JPH11506777A - 酸素除去による冷凍赤血球の有効貯蔵寿命の延長方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 経済的な４℃保存方法であり、赤血球の品質を維持させ、生体生存を確保しつつ後輸血の長期化を図る方法である。保存時において酸素を除去することにより、アデノシン・トリフォスフェートのレベルが維持され、赤血球の４℃保存におけるヘモリシスおよび薄膜小胞生成を減少させることができた。赤血球におけるアデノシン・トリフォスフェートのレベルをアンモニウム・フォスフェートの添加により高めることもできる。

Description

【発明の詳細な説明】 酸素除去による冷凍赤血球の有効貯蔵寿命の延長方法 発明の技術分野 本発明は血液の保存に係わり、特に酸素の非存在下での血液の冷凍保存に関す る。本発明は米国エネルギー省によるカリフォニア大学評議委員会に対する契約 Ｎｏ．Ｗ−７４０５−ＥＮＧ−３６に基づき政府援助のもとで成されたものであ る。従って、米国政府は本発明に対し、ある種の権利を有する。 発明の背景 現在の血液供給は需要に比べて可なり少ない。保存血液は保存時における着実 な劣化により約５−６週間で使用不能になると考えられている。なぜならば、そ のような血液は輸血後の循環において生存し得ないからである。この劣化はヘモ グロビンの酸化、退化、アデノシン・トリホスフェート（ＡＴＰ）涸渇が一部関 係している。さらに、非自己由来の供血者からの血を受けた場合の危険性も大き い。この現在の需要に対処するためには、血液保存技術は簡単で、安価で長期間 保存可能でなければならない。 赤血球（ＲＢＣｓ）は人体中にて激しい流れの条件下でタンパク合成なくして 約４ケ月生存する。酸素（Ｏ₂）はヘモグロビン（Ｈｂ）をメト−Ｈｂに変換さ せるのに必須のものである。このメト−Ｈｂが分解すると、毒性生成物、例えば ヘミクローム、ヘミン、遊離Ｆｅ³⁺が生じる。Ｏ₂とともに、 これらの生成物は触媒として機能し、ヒドロキシル・ラジカル（ＯＨ・）を生じ させる。このＯＨ・およびメト−Ｈｂ分解生成物が赤血球の脂質薄膜、薄膜骨格 、血球成分を損傷させる。後述のように、現在の赤血球保存に対するアプローチ の仕方はヘモグロビン分解損傷経路に対処するものではない。 冷凍は生体でのメト−Ｈｂ還元に必要な酵素を不能にし、破壊性Ｏ₂の赤血球 中の溶解度を増大させ（ほぼ２倍）、糖分解速度を減少させる（４℃ではその速 度は３７℃の約１％）ことによりＡＴＰのレベルを減少させる。赤血球中ＡＴＰ の減少はエキノサイト（赤血球の不安定な形態）の形成を生じさせ、薄膜の小胞 形成を促し、赤血球の表面積を縮小させ、脾臓マクロファージにより腐骨形成を 加速させる。小胞形成は冷凍保存期間中継続し、エキノサイト形成により悪化し 、赤血球薄膜面積を減少させることにより赤血球の生存を減少させる。 血液保存においてＡＴＰレベルを向上させたり保持させるための研究が行われ ている。例えば、文献、Vox Sang 65．87-94(1993)．Greenwalt et al．“変性 フォスフェート−アンモニウム添加溶液の用いた生体内、生体外の赤血球保存− ７の研究”において、著者は２０ｍＭのＮＨ₄Ｃｌ、３０ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄、 ２ｍＭのアデニン、１１０ｍＭのデキストロース、５５ｍＭのマンニトールを含 み、ｐＨが７．１５の実験添加剤溶液（ＥＡＳ−２）がヒトＲＢＣｓの貯蔵寿命 を従来の５−６週間から８−９週間に延長させるのに効果 があったとしている。