ES2202436T3

ES2202436T3 - Promotores para la expresion genica.

Info

Publication number: ES2202436T3
Application number: ES96912181T
Authority: ES
Inventors: Peter A. Lagosky
Original assignee: NPS Allelix Corp Canada
Current assignee: NPS Allelix Corp Canada
Priority date: 1995-05-19
Filing date: 1996-05-16
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2016-05-16
Also published as: CN1190993A; DE69629808D1; EP0828844B1; KR19990014906A; PT828844E; HUP9900750A2; CN1131313C; NO325879B1; DK0828844T3; EE9700355A; AU5511696A; MX9708689A; TR199701394T1; PL324226A1; IS4609A; ATE248923T1; NO975286D0; NO975286L; CA2221587A1; JP2006187295A

Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UN NUEVO SISTEMA DE EXPRESION PARA LA PRODUCCION DE PROTEINAS EN HUESPEDES BACTERIANOS. EL SISTEMA UTILIZA NUEVOS PROMOTORES QUE SON ALTAMENTE EFICIENTES EN LA INICIACION DE LA TRANSCRIPCION, Y QUE POR CONSIGUIENTE ESTIMULAN EL RENDIMIENTO DE PROTEINAS. LOS PROMOTORES COMPRENDEN LA REGION -35 DEL PROMOTOR CONSENSO DE E. COLI, LA REGION -10 DEL PROMOTOR LPPP-5 Y UN ESPACIADOR ENTRE ESTAS DOS REGIONES DERIVADO DE CUALQUIERA DE LOS DOS PROMOTORES LPP O LACUV5.

Description

Promotores para la expresión génica.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a la técnica de ingeniería genética aplicada a hospedantes bacterianos. Más particularmente, la invención se refiere a sistemas de expresión para la producción de proteínas en hospedantes bacterianos.

Antecedentes de la invención

El advenimiento de la tecnología de ADN recombinante ha permitido a la producción de diversas proteínas de origen natural y sintéticas en organismos tales como bacterias, hongos, levaduras y células de mamíferos. En general, implica la inserción de genes, que codifican una proteína deseada, en un organismo hospedante, y utilizar la maquinaria celular del hospedante para expresar el gen.

La tecnología de ADN recombinante se desarrolla continuamente para lograr la producción de proteínas en campos comercialmente aceptables. Un factor limitante en la producción recombinante de proteínas es la velocidad a la que se expresa el gen que codifica la proteína deseada. En particular, se ha encontrado que la región promotora de un gen es crítica en el proceso de transcripción de la expresión génica. Un promotor eficiente, tal como el promotor trp encontrado en E. coli, se une fuertemente a ARN polimerasa dirigida a ADN para iniciar la transcripción del gen generando ARNm. Un promotor menos eficiente, tal como el promotor la@, se une a ARN polimerasa de forma menos fuerte, dando como resultado una velocidad más lenta de generación de ARNm.

El promotor trp se ha usado ampliamente en la producción de proteínas heterólogas debido a su capacidad para iniciar eficientemente la transcripción. A pesar de su eficiencia, un fallo inherente del promotor trp es que no se controla fácilmente. De forma específica, el promotor trp no es totalmente reprimible, es decir, puede inducir la transcripción antes de que se haga crecer al hospedante en cultivo hasta una fase apropiada para la producción de proteínas. Otro promotor ampliamente usado es lac, que es menos eficiente que trp, pero es más controlable.

Para desarrollar promotores más eficientes, se han combinado componentes funcionales de diferentes promotores, por ejemplo los descritos en la Patente de Estados Unidos US 5.362.646. En un ejemplo, se combinaron porciones del promotor A_{1} del bacteriófago T7 (P_{A1}) con dos operadores lac. Específicamente, se sustituyó la región espaciadora entre las denominadas regiones -35 y -10 del promotor del bacteriófago T7 con una secuencia modificada del operador lac, y, para controlar el híbrido del promotor resultante, se introdujo en la dirección 3' un segundo operador lac. Se encontró que el sistema resultante de promotor/operador, que se incorpora en los plásmidos pUHE comercialmente disponibles, inicia la transcripción eficientemente tras la inducción, y aún es altamente reprimible antes de la inducción.

