマー化合物を含んでなる
    組成物。
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NO (1) NO832292L (ja)

Families Citing this family (215)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL70765A (en) * 1983-01-27 1988-07-31 Enzo Biochem Inc Substrates containing non-radioactive chemically-labeled polynucleotides and methods using them
US4994373A (en) 1983-01-27 1991-02-19 Enzo Biochem, Inc. Method and structures employing chemically-labelled polynucleotide probes
FR2540122B1 (fr) * 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4948882A (en) * 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
CA1254525A (en) * 1983-04-13 1989-05-23 Christine L. Brakel Kit for terminally chemically labeling dna
EP0124124A3 (en) * 1983-05-02 1987-08-26 Enzo Biochem, Inc. Method and materials useful for the analysis and detection of genetic material
CA1228811A (en) 1983-05-05 1987-11-03 Robert G. Pergolizzi Assay method utilizing polynucleotide sequences
DE3485811T2 (de) * 1983-05-31 1993-01-07 Orgenics Ltd Molekulare genetische sonde und verfahren zu ihrer herstellung, testmethode und satz in denen diese molekulare genetische sonde gebraucht wird.
CA1338856C (en) * 1983-07-05 1997-01-21 Jannis Stavrianopoulos In vivo labelling of polynucleotide sequences
US4724202A (en) * 1983-12-12 1988-02-09 Molecular Diagnostics, Inc. Use of non-hybridizable nucleic acids for the detection of nucleic acid hybridization
EP0144914A3 (en) * 1983-12-12 1986-08-13 Miles Inc. Hybridization assay employing labeled pairs of hybrid binding reagents
IL73578A (en) * 1983-12-12 1989-09-28 Miles Lab Method and reagent for the detection of polynucleotide sequence in sample of dna or rna by using a nucleic acid probe and contact of duplexes with immobilizing antibody
US4777129A (en) * 1983-12-12 1988-10-11 Molecular Diagnostics, Inc. Nucleic acid probe detectable by specific nucleic acid binding protein
EP0146039A3 (en) * 1983-12-12 1986-08-27 Miles Inc. Hybridization assay with immobilization of hybrids by antihybrid binding
USRE43096E1 (en) 1984-01-16 2012-01-10 California Institute Of Technology Tagged extendable primers and extension products
US4707440A (en) * 1984-01-30 1987-11-17 Enzo Biochem, Inc. Nucleic acid hybridization assay and detectable molecules useful in such assay
US4748111A (en) * 1984-03-12 1988-05-31 Molecular Diagnostics, Inc. Nucleic acid-protein conjugate used in immunoassay
CA1260372A (en) * 1984-04-27 1989-09-26 Elazar Rabbani Hybridization method for the detection of genetic materials
US4766064A (en) * 1984-05-07 1988-08-23 Allied Corporation Displacement polynucleotide assay employing polyether and diagnostic kit
US4766062A (en) * 1984-05-07 1988-08-23 Allied Corporation Displacement polynucleotide assay method and polynucleotide complex reagent therefor
CA1264451A (en) * 1984-05-23 1990-01-16 Nanibhushan Dattagupta Nucleic acid probe coupled to radioactive label
US4670380A (en) * 1984-05-23 1987-06-02 Molecular Diagnostics, Inc. Assays utilizing labeled nucleic acid probes
US4957858A (en) * 1986-04-16 1990-09-18 The Salk Instute For Biological Studies Replicative RNA reporter systems
IL71947A (en) * 1984-05-29 1987-10-30 Yeda Research And Dev Comp Ltd Enzyme hydrazides and method for detection and determination of glycoconjugates
FR2565996B1 (fr) * 1984-06-15 1988-01-22 Inst Nat Sante Rech Med Acides nucleiques marques chimiquement, leur utilisation et necessaire pour sa mise en oeuvre
DE3431536A1 (de) * 1984-08-28 1986-03-13 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Derivatisierte nucleinsaeure-sequenz, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zum nachweis von nucleinsaeuren
US4692509A (en) * 1984-11-27 1987-09-08 Molecular Diagnostics, Inc. Radioactive labeling of proteins with nucleosides or nucleotides
US4670379A (en) * 1984-12-19 1987-06-02 E. I. Du Pont De Nemours And Company Polynucleotide hydridization assays employing catalyzed luminescence
ATE43348T1 (de) * 1985-01-24 1989-06-15 Neopharmed Spa Acylierte cytidin-diphosphat-choline, verfahren zu ihrer herstellung und ihre therapeutische verwendung.
DE3667669D1 (de) * 1985-03-21 1990-01-25 Molecular Diagnostics Inc Spezifische jodierung von nukleinsaeure.