包装されたＲＢＣｓは簡単な洗浄工程の後、上澄液を除去 することにより輸液を行うのに適している。Greenwalt et alはＡＴＰ濃度以外 の要因が保存５０日後のＲＢＣ生存力を決定するのに重要な役割を果たしている と結論している。文献、Transfusion 7，401-408(1967)，L.Wood，E.Beutler“ フォスフェート・アデニン媒体に貯蔵したヒト血液の生存力”を引用し、実験の 結果、ＡＴＰ濃度を２４時間ＲＢＣ生存との関係は８週間の保存後においてはっ きりしなくなったと述べている。E.Beutler，C.West は赤血球ＡＴＰ濃度と生存 力との関係は長期の保存後においては弱いことを、文献、J.Lab.Clin.Med.102， 53-62(1983)“ＣＰＤ−Ａ中での赤血球濃縮物の４２日、４９日間の保存”で述 べている。 文献、Vox Sang 51，27-34(1986)，Hogman et al,“＋４℃での液体保存にお ける赤血球に対するＯ₂の影響”において、著者は赤血球中のＡＰＴ含量は２− ３週間後において嫌気性保存の方が好気性保存よりも若干良好であったと述べて いる。静脈液を冷凍し、窒素雰囲気中で酸素透過性のバッグに入れて酸素を与え ることなく保存し、これにより酸素のレベルを徐々に減少させた。その結果、４ ℃での保存の間、酸素濃度が徐々に減少し、６０％の濃度から５週間で３０％の 濃度に減少させた。その結果、保存赤血球の全体的品質に対するその効果につい てはっきりした結論は得られなかった。これらの著者はヘモグロビンに対する酸 素依存性損傷、ヘモグロビン分解生成物による酸素媒介損傷について取組んでお らず、またそれらを可なり減少させることをしていない。 したがって、本発明の目的は、ヘモグロビン分解、赤血球分解（ヘモリシス） およびＡＴＰ涸渇の問題を、自己由来の輸血、高められた異質組織輸血の実行に 即した方法で取扱うものであり、赤血球の冷凍保存がその後の使用に障害をもた らす虞れのない保存期間の延長を達成することである。 本発明の他の目的は、輸血サンプルを製造するのに必要な手続きの複雑性を少 なくすることができる延長された血液の保存方法を提供するものである。 本発明の他のその他の目的、利点、新規な特徴は以下の記載から明らかであろ う。 本発明の概要 上記目的を達成するための本発明の赤血球保存方法は以下の工程からなること を特徴とする。すなわち、保存されるべき赤血球を含む全血のサンプルを抗凝固 剤溶液と混合し赤血球の第１の懸濁液を形成する工程と、該第１の懸濁液の液体 部分（血漿）から赤血球を濃縮し赤血球の密集体を形成する工程と、該赤血球の 密集体をグルコース、アデニン、塩を含む添加剤溶液と混合し第２の赤血球懸濁 液を形成する工程と、該第２の赤血球懸濁液から酸素を除去する工程と、該第２ の赤血球懸濁液を４℃に冷却する工程とからなることを特徴とする方法を提供す るものである。 好ましくは、この冷却された赤血球がさらに酸素に接することがないようにす る。 本発明の他の態様として、以下の赤血球保存方法が提供さ れる。すなわち、赤血球の密集体を形成する工程と、該赤血球の密集体をグルコ ース、アデニン、塩を含む添加剤溶液と混合し赤血球懸濁液を形成する工程と、 該赤血球懸濁液から酸素を除去する工程と、該赤血球懸濁液を４℃に冷却する工 程とからなることを特徴とするものである。 好ましくは、この冷却された赤血球がさらに酸素に接することがないようにす る。 本発明の利点は、ヘモグロビンの劣化を防止させるところの無酸素の環境を生 じさせる結果、ＡＴＰのレベルが維持され、ヘモリシスの減少および冷凍ＲＢＣ ｓに薄膜小胞の蓄積の減少が図られ、その結果、有効な冷凍保存の期間を延長さ せることができることである。 図面の簡単な説明 図面は本発明の具体例を説明記載とともに示すもので、これにより本発明の原 理の理解を容易にするものである。ここで、 図１は赤血球をアンモニウム・フォスフェートで処理し４℃で保存した場合の 薄膜小胞の蓄積量に対する種々の保存ガスの効果を時間を関数として示すもので ある。 図２は赤血球をアンモニウム・フォスフェートで処理し４℃で保存した場合の ヘモリシスの割合に対する種々の保存ガスの効果を時間を関数として示すもので ある。 図３は赤血球をアンモニウム・フォスフェートの存在の有無の条件下で４℃で 保存した場合の細胞質ＡＴＰレベルに対する種々の保存ガスの効果を時間を関数 として示すものであ る。 図４は酸素除去の効果が、全赤血球ＡＴＰ，ヘモリシスの割合および発生小胞 の蓄積量に及ぼす影響を、赤血球を４℃で３．５週間保存した場合について示す もので、これを無処理の対照サンプルとの比較で表している。 発明の詳細な説明 本発明の特徴を簡単に述べると、赤血球の長期の保存を酸素を除去した状態で ４℃で行い、かつ保存されたＲＢＣｓがその後さらに酸素に触れることを避ける ことにより、輸血された赤血球の生体での生存特性を改善したことにある。これ はヘモリシス、小胞生成、ＡＴＰレベルの生体診断により総合的に見ることによ り赤血球の生体生存への有効性を知ることができる。さらに、保存赤血球におけ るアデノシン・トリホスフェートのレベルがアンモニウム・フォスフェートを添 加した或るサンプルにおいて高められていることが判明した。 酸素除去および種々の添加剤溶液の作用を、ジ−（２−エチルヘキシル）フタ レート（ＤＥＨＰ）可塑化剤を含む標準の塩化ビニル（ＰＶＣ）バッグで、これ にクエン酸塩、フォスフェート、塩化ナトリウム、アデニン、デキストロース（ 抗凝固／緩衝溶液、ＡＳ３）を収容したものに赤血球を入れて保存したものにつ いて、遠心分離後に検査した。酸素は血液バッグにアルゴンを７ないし１０回吹 き込むことにより常温のＲＢＣｓから除去した。その結果、ＲＢＣｓ中の酸素レ ベルは飽和レベルの８ないし５％となった。各血液ユニッ トを再分割（約１２０ｍＬ区分）にし、ＤＥＨＰ可塑化ＰＶＣトランスファーバ ッグ（容量１５０ｍＬ）に収容した。血液は遮光血液バンク冷凍庫中で４℃で保 存しサンプルを滅菌隔膜サンプリングポートを介して取り出した。急速バージン グの後の急速冷却はＲＢＣｓ中に乳酸が蓄積するのを防止する上で必要なことで ある。さらに、酸素はＲＢＣｓが冷却された後に、除去することも可能である。 しかし、ＲＢＣｓは一旦冷却されると酸化作用に対し無防備になり、かつ、酸素 除去は４℃で行うよりも３７℃あるいは２１℃で行う方がより急速に酸素除去が なされるため、好ましい方法としては、酸素除去を行った後に冷却を行うことで ある。上記のHogman et alにより報告されているように、従来のＰＶＣバッグは 酸素透過性のものであり、包装された赤血球は従来の保存方法では約４週間で完 全に酸化されてしまう。貯蔵用ガスで置換した長期効果を評価するため、トラン スファーバッグをアルゴンなどの不活性ガスで満たされた嫌気性チャンバーに保 存した。嫌気性チャンバーを部分的真空に曝し、ついで適当なガスで満たすサイ クルを２ないし３回繰り返すことにより血液バッグのガス置換をさらに促進させ ることができた。さらにパラジウム触媒を備えた水素発生システムを嫌気性チャ ンバーに配置し、中の血液バッグからの微量の酸素を連続的に除去した。 ＥＡＳ２、つまりＡＴＰを増大させるアンモニウムフォスフェート添加溶液の 作用（上述の Greenwalt et alで記載されているように）をさらに本発明者によ り検査した。上述の ように、この添加剤溶液は赤血球が保持するＡＴＰを４℃での保存の間、徐々に 増大させた。 次に、本発明の好ましい具体例について図面を参照して説明する。まず、図１ には、赤血球をアンモニウム・フォスフェートで処理し４℃で保存した場合の薄 膜小胞の蓄積量に対する種々の保存ガスの効果が時間を関数として示されている 。保存時に赤血球から放出され薄膜小胞の形で得られたたんぱく質の量が、ＡＳ ３（丸印）、ＥＡＳ２（Ｘ印）、ＥＡＳ２＋アルゴン（＋印）について示されて いる。これらの点は５個の平均値を示している。１０ｍＭのＮＨ₄ ⁺（ＮＨ₄Ｃｌ として）および２０ｍＭのＭＰＯ₄ ^-3（Ｎａ₂ＨＰＯ₄として）の添加（ＥＡＳ２ ）は保存期間を通してＡＴＰレベルを可なり増大させ小胞生成を減少させた。ア ルゴンおよびＯ₂除去剤（Ｈ₂／Ｐｄ）で酸素を除去することにより小胞の生成を さらに抑制し得ることが理解できよう。（ＮＨ₄）₃ＰＯ₄の存在下でアルゴンで 酸素を除去することによりヘモリシスの割合が減少し、ＡＴＰレベルは、酸素除 去なしで（ＮＨ₄）₃ＰＯ₄の存在下で達成されたＡＴＰレベルよりも更に大きく 増大した。 図２は赤血球をアンモニウム・フォスフェートで処理し４℃で保存した場合の ヘモリシスの割合に対する種々の保存ガスの効果を時間を関数として示している 。ヘモリシスの率がＡＳ３（丸印）、ＥＡＳ２（Ｘ印）、ＥＡＳ２＋アルゴン（ ＋印）について示されている。これらの点はＡＳ３の場合は１０個、その他は５ 個の平均値を示している。すべてのサ ンプルについてヘモリシスの度合いは、生体外診断のため冷凍ＲＢＣｓを繰返し サンプリングするため、その際の反転あるいは混合のため予想より幾分高くなっ ていた。この結果から、酸素を除去したＲＢＣ懸濁液はヘモリシスの率が減少し ていることが理解されるであろう。 図３は赤血球をアンモニウム・フォスフェートの存在の有無の条件下で４℃で 保存した場合のＡＴＰの濃度に対する種々の保存ガスの効果を時間を関数として 示すものである。合計細胞質ＡＴＰはμｍｏｌＡＴＰ／ｇＨｂで与えられている 。このＡＴＰのレベルがＡＳ３（丸印）、ＥＡＳ２（Ｘ印）、ＥＡＳ２＋アルゴ ン（＋印）について示されている。これらの点は５ないし１０個の平均値を示し ている。酸素涸渇サンプルは、検査した１１週間に亘って、（ＮＨ₄）₃ＰＯ₄添 加剤存在のものより高いＡＴＰレベルを維持することが分かる。 以下、本発明の方法の詳細について実施例を参照して説明する。 実施例 図４は酸素除去の効果が、全赤血球ＡＴＰ，ヘモリシスの割合および発生小胞 の蓄積量に及ぼす影響を、赤血球を４℃で３．５週間保存した場合について示す もので、これを無処理の対照サンプルとの比較で表している。包装された赤血球 の６個のユニットをAdsol あるいはＡＳ３保存液にて３−４日商業血液バンクで 保存した。約等量の超純粋アルゴンを、赤血球を３００ｍＬ収容した血液バッグ に温度２２℃で導入 し水平に静かに撹拌した（４０ｒｐｍ）。このガスは４時間に亘って７回交換し 、最終的にヘモグロビンの酸素飽和度を５％とした。各血液ユニットをついでト ランスファーバッグ（容量１５０ｍＬ）に収容した。このトランスファーバッグ はＡｒ９０％、Ｈ₂１０％およびパラジウム触媒を収容した気密キャニスターに 予め収納したものである。この血液は遮４℃で保存した。その結果、酸素の除去 のみで生体生存の全ての兆候の改善を容易に観察することができた。これらの結 果は、控え目のものである。なぜならば、これらのサンプルは既に、酸素の存在 下で２−４日間冷蔵されたものを用いたからである。 上記記載は説明のためのもので本発明を制限することを意図したものではない 。したがって、種々の変更も本発明の趣旨に従って可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ヨシダ，タツロウ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02165，ニュートン，コモンウェルス ア ヴェニュ 1736

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．赤血球を保存するための方法であって、 （ａ）保存されるべき赤血球を含む全血のサンプルを抗凝固剤溶液と混合し、 赤血球の第１の懸濁液を形成する工程と、 （ｂ）該第１の懸濁液の液体部分から赤血球を濃縮し赤血球の密集体を形成す る工程と、 （ｃ）該赤血球の密集体をグルコース、アデニン、塩を含む添加剤溶液と混合 し第２の赤血球懸濁液を形成する工程と、 （ｄ）該第２の赤血球懸濁液から酸素を除去する工程と、 （ｅ）該第２の赤血球懸濁液を４℃に冷却する工程と、 からなることを特徴とする方法。 ２．該第２の赤血球懸濁液から酸素を除去する工程が第２の赤血球懸濁液に不 活性ガスを繰返し吹き込むことからなる請求の範囲１記載の方法。 ３．該第２の赤血球懸濁液を酸素透過性の容器に収納し、無酸素雰囲気にて置 く工程をさらに含む請求の範囲１記載の方法。 ４．該第２の赤血球懸濁液を酸素透過性の容器に収納し、酸素除去剤を収容し た無酸素雰囲気にて置く工程をさらに含む請求の範囲１記載の方法。 ５．該第２の赤血球懸濁液にアンモニウム・フォスフェートを添加しアデノシ ン・トリフォスフェートの赤血球中レベ ルを増大する工程をさらに含む請求の範囲１記載の方法。 ６．該第２の赤血球懸濁液から酸素を除去する工程が該第２の赤血球懸濁液を ４℃に冷却する工程の前に行われる請求の範囲１記載の方法。 ７．アンモニウム・フォスフェートの赤血球中の濃度を下げるため、使用に供 する前に赤血球をグルコースを含む塩溶液で洗浄する工程をさらに含む請求の範 囲１記載の方法。 ８．赤血球を保存するための方法であって、 （ａ）赤血球の密集体を形成する工程と、 （ｂ）該赤血球の密集体をグルコース、アデニン、塩を含む添加剤溶液と混合 し赤血球懸濁液を形成する工程と、 （ｃ）該赤血球懸濁液から酸素を除去する工程と、 （ｄ）該赤血球懸濁液を４℃に冷却する工程と、 からなることを特徴とする方法。 ９．該赤血球懸濁液から酸素を除去する工程が該赤血球懸濁液に不活性ガスを 繰返し吹き込むことからなる請求の範囲８記載の方法。 １０．該赤血球懸濁液を酸素透過性の容器に収納し、無酸素雰囲気にて置く工 程をさらに含む請求の範囲８記載の方法。 １１．該赤血球懸濁液を酸素透過性の容器に収納し、酸素除去剤を収容した無 酸素雰囲気にて置く工程をさらに含む請求の範囲８記載の方法。 １２．該赤血球懸濁液にアンモニウム・フォスフェートを添加しアデノシン・ トリフォスフェートの赤血球中レベルを 増大する工程をさらに含む請求の範囲８記載の方法。 １３．該赤血球懸濁液から酸素を除去する工程が該赤血球懸濁液を４℃に冷却 する工程の前に行われる請求の範囲８記載の方法。 １４．アンモニウム・フォスフェートの赤血球中の濃度を下げるため、使用に 供する前に赤血球をグルコースを含む塩溶液で洗浄する工程をさらに含む請求の 範囲８記載の方法。