Otro promotor descrito por Tsung et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:5940) comprende la región -35 de trp eficiente, la región -10 del promotor lppP-5 altamente eficiente (una variante del promotor lpp), y un espaciador derivado del promotor lac. Este promotor demostró ser tan altamente eficiente iniciando la transcripción como para dar por resultado la letalidad de la célula. Aunque diversos promotores han permitido rendimientos mejorados de proteínas en hospedantes microbianos, aún existe una necesidad de promotores que induzcan la producción de forma más eficiente de proteínas comercialmente valiosas.

Sumario de la invención

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un nuevo constructo de ADN recombinante útil para expresar una proteína en un hospedante bacteriano. El constructo comprende una región que codifica una proteína y, enlazada operablemente a aquella, una región de control que comprende un promotor que tiene la siguiente secuencia de ADN:

5'-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3'

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra la secuencia nucleotídica y una representación esquemática de un casete de expresión que incorpora constructos de ADN recombinante según la invención;

la Figura 2 ilustra secuencias nucleotídicas de constructos de ADN según la invención, que comprenden una región promotora y operadora.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona secuencias de ADN útiles para inducir la expresión de ADN con eficiencia elevada en hospedantes bacterianos tales como E. coli. El uso de vectores de expresión que comprenden estas secuencias proporciona un medio valioso para lograr la producción aumentada de proteínas expresables, tanto endógenas como heterólogas. En un aspecto de la invención, se proporciona un nuevo constructo de ADN recombinante útil para expresar una proteína en un hospedante bacteriano. El constructo comprende una región que codifica la proteína, enlazada operablemente con una región de control que comprende un promotor para permitir la expresión de dicha proteína en el hospedante, en el que el promotor comprende la siguiente secuencia de ADN:

5'-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3'

Estos promotores tienen en común una región -35 de la secuencia de consenso TTGACA, y una región -10 de la secuencia TATACT. La secuencia espaciadora, es decir la secuencia de 18 bases que intervienen, es la secuencia ACATAAAAAACTTTGTGT según la invención. En consecuencia, la invención proporciona constructos de ADN en los que el ADN que codifica una proteína deseada está enlazado operablemente bajo control de expresión a un promotor de la secuencia 5'-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3'.

Aquellos expertos en la técnica apreciarán que los promotores de la invención constituyen un elemento esencial de los componentes requeridos, dentro de la región de control funcional, para inducir la expresión. Además, estos promotores se pueden insertar, usando procedimientos estándares, en cualquier vector adecuado de expresión que se pueda replicar en bacterias Gram -ve o +ve. Más particularmente, y para formar una región de control de la expresión génica, los presentes promotores se incorporarán con otros elementos de control tales como los que se requieran típicamente para esa expresión, incluyendo un sitio de unión ribosómica y, en realizaciones de la invención, un operador que funciona para controlar la función del promotor.

Estos componentes se disponen necesariamente con relación unos respecto de otros, según se requiera para que ocurra la expresión según principios bien comprendidos de la expresión génica.

En una realización de la invención, la región de control del constructo incorpora un operador. Los operadores que se pueden usar incluyen los inducibles directamente por inductores químicos, y aquellos tales como lac que son desreprimibles. Ejemplos de operadores adecuados incluyen los operadores de lactosa, galactosa, triptófano y tetraciclina de E. coli (véanse Miller et al "The Operon", Cold Spring Harbour Laboratory, 1980, y Hillen et al, J. Mol. Biol., 1984, 172:185). Los operadores preferidos son altamente reprimibles, de forma que se pueda controlar la expresión de ADN que codifica la proteína. En una realización específica, la región de control comprende el operador lac (fig. 1) que evita la expresión a partir del promotor en ausencia del isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) inductor sintético y la lactosa inductora natural.

La región de control comprende además una secuencia de sitio de unión ribosómica (RBS) para facilitar la unión de ribosomas al transcripto de ARNm e iniciar de ese modo la traducción de la región codificante de ARN para generar la proteína. Los sitios adecuados de unión a ribosomas incluyen lac y bacteriófago T5. En una realización preferida, el RBS es una secuencia derivada del RBS de bacteriófago T5 que tiene la secuencia 5'-ATTAAAGAGGAGAAATTAAGC-3'.

