JPH11509083A - 遺伝子発現用プロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、細菌宿主内におけるタンパク質産生のための新規な発現システムを提供する。このシステムは、転写の開始にきわめて効率的であり、したがってタンパク質収率が増大する新規なプロモーターを利用する。このプロモーターはコンセンサス大腸菌プロモーターの−35領域、lppP-5プロモーターの−10領域およびlppPまたはlacUV５プロモーターいずれかに由来する上記２領域の間のスペーサーから構成される。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子発現用プロモーター発明の分野 本発明は、細菌宿主に適用される遺伝子工学技術に関する。さらに詳しくは、 本発明は、細菌宿主におけるタンパク質の製造のための発現系に関する。発明の背景 組換えDNA技術の出現は、様々の天然に存在するタンパク質および合成タンパ ク質の細菌、かび、酵母および哺乳動物細胞のような生物体内における製造を可 能にしてきた。一般的に、それは、所望のタンパク質をコードする遺伝子の宿主 生物体内への挿入、およびその遺伝子発現のための宿主細胞機構の利用を包含す る。 組換えDNA技術は、工業的に受け入れられる収率でのタンパク質の製造を達成 するために、絶えず発展を続けている。タンパク質の組換え製造における制限因 子は、所望のタンパク質をコードする遺伝子の発現率である。とくに、遺伝子の プロモーター領域が遺伝子発現の転写過程に重要であることが明らかにされてい る。大腸菌に見出されるtrpプロモーターのような効率的なプロモーターはDNA− 依存性RNAポリメラーゼに強固に結合し、mRNAの発生における遺伝子の転写を開 始させる。lacプロモーターのような効率がより低いプロモーターはRNAポリメラ ーゼにそれほど強固には結合せず、mRNAの発生率はもっと低下する。 trpプロモーターは、転写を効率的に開始させるその能力により、異種タンパ ク質の製造に広範囲に用いられている。その効率性にもかかわらず、trpプロモ ーターには制御が容易ではないという固有の欠点がある。とくに、trpプロモー ターは完全には抑制されず、すなわち宿主が 培養液中でタンパク質の産生に適当な期に生育する前に転写を駆動してしまう。 他の広範囲に使用されるプロモーターのlacは、trpほど効率的ではないが、制御 はより容易である。 さらに効率的なプロモーターを開発するため、異なるプロモーターの機能成分 が、たとえば米国特許第5,362,646号に記載の場合のように組合わされてきた。 一例では、バクテリオファージＴ７プロモーターA₁(P_A1)が２つのlacオペレータ ーと組合わされている。とくに、バクテリオファージＴ７プロモーターのいわゆ る−35および−10領域の間のスペーサー領域が修飾lacオペレーター配列で置換 され、得られたプロモーターハイブリッドを制御するために、第二のlacオペレ ーターが下流に導入された。生じたプラスミド／オペレーター系を市販のpUHEプ ラスミドに導入すると、誘導により効率的に転写を開始し、しかも誘導前には高 度に抑制されることが見出された。 Tsungら（Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1990，87: 5940）によって記載され た他のプロモーターは、有効なtrp−35領域、高度に効率的なlppP-5プロモータ ー（lppプロモーターの変異体）からの−10領域およびlacプロモーター由来のス ペーサーから構成される。このプロモーターは転写開始に極めて効率的であり、 細胞の致死を生じるほどであった。様々なプロモーターが微生物宿主におけるタ ンパク質の収率の改善を可能にしているものの、工業的に価値のあるタンパク質 のさらに効率的な産生を駆動するプロモーターの要求は依然として存在する。発明の概要 本発明の一態様によれば、細菌宿主内におけるタンパク質の発現に有用な新規 組換えDNA構築体が提供される。この構築体は、タンパク質のコード領域と、そ れに操作可能（operably）に連結する。 5′-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3′ および 5′-TTGACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATACT-3′ から選択されるDNA配列を有するプロモーターからなる制御領域によって構成さ れる。図面の簡単な説明 図１は、本発明の組換えDNA構築体が導入された発現カセットのヌクレオチド 配列および模式的表示を例示す。 