US4767699A (en) * 1985-05-02 1988-08-30 Allied Corporation Diagnostic reagent, kit and method employing polynucleotide displacement, separation, enzymatic cleavage and adenosine phosphate detection
US5273882A (en) * 1985-06-13 1993-12-28 Amgen Method and kit for performing nucleic acid hybridization assays
US4833251A (en) * 1985-06-25 1989-05-23 Siska Diagnostics, Inc. Compounds for tagging nucleic acid probes
JPS622164A (ja) * 1985-06-25 1987-01-08 シスカ・ダイアグノステイツクス・インコ−ポレ−テツド Ｎ４−（置換アミノ）シチジンを含む核酸プロ−ブ
US4780405A (en) * 1985-06-25 1988-10-25 Siska Diagnostics, Inc. Carbonic anhydrase inhibitor-tagged nucleic acid probes
CA1295559C (en) * 1985-08-13 1992-02-11 Jannis Stavrianopoulos Method for labeling polynucleotide sequences
JP2509574B2 (ja) * 1985-08-15 1996-06-19 アモコ・コーポレーション 標識付けした核酸
JP3293820B2 (ja) * 1985-12-13 2002-06-17 エンゾ− バイオケム インコ−ポレイテツド 標的ポリヌクレオチドにハイブリツド形成するための新規な一工程方法とポリヌクレオチド化合物
JPS638396A (ja) * 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
US6022958A (en) * 1986-08-13 2000-02-08 Bayer Corporation cDNAs coding for members of the carcinoembryonic antigen family
GB8621337D0 (en) * 1986-09-04 1986-10-15 Agricultural Genetics Co Non-radioactive nucleic acid hybridization probes
SE454781B (sv) * 1986-10-17 1988-05-30 Wallac Oy Hybridiseringsforfarande for detektion av polynukleotidsekvens
AU619170B2 (en) * 1987-01-09 1992-01-23 Abbott Laboratories Diagnostic assays using nucleic acid probes
US5227474A (en) * 1987-02-13 1993-07-13 Abbott Laboratories Bifunctional chelating agents
US5057302A (en) * 1987-02-13 1991-10-15 Abbott Laboratories Bifunctional chelating agents
AU622104B2 (en) * 1987-03-11 1992-04-02 Sangtec Molecular Diagnostics Ab Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and kit therefore
WO1989001049A1 (en) * 1987-07-31 1989-02-09 Gen-Probe Incorporated Assay for polynucleotides employing oligonucleotides to eliminate undesirable cross reactions
GB2209754A (en) * 1987-09-17 1989-05-24 Thomas Lee Mattson Polyaldehydic polynucleotides in use as probes,their preparation and use
US5245026A (en) * 1987-09-24 1993-09-14 Abbott Laboratories Metal containing 8-hydroxyquinoline chelating agents
US5021567A (en) * 1987-09-24 1991-06-04 Abbott Laboratories 8-hydroxyquinoline chelating agents
US5525465A (en) * 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3856406T2 (de) * 1987-10-28 2000-10-19 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine, Parkville Oligonucleotid-polyamid konjugate
US4886741A (en) * 1987-12-09 1989-12-12 Microprobe Corporation Use of volume exclusion agents for the enhancement of in situ hybridization
US5109124A (en) * 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5047523A (en) * 1988-08-02 1991-09-10 Ortho Diagnostic Systems Inc. Nucleic acid probe for detection of neisseria gonorrhoea
US5185243A (en) * 1988-08-25 1993-02-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Method for detection of specific nucleic acid sequences
US5858652A (en) * 1988-08-30 1999-01-12 Abbott Laboratories Detection and amplification of target nucleic acid sequences
KR910700348A (ko) * 1988-12-07 1991-03-14 원본미기재 삽입을 함유하는 또는 결실에 해당하는 dna의 풍부화 및 클로닝 방법
US5324829A (en) * 1988-12-16 1994-06-28 Ortho Diagnostic Systems, Inc. High specific activity nucleic acid probes having target recognition and signal generating moieties
GR1000347B (el) * 1988-12-21 1992-06-25 Ortho Diagnostic Systems Inc Μεθοδος παραγωγης νουκλεοτιδικων ανιχνευτων χρησιμοποιωντας ενα συμπληρωμα γεφυρωσεως.
US5998135A (en) * 1989-02-24 1999-12-07 Enzo Diagnostics, Inc. Energy transfer hybridization assay using intercalators and lanthanide metals
DE69028725T2 (de) * 1989-02-28 1997-03-13 Canon Kk Partiell doppelsträngiges Oligonukleotid und Verfahren zu seiner Bildung
CA2012982A1 (en) * 1989-03-27 1990-09-27 Frank W. Hobbs Process for rapid nucleic acid detection by incorporating a reporter moiety into amplified target nucleic acid
DE3916871A1 (de) * 1989-05-24 1990-11-29 Boehringer Mannheim Gmbh Modifiziertes phosphoramidit-verfahren zur herstellung von modifizierten nukleinsaeuren
EP0407816A3 (en) * 1989-07-14 1993-01-27 Abbott Laboratories Base modified nucleosides
DE4020529A1 (de) * 1989-09-12 1991-03-21 Roxana Vasiloiu Multifunktionelle(s) enzym(e) mit nucleosid-didesoxyribosyltransferase(n) und/oder nucleoside-desoxyribosyltransferasen(n) und/oder kinease- und/oder reduktase- und/oder desaminase- und/oder polymerase-aktivitaet
EP0422861B1 (en) * 1989-10-13 2000-05-17 Zeneca Limited Probes
WO1993024511A1 (en) * 1992-05-29 1993-12-09 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates
WO1991011533A1 (en) * 1990-01-26 1991-08-08 E.I. Du Pont De Nemours And Company Method for isolating primer extension products from template-directed dna polymerase reactions
CA2079109A1 (en) * 1990-03-29 1991-09-30 John A. Latham Oligonucleotide-transport agent disulfide conjugates
US5677440A (en) * 1990-07-16 1997-10-14 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates
US5612199A (en) * 1991-10-11 1997-03-18 Behringwerke Ag Method for producing a polynucleotide for use in single primer amplification
US5292938A (en) * 1992-04-13 1994-03-08 Associated Universities, Inc. Synthesis of 4-substituted-trans-1, 2-diaminocyclohexyl polyaminocarboxylate metal chelating agents for the preparation of stable radiometal antibody immunoconjugates for therapy and spect and pet imaging
DE69310179T2 (de) * 1992-07-31 1997-07-31 Behringwerke Ag Verfahren zur einführung von definierten sequenzen am 3' ende von polynukleotiden
US5312527A (en) * 1992-10-06 1994-05-17 Concordia University Voltammetric sequence-selective sensor for target polynucleotide sequences
US6495676B1 (en) 1993-04-13 2002-12-17 Naxcor Nucleic acid sequence detection employing probes comprising non-nucleosidic coumarin derivatives as polynucleotide-crosslinking agents
US5616464A (en) * 1994-12-27 1997-04-01 Naxcor Nucleic acid sequence detection employing amplification probes
US5767259A (en) * 1994-12-27 1998-06-16 Naxcor Oligonucleotides containing base-free linking groups with photoactivatable side chains
US6294323B1 (en) 1993-04-14 2001-09-25 Behringwerke Ag Self initiating single primer amplification of nucleic acids
US5925517A (en) * 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
US5446137B1 (en) * 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
CA2140081C (en) * 1994-01-13 2008-04-01 Dean L. Engelhardt Process, construct and conjugate for producing multiple nucleic acid copies
US5731153A (en) * 1996-08-26 1998-03-24 The Regents Of The University Of California Identification of random nucleic acid sequence aberrations using dual capture probes which hybridize to different chromosome regions
US5783387A (en) * 1995-02-06 1998-07-21 The Regents Of The University Of California Method for identifying and quantifying nucleic acid sequence aberrations
US6027879A (en) * 1995-08-09 2000-02-22 The Regents Of The University Of California Detection and isolation of nucleic acid sequences using a bifunctional hybridization probe
US5616465A (en) * 1995-08-09 1997-04-01 The Regents Of The University Of California Detection and isolation of nucleic acid sequences using competitive hybridization probes
CA2279673A1 (en) 1995-12-15 1997-06-16 Enzo Therapeutics, Inc. Property effecting and/or property exhibiting constructs for the expression of non-native nucleic acids for therapeutic and diagnostic uses
GB9602028D0 (en) * 1996-02-01 1996-04-03 Amersham Int Plc Nucleoside analogues
EP0892808B1 (en) * 1996-04-12 2008-05-14 PHRI Properties, Inc. Detection probes, kits and assays
EP0917533A2 (en) * 1996-07-03 1999-05-26 President And Fellows Of Harvard College Oligonucleotide linker and techniques involving immobilized and linked oligonucleotides
US6537783B1 (en) 1996-08-02 2003-03-25 Bio Merieux Prefunctionalized nucleotide and process for amplifying a sequence using a prefunctionalized nucleotide
AU9063398A (en) * 1997-09-12 1999-04-05 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
DE19741715A1 (de) * 1997-09-22 1999-03-25 Hoechst Ag Pentopyranosyl-Nucleosid, seine Herstellung und Verwendung
FR2780059B1 (fr) 1998-06-17 2002-10-11 Bio Merieux Procede de marquage d'un acide ribonucleique et fragments d'arn marques ainsi obtenus
US6037130A (en) * 1998-07-28 2000-03-14 The Public Health Institute Of The City Of New York, Inc. Wavelength-shifting probes and primers and their use in assays and kits
DE19850594A1 (de) * 1998-11-03 2000-05-04 Biochip Technologies Gmbh Verfahren zur Markierung von Nukleinsäuren
US6613516B1 (en) 1999-10-30 2003-09-02 Affymetrix, Inc. Preparation of nucleic acid samples
US6902891B2 (en) 1999-12-17 2005-06-07 Bio Merieux Process for labeling a nucleic acid
US6489114B2 (en) 1999-12-17 2002-12-03 Bio Merieux Process for labeling a ribonucleic acid, and labeled RNA fragments which are obtained thereby
JP2003518511A (ja) 1999-12-28 2003-06-10 トランジェーヌ、ソシエテ、アノニム ポリヌクレオチドを細胞へトランスフェクションするための組成物を調製するためのリチウム（Ｌｉ＋）の使用および遺伝子治療で有用な組成物
JP2004516810A (ja) * 2000-06-07 2004-06-10 リ−コール インコーポレーティッド 電荷スイッチヌクレオチド
US7338805B2 (en) 2001-05-04 2008-03-04 Bio Merieux Labeling reagents, methods for synthesizing such reagents and methods for detecting biological molecules
US7060441B2 (en) 2001-05-04 2006-06-13 Biomerieux Method for fragmenting and labeling DNA involving abasic sites and phosphate labeling
FR2827304B1 (fr) 2001-07-16 2004-05-21 Commissariat Energie Atomique Procede et support d'analyse biologique utilisant des oligonucleotides comportant un marqueur activable enzymatiquement
US20070136825A1 (en) 2001-09-18 2007-06-14 Wolf-Bernd Frommer Fusion proteins useful for detecting analytes
AU2004233997C1 (en) 2003-04-29 2014-01-30 Massachusetts Institiute Of Technology Methods and devices for the sustained release of multiple drugs
DK1648931T3 (da) 2003-07-21 2011-03-07 Transgene Sa Multifunktionelle cytokiner
AU2004269196B2 (en) 2003-09-03 2010-03-04 Shmuel Bukshpan Methods and apparatus for rapid crystallization of biomolecules
JP3615752B1 (ja) 2003-11-18 2005-02-02 淳 高橋 細径樹脂捩じりブラシ
US6991911B2 (en) 2003-12-15 2006-01-31 Dade Behring Inc. Assay for entactogens
US7022492B2 (en) 2003-12-15 2006-04-04 Dade Behring Inc. Ecstasy haptens and immunogens
FR2868071B1 (fr) 2004-03-26 2006-06-09 Biomerieux Sa Reactifs de marquage, procedes de synthese de tels reactifs et procedes de detection de molecules biologiques
US8278262B2 (en) 2004-09-21 2012-10-02 Biontech Ag Use of microproteins as tryptase inhibitors
US7541144B2 (en) * 2005-01-31 2009-06-02 Agilent Technologies, Inc. RNA labeling method
WO2006082059A1 (en) 2005-02-02 2006-08-10 Universität Bayreuth Esterases for monitoring protein biosynthesis in vitro
FR2886735B1 (fr) 2005-06-01 2015-09-11 Biomerieux Sa Procede de marquage ou de traitement d'un echantillon biologique contenant des molecules biologiques d'interet, notamment des acides nucleiques
US7718365B2 (en) * 2005-07-09 2010-05-18 Agilent Technologies, Inc. Microarray analysis of RNA
US8076064B2 (en) * 2005-07-09 2011-12-13 Agilent Technologies, Inc. Method of treatment of RNA sample
US7544471B2 (en) * 2005-07-30 2009-06-09 Agilent Technologies, Inc. Preparing RNA from a wax-embedded tissue specimen
ES2436404T3 (es) 2005-10-03 2013-12-30 University Health Network Inhibidores ODCasa para el tratamiento de malaria
US7700289B2 (en) * 2006-04-03 2010-04-20 Agilent Technologies, Inc. Method for labeling RNA
US20080038686A1 (en) * 2006-04-18 2008-02-14 Shigemi Nagai Methods and kits for early stage caries detection
US8647119B1 (en) 2006-04-18 2014-02-11 President And Fellows Of Harvard College Methods and kits with fluorescent probes for caries detection
EP2028272B1 (en) 2006-06-06 2014-01-08 Panasonic Corporation Method of modifying nucleotide chain
US7772390B1 (en) 2006-07-18 2010-08-10 The Regents Of The University Of California Lipid mediated nucleic acid synthesis
US20080091005A1 (en) * 2006-07-20 2008-04-17 Visigen Biotechnologies, Inc. Modified nucleotides, methods for making and using same
WO2008092854A2 (en) 2007-01-30 2008-08-07 Transgene S.A. Papillomavirus e2 polypeptide used for vaccination
FR2917090B1 (fr) 2007-06-11 2012-06-15 Biomerieux Sa Reactifs de marquage portant des fonctions diazo et nitro, procedes de synthese de tels reactifs et procedes de detection de molecules biologiques
CN101835793B (zh) 2007-08-24 2014-04-23 乌利班-马克西姆利安大学 抑制β1-肾上腺素受体抗体的突变双环化受体肽
FR2934595B1 (fr) 2008-07-29 2013-04-05 Biomerieux Sa Reactifs de marquage ayant un noyau pyridine portant une fonction diazomethyle, procedes de synthese de tels reactifs et procedes de detection de molecules biologiques
GB0815968D0 (en) * 2008-09-03 2008-10-08 Angeletti P Ist Richerche Bio Antiviral agents
WO2010070136A2 (en) 2008-12-19 2010-06-24 Centre de Recherche Public de la Santé Novel caviidae allergens and uses thereof
EP2367564A1 (en) 2008-12-22 2011-09-28 Universität Regensburg Norrin in the treatment of diseases associated with an increased tgf-beta activity
KR20110118811A (ko) 2009-02-13 2011-11-01 노파르티스 아게 비-리보좀 펩티드 합성효소를 코딩하는 생합성 클러스터의 핵산 분자 및 그의 용도
DE102010018878B4 (de) 2009-04-30 2013-09-26 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Neue Zell-Linie zur Fluoreszenz-basierten Detektion von funktionell aktiven Antikörpern und Autoantikörpern gegen den Beta1-adrenergen Rezeptor
TWI555531B (zh) 2009-08-07 2016-11-01 傳斯堅公司 用以治療ｂ型肝炎病毒（ｈｂｖ）感染之組成物
EP2470203A1 (en) 2009-08-26 2012-07-04 Medizinische Hochschule Hannover Means and methods for producing artificial capsular polysaccharides of neisseria meningitidis
EP2519647A1 (en) * 2009-12-31 2012-11-07 Ventana Medical Systems, Inc. Methods for producing uniquely specific nucleic acid probes
EP3181692A1 (en) 2010-05-07 2017-06-21 Centre National De La Recherche Scientifique Ucp1 (thermogenin) - inducing agents for use in the treatment of a disorder of the energy homeostasis
WO2011144761A1 (en) 2010-05-21 2011-11-24 Universität Für Bodenkultur Wien Compositions for use in treating or diagnosing bone disorders and/or cardiovascular disorders
US8795664B2 (en) 2010-06-04 2014-08-05 Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffentlichen Rechts, Universitätsmedizin Monoclonal antibodies targeting amyloid beta oligomers
ES2486321T3 (es) 2010-06-18 2014-08-18 Xiberscience Gmbh Péptidos como agentes activos para estabilizar barreras biológicas
JP2013538051A (ja) 2010-08-26 2013-10-10 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｄｃｃの第５フィブロネクチンタイプｉｉｉドメインの組換えｆｃ融合タンパク質
FR2968302B1 (fr) 2010-12-06 2012-11-30 Biomerieux Sa Procedes de fonctionalisation et reactifs utilises dans de tels procedes utilisant un anhydride isatoique ou un de ses derives, molecules biologiques ainsi traitees et kits
WO2012095841A1 (en) 2011-01-10 2012-07-19 State Of Israel, Ministry Of Agriculture And Rural Development, A.R.O. - Volcani Center Improved tomato plants
WO2012113779A1 (en) 2011-02-21 2012-08-30 Medizinische Universität Wien Means and methods for treating a disease or disorder related to lymphangiogenesis or preventing metastasis
EP2523002A1 (en) 2011-05-13 2012-11-14 Universität Bayreuth Utilization of magnetic nanoparticles as intracellular pull-down system
EP2522689A1 (en) 2011-05-13 2012-11-14 Universität Bayreuth Non-viral transfection systems
WO2013017656A1 (en) 2011-08-02 2013-02-07 Medizinische Universität Wien Antagonists of ribonucleases for treating obesity
WO2013024173A1 (en) 2011-08-17 2013-02-21 Technische Universität München Computer implemented method for identifying regulatory regions or regulatory variations
CA2859708C (en) 2011-12-22 2023-04-04 Medizinische Universitat Wien Cyclotides as immunosuppressive agents
EP2626066A1 (en) 2012-02-10 2013-08-14 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Combination therapy comprising selective VEGFR-2 inhibitors and MEK inhibitors
EP3689895B1 (en) 2012-02-29 2024-07-17 Syngenta Participations Ag Modulation of seed vigor
WO2014006063A2 (en) 2012-07-02 2014-01-09 Medizinische Universität Wien Complement split product c4d for the treatment of inflammatory conditions
BR112015000032A2 (pt) 2012-07-04 2017-08-08 Basf Se micro-organismo geneticamente modificado, uso de um polinucleotídeo, e, método de produzir um polímero
FR2994184B1 (fr) 2012-08-02 2017-12-08 Biomerieux Sa Procedes de fonctionalisation et reactifs utilises dans de tels procedes utilisant un anhydride aza-isatoique ou un de ses derives, molecules biologiques ainsi traitees et kits
EP2695950A1 (en) 2012-08-10 2014-02-12 Blackfield AG Markers for responsiveness to an inhibitor of the fibroblast growth factor receptor
CN104797718B (zh) * 2012-09-12 2020-05-08 加利福尼亚大学董事会 通过单链扩增和测序对单个细胞进行精确基因组测序
EP2708241A1 (en) 2012-09-12 2014-03-19 Netris Pharma Recombinant Fc-fusion protein of the two Immunoglobulin domains of UNC5
EP2708231A1 (en) 2012-09-12 2014-03-19 Netris Pharma Combined treatment with netrin-1 interfering drug and chemotherapeutic drug
JP6472789B2 (ja) 2013-05-14 2019-02-20 シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッドＳｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ． 受容体含有安定化液剤
EP3013964B1 (en) 2013-06-28 2020-05-06 ethris GmbH Compositions for introducing rna into cells
WO2015022326A1 (en) 2013-08-12 2015-02-19 Xiber Science Gmbh Peptides as active agents for treating primary graft dysfunction
PT2808338E (pt) 2013-09-16 2016-06-15 Cemm - Forschungszentrum Für Molekulare Medizin Gmbh Calreticulina mutante para o diagnóstico de malignidades mieloides
JP6564369B2 (ja) 2013-12-09 2019-08-21 デュレクト コーポレイション 薬学的活性剤複合体、ポリマー複合体、ならびにこれらを伴う組成物及び方法
EP3104873B1 (en) 2014-02-13 2019-09-04 Technische Universität München Fgf-8 for use in treating diseases or disorders of energy homeostasis
WO2015128030A1 (en) 2014-02-26 2015-09-03 Ethris Gmbh Compositions for gastrointestinal administration of rna
US10407703B2 (en) 2014-04-17 2019-09-10 Medizinische Hochschule Hannover Means and methods for producing Neisseria meningitidis capsular polysaccharides of low dispersity
US10655152B2 (en) 2014-09-30 2020-05-19 Solenis Technologies, L.P. Method for producing an amide
BR112017005840A2 (pt) 2014-09-30 2018-02-27 Basf Se processos para preparar uma solução aquosa de acrilamida, reduzir concentração de ácido acrílico de uma solução aquosa de acrilamida, solução aquosa de acrilamida, homopolímero ou copolímero de acrilamida, e, solução de um homopolímero e/ou copolímero de acrilamida.
WO2016050819A1 (en) 2014-09-30 2016-04-07 Basf Se Method for preparing an acrylamide solution having a low acrylic acid concentration
EP3034539A1 (en) 2014-12-19 2016-06-22 Ethris GmbH Compositions for introducing nucleic acid into cells
EP3225694A1 (en) 2016-03-29 2017-10-04 Basf Se Method for the production of acrylamide by defined addition of the biocatalyst
AU2017242461B2 (en) 2016-03-29 2021-09-09 Basf Se Process for producing a polyacrylamide solution with increased viscosity
EP3225693A1 (en) 2016-03-29 2017-10-04 Basf Se Method for preparing aqueous acrylamide solutions
WO2017178193A1 (en) 2016-04-14 2017-10-19 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method for the identification of random polynucleotide or polypeptide sequences with biological activity
US20190153300A1 (en) 2016-04-26 2019-05-23 Basf Se Method for preparing an aqueous polyacrylamide solution
WO2017186685A1 (en) 2016-04-26 2017-11-02 Basf Se Method for preparing an aqueous polyacrylamide solution
CA3019652A1 (en) 2016-04-26 2017-11-02 Basf Se Method for preparing an aqueous polyacrylamide solution
CN109414448B (zh) 2016-06-17 2021-10-26 豪夫迈·罗氏有限公司 用于减少PAPD5或PAPD7 mRNA治疗乙型肝炎感染的核酸分子
WO2018185222A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Acib Gmbh - Austrian Centre Of Industrial Biotechnology Aminoacyl trna synthetases and orthogonal trnas
WO2019020702A1 (en) 2017-07-26 2019-01-31 Medizinische Universität Wien THYMIDINE KINASE SUPERACTIVE FOR USE IN ANTICANCER THERAPY
UA126931C2 (uk) 2017-10-16 2023-02-22 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг МОЛЕКУЛИ НУКЛЕЇНОВИХ КИСЛОТ ДЛЯ ЗМЕНШЕННЯ РІВНЯ мРНК PAPD5 І PAPD7 ДЛЯ ЛІКУВАННЯ ІНФЕКЦІЙНОГО ГЕПАТИТУ B
EP3740491A1 (en) * 2018-01-18 2020-11-25 Array Biopharma, Inc. Substituted pyrrolo[2,3-d]pyrimidines compounds as ret kinase inhibitors
MX2020011166A (es) 2018-04-25 2022-10-19 Ethris Gmbh Agentes crioprotectores para formulaciones en forma de particulas.
US12378584B2 (en) 2018-06-13 2025-08-05 Engenes Biotech Gmbh Methionine analogue synthesis
SG11202012759XA (en) 2018-07-03 2021-01-28 Hoffmann La Roche Oligonucleotides for modulating tau expression
US20210332336A1 (en) 2018-08-31 2021-10-28 Leibniz-Institut Für Pflanzenbiochemie Calcium dependent protein kinase constructs and uses thereof
US12584126B2 (en) 2018-09-11 2026-03-24 Helmholtz Zentrum Muenchen—Deutsches Forschungszentrum Fuer Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) microRNA inhibitors for use in treating metabolic diseases
US12404605B2 (en) 2018-10-05 2025-09-02 MultiplexDX, s.r.o. Method for diagnosing diseases using multiplex fluorescence and sequencing
RU2734941C2 (ru) * 2018-12-19 2020-10-26 Общество с ограниченной ответственностью "ИБМХ-ЭкоБиоФарм" (ООО "ИБМХ-ЭкоБиоФарм") Способ получения модифицированных комбинаторных ДНК библиотек методом твердофазной реакции удлинения праймера на ПЭТ-микрочастицах
EP4031658A1 (en) 2019-08-07 2022-07-27 DB Biotech, AS Improved horseradish peroxidase polypeptides
US20220332799A1 (en) 2019-09-04 2022-10-20 Deutsches Zentrum Für Neurodegenerative Erkrankungen E.V. (Dzne) Herv inhibitors for use in treating tauopathies
WO2021048257A1 (en) 2019-09-11 2021-03-18 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Bactericidal phage vectors
EP4055179A1 (en) 2019-11-05 2022-09-14 Basf Se Method of storing a biocatalyst
WO2021186035A1 (en) 2020-03-20 2021-09-23 Medizinische Universität Wien Cyclotides in combination with kappa opioid receptor ligands for ms therapy
EP4146832A2 (en) 2020-05-04 2023-03-15 MultiplexDX, s.r.o. Means and methods for detecting novel coronavirus (sars-cov-2)
WO2022003142A1 (en) 2020-07-03 2022-01-06 Engenes Biotech Gmbh PYRROLYSYL-tRNA SYNTHETASE VARIANTS AND USES THEREOF
US20220082569A1 (en) * 2020-09-11 2022-03-17 Illumina, Inc. Detecting elements using sugar-lectin couplings
WO2022063966A1 (en) 2020-09-24 2022-03-31 Medigene Immunotherapies Gmbh Prame specific t-cell receptors and uses thereof
EP4119581A1 (en) 2021-07-14 2023-01-18 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt GmbH Novel fab dimers
EP4215042A1 (en) 2022-01-21 2023-07-26 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin A non-human mammal comprising in its genome at least two human leukocyte antigen (hla) class i alleles, methods of making such mammal and uses thereof
EP4299753A1 (en) 2022-06-29 2024-01-03 enGenes Biotech GmbH Method for producing extrachromosomal nucleic acids
CN119317722A (zh) 2022-06-29 2025-01-14 武田药品工业株式会社 用于生产染色体外核酸的方法
WO2024047155A1 (en) 2022-08-31 2024-03-07 Dsm Ip Assets B.V. Bifidobacterium adolescentis strains, methods and uses thereof for starch degradation and modifying gut flora in non-human mammals
WO2024089180A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 Eximmium Biotechnologies Gmbh Method to determine extracellular vesicle recovery
WO2024115430A1 (en) 2022-11-28 2024-06-06 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Acinetobacter baumannii phages
WO2024180222A1 (en) 2023-03-02 2024-09-06 Universitaet Des Saarlandes Methods for producing l-pipecolic acid
WO2025079025A1 (en) 2023-10-13 2025-04-17 Takeda Pharmaceutical Company Limited Ides-rapamycin conjugate in aav gene therapy
WO2025104216A1 (en) 2023-11-15 2025-05-22 Helmholtz Zentrum Muenchen - Deutsches Forschungszentrum Für Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) Bacteriophage compositions
WO2025114609A1 (en) 2023-12-01 2025-06-05 MultiplexDX, s.r.o. Method for predicting the efficacy of an antibody-drug-conjugate (adc) using multiplex fluorescence in situ hybridization (fish) and multiplex sequencing
WO2025242868A1 (en) 2024-05-23 2025-11-27 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Phage composition
WO2026068725A1 (en) 2024-09-26 2026-04-02 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Synthetic transfer vehicles for delivering rna to cells
EP4717762A1 (en) 2024-09-26 2026-04-01 Universität des Saarlandes, eine Körperschaft des Öffentlichen Rechts Curcumin producing gram positive bacteria
EP4729534A1 (en) 2024-10-21 2026-04-22 Technische Universität München, in Vertretung des Freistaats Bayern Polypeptides comprising protein domains linked via rigid amino acid linkers

Family Cites Families (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1617886A1 (de) 1967-03-06 1971-01-28 Dr Med Karl Theurer Verfahren zur Herstellung von Arzneimitteln mit selektivem Tropismus gegen Krebs und bestimmte Organe
DE1814134A1 (de) 1968-12-12 1970-09-10 Theurer Dr Med Karl Zusatzverfahren zur Herstellung von arzneimitteln mit selektivem Tropismus
US3906031A (en) 1971-03-15 1975-09-16 Research Corp Novel 9-fluorenylmethoxycarbonyl compounds
US4124702A (en) 1971-07-06 1978-11-07 Merck & Co., Inc. Polynucleotides active as inducers of interferon production in living animal cells
US3931397A (en) 1971-11-05 1976-01-06 Beecham Group Limited Biologically active material
US3960840A (en) * 1972-12-29 1976-06-01 University Of Illinois Foundaton Fluorescent derivatives of adenine-containing compounds
JPS49126395A (ja) 1973-04-04 1974-12-03
US4038480A (en) 1973-09-17 1977-07-26 Icn Pharmaceuticals, Inc. 6-aminocarbonyl purine 3',5'-cyclic nucleotides
GB1446536A (en) 1975-02-21 1976-08-18 Yeda Res & Dev Pharmaceutically active compositions
US4230797A (en) * 1975-04-28 1980-10-28 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a coenzyme as label
IN142734B (ja) * 1975-04-28 1977-08-20 Miles Lab
US4119521A (en) 1977-04-25 1978-10-10 Stephen Turner Fluorescent derivatives of activated polysaccharides
JPS53133283A (en) 1977-04-25 1978-11-20 Agency Of Ind Science & Technol High polymers bonded to adenine nucleotide derivatives
SU659573A1 (ru) 1977-05-31 1979-04-30 Институт биологической физики АН СССР Спин-меченые производные олигорибонуклеотидов как спиновые зонды дл исследовани механизма действи ферментов и способ их получени
US4847240A (en) 1978-01-16 1989-07-11 The Trustees Of Boston University Method of effecting cellular uptake of molecules
US4151065A (en) 1978-01-30 1979-04-24 The Regents Of The University Of California Horizontal slab gel electrophoresis
FR2422956A1 (fr) * 1978-04-13 1979-11-09 Pasteur Institut Procede de detection et de caracterisation d'un acide nucleique ou d'une sequence de celui-ci, et reactif enzymatique pour la mise en oeuvre de ce procede
IL57571A (en) * 1978-06-22 1983-03-31 Miles Lab Flavin adenine dinucleotide-labeled conjugates and their use in a homogeneous immunoassay method for determining haptens
US4213893A (en) 1978-10-12 1980-07-22 Miles Laboratories, Inc. Flavin adenine dinucleotide-labeled conjugates for use in specific binding assays
JPS5519239A (en) 1978-07-28 1980-02-09 Green Cross Corp:The Interferon-producing attractant
DE2841414C2 (de) 1978-09-22 1980-04-03 Gesellschaft Fuer Biotechnologische Forschung Mbh (Gbf), 3300 Braunschweig Verfahren zur Herstellung von an Makromoleküle gebundenen, ein Adeninringsystem enthaltenden Koenzymen
US4305922A (en) * 1978-10-04 1981-12-15 University Patents, Inc. Labeling proteins with 99m-Tc by ligand exchange
JPS5564599A (en) 1978-11-08 1980-05-15 Unitika Ltd Adenosine triphosphate derivative
US4224408A (en) * 1978-11-22 1980-09-23 Abbott Laboratories Deoxyribonucleic acid synthesis using binding protein
US4260737A (en) * 1979-03-16 1981-04-07 University Patents, Inc. Radioiodine labeling during protein synthesis
DE3060377D1 (en) * 1979-08-29 1982-07-01 Nihon Mediphysics Co Ltd 2-oxopropionaldehyde bis(thiosemicarbazone)derivatives and their production and use
US4318846A (en) 1979-09-07 1982-03-09 Syva Company Novel ether substituted fluorescein polyamino acid compounds as fluorescers and quenchers
US4259232A (en) 1979-10-23 1981-03-31 Miles Laboratories, Inc. Flavin adenine dinucleotide-labeled protein and polypeptide conjugates
US4310662A (en) * 1979-12-26 1982-01-12 Genentech, Inc. Nucleosidic phosphorylating agent and methods
US4255566A (en) * 1980-02-19 1981-03-10 Miles Laboratories Flavin adenine dinucleotide derivatives and labeled conjugates prepared therefrom
US4500707A (en) 1980-02-29 1985-02-19 University Patents, Inc. Nucleosides useful in the preparation of polynucleotides
US4293310A (en) 1980-03-14 1981-10-06 University Of Pittsburgh Photoelectrochemical immunoassay
US4421735A (en) * 1980-04-17 1983-12-20 The Massachusetts General Hospital Radiolabeled diagnostic compositions and method for making the same
JPS5711999A (en) 1980-06-26 1982-01-21 Chugai Pharmaceut Co Ltd Novel adenosine phosphate compound containing introduced iodine and its preparation
JPS5742632A (en) 1980-08-29 1982-03-10 Takeshi Sasaki Double-chain dna bonded to d-glutamic acid-d-lysine copolymer, its preparation and medicine containing the same
US4358535A (en) * 1980-12-08 1982-11-09 Board Of Regents Of The University Of Washington Specific DNA probes in diagnostic microbiology
DE3152738C2 (de) 1981-02-23 1986-06-19 Institut botaniki AN Kazachskoj SSR, Alma-Ata K}vette für die photometrische Abtastung von Gelsa{ulen
US4668777A (en) 1981-03-27 1987-05-26 University Patents, Inc. Phosphoramidite nucleoside compounds
US4415732A (en) 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
CA1194862A (en) * 1981-03-30 1985-10-08 Jemo Kang Method for making chromogenic and/or fluorogenic substrates for use in monitoring catalytic or enzymatic activity
US4378458A (en) * 1981-03-30 1983-03-29 Baker Instruments Corporation Novel chromogenic and/or fluorogenic substrates for monitoring catalytic or enzymatic activity
US4529796A (en) * 1981-03-30 1985-07-16 Baker Instruments Corporation Method for making chromogenic and/or fluorogenic substrates for use in monitoring catalytic or enzymatic activity
US4708935A (en) 1981-04-10 1987-11-24 Research Corporation (2-5')-Oligo (3'-deoxyadenylate) and derivatives thereof
CA1219824A (en) * 1981-04-17 1987-03-31 David C. Ward Modified nucleotides and methods of preparing and using same
US4711955A (en) * 1981-04-17 1987-12-08 Yale University Modified nucleotides and methods of preparing and using same
US4373071A (en) 1981-04-30 1983-02-08 City Of Hope Research Institute Solid-phase synthesis of polynucleotides
US4401796A (en) 1981-04-30 1983-08-30 City Of Hope Research Institute Solid-phase synthesis of polynucleotides
US4375401A (en) 1981-05-20 1983-03-01 Nicholas Catsimpoolas Electrophoresis system
CA1205028A (en) 1981-07-01 1986-05-27 Jerald C. Hinshaw Fluorescent chelates and labeled specific binding reagents prepared therefrom
CA1180647A (en) 1981-07-17 1985-01-08 Cavit Akin Light-emitting polynucleotide hybridization diagnostic method
US4460772A (en) 1981-08-27 1984-07-17 Miles Laboratories, Inc. 6-[N-(ω-Carboxyalkyl)amino]-1,3-dimethyl-5-formamidouracils
FR2519005B1 (fr) * 1981-12-29 1985-10-25 Pasteur Institut Fragments d'adn marques a l'une au moins de leurs extremites par des ribonucleotides modifies reconnaissables par des molecules affines et procede pour realiser une analyse de tels fragments d'adn
FR2519004B1 (fr) * 1981-12-29 1985-09-27 Pasteur Institut Acide adenosine 5'-triphosphorique modifie et procede de dosage de substances biologiques susceptibles de fixer des produits de degradation de l'acide adenosine 5'-triphosphorique
CA1222691A (en) * 1981-12-29 1987-06-09 Wilhelmus T. Goedemans Method of preparing radionuclide-labelled proteins, in particular antibodies or antibody fragments
ATE53862T1 (de) * 1982-01-22 1990-06-15 Cetus Corp Verfahren zur charakterisierung von hla und die darin benutzten cdns-testmittel.
EP0090789A1 (en) 1982-03-26 1983-10-05 Monsanto Company Chemical DNA synthesis
US4474948A (en) 1982-04-08 1984-10-02 Biosearch Benzazolides and their employment in phosphite ester oligonucleotide synthesis processes
US4490472A (en) 1982-06-17 1984-12-25 Imreg, Inc. Sensitive tests for malignancies based on DNA detection
US5260433A (en) * 1982-06-23 1993-11-09 Enzo Diagnostics, Inc. Saccharide specific binding system labeled nucleotides
US5241060A (en) * 1982-06-23 1993-08-31 Enzo Diagnostics, Inc. Base moiety-labeled detectable nucleatide
US4880918A (en) 1982-07-13 1989-11-14 Eliezer Rapaport Arrest and killing of tumor cells by adenosine 5-diphosphate and adenosine-5-triphosphate
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
JPS5944648A (ja) 1982-09-07 1984-03-13 Sansou Seisakusho:Kk デオキシリボ核酸の塩基配列決定方法
JPS59126252A (ja) 1983-01-08 1984-07-20 Fuji Photo Film Co Ltd Ｄｎａもしくはｄｎａ部分分解物の塩基配列決定法
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) * 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4483964A (en) 1983-06-20 1984-11-20 Chiron Corporation Reactor system and method for polynucleotide synthesis
US4517338A (en) 1983-06-20 1985-05-14 Chiron Corporation Multiple reactor system and method for polynucleotide synthesis
US4598049A (en) 1983-08-31 1986-07-01 Systec Inc. General purpose gene synthesizer
JPS5993100A (ja) 1983-10-31 1984-05-29 Wakunaga Seiyaku Kk オリゴヌクレオチド誘導体
JPS6096610A (ja) 1983-10-31 1985-05-30 Agency Of Ind Science & Technol ニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチドホスフエ−トを結合した高分子物質
CA1244786A (en) 1983-12-20 1988-11-15 Lloyd M. Smith Synthesis of amino-derivitized oligonucleotides
US5015733A (en) 1983-12-20 1991-05-14 California Institute Of Technology Nucleosides possessing blocked aliphatic amino groups
US4849513A (en) 1983-12-20 1989-07-18 California Institute Of Technology Deoxyribonucleoside phosphoramidites in which an aliphatic amino group is attached to the sugar ring and their use for the preparation of oligonucleotides containing aliphatic amino groups
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5171534A (en) 1984-01-16 1992-12-15 California Institute Of Technology Automated DNA sequencing technique
US4707440A (en) 1984-01-30 1987-11-17 Enzo Biochem, Inc. Nucleic acid hybridization assay and detectable molecules useful in such assay
JPH0610665B2 (ja) 1984-02-01 1994-02-09 株式会社日立製作所 核酸の塩基配列決定装置
JPS60169495A (ja) 1984-02-15 1985-09-02 Takeda Chem Ind Ltd 変性されたｄνａおよびその用途
JPS60242368A (ja) 1984-05-16 1985-12-02 Hitachi Ltd 核酸塩基配列決定方法
FR2568254B1 (fr) 1984-07-25 1988-04-29 Centre Nat Rech Scient Application d'oligonucleotides lies a un agent intercalant, notamment a titre de medicament
JPS61103824A (ja) 1984-10-27 1986-05-22 Nippon Kayaku Co Ltd ポリリボイノシン酸・ポリリボシチヂル酸・ポリ−レ−リジン複合体の注射用製剤の新規調製法
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
US4833251A (en) 1985-06-25 1989-05-23 Siska Diagnostics, Inc. Compounds for tagging nucleic acid probes
US5258538A (en) 1985-08-26 1993-11-02 Applied Biosystems, Inc. 2,3-disubstituted-1,3,2-oxazaphosphacycloalkanes as nucleic acid linking agents
US4757141A (en) 1985-08-26 1988-07-12 Applied Biosystems, Incorporated Amino-derivatized phosphite and phosphate linking agents, phosphoramidite precursors, and useful conjugates thereof
US4868105A (en) 1985-12-11 1989-09-19 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assay
US4855225A (en) 1986-02-07 1989-08-08 Applied Biosystems, Inc. Method of detecting electrophoretically separated oligonucleotides
US5212059A (en) 1988-01-11 1993-05-18 Microprobe Corporation Oligonucleotide probes for the detection of periodontal pathogens
US5366860A (en) 1989-09-29 1994-11-22 Applied Biosystems, Inc. Spectrally resolvable rhodamine dyes for nucleic acid sequence determination
US5811232A (en) 1989-12-04 1998-09-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides for Papillomavirus
US5874564A (en) 1990-03-21 1999-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Reagents and methods for modulating gene expression through RNA mimicry
AU7662091A (en) 1990-03-21 1991-10-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Reagents and methods for modulating gene expression through rna mimicry
US5665710A (en) 1990-04-30 1997-09-09 Georgetown University Method of making liposomal oligodeoxynucleotide compositions
US5166195A (en) 1990-05-11 1992-11-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibitors of the human immunodeficiency virus phosphorothioate oligonucleotides
BR9106702A (pt) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Inc Analogo de oligonucleotideos e processos para modular a producao de uma proteina por um organismo e para tratar um organismo
CA2089666C (en) 1990-08-16 2003-01-07 Kevin P. Anderson Oligonucleotides for modulating the effects of cytomegalovirus infections
US5162654A (en) 1991-02-01 1992-11-10 Wisconsin Alumni Research Foundation Detection apparatus for electrophoretic gels
US5242906A (en) 1991-04-22 1993-09-07 University Of North Carolina At Chapel Hill Antisense oligonucleotides against Epstein-Barr virus
ATE143700T1 (de) 1991-09-23 1996-10-15 Pfizer Verfahren für die detektion von spezifische mrns und dns in zellen
US5652094A (en) 1992-01-31 1997-07-29 University Of Montreal Nucleozymes
US5643780A (en) 1992-04-03 1997-07-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating RNA activity through modification of the 5' cap structure of RNA
US6303297B1 (en) 1992-07-17 2001-10-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Database for storage and analysis of full-length sequences
US5541311A (en) 1992-12-07 1996-07-30 Third Wave Technologies, Inc. Nucleic acid encoding synthesis-deficient thermostable DNA polymerase
JPH0793370A (ja) 1993-09-27 1995-04-07 Hitachi Device Eng Co Ltd 遺伝子データベース検索システム
US5980096A (en) 1995-01-17 1999-11-09 Intertech Ventures, Ltd. Computer-based system, methods and graphical interface for information storage, modeling and stimulation of complex systems
DE19508366C2 (de) 1995-03-10 1998-01-29 Evotec Biosystems Gmbh Verfahren zum direkten Nachweisen weniger Nucleinsäurestränge
JP2001517925A (ja) 1995-12-22 2001-10-09 ベーリングウエルケ、アクティエンゲゼルシャフト 核酸の均質増幅および検出
CA2262776C (en) 1996-08-02 2005-03-08 Genesense Technologies, Inc. Antitumor antisense sequences directed against r1 and r2 components of ribonucleotide reductase
US6189013B1 (en) 1996-12-12 2001-02-13 Incyte Genomics, Inc. Project-based full length biomolecular sequence database
US5953727A (en) 1996-10-10 1999-09-14 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Project-based full-length biomolecular sequence database
TW520297B (en) 1996-10-11 2003-02-11 Sequus Pharm Inc Fusogenic liposome composition and method
US5966712A (en) 1996-12-12 1999-10-12 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Database and system for storing, comparing and displaying genomic information
JP2001515234A (ja) 1997-07-25 2001-09-18 アフィメトリックス インコーポレイテッド 多型性データベースを提供するためのシステム

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Publication number Publication date
EP0285950A3 (en) 1990-11-07
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ES8802257A1 (es) 1988-04-16
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