La región de control de los constructos según la presente invención se enlazan operablemente con una región que codifica una proteína endógena o heteróloga. La expresión "proteína heteróloga" se refiere a un polipéptido o proteína que, aunque no se produce naturalmente por el hospedante bacteriano, es expresada por este hospedante cuando se transforma adecuadamente con ADN que codifica la proteína; se puede usar ADN genómico, ADNc y ADN sintético para transformar al hospedante. Las proteínas que se pueden producir usando el sistema descrito en este documento incluyen, pero no se limitan, a hormonas tales como hormona paratiroidea (PTH), glucagón o sus fragmentos y péptidos relacionados tales como GLP-1 y GLP-2; factores de crecimiento, tales como factor de crecimiento epidérmico (EGF); y linfoquinas tales como interleuquina-6 y -8 (IL-6, -8). Para facilitar el aislamiento de la forma auténtica de la proteína, es decir, de la proteína sin un residuo Met N-terminal adicional, también se pueden producir proteínas de fusión que se rompen tras la expresión. Por ejemplo, el ADN que codifica una proteína de interés puede estar precedido por un ADN que codifica un péptido señal, tal como la proteína ompA de la membrana externa de E. coli. En este caso, el gen expresado produce una proteína de fusión que comprende un péptido señal de ompA que contiene N-Met que es seguido de la proteína deseada. El péptido señal lleva la proteína de fusión a través de la intermembrana de la bacteria en la que se rompe el péptido señal. Otros péptidos señal que se pueden usar incluyen fosfatasa alcalina, enterotoxina II estable al calor de E. Coli, y proteína A de Streptococcus. Como alternativa, se puede sintetizar una proteína de fusión y se puede romper en un procedimiento separado para producir la proteína deseada. Por ejemplo, se puede romper la glutation-S-transferasa (GST), a partir de una proteína deseada, con trombina o factor Xa.

En una realización específica de la invención, la región codificante comprende ADN que codifica PTH humana, cuya secuencia de aminoácidos se describe por Hendy et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78:7365). En los ejemplos descritos aquí, la secuencia de ADN que codifica PTH se acopla directamente a, y en una ventana de lectura con, ADN que codifica el péptido señal de ompA.

Los constructos de ADN recombinante preferidos ilustrados en la Figura 1, que tienen el espaciador lpp o lacUV5, se produjeron a partir de oligonucleótidos de una sola cadena sintetizados mediante el método de fosforamidito. La cadena purificada en gel, que comprende las secuencias del sitio de restricción Xhol a EcoRl, se usó entonces como una diana de PCR inicial, y se amplificó mediante PCR en un fragmento de ADN de doble cadena usando oligonucleótidos de ADN de una sola cadena complementarios que se hibridaron específicamente en los extremos de la secuencia de oligonucleótidos inicial mostrada o de su cadena complementaria. De este modo, los constructos se prepararon usando metodología de síntesis de genes estándar, como se describe, por ejemplo, por Maniatis et al ("Molecular Cloning" Cold Spring Harbour Laboratories, 1982) e Innis et al ("PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications").

En otro aspecto de la invención, se proporcionan vectores de expresión útiles para producir transformantes de células hospedantes bacterianas que incorporan un constructo de ADN recombinante según la invención. Los constructos de ADN según la invención se pueden incorporar como un "casete" en un vector, preferiblemente un vector de plásmido, mediante técnicas establecidas. Generalmente, un vector se rompe en los sitios de restricción que corresponden con los sitios de restricción en cualquiera de los extremos en el casete. El casete se introduce entonces ligando los extremos a los sitios rotos complementarios en el vector.

Aunque se pueden usar vectores a base de bacteriófagos, se prefieren los vectores de plásmidos tales como la serie de plásmidos pBR322 y pUC. Una vez incorporado en un vector adecuado, el plásmido resultante se puede amplificar en un hospedante para proporcionar cantidades suficientes para el trabajo de clonado subsiguiente. Se apreciará que el ADN que codifica la proteína seleccionada se incorpora convenientemente en el plásmido con sitios de clonación múltiples proporcionados allí, usando métodos de clonación/ligación estándar. También, un plásmido incorporará necesariamente un origen de replicación, y lo más deseable incorporará un marcador tal como los genes resistentes a ampicilina o tetraciclina para permitir la selección de las células transformadas. También se apreciará que se requerirán codones de terminación de traducción en las tres ventanas de lectura y una región de terminación transcripcional correctamente posicionada, para la expresión satisfactoria de la proteína deseada. Los terminadores transcripcionales adecuados incluyen los terminadores transcripcionales de los genes trpA, thr, his y phe de E. coli.