図２および３はプロモーターおよびオペレーター領域からなる本発明のDNA構 築体のヌクレオチド配列を例示する。発明の詳細な説明 本発明は、細菌宿主たとえば大腸菌内において、高度に効率的なDNAの発現を 駆動させるのに有用なDNA配列を提供する。これらの配列からなる発現ベクター の使用は、同種および異種の両方の発現タンパク質の産生の増大を達成するため に有用な手段を与える。本発明の一態様においては、細菌宿主内でのタンパク質 の発現に有用な新規組換えDNA構築体が提供される。この構築体はタンパク質の コード領域と、このタンパク質に操作性に連結して宿主内におけるこのタンパク 質の発現を可能にするプロモーターからなる制御領域とから構成され、この場合 プロモーターは、 5′-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3′ および 5′-TTGACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATACT-3′ から選択されるDNA配列を有する。 これらのプロモーターは共通してコンセンサス配列の−35領域： TTGACAおよびその配列の−10領域：TATACTを有する。スペーサー配列すなわち介 在する18塩基の配列は、本発明よれば、ACATAAAAAACTTTGTGTまたはCTTTATGCTTCC GGCTCGのいずれかであることができ、好ましくは、ACATAAAAAACTTTGTGTである。 したがって、本発明はその好ましい実施態様においては、所望のタンパク質をコ ードするDNAが、配列： 5′-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3′ のプロモーターに対する発現制御下に操作性に連結しているDNA構築体を提供す るものである。 本技術分野の熟練者には明らかなように、本発明のプロモーターは、機能制御 領域内に、発現を駆動するために要求される成分の１つの必須エレメントを構成 する。さらに、これらのプロモーターはグラム陰性またはグラム陽性（Gram−ve or＋ve）細菌内で複製可能な任意の適当な発現ベクター中に標準操作を用いて 挿入することができる。さらに特定すれば、遺伝子発現制御領域を形成させるた めに、本発明のプロモーターは、発現に通常要求される他の制御エレメント、た とえばリボソーム結合部位および、本発明の実施態様においては、プロモーター 機能を制御するように働くオペレーターが導入されることになる。 これらの成分は、よく理解されている遺伝子発現原理に従って発現が起こるた めに要求される互いの相対位置で配列される必要がある。 本発明の一実施態様においては、構築体の制御領域にオペレーターが導入され る。使用できるオペレーターには、化学インデューサーによって直接誘導されう るオペレーター、およびlacのように脱抑制可能なオペレーターが包含される。 適当なオペレーターの例には大腸菌ラクトース、ガラクトース、トリプトファン およびテトラサイクリンオペレーターが包含される(Millerら，“The Operon” ，Cold Spring Harbor Labo-ratory，1980ならびにHillら，J.Mol．Biol.，1984，172;185参照)。好ま しいオペレーターは高度に抑制可能であって、タンパク質をコードするDNAの発 現の制御が可能である。特定の実施態様においては、制御領域は、合成インデュ ーサーのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）および天然イ ンデューサーのラクトースの不存在下に、プロモーターからの発現を防止するla cオペレーターから構成される（図１）。 制御領域はさらに、リボソームのmRNA転写体への結合を促進し、それによりRN Aコード領域の翻訳を開始させてタンパク質を発生させるリボソーム結合部位（R BS）から構成される。適当なリボソーム結合部位には、lacおよびバクテリオフ ァージＴ５が包含される。好ましい実施態様では、RBSは配列：5′-ATTAAAGAGGA GAAATTAAGC-3′を有するＴ５バクテリオファージRBSに由来する配列である。 本発明の構築体の制御領域は、内因性または異種タンパク質のコード領域と操 作可能に連結される。「異種タンパク質」の語は、細菌宿主によって天然には産 生されないが、そのタンパク質をコードするDNAで適当にトランスフォームされ た場合、この宿主によって発現されるポリペプチドまたはタンパク質を意味し、 宿主のトランスフォームにはゲノムDNA、cDNAおよび合成DNAを使用することがで きる。