JPH11505533A - 標識物と生体有機分子間の白金介在リンカの製造法、生物有機分子の標識法、対象生物物質の検出法および診断用テストキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、特定対象分子の検出に使用することのできる標識化物質の製造に最適な白金化合物の改良製造法を提供する。該白金配位化合物は二つの反応性基を持ち、その一方は標識物に置換し、他方は標識すべき物質に置換する。標識化物質の製造が、適正な原料物質の選択と、適正な中間体の製造により大幅に改善される。標識効果が大幅に改善されたことにより、本発明の一部である標識キットの製造も可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】 標識物と生体有機分子間の白金介在リンカの製造法、生物有機分子の標識法、 対象生物物質の検出法および診断用テストキット 本発明は、白金化合物に基づくリンカ（標識物と生体有機分子間の結合部分） の製造法に関する。白金（配位）化合物は長い間興味深い分子と考えられてきた 。これらの化合物とその使用についての総説として、リーディックら（Reedijk et al.）の「構造と結合（Structure and Bonding）、６７、５３〜８９ページ 、１９８７」を引用する。特に、シス型白金は抗腫瘍剤として期待できるとして 多くの注目を集めている。この白金化合物の抗腫瘍活性は、白金化合物が少なく とも二つの反応性基（好ましくは、互いにシス方向を向いている）を持つことに 由来しており、この反応性基がＤＮＡ分子の架橋を可能とし、結果としてこれら ＤＮＡ分子の複製を抑制する。 白金（配位）化合物の他の使用例がＰＣＴ出願（ＷＯ９２／０１６９９）に開 示されており、当該出願によると、二つの反応性部分（脱離基と規定）を持つ白 金化合物は蛍光物質と反応して単一の反応性部分を持つ標識化白金化合物を生じ 、その反応性部分が核酸、好ましくは、グアニン残基のＮ−７位で（非共有的に ）結合する。本発明は、そのような標識物質のリンカとしての使用に適した白金 化合物の改良製造法、標識化物質の製造法、および診断用テストキット製造にお ける当該物質の用途を提供する。 ＷＯ９２／０１６９９に開示された原料化合物は、白金（ＩＩ）（エチレンジ アミン）二塩化物または［白金（ＩＩ）（エチレンジアミン）（Ｍｅ₂ＳＯ）Ｃ ｌ］⁺Ｃｌ^-である。これら両化合物をリンカとして用いるには、ある種の欠陥が ある。第一の化合物は市販品として入手可能であり、第二の化合物（より好まし い）は塩化物塩として合成しなければならない。二塩化物では、塩素イオンＣｌ^- のマーカ基あるいはグアニン基に対する置換反応性が劣る。さらに二個のＣｌ^- イオンが略同等の反応性を有するため、両方のイオンが標識物により置換されて しまうということが起こり、標識化物質が対象生体分子に結合するための反応性 部分が残らなくなる。そのため、異なる反応性部分を持つ化合物が標識化使用目 的に極めて好ましい。後者の化合物はこの目的に適うが、この化合物でＤＮＡを 完全標識しようとすると数分どころか数時間に及ぶ長時間を要するため、日常使 用に適した生成物とはならない。 我々はこの度、式ＰｔＥ₄（Ｅは電子陰性基、好ましくはハロゲン、ＮＯ₃ ^-ま たはＳＯ₃ ^-）で表される好適な原料化合物を選択することにより、上述の第一化 合物および多くの新規化合物を含む対称性リンカの非常に簡単な信顆性の高い製 造法を見出した。実施例に記載のごとく、これら原料化合物とエチレンジアミン との反応は非常に単純で効果的である。さらに、この反応は標識化物質を製造す るための最適な対称性中間体化合物に導き得る。標識化物質を製造するためにこ れら原料化合物を使用する利点についてこれまで開示されたことはなく、またこ れらの化合物がこの目的に使用されたこともない。これらの化合物を使用する主 な利点は、生成する白金化合物の安定な架橋を結合させるに際し、遮断試薬を使 用する必要がないことである。もう一つの利点は、生成した中間体化合物が遮断 試薬を用いずとも再度標識化が可能なことである。さらに、これらの反応の収率 が非常に高い。これら対称性原料化合物を使用するさらなる利点は、次工程反応 を阻害したり、収率を低下させたり、あるいは余分な分離工程を要するような異 なる生成物が混合物として形成されないということである。本発明による最適中 間体化合物は、白金（ＩＩ）（エチレンジアミン）（ＮＯ₃）₂である。驚くべき ことに、これらの化合物は二重の標識化はほとんど起こらず、この事実はＷＯ／ ０１６９９の二塩化物と対照的である。この物質は適当な標識基を使用して容易 に調製可能であり、しかも生成する標識物質はさらに残りのＮＯ₃基の置換反応 によって標識すべきあるいは検出すべき生体有機分子に結合させることができる 。その際の反応は、既知の白金化合物との反応よりかなり急速に進行する。さら に、この化合物の製造法および生成する化合物は、ＤＭＳＯのような毒性の高い 物質を必要としない。 中間体化合物は、適当な標識物（マーカとしても知られる）で標識することが できる。これらの標識物は、放射活性標識物、酵素（検出すべき基質との反応を 必要とする）、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチンのような特異的に結合 するペア構成成分、ビオシチン、イミノビオシチン、コロイド状色素物質、フッ 化クロム（ローダミンなど）、還元性物質（エオジン、エリスロジンなど）、（ 着色）ラテックスゾル、ジゴキシゲニン、金属ゾルまたは他の粒状ゾル（セレン 、炭素など）、ダンシルリジン、抗体、プロテインＡ，プロテインＧなどである 。これらの標識物は、リンカに直接またはスペーサ・アーム（好ましくはポリリ ジン）を介して結合する。核酸と蛋白の標識がとても簡単なため、リンカ・標識 化合物を別途キットとして販売することができる。一般のユーザは、それによっ て簡単に標識化物質を製造することができるし、当該物質に応じて多くの異種標 識物を同じやり方で結合させることもできる。このことは、一回のアッセイで復 数種の検出を可能とする。さらに、白金標識化合物（たとえば、ＷＯ／０１６９ ９から）の既知の利点も勿論本発明方法および化合物によって得られる。白金化 合物のもう一つの利点は、銀あるいは他の金属結晶を沈殿させるための核として も白金を使用することによって多少なりとも直接にそれらを検出できることであ る。 利用可能なＳ（硫黄）あるいはＮ（窒素）を含むほとんど全ての生体有機分子 は、白金化合物で標識することができる。該標識化合物にて本発明により標識可 能な最適生体有機分子は、核酸（ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ， ＲＮＡ，ホモ二本鎖、ヘテロ二本鎖、多重鎖）である。該白金は、非常に簡単に グアニジンのＮ−７位に（非共有的に）結合することができる。この方法でＲＮ ＡまたはＤＮＡ分子が一本鎖またはそうでない場合であっても簡単に検出するこ とができるが、さらにハイブリッド形成法用のプローブ製造にも使用することが できる。この場合、非標識のＤＮＡ／ＲＮＡ分子が当該標識化プローブにハイブ リッドする。該白金化合物がハイブリッド形成を阻害することは、まずほとんど ない。また、この技術によればプローブを作製する際にヌクレオチドを修飾する 必要もなくなる。しかも、蛋白、ペプチドおよび他の生体有機分子も本発明に従 い、該標識物質により標識することができる。 本発明の白金化合物は、生体有機分子をニトロセルロース、ナイロンフィルタ 、 マイクロタイタプレートなどの固体表面に結合するのに好適である。 本発明方法により修飾したヌクレオチドおよびその修飾ヌクレオチドを包含さ せたオリゴおよびポリヌクレオチド、あるいはこれら新規白金化合物を用いて直 接修飾したオリゴおよびポリヌクレオチドは、生物医学研究、臨床診断薬および 組換えＤＮＡ技術におけるプローブとして用いることができる。 これら広範な用途は当該白金化合物がポリペプチドに結合し得る、あるいはポ リペプチドと相互に作用し得る検出可能な部分を持ち、かつ、ポリペプチドとの 間で検出可能な安定な複合体を形成する能力を有することによる。いくつかの用 法例としては、核酸含有病因物質、たとえば、細菌、ウイルスの検出および同定 ；抗生物質耐性細菌のスクリーニング；薬理効果に関係する遺伝病用動物のスク リーニング；たとえば、２１−トリソミ（３染色体性）、鎌状赤血球貧血などの 遺伝病の診断；染色体核型同定；および腫瘍細胞の同定などである。 本発明の他の利点および実施態様は、以下の実験の部で明瞭となろう。 実験の部 中間体白金化合物の合成 これらの化合物は、以下の工程により調製することができる： （ａ）アニオンが下記の構造式（１）を有する化合物を適当な溶媒中、適当な 条件下でＫＩと反応させ、 下記のアニオン構造式（２）を有するヨウ素化白金化合物を形成し、 （ｂ）該ヨウ素化白金化合物（２）を適当な溶媒中エチレンジアミンと反応さ せて、式Ｐｔ（ｅｎ）Ｉ₂で表され、かつ、下記構造式（３）を有するエチレン ジアミン・ヨウ素化白金化合物を形成し、 （ｃ）該化合物（３）を適当な溶媒中、適当な条件下でＡｇＮＯ₃と反応させ 、下記構造式（４）を有する化合物を形成し、 （ｄ）該化合物（４）を適当な溶媒中、適当な条件下でＫＣｌと反応させ、下 記構造式（５）を有する化合物を形成し、 （ｅ）該化合物（５）を適当な溶媒中、適当な条件下でＡｇＮＯ₃と反応させ 、下記構造式（６）を有する化合物を形成し、 （ｆ）該化合物（６）を、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ標識物として使用する ハプテン結合Ｐｔ（ｅｎ）化合物合成用修飾白金化合物として回収する。 化合物（４）および（６）は勿論同一の化合物であるが、これらを調製する反 応はいずれも互換性がある。 実施例１ Ｐｔ（ｅｎ）−ジアミン原料物質の調製 白金メチレンジアミン（ＮＯ₃）₂の調製：原料物質 Ｐｔ（ｅｎ）（ＮＯ₃）₂ 全反応を暗所で実施する。 １ｇの四塩化白金カリウムＫ₂ＰｔＣｌ₄（２．４ｍｍｏｌ，シグマ）をミリポ ア濾過水５０ｍｌに溶かし、室温で攪拌する。１０当量のヨウ化カリウムＫＩ（ ２４ｍｍｏｌ，３．９９９ｇ，シグマ）を加える。溶液は、直ちにオレンジ色か ら暗赤色（Ｋ₂ＰｔＩ₄）に変わる；５分間攪拌する。 この白金溶液に１当量のエチレンジアミン（２．４ｍｍｏｌ，１６０．８７４ ３μｌ、メルク１１−０．９ｋｇ；１６１μｌのエチレンジアミンを５ｍｌのミ リポア水で希釈したもの）をゆっくりと加え、室温で１時間攪拌する。 黄褐色の沈殿Ｐｔ（ｅｎ）Ｉ₂を形成するが、上清部は透明となる。 この溶液を１．０μｍのメンブランフィルタ（シュライヒャーおよびシュエル ；Schleicher & Schuell）で濾過し、沈殿をミリポア水、エタノール、ジエチル エーテルで順次洗浄する。生成したＰｔ（ｅｎ）Ｉ₂を真空乾燥機中、３７℃で 少なくとも４時間乾燥する。 乾燥したＰｅ（ｅｎ）Ｉ₂を秤量し（−１．０７ｇ）、４５ｍｌミリポア水・ ５ｍｌアセトンに懸濁する；溶液は懸濁している。１．９５当量のＡｇＮＯ₃（ Ｍ＝１６９．９，シグマ）を加える。反応液を室温で一夜攪拌する。 反応液を１．０μｍのメンブランフィルタで濾過する；沈殿はヨウ化銀ＡｇＩ である；濾液は透明でなければならない。 ０．５ｍｌのＰｔ（ｅｎ）（ＮＯ₃）₂含有溶液に過剰のＫＣｌまたはＮａＣｌ を加え、過剰のＫＣｌまたはＮａＣｌを加えた直後に白色の沈殿が生じないこと を確認する。もし白色の沈殿（黄色の沈殿のみで）が生じなければ、全溶液に過 剰のＫＣｌまたはＮａＣｌを加える。黄色の沈殿が生成したところで溶液を濾過 し、沈殿（Ｐｔ（ｅｎ）Ｃｌ₂）をミリポア水、エタノール、ジエチルエーテル で洗浄する。 得られた沈殿物を真空乾燥機中、３７℃で少なくとも４時間乾燥する。 乾燥したＰｅ（ｅｎ）Ｃｌ₂（Ｍ＝３２６．１）を秤量し、４５ｍｌミリポア 水／５ｍｌアセトンに懸濁し、濁った液を攪拌する。１．９５当量のＡｇＮＯ₃ を加え、反応液を室温で一夜攪拌する。溶液はＡｇＣｌが生成しているために白 色となる。 溶液を暗所で濾過して、濾液はロータリエヴァポレーションによりアセトンを 除去し、２５ｍｌまで濃縮する。次いで、濾液を凍結乾燥する。生成物は、ＮＭ Ｒまたは赤外線吸収スペクトル法によりチェックする。下表に元素分析値を示す 。 実施例２ 免疫学的に検出可能なハプテン−Ｐｔ（ｅｎ）化合物の調製 白金エチレンジアミン−ε−（６−（ビオチノイル）アミノ）ヘキサノイル− Ｌ−リジン−ナイトレートの調製 ［Ｐｔ（ｅｎ）（ビオシチン−Ｘ）（ＮＯ₃）］ＮＯ₃ 全反応を暗所で実施する。 ビオシチン−Ｘ３１．６ｍｇ（０．０６５ｍｍｏｌ，モレキュラ・プローブ・ インク、米国）を１５ｍｌのミリポア水に暗所で加え、わずかに加熱（最高４０ ℃まで）して溶解させ、０．４Ｍの水酸化ナトリウムでｐＨ７〜８に調整する。 Ｐｔ（ｅｎ）（ＮＯ₃）₂２３．４ｍｇ（Ｍ＝３７９．１，０．０６２ｍｍｏｌ） （実施例１参照）をミリポア水１０ｍｌに暗所で加え、わずかに加熱（最高５０ ℃まで）してＰｔ（ｅｎ）（ＮＯ₃）₂を完全に溶かす。 両方の試薬が完全に溶解したところで、ビオシチン溶液を白金溶液に添加し、 暗所、室温で２１０分間反応させる。反応液のｐＨは７．０に維持する必要があ り、そのために反応の間モニタして必要に応じＨ₂ＯまたはＨＮＯ₃を加える。 生成物［Ｐｔ（ｅｎ）（ビオシチン−Ｘ）（ＮＯ₃）］ＮＯ₃を凍結乾燥し単離 する。 生成物の安定性は、ｐｔがビオシチン−Ｘのアミノ基だけでなくカルボキシル 基にも結合することで保証される。白金化合物と後者との結合速度が優位となっ て、キレート環が形成され、重合反応が起こらなくなるため、それが一旦水に溶 解すると生成物を安定化させると見做される。 下表に［Ｐｔ（ｅｎ）（ビオシチン−Ｘ）（ＮＯ₃）］ＮＯ₃の元素分析値を示 す。 実施例３ 白金エチレンジアミン−ジゴキシゲニン^R−Ｌ−リジン−ナイトレートの調製 ［Ｐｔ（ｅｎ）（ジゴキシゲニン−Ｘ）（ＮＯ₃）］ＮＯ₃ Ｐｔ（ｅｎ）（ＮＯ₃）₂（０．０６２ｍｍｏｌ，２３．６５ｍｇ）をメタノ ール２０ｍｌに加え、５０℃に加熱して完全に溶解する。 ジゴキシゲニン−Ｌ−リジン（４５．３ｍｇ）をメタノール２０ｍｌに加え、 固形物が完全に溶解するまで加熱する。 両方の溶液を混合して、少なくとも３時間反応させる。最終産物をロータリエ ヴァポレーションにより単離する。ジゴキシゲニン^Rは、ベーリンガ・マンハイ ム社の登録商標である。 実施例４ 蛍光性白金（ｅｎ）化合物の調製 白金エチレンジアミン−フルオレセインアミン−ナイトレートの調製 ［Ｐｔ（ｅｎ）（フルオレセインアミン−Ｘ）（ＮＯ₃）］ＮＯ₃ 全反応を暗所で実施する。 Ｐｔ（ｅｎ）（ＮＯ₃）₂（０．２５ｍｍｏｌ，９４．８ｍｇ）を１０ｍｌメタ ノール／２ｍｌ水に加え、加熱溶解する。 フルオレセインアミン（０．２７ｍｍｏｌ，９５．５ｍｇ，シグマ）を１０ｍ ｌのメタノールに溶解する。 フルオレセインアミン溶液を白金溶液に加え、直後の色の変化を観察する。 少なくとも３時間反応させる。結晶性の最終産物をロータリエヴァポレーショ ンにより単離し、凍結乾燥する。 実施例５ 白金エチレンジアミン−５’−アセトアミドフルオレセイン−ナイトレートの 調製 ［Ｐｔ（ｅｎ）（５’−アセトアミドフルオレセイン−Ｘ）（ＮＯ₃）］ＮＯ₃ 全反応を暗所で実施する。 Ｐｔ（ｅｎ）（ＮＯ₃）₂（０．０４７ｍｍｏｌ，１７．８ｍｇ）をメタノール ５ｍｌに加え、加熱溶解する。 ５’−アセトアミドフルオレセイン（０．０４９ｍｍｏｌ，２０ｍｇ，モレキ ュラ・プローブ・インク）を１０ｍｌのメタノールに溶解する。 アセトアミドフルオレセイン溶液を白金溶液に加え、少なくとも３時間反応さ せる。 最終産物をロータリエヴァポレーションにより単離する。 実施例６ 白金エチレンジアミン・ε−（６−（フルオレセイン−５−カルボキサミド） ヘキサノイル）−Ｌ−リジン−ナイトレートの調製 ［Ｐｔ（ｅｎ）フルオレセインリジン（ＮＯ₃）］ＮＯ₃ 全反応を暗所で実施する。 Ｐｔ（ｅｎ）（ＮＯ₃）₂（０．０７７ｍｍｏｌ，２９．１７ｍｇ）をメタノー ル１０ｍｌに加え、加熱溶解する。 ε−（６−（フルオレセイン−５−カルボキサミド）ヘキサノイル）−Ｌ−リ ジン（０．０８１ｍｍｏｌ，５０ｍｇ）をメタノール１０ｍｌに溶解する。 フルオレセイン溶液を白金溶液に加え、少なくとも３時間反応させる。最終産 物をロータリエヴァポレーションにより単離する。 実施例７ 白金エチレンジアミン−５−（および６）−（（Ｎ−（５−アミノペンチル） アミノ）カルボニル）テトラメチルローダミン−ナイトロレートの調製 ［Ｐｔ（ｅｎ）（テトラメチルローダミン・カダベリン）（ＮＯ₃）］ＮＯ₃ 全反応を暗所で実施する。 Ｐｔ（ｅｎ）（ＮＯ₃）₂（０．０７４ｍｍｏｌ，２８ｍｇ）をメタノール１ ０ｍｌに加え、加熱溶解する。 テトラメチルローダミン・カダベリン（０．０７７ｍｍｏｌ，４０ｍｇ，モレ キュラ・プローブ・インク）をメタノール１０ｍｌに溶解する。 両溶液を混ぜ合わせ、少なくとも３時間反応させる。 最終産物をロータリエヴァポレーションにより単離する。 実施例８ 白金エチレンジアミン−カスケード・ブルー^R・カダベリン・ナイトレートの 調製 Ｐｔ（ｅｎ）（カスケード・ブルー・カダベリン）（ＮＯ₃）］ＮＯ₃ Ｐｔ（ｅｎ）（ＮＯ₃）₂（０．０５７ｍｍｏｌ，２１．６ｍｇ）を脱ミネラル 水１０ｍｌに加え、５０℃に加熱して完全に溶解させる。 カスケード・ブルー・カダベリン（０．０６ｍｍｏｌ，４０ｍｇ，モレキュラ ・プローブ・インク）を脱ミネラル水１０ｍｌに溶解する。 両溶液を混ぜ合わせ、少なくとも３時間反応させる。 最終産物をロータリエヴァポレーションにより単離する。 カスケード・ブルー^Rは、モレキュラ・プローブ・インクの登録商標である。 実施例９ 白金エチレンジアミン−４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ− ３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニルエチレンヂアミン−ナ イトレートの調製 Ｐｔ（ｅｎ）（ＢＯＤＩＰＹ^R ５３０／５５０ Ｃ３ＥＤＡ）（ＮＯ₃）］Ｎ Ｏ₃ Ｐｔ（ｅｎ）（ＮＯ₃）₂（０．０５２ｍｍｏｌ，１９．６６ｍｇ）をメタノ ール１０ｍｌに加え、加熱溶解する。 ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０ Ｃ３ＥＤＡ（０．０５４５ｍｍｏｌ，２５６ ｍｇ，モレキュラ・プローブ・インク）をメタノール１０ｍｌに溶解する。 両溶液を混和し、少なくとも３時間反応させる。 最終産物をロータリエヴァポレーションにより単離する。 ＢＯＤＩＰＹ^Rは、モレキュラ・プローブ・インクの登録商標である。 実施例１０ 白金エチレンジアミン−Ｎ−ε−（５−ジメチルアミノナフタレン−１−スル ホニル）−Ｌ−リジン−ナイトレートの調製 ［Ｐｔ（ｅｎ）（ダニシル・リジン）（ＮＯ₃）］ＮＯ₃ Ｐｔ（ｅｎ）（ＮＯ₃）₂（０．１２５ｍｍｏｌ，４７．５ｍｇ）を脱ミネラル 水２０ｍｌに加え、５０℃に加熱して完全に溶解させる。 ダニシル・リジン（０．１３ｍｍｏｌ，５０ｍｇ，モレキュラ・プローブ・イ ンク）を脱ミネラル水２０ｍｌに溶解し、０．４Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ７〜 ８に調整する。 両溶液を混和し、少なくとも３時間反応させる。最終産物は凍結乾燥により単 離する。 実施例１１ Ｐｔ（ｅｎ）−化合物をＤＮＡにカップリングする反応 ＤＮＡ分子をＰｔ（ｅｎ）−化合物で標識する典型的な反応 ５μｇの二本鎖ＤＮＡを超音波処理するか、あるいはＤＮａｓｅ（ディーエヌ エース）で処理して３００〜５００ｂｐの断片とする。これに６μｇのＰｔ（ｅ ｎ）−化合物を加え、その容量を５０μｌに調整する。反応混合物を６５℃で１ 時間保温する。未結合のＰｔ（ｅｎ）−化合物を１００μｌのＮＡＤＤＴＣ溶液 を添加してブロックする。Ｐｔ（ｅｎ）−化合物で標識されたＤＮＡはセファデ ックスＧ−５０のカラムで精製する。このように簡単に標識し、精製したＤＮＡ は−２０℃で保存するか、そのままＤＮＡプローブによるアッセイに使用する。 Ｐｔ（ｅｎ）−化合物で標識したＤＮＡプローブは、少なくとも２年間はその活 性および／または特異性を失うことなく２０℃で保存することができる。 上記の全ての応用例は、このプロトコールに従って標識したプローブを用いて 実施される。 実施例１２ 白金エチレンジアミン−ローダミン１２３−ナイトレートの調製 ［Ｐｔ（ｅｎ）（ローダミン１２３）（ＮＯ₃）］ＮＯ₃ 全反応を暗所で実施する。 Ｐｔ（ｅｎ）（ＮＯ₃）₂（０．０５８ｍｍｏｌ，２１．９ｍｇ）をＮ，Ｎ−ジ メチルホルムアミド１０ｍｌに加え、加熱溶解させる。 ローダミン１２３（０．０６０ｍｍｏｌ，２２．８ｍｇ）をＮ，Ｎ−ジメチル ホルムアミド８ｍｌに溶解する。ローダミン溶液を白金溶液に加え、少なくとも ３時間反応させる。生成物は、ロータリエヴァポレーションにより単離する。 実施例１３ 白金エチレンジアミン−（７−アミノ−４−メチルクマリン）−ナイトレート の調製 ［Ｐｔ（ｅｎ）（７−アミノ−４−メチルクマリン）（ＮＯ₃）］ＮＯ₃ 全反応を暗所で実施する。 Ｐｔ（ｅｎ）（ＮＯ₃）₂（０．０９８ｍｍｏｌ，３７．０ｍｇ）を２５ｍｌメ タノール／２ｍｌ脱ミネラル水に添加し、加熱溶解させる。７−アミノ−４−メ チルクマリン（０．１０ｍｍｏｌ，１８ｍｇ）をメタノール１０ｍｌに溶解する 。７−アミノ−４−メチルクマリン溶液を白金溶液に加え、少なくとも４時間反 応させる。生成物は、ロータリエヴァポレーションにより単離し、凍結乾燥する 。 実施例１４ 白金エチレンジアミン−５−アミノエオジン−ナイトレートの調製 ［Ｐｔ（ｅｎ）（５−アミノエオジン）（ＮＯ₃）］ＮＯ₃ 全反応を暗所で実施する。 Ｐｔ（ｅｎ）（ＮＯ₃）₂（０．０６８ｍｍｏｌ，２５．６ｍｇ）をＮ，Ｎ−ジ メチルホルムアミド１５ｍｌに加え、加熱溶解させる。５−アミノエオジン（０ ．０７５ｍｍｏｌ，５０ｍｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１０ｍｌに溶解 する。５−アミノエオジン溶液を白金溶液に加え、少なくとも４時間反応させる 。生成物は、ロータリエヴァポレーションにより単離する。 ５−アミノエオジン：モレキュラ・プローブ（Ａ−１１７）より購入可能 実施例１５ 白金エチレンジアミン−５−ＩＲＤ−ナイトレートの調製 ［Ｐｔ（ｅｎ）（ＩＲＤ）（ＮＯ₃）］ＮＯ₃ 全反応を暗所で実施する。 Ｐｔ（ｅｎ）（Ｎ〇₃）₂（０．００８ｍｍｏｌ，３．２ｍｇ）をＮ，Ｎ−ジメ チルホルムアミド５ｍｌに加え、加熱溶解させる。ＩＲＤ（下記参照）（０．０ ０９ｍｍｏｌ，７．５ｍｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド５ｍｌに溶解する 。ＩＲＤ溶液を白金溶液に加え、少なくとも３時間反応させる。生成物は、ロー タリエヴァポレーションにより単離する。 実施例１６ 汎用結合方式によるＤＮＡプローブのビオチン標識 序 論 この標識法は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＩＳＨ）のためにＤＮＡプ ローブをビオチンで標識するのに使用されている。本実施例では品質管理手続の ためのプロトコールとデータを含む標識手技を提示している。ビオチン標識のた めに、プラスミドでクローン化したヒト・パピローマウイルス・タイプ６（ＨＰ Ｖ，４０％ＧＣ塩基対）の全ＤＮＡを用いた。 実験手技 プラスミドＤＮＡの調製 ヒト・パピローマウイルス・タイプ６の全ＤＮＡをベクタｐＳｐ−６４にクロ ーン化した。プラスミドＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｃ−６００）に導入 し、アンピシリン含有ＬＢプレート上に移植した。単一コロニが一夜で大きな細 胞集団に成長した。プラスミドＤＮＡはバーンボイムとドリーの方法１に従って 単離し、セファロースＣ１−２Ｂ（ファルマシア）によるカラムクロマトグラフ ィにより精製し、制限酵素分析により挿入断片を調べた。プラスミドＤＮＡの濃 度はＡ２６０／２８０の吸光度により定量した。エタノール沈殿の後、ＤＮＡを １０ｍＭトリス・塩酸 （ｐＨ７．２；０．３ｍＭＥＤＴＡ）に最終濃度が１μ ｇ／μｌとなるように溶解した（バッチ＃１５０８９４）。次いで、このＤＮＡ を氷上１０分間ずつ３回超音波（ソニプレップ１５０、ＭＳＥ）処理した。 得られたＤＮＡ断片のサイズは２％アガロース・ゲル電気泳動で測定し、２０ ０〜４００塩基対であることが判明した（バッチ＃０５１０９４）。 プラスミドＤＮＡの標識化および精製 プラスミドＨＰＶ−６ ＤＮＡを以下の試薬と混合することによりビオチン− ＵＬＳで標識した。 プラスミドＨＰＶ−６ＤＮＡ(バッチ＃０５１０９４) ５μｌ(１μｇ/μｌ) ビオチン−ＵＬＳ標識化試薬(バッチ＃ＢＸ９４０８３０) ８μｌ(１μｇ/μｌ) 脱ミネラル水(＜０．２/μＳ/ｃｍ) ３７μｌ ５０μｌの反応混合物を８５℃で１５分間インキュベートした。 過剰の標識化試薬を５０μｌのジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム（２％脱 ミネラル水溶液）を加えて捕捉し、室温で３０分間放置した。 Ｓ３００ＨＲミクロスピンカラム（ファルマシア）によるサイズ排除クロマト グラフィで未結合のビオチン−ＵＬＳを除去した。 溶出容量を５００μｌとして１０ｎｇ／μｌ濃度のビオチンＨＰＶＶ−６プロ ーブ（バッチ＃０６１０９−４）を得た。 検出限界の品質管理 ビオチン・プローブの検出限界を以下のプロトコールに示す直接スポット−ブ ロット（点染）および逆ろ紙ハイブリッド形成により決定した。 直接スポット−ブロット ビオチン標識したＨＰＶ−６プローブ（バッチ０６１０９４）を９００ｍＭ塩 化ナトリウム、９０ｍＭクエン酸ナトリウムおよび２００μｇ／ｍｌ一本鎖サケ 精子ＤＮＡから成るスポットバッファに１０倍系列希釈し、１μｌ当たり１００ ０〜０．１ｐｇの希釈系列とした。 １μｌずつのスポットをニトロセルロース膜（メンブレン）に載せ、８０℃で ２時間加温放置してＤＮＡを結合させた。ストレプトアビジン−アルカリフォス ファターゼ接合体（シグマ）をＮＢＴ／ＢＣＩＰ沈殿基質溶液（シグマ）と組み 合わせて用い、ビオチンプローブを以下のプロトコールに従い可視化した： − メンブレンを０．５％ツイーン２０含有ＴＢＳ溶液（ＴＢＳＴ）に５分間 侵漬する。 − メンブレンをストレップ−ＡＰ（３ＤＥＡ Ｕ／ｍｌ）と共にＴＢＳＴ中 、３７℃で１５分間加温放置する。 − ＮＣ−メンブレンを５分間ずつ３回ＴＮＳ溶液中で洗浄し、次いで脱ミネ ラル水により５分間洗浄した。 − メンブレンをＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質溶液と３７℃で１５分間加温放置し、 次いで脱ミネラル水にて洗浄、空気乾燥した。 結 果 この方法によるビオチンＤＮＡプローブの検出限界は、１ｐｇ以下であった。 逆ろ紙ハイブリッド形成 ＨＰＶ−６ ＤＮＡ（バッチ０５１０９４）を０．１Ｎ水酸化ナトリウムで１ ／１０に希釈し、１００℃で５分間加温放置し、次いで直接氷の上に置いて一本 鎖ＤＮＡとした。冷却した０．１Ｎ水酸化ナトリウムで１０倍系列希釈して、１ μｌ当たり１０，０００〜１ｐｇ ＤＮＡの系列液とした。１μｌずつのスポッ トをナイロン・メンブレン（ベーリンガ・マンハイム）に載せ、風乾した。ビオ チン標識ＨＰＶ−６ ＤＮＡプローブを５ｘＳＳＰＥ／０．５％ＳＤＳ溶液で希 釈し、２００ｎｇ／ｍｌ濃度の溶液を得た。この溶液を１００℃で５分間加温放 置した後、５分間直接氷につけた。 目標のＤＮＡを含有するナイロン・メンブレンを２ｘＳＳＣに５分間侵漬し、 次いで一本鎖プローブ溶液で３７℃２時間加温放置した。過剰のビオチンプロー ブを２ｘＳＳＰＥ／０．１％ ＳＤＳで３７℃１０分間ずつ３回処理して除去し 、次いで５分間ＴＢＳＴで加温処理した。 ビオチンプローブは、直接スポット・ブロット法で述べたと同じプロトコール を実施、可視化した。 結 果 この方法によるビオチンＤＮＡプローブの検出限界は１０ｐｇ以下であった。 Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成の実施 試験材料は、オルガノシラン被覆ガラススライドに載せたＨＰＶ−６陽性頚部 コンジローマの６μｍパラフィン切片であった。以下のプロトコールを用いた（ 特に断らない限り、各工程は室温で行う）： １．パラフィン切片はキシレンで３度脱蝋して、等級エタノールで水和した。 ２．切片をＴＢＳＴで５分間すすいだ。 ３．切片を０．１Ｎ塩酸中、０．２５％ペプシンで３７℃５分間消化し、等級 エタノールで脱水後風乾した。 ４．プローブ溶液１０μｌを切片に注ぎ、カバースリップで被った。プローブ 溶液とは、０．６Ｍ ＮａＣｌ，０．０６Ｍクエン酸ナトリウム、３５％ホルム アミド、１０％デキストラン硫酸、２．５ｘデンハート溶液および１０μｌ／ｍ ｌ一本鎖さけ精子ＤＮＡから成るハイブリッド形成用混合物にビオチンＨＰＶ− ６プローブＤＮＡ（バッチ＃０６１０９４）を２ｎｇ／μｌの濃度に溶解したも のをいう。 ５．スライドを９５℃のホットプレート上に５分間置き、プローブと標的ＤＮ Ａを同時に変性させた。 ６．スライドを３７℃の加湿器に２時間入れてハイブリッド形成させた。 ７．カバースリップを取り除き、スライドを１５ｍＭ ＮａＣｌ，１．５ｍＭ クエン酸ナトリウムおよび５％ホルムアミドで３回洗浄した。 ８．スライドをＴＢＳＴですすいだ。 ９．切片をストレプトアビジンＡＰ接合体（ＴＢＳＴ中の３ＤＥＡ Ｕ／ｍｌ ）で３７℃１５分間保温処理した。 10．スライドをＴＢＳＴ（３ｘ）および脱ミネラル水（１ｘ）でそれぞれ５分 間洗浄した。 11．切片をＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質溶液３７℃１５分間保温処理した。 12．スライドを脱ミネラル水で洗浄（３ｘ）し、切片をグリセロール／ゼラチ ンに固定した。 結 果 この切片を用いて、ＨＰＶ−６感染細胞部分には青／紫色の沈殿を認め、残り の組織にはわずかなバックグランドを認めた。 結 論 結果によれば、ＵＬＳ法で標識したＤＮＡは好ましい標識検出限界を示す。Ｕ ＬＳ法は実施が迅速・容易であり、感度が高く、酵素処理工程を要しないなど、 結果として再現性の高い、全製造工程のコストを低下し得る方法なので、研究目 的、日常の、あるいは工業的標識核酸の製造に最適である。ＵＬＳ法は、常用さ れている非同位体標識法と同等の有用な代替法を提供する。 一般文献 １．マニアティス・Ｔ．，サムブルーク・Ｊ．，フリッシュ・Ｅ．Ｆ．，モエ レキュラ・クローニング、第二版、コールド・スプリング・ハーバ・ラボラトリ ー・プレス、ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３０９−６． ２．ケラー・Ｇ．Ｈ．，マナック・Ｍ．Ｍ．，ＤＮＡプローブ、ストックトン ・プレス、ＩＳＢＮ ０−３３３−４７６５９−Ｘ． 適 応 １．いわゆるＬＩＤＩＡ法（リンクＤＮＡイムノ・アッセイ；Linked DNA imm uno Assay）におけるＰｔ−ＤＮＡリンカの使用 ＬＩＤＩＡ法は少量のＤＮＡ（またはＲＮＡ）、たとえば、原料物質ＰＣＲ増 幅後のＤＮＡの定量分析を可能とする。本方法は特異的ＤＮＡ（ＲＮＡ）プロー ブを使用し、かつ、迅速ＤＮＡ（ＲＮＡ）Ｐｔ−標識化工程を経るために操作が 簡単なので、感度・特異性の高い方法である。 方法の記載： 本方法では、ＤＮＡ（ＲＮＡ）プローブの標識に迅速Ｐｔ標識化合物を使用す る。 本方法では、異なる３種の手法が可能である。 １．ＤＮＡ分子に交差結合する白金化合物を用いてＤＮＡプローブ分子をプラ スチック、ナイロンまたはニトロセルロースの表面に不可逆的に結合させる。次 いで、ＤＮＡ標的物の検出を典型的な標識化ＤＮＡ／ＲＮＡプローブ（ニックト ランスレーションまたは化学修飾、ランダムプライミング）により実施する。 ２．検出可能な基をＤＮＡに結合させ、ＤＮＡ分子をいわゆるＤＮＡプローブ とする。ＤＮＡ化合物を表面に結合させるには、科学上既知の古典的方法により 実施できる（特別に処理したマイクロタイタプレートに共有結合させる、ＤＮＡ 分子をニトロセルロースに焼き付ける、あるいはＤＮＡ分子をナイロンメンブレ ンに結合させる）。 ３．手法１および２の組み合わせ 手法１ 固定化したＤＮＡプローブはハイブリッド形成法により検体中の特定標的分子 を捕捉するのに使用できる。形成されたハイブリッドを検出するには異なる方法 を使用する；たとえば、第二の標識化ＤＮＡプローブを使用して標的ＤＮＡ分子 の異なる部分とハイブリッド形成させ、サンドイッチ型のハイブリッドを形成す る。標識物は、常用の免疫検出法および発色法により検出することができる。 手法２ （増幅された）検出可能なＤＮＡ（ＲＮＡ）含有物をプロトコールに従って直 接標識する。 過剰の標識物は、ＮａＤＤＴＣまたはチオウリューム（Thiooreum）を加えて 失活させる。この手法が他の方法と異なる点は、標的物を検出するために、他の アッセイ法では標識したＤＮＡ（ＲＮＡ）プローブを使用するのに対し、本方法 では標的分子を標識する点にある。Ｐｔ−標識化合物（ＵＬＳ）の素早い結合能 力が、診断テスト手順（通常の結合時間は６５℃で６０分を要する）におけるＤ ＮＡ結合工程の常用化を可能とする。 第二工程は、標的の特異プローブで予めコートしたマイクロタイタプレート中 で行う。インキュベーションは安定な“標識化標的物”とプローブのハイブリッ ド形成のために行う。標的分子を直接標識化することが面倒な二重ハイブリッド 形成技術を無用のものとする；二重ハイブリッド形成法では一方のプローブを標 的物の捕捉に使用し、もう一方の標識化プローブを固定化した標的物の検出に使 用する。 本方法においては、プローブがマイクロタイタプレートのウエル表面に共有結 合により結合してある。第二工程のインキュベーションは液中ハイブリッド形成 が特徴であり、迅速に実施することができる。これが定量的ＤＮＡハイブリッド 形成技術に対するこの手法の主要な革新的特徴の一つである。 手法３ ＤＮＡプローブまたはＤＮＡ標的物の固定化およびＤＮＡプローブと標的物の 標識化のためには、新たに開発されたＰｔ汎用標識化システムを用いることがで きる。これら二つのＤＮＡ結合方式は、“キャッチャ”（捕捉体）および“デテ クタ”（検出体）の双方が第二の物質に結合する場合（ビオチン、ジゴキシゲニ ンのような検出可能な基またはプラスチックスティック、マイクロタイタプレー ト、メンブレンのような担体表面のいずれか）の一つのアッセイに組み合わせる ことができる。 方式の例：ヒトの診断薬におけるＳＴＤ関連微生物の検出（クラミジア、梅毒 、エイズ、ヘルペス、淋疾、Ｂ−型肝炎） ２．Ｐｔ−ＤＮＡ標識物のテストストリップ手技との組み合わせ使用および様 式 “ＤＮＡ侵漬スティック” ＤＮＡ侵漬スティック手技は、少量のＤＮＡ（またはＲＮＡ）の定量および半 定量分析を可能とする；たとえば、ＰＣＲ増幅後の、あるいは体液検体（血液、 尿、汗など）に存在するものである。 この手技は特異的ＤＮＡ（ＲＮＡ）プローブを使用し、かつ、迅速ＤＮＡ（Ｒ ＮＡ）Ｐｔ−標識化工程を経るために操作が簡単なので、感度・特異性の高い方 法である。 この新開発のＰｔ標識物を用いることを特徴とする汎用性標識法は、ＤＮＡ（ ＲＮＡ）分子を結合させるのに３種の方法で用いることができる。 １．検出可能なマーカ基をポリヌクレオチド配列に結合させるのに使用するる ことができる。 ２．ポリヌクレオチド配列を固相（プラスチック、メンブレン、ラテックス・ ビーズ、ヒドロゾル、またはマイクロタイタプレート）に不可逆的に結合させる のに使用することができる。 ３．１および２の組み合わせ 利点１： この例では、テスト試料中の生物学的分析対象物の検出に二通りの方法がある 。 第一の方法では、ＤＮＡプローブを新開発のＰｔ標識化合物を用いて標識でき る。この標識化したプローブは標的のＤＮＡ配列と一次プローブとの間に形成さ れる、事前にメンブレン上に形成されたハイブリッドの検出に用いることができ る。この方法で必須のことは、一次プローブが二次Ｐｔ標識プローブとは異なる 標的物上の配列を認識することである。実際に、これはたとえばＲＮＡハイブリ ッド形成で達成され、その際にはポリＡプローブが全ＲＮＡ（ポリＴ端子により 認識可能）をメンブレンに固定化するのに用いられる。 第二の方法はやや異なって、この場合には迅速で特異性の高いｐｔ標識化を特 徴とするので、標的物をテスト試料液中で標識することができる。この方法での 処方は、標識化した標的物を適当なメンブレン上に固相化した特異的非標識ＤＮ Ａプローブで捕捉することから成る。これがＤＮＡ／ＲＮＡへ応用した侵漬ステ ィック法である。 利点２： ＤＮＡプローブまたは標的ＤＮＡを固相化するには、非標識のＰｔ化合物（す なわち、二つの遊離結合部位を持つＰｔ化合物）が、ＤＮＡと担体（プラスチッ ク、メンブレン、マイクロタイタプレートなど）表面との橋渡しとして用いられ る。 これまでの科学では、自然な方法でＤＮＡに結合する物質がほとんど知られて いなかったために、これはＤＮＡ配列の捕捉分子として診断アッセイにおいての 有用性を著しく高めるものである。このＰｔ架橋分子を広めることで、ＤＮＡ技 術にとって新しい応用分野が広がりつつある。 利点３：実施例１および２の組み合わせ 一般法：特に、Ｐｔリンカ分子をラテックスまたはヒドロゾル・アッセイに用 いるのは興味深い。このリンカは、ＤＮＡ分子と微少粒子のカップリングを可能 にする。ＤＮＡ分子は、標的物質とハイブリッドを形成することができる。陽性 反応はＤＮＡハイブリッド粒子化合物を架橋結合させ、粒子の凝集像として可視 化することができる。 このようなテストは定量化可能であり、その凝集度は調整して、特定の波長で 測定することができる。殊に、金粒子は最適波長が凝集後に移動するという固有 の特性を有している。 ３．診断テスト手順においてＰｔ−マーカ化合物を用いる蛋白質の標識 Ｐｔ−マーカ化合物は特定の条件下で蛋白質構造と相互作用する能力を有し、 ＤＮＡの結合条件とは異なる条件で、たとえば以下のような標識に使用すること ができる。 ａ．テスト試料中の一次標的を検出するためのモノまたはポリクローナル抗体 ｂ．いわゆる拮抗原理に基づく試験法の抗原として用いる蛋白誘導体 ｃ．他の化合物と特異的に相互作用することが知られている特別な蛋白構造物 ；ただし、互いに非免疫的な相互作用を生じるものである；たとえば、ストレプ トアビジンとビオチン、およびプロテインＡおよびＢとイムノグロブリン。 標識化したトレーサ分子は、適当なテスト方式（侵漬スティック、ＥＬＩＳＡ 、その他）によって、ある量のある種の生物分析対象物を定性的あるいは定量的 測定するのに使用することができる。 ４．長期作用蛋白質 本発明Ｐｔリンカの特に興味のある有力な用法は、生体内蛋白質（一般には生 体分子）を安定化することである。該Ｐｔ化合物の治療上の利用は、治療薬（イ ンシュリン、第ＩＩＩ因子など）として使用される生体物質が体内では短期間の 作用を示すということである。これらの物質をＰｔ化合物とカップリングさせる ことは、これらの分子の半減期を引き延ばし、生体内で生成し使用される物質が 長期作用することを可能にする可能性がある。このことは患者にトラブルを少な くし、高価な医薬・治療薬の使用がより効果的に成り得ることを示唆している。 ５．銀−増幅技術での白金化ＤＮＡプローブの検出 白金化ＤＮＡ／ＲＮＡプローブは、試料材料中のＤＮＡ／ＲＮＡ配列を検出す るハイブリッド形成法に使用することができる。標的部位に白金化合物を導入す ることは、イオン性銀を金属性銀に還元するように特別に設計された化学反応に おいて、Ａｇ分子を沈殿させることを可能とする。Ｐｔ核の部位では、Ｐｔ核の 触媒効果により金属性銀（黒色）の分解が起こる。 イオン性の銀は、溶液中還元剤（たとえば、水素化ホウ素ナトリウム、ヒドロ キノン）で還元される。一定割合で泊金上に沈積する銀の量は増幅のためのイン キュベーション時間に比例する。目に見えないＰｔ核の可視化は、テスト試料中 に黒色スポットの現れるのを実験的に観察して行う。 黒色スポットは特異的プローブが結合している部位、すなわち、特異的標的の 存在部位を意味している。この技術は、種々の微生物および遺伝子転座／異常検 出のための迅速で容易な診断手技を可能とする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 イェルスマ，ティンカ オランダ国 1326 デーヘー アルメレ ケルセボームストラート 39 (72)発明者 ファン エス，レムコ マリア オランダ国 1541 エヌエル コーグ ア ー／デー ザーン ヘナラント 25 (72)発明者 ファン デン ベルフ，フランシスキュス ミシエル オランダ国 2134 イェーベー ホーフト ドルプ クラーターボス 75 (72)発明者 レンペルス，エドウィン レオ マリオ オランダ国 1788 ヘーベー ユリアナド ルプ フォーヘルザント 2231 (72)発明者 ブルーミンク，マリーケ ヨハンナ オランダ国 2341 エルエム ウーフスト ヘースト ホフブルーケルラーン 31

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．標識化物質のリンカの製造法であって、該リンカが下記式 （ただし、式中Ｘは安定化した架橋を表し、ＡおよびＢは同一または異なって反 応性部分を表す）で表される白金化合物から成り、原料物質が下記構造式 （ただし、式中Ｃは電気陰性反応性部分を表す）で表される化合物から成ること を特徴とする標識化物質のリンカの製造法。 ２．ＡおよびＢが同一であることを特徴とする請求項１記載の方法。 ３．Ｘが脂肪族ジアミンを表すことを特徴とする請求項１〜２記載の方法。 ４．Ｘが２〜６個の炭素を有するジアミンを表すことを特徴とする請求項３記 載の方法。 ５．Ｘがエチレンジアミン基であることを特徴とする請求項２記載の方法。 ６．ＡおよびＢがＮＯ₃ ^-、ＳＯ₃ ^-、Ｃｌ^-、Ｉ^-、または他のハロゲンから成る 群より選ばれることを特徴とする請求項５記載の方法。 ７．Ｃがハロゲン、ＮＯ₃ ^-、またはＳＯ₃ ^-であることを特徴とする前記請求項 のいずれかに記載の方法。 ８．標識化物質のリンカの製造法であって、該リンカが下記式 （ただし、式中Ｘはエチレンジアミン基を表し、ＡおよびＢはＮＯ₃ ^-を表す）で 表される白金化合物から成り、原料物質が下記構造式 （ただし、式中Ｃはハロゲンを表す）で表される化合物から成り、かつ、原料物 質をエチレンジアミンと反応させ、その生成物をＡｇＮＯ₃と反応させることを 特徴とする標識化物質のリンカの製造法。 ９．式 （ただし、式中Ａ、ＢおよびＸは前項に定義のとおりである）で表される化合物 と、ＹをＢに置換し得る標識基とを反応させることを特徴とする式 （ただし、ＸおよびＡは前項に定義のとおりであり、Ｙは標識基である）で表さ れることを特徴とする標識物質の製造法。 10．請求項９の方法によって得られる標識化合物を生物有機分子と反応させ、 該Ａ基を生物有機分子と置換することを特徴とする生物有機分子の標識化法。 11．生物有機分子が蛋白質、ペプチド、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子または（オリ ゴ）ヌクレオチドであることを特徴とする請求項１０記載の方法。 12．請求項１〜８のいずれかの方法で得られるリンカと少なくとも一種の適当 な標識物および他の任意の適当な検出手段から成ることを特徴とする生物物質の 検出、定量および／または位置特定のための診断テストキット。 13．請求項９の方法で得られる標識物および任意の他の適当な検出手段から成 ることを特徴とする生物物質の検出、定量および／または位置特定のための診断 テストキット。 14．請求項１０または１１の方法で得られる標識化生物有機分子および任意の 他の適当な検出手段から成ることを特徴とする生物物質の検出、定量および／ま たは位置特定のための診断テストキット。