Una vez que se incorpora en el vector el ADN que codifica la proteína deseada, se transforma un hospedante bacteriano seleccionado usando técnicas de transformación mediadas por cloruro de calcio estándares. Los hospedantes bacterianos adecuados incluyen bacterias gram-negativas tales como E. coli y Salmonella. Preferiblemente, el hospedante es una cepa de E. coli comercialmente disponible y lo más preferible JM101 y sus derivados.

Cuando la región de control del constructo de ADN comprende el operador lac, según se describe con más detalle en lo sucesivo, la cepa hospedante transformada debe ser capaz de expresar, y deseablemente en algunos casos sobreproducir, el producto lacI de forma que se pueda regular la función del promotor y por tanto la expresión de la proteína. La necesidad de sobreproducción de lacI por algunos transformantes se puede satisfacer, según una realización de la invención, usando hospedantes que ya cosechan el gen lacI^{q} responsable de la sobreproducción del producto lacI. Las cepas de E. coli sobreproductoras de lacI, que se pueden emplear como hospedantes, incluyen la serie de cepas JM disponibles de Clontech Laboratories Inc., California, USA. Las cepas hospedantes específicas adecuadas para uso incluyen JM101, JM105 y JM107. Como alternativa, la sobreproducción de lacI en el transformante se puede satisfacer incorporando el gen lacI^{q} en vectores de la invención. En esta situación, puesto que la sobreproducción de lacI está mediada por el vector, se puede emplear cualquiera de una variedad de cepas de hospedante bacteriano comercialmente disponibles, incluyendo cepas DH1, RR1, C600, CMK603 y EB505 de E. coli. El gen lacI^{q} a incorporar en el vector se puede obtener como un fragmento HindIII de 1,2 kb del plásmido pMMB22 (descrito por Bagdasarian et al (Gene, 1983, 26:273)), y se puede incorporar entonces de forma no disruptiva en cualquier sitio en el vector del plásmido.

Para potenciar la estabilidad de herencia de vectores, en particular plásmidos, de la cepa originalmente transformada a su progenie, también se puede incorporar en el vector un elemento de partición (par) funcional en E. coli. Uno de tales elementos par se puede liberar a partir de pSC101 como un fragmento HincII/Aval de 380 pb, y entonces se puede clonar en un sitio adecuado en el vector.

Tras la transformación, los hospedantes bacterianos que cosechan el vector de expresión se cultivan en un medio de cultivo que sea el más apropiado para el hospedante seleccionado. Para E. coli, se puede usar el caldo LB o el medio 2YT (extracto de levadura/triptona) para cultivar aquellas cepas preferidas en este documento. Se debe mantener la presión selectiva por transformantes de plásmidos proporcionando un agente citotóxico que extermine la cepa hospedante no transformada. Por ejemplo, se debería cultivar un transformante con un plásmido que cosecha el gen de la resistencia a tetraciclina, en un medio que contiene tetraciclina. Son adecuadas concentraciones de tetraciclina en el medio de alrededor de 5-15 \mug/ml.

El promotor en el constructo es preferiblemente regulable a través de la unión de una molécula represora a un operador localizado adyacente al promotor en la región de control. En una realización preferida, el producto génico lacI se une a un operador lac localizado adyacente al promotor. En este caso, la unión del producto lacI reprime al promotor, reduciendo los niveles de expresión del ADN codificante bajo su control. Para elevar los niveles de expresión, se añade al medio de cultivo el compuesto químico IPTG (isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido), que se une al lacI y desreprime al promotor, para desreprimir al promotor e inducir la expresión. Adecuadamente, el IPTG se añade al medio de cultivo cuando las células han alcanzado un log de la fase de crecimiento medio.

Para determinar la densidad óptima a la cual los cultivos se deben hacer crecer para conseguir el rendimiento máximo de la proteína deseada, se pueden realizar ensayos y se pueden ensayar niveles de proteínas en un experimento con el transcurso del tiempo. En general, se pueden recuperar producciones razonables de proteína una vez las células alcanzan un log de fase de crecimiento medio, aunque se puede esperar que se acumulen cantidades mayores de proteína en alrededor de 4-5 horas después.