ここに記載されるシステムを用いて産生できるタンパク質としては、それ らに限定されるものではないが、ホルモンたとえば副甲状腺ホルモン(PTH)、グ ルカゴンまたはそのフラグメントおよび関連ペプチドたとえばGLP-1およびGLP-2 、増殖因子たとえば上皮増殖因子(EGF)、ならびにリンホカインたとえばインタ ーロイキン−６および−８（IL-6、−8）が包含される。タンパク質の標準型す なわち付加的Ｎ−末端Met残基をもたないタンパク質の 単離を容易にするため、発現に続いて切断される融合タンパク質を産生させるこ ともできる。たとえば、問題とするタンパク質をコードするDNAに、シグナルペ プチドたとえば大腸菌外膜タンパク質ompAをコードするDNAを先行させる。この 例では、遺伝子発現により、N-Met含有ompAシグナルペプチドに所望のタンパク 質が続く融合ペプチドが生成する。シグナルペプチドは細菌内膜を通過して融合 タンパク質を運搬し、そこでシグナルペプチドは切断される。使用できる他のシ グナルペプチドには、アルカリホスファターゼ、大腸菌熱安定性エンテロトキシ ンIIよびブドウ球菌からのプロテインＡがある。別法として融合タンパク質の合 成と切断を別個の操作で行って所望のタンパク質を得ることもできる。たとえば 、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(GST)は所望のタンパク質からトロン ビンまたは第Ｘａ因子によって切断できる。 本発明の特定の実施態様においては、コード領域はそのアミノ酸配列がHendy ら(Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1981，78：7365)によって記載されているヒト PTHをコードするDNAから構成される。本明細書に記載の実施例においてはPTHを コードするDNA配列はompAシグナルペプチドをコードするDNAと直接リーディング フレームを合わせて連結される。 図１に例示する好ましい組換えDNA構築体は、lppまたはlacUV５スペーサーを 有し、ホスホルアミダイト法によって合成された一本鎖オリゴヌクレオチドから 製造された。XhoＩからEcoRＩ制限部位までの配列からなるゲル精製鎖をついで 初期PCR標的として使用し、これを、示した初期オリゴヌクレオチド配列または その相補性鎖いずれかの末端に特異的にハイブリダイズする相補性一本鎖DNAオ リゴヌクレオチドを用いて二本鎖DNAフラグメントにPCR増幅した。すなわち、構 築体は、たとえば Maniatisら（“Molecular Cloning”,Cold Spring Harbor Laboratories,1982） ならびにInnisら（“PCR Protocols，A Guide to Methods and Applications” ）に記載されている標準遺伝子合成法を用いて調製される。 本発明の他の態様においては、本発明の組換えDNA構築体を導入する細菌宿主 細胞トランスフォーマントの産生に有用な発現ベクターが提供される。本発明の DNA構築体は確立された技術により、「カセット」としてベクター好ましくはプ ラスミドベクター中に導入することができる。一般的にベクターは、カセット上 のいずれか一方の末端における制限部位に相当する制限部位で切断される。カセ ットはついで、その末端をベクター上の相補性の切断部位にライゲートして導入 される。 バクテリオファージベースのベクターも使用できるが、プラスミドベクター、 たとえばpBR322およびpUC系のプラスミドが好ましい。適当なベクター中に導入 されたならば、生成したプラスミドを宿主内で以下のクローニング作業に十分な 量が得られるように増殖させる。選ばれたタンパク質をコードするDNAは、標準 的なクローニング／ライゲーション法を用い、多重クローニング部位を有するプ ラスミドへの導入が便利なことは自明である。また、プラスミドにより当然、複 製の起源が導入され、トランスフォームされた細胞の選択を可能にするためのマ ーカー、たとえばアンピシリンもしくはテトラサイクリン抵抗性遺伝子も導入さ れることがとくに望ましい。また３つのすべてのリーディングフレームでの翻訳 停止コドンおよび正しく配置された転写停止領域が所望のタンパク質の満足でき る発現に必要なことも自明の通りである。適当な転写ターミネーターには大腸菌 trpA、thr、hisおよびphe遺伝子の転写ターミネーターが包含される。 所望のタンパク質をコードするDNAがベクターに導入されたならば、標準的塩 化カルシウム誘導トランスフォーメーション法を用いて、選択された細菌宿主を 上記ベクターでトランスフォームする。適当な細菌宿主には大腸菌およびサルモ ネラ菌のようなグラム陰性菌が包含される。好ましくは、宿主は市販の大腸菌株 であり、とくに好ましくはJM101およびその誘導体である。 DNA構築体の制御領域が、以下に詳細に記述するようにlacオペレーターで構成 される場合には、トランスフォームされた宿主株は、プロモーター機能したがっ てタンパク質の発現を調節できるように、lacＩ産物の発現が可能であり、場合 により望ましくは過剰産生が可能でなければならない。一部のトランスフォーマ ントによるlacＩ過剰産生の必要性は、本発明の一実施態様においてlacＩ産物の 過剰産生に応答するlacＩ^q遺伝子がすでに繋留されている宿主を用いることによ って達成できる。宿主として使用できる大腸菌のlacＩ過剰産生株にはClontech Laboratories Inc.(California，USA)から入手できるJM系列の株が包含される。 使用に適した特定の宿主株には、たとえばJM101、JM105およびJM107が包含され る。また、トランスフォーマントによるlacＩ過剰産生は、本発明のベクターにl acＩ^q遺伝子を導入することによっても達成することができる。この場合、lacＩ の過剰産生はベクターによって誘導されるので、市販されている様々な細菌宿主 株の任意の株、たとえば、大腸菌株DH１、RR１、Ｃ600、CMK603およびEB505を使 用することができる。ベクターに導入するlacＩ^q遺伝子はプラスミドpMMB22(Bag dasarianら，Gene，1983，26：273に記載されている)の1.2kb HindIIIフラグメ ントとして得られ、ついでプラスミドベクターの任意の部位に非破壊的に導入す ることができる。 ベクターとくにプラスミドにおいて、最初にトランスフォームされた株からそ の子孫への遺伝の安定性を増大させるためには、大腸菌内で機能する分配エレメ ント（par）もベクターに導入される。このようなparエレメントの一つはpSC101 から380bp HincII／AvaＩフラグメントとして遊離させ、ついでベクターの適当 な部位にクローン化される。 トランスフォーメーションに続いて、発現ベクターを繋留する細菌宿主を選ば れた宿主に最も適当な培養培地内で培養する。大腸菌の場合、本発明に好ましい 株の培養には、LB培地または２YT培地（酵母エキス／トリプトン）が使用できる 。プラスミドトランスフォーマントの選択圧は、トランスフォームされていない 宿主株を死滅させる細胞毒性物質を与えることによって維持される。たとえばテ トラサイクリン抵抗性の遺伝子を繋留するプラスミドによるトランスフォーマン トは、テトラサイクリン含有培地内で培養する。テトラサイクリンの培地中濃度 は５〜15μg／mL程度が適当である。 構築体におけるプロモーターは、制御領域においてプロモーターに隣接して配 置されるオペレーターに対するレプレッサー分子の結合によって調節可能である ことが好ましい。好ましい実施態様においては、lacＩ遺伝子産物が、そのプロ モーターに隣接して配置されるlacオペレーターに結合する。この例では、lacＩ 産物の結合がプロモーターを抑制し、その制御下にあるコードDNAの発現レベル を低下させる。発現レベルを上昇させるためには、lacＩを結合してプロモータ ーを脱抑制する化学物質、IPTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ ド）を培養培地に添加してプロモーターを脱抑制し、発現を誘導する。IPTGは、 細胞が中間対数増殖期に到達した時点で培養培地に添加することが適当である。 所望のタンパク質の最大収率を実現するために培養体を増殖させなければなら ない至適濃度の決定には、試験を実施してタンパク質のレベルを経時的にアッセ イすることができる。一般に、タンパク質の合理的な収率は細胞が中間対数期に 到達した時点で回収できるが、さらに大量のタンパク質の蓄積はその後約４〜５ 時間以内に期待できる。 所望のタンパク質は、本技術分野において確立された、そのタンパク質に適当 な方法によって精製することができる。本発明の特定の実施態様においては、発 現したPTHはペリプラスム間隙を通って培養培地中に分泌され、そこで直接回収 される。タンパク質が分泌されたならば、使用した培地を、分子サイズ、正味電 荷、等電点等のタンパク質の性質に応じた生物学的方法を用いて単離することが できる。培地は最初にたとえば凍結乾燥によって濃縮する。さらに、タンパク質 に対する抗体、または天然のリガンドが利用できる場合には、親和性カラムも使 用できる。本発明の特定の実施態様を以下に図面を参照しながら例示する。 実施例１ その成熟型においてPTHは84−アミノ酸ペプチドであり、ヒトでは血中カルシ ウムを上昇させ、骨形成を調節する作用を有する。ヒトのPTHをコードするDNAは 、確立された方法を用い、Hendyら（前出）によって発表されたアミノ酸配列に 従って合成され、以下に記載する構築体内に、図１に示すように導入された。 以下に示す表１および図１に例示したプロモーター＃１および＃２を導入した 好ましい組換えDNA構築体、ならびに対照プロモーター＃３および＃４を導入し た構築体は、ホスホルアミダイト法によって合成された一本鎖オリゴヌクレオチ ドから製造した。XhoＩからEcoRＩ制限部位 までの配列からなるゲル精製鎖をついで初期PCR標的として使用し、示した初期 オリゴヌクレオチド配列もしくはその相補性鎖いずれかの末端に特異的にハイブ リダイズする相補性の一本鎖DNAオリゴヌクレオチドを用い二本鎖DNAフラグメン トにPCR増幅した。すなわち構築体は、たとえばManiatisら（“Molecular Cloni ng”，Cold Spring Habor Labo-ratories，1982）ならびにInnisら(“PCR Proto cols，A Guide to Methods and Applications”)に記載されている標準遺伝子合 成法を用いて調製される。 この構築体をついで、アンピシリン抵抗性に代えテトラサイクリン抵抗性を付 与するpUC18誘導プラスミドにクローン化した。次にJM101誘導大腸菌宿主株を確 立された技術（Maniatisら，“Molecular Cloning”，Cold Spring Harbor Labo ratory，1982）に従ってトランスフェクトした。 実施例２ トランスフォームされた宿主の発現 PTHベクターを含有するトランスフォーマントを、0.5％グルコースおよびテト ラサイクリンを含有する２YT培地中30℃において一夜培養し、同一組成の新鮮な 培地中に接種し、中間対数期に達するまで30℃で培養を続けた。培養液をついで １時間の増殖間隔で誘導し（１mM IPTG）、培養液のアリコートを採取し、分画 化して培養培地のサンプルを作成し、分泌されたPTH産物を標準Allegroアッセイ を用いて同定した。結果は以下の表１に示す。 Allegroアッセイの結果は、18b.p．lppおよびlacUV５配列を導入するプロモー ターが異種PTHタンパク質のレベルの上昇を促進することを示している。プロモ ーター＃１および＃２はスペーサーが修飾lacオペレーター配列（lacＯ）で置換 されたプロモーター＃３、および−35および−10領域がバクテリオファージＴ７ に由来しスペーサーがlacＯプロモーターであるプロモーター＃４に比較して好 ましい。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)をコードする 遺伝子の発現に同じプロモーターを用いた研究でもプロモーター＃１および＃２ によって発現が増大する類似の結果を示した。また、それぞれのプロモーターの 実験で、バクテリオファージT5 RBSと組合わせた場合に、lac由来のRBSに比較し てタンパク質収率の増加を示すことが注目された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．細菌宿主内におけるタンパク質の発現に有用な組換えDNA構築体において、 タンパク質のコード領域がそのタンパク質の宿主内での発現を可能にするプロモ ーターに操作可能に連結してなり、プロモーター領域は 5′-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3′ および 5′-TTGACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATACT-3′ から選択されるDNA配列からなる組換えDNA構築体。 ２．プロモーター領域はDNA配列 5′-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3′ からなる請求項１記載の組換えDNA構築体。 ３．細菌宿主は大腸菌である請求項１記載の組換えDNA構築体。 ４．制御領域はさらにタンパク質の発現を調節するオペレーターからなる請求項 ３記載の組換えDNA構築体。 ５．オペレーターはlacオペレーターである請求項４記載の組換えDNA構築体。 ６．タンパク質はヒトPTHである請求項５記載の組換えDNA構築体。 ７．タンパク質の宿主ペリプラスムへの分泌を可能にする、コード領域とリーデ ィングフレームの合致したOmpAシグナルペプチドをコードするDNAからさらに構 成される請求項６記載の組換えDNA構築体。 ８．制御領域はDNA配列：ATTAAAGAGGAGAAATTAAGCをもつＴ５リボソーム結合部位 からなる請求項３記載の組換えDNA構築体。 ９．図２に定義された配列を有する請求項３記載の組換えDNA構築体。 10．図３に定義された配列を有する請求項３記載の組換えDNA構築体。 11．請求項１〜10のいずれかに記載の組換えDNA構築体からなる、細菌宿主細胞 トランスフォーマントの産生に有用なベクター。