La proteína deseada se puede purificar mediante técnicas establecidas en la técnica, según sea apropiado para esa proteína. En una realización específica de la invención, la PTH expresada se excreta más allá del espacio periplásmico y en el medio de cultivo en el que se recupera directamente. Cuando se excreta la proteína, el medio gastado se puede aislar usando técnicas bioquímicas que reflejen la naturaleza de la proteína en términos de su tamaño molecular, carga neta, punto isoeléctrico, etc. El medio se puede concentrar primero, por ejemplo mediante liofilización. Además, cuando hay disponibles anticuerpos o está disponible un ligando natural para la proteína, se pueden usar columnas de afinidad. Las realizaciones específicas de la invención se ejemplifican ahora con referencia a los dibujos.

Ejemplo 1

En su forma madura, la PTH es un péptido de 84 aminoácidos que actúa en los seres humanos elevando el calcio en la sangre y modulando la formación de hueso. El ADN que codifica la PTH humana se sintetizó usando las técnicas establecidas y según la secuencia de aminoácidos publicada por Hendy et al., supra , y se incorporó en los constructos descritos a continuación, según se muestra en la Figura 1.

Los constructos preferidos de ADN recombinante que incorporan el promotor nº 1 y nº 2, así como los promotores de referencia nº 3 y nº 4, ilustrados en la tabla 1 y en la figura 1, a los que ahora se hace referencia, se produjeron a partir de un oligonucleótido de una sola cadena sintetizado mediante el método de fosforamidito. La cadena purificada en gel, que comprende las secuencias del sitio de restricción Shol a EcoRl, se usó entonces como una diana de PCR inicial, y se amplificó mediante PCR en un fragmento de ADN de doble cadena usando oligonucleótidos de ADN de una sola cadena complementaria que se hibridaron especialmente en los extremos de la secuencia de oligonucleótidos inicial mostrada o de su cadena complementaria. De este modo, los constructos se preparan usando metodología de síntesis de genes estándar, según se describe, por ejemplo, por Maniatis ("Molecular Cloning" Cold Spring Harbour Laboratories, 1982) e Innis et al ("PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications").

Los constructos se clonaron entonces en un plásmido derivado de pUC18 que confiere resistencia a tetraciclina en lugar de resistencia a ampicilina. Entonces se transfectó una cepa de hospedante de E. coli derivada de JM101, según técnicas establecidas (véase Maniatus et al "Molecular Cloning", Cold Spring Harbour Laboratory, 1982).

Ejemplo 2 Expresión del hospedante transformado

Los transformantes que contienen los vectores de PTH se cultivaron toda la noche a 30ºC en caldo 2YT que contiene 0,5% de glucosa y tetraciclina, y entonces se inocularon en medio reciente de la misma composición, continuándose el cultivo a 30ºC hasta alcanzar un log de fase medio. Los cultivos se indujeron entonces (1 mM de IPTG) a intervalos de crecimiento de 1 hora, se extrajeron alícuotas del cultivo, y se fraccionaron para producir muestras de medio de cultivo para identificar los productos de PTH excretados usando un ensayo Allegro estándar. Los resultados de estos ensayos se proporcionan en la Tabla 1 a continuación:

TABLA 1

Promotor	RBS	PTH Máx
	región	espaciador	región		(mg/l)
nº	-35		-10		6-8h
	trp	lpp	lppP-5	T5	245
1				lac	148
	trp	lacUV5	lppP-5	T5	121
2				lac	10
	trp	lacO	lppP-5	T5	50
3				lac	5
	T7	lacO	T7	T5	100
4				lac	10

Los resultados del ensayo Allegro indican que los promotores que incorporan las secuencias lpp y lacUV5 de 18 pb facilitan niveles mejorados de proteína de PTH heteróloga. Los promotores n^{os} 1 y 2 se comparan favorablemente con el promotor nº 3, en el que el espaciador fue sustituido con una secuencia de operador lac modificada (lacO); y con el promotor nº 4, en el que las regiones -35 y -10 son del bacteriófago T7 y el espaciador es un promotor lacO. Los estudios con los mismos promotores que expresan el gen que codifica la cloranfenicol-acetil-transferasa (CAT), mostraron resultados similares de expresión mejorada para los promotores nº 1 y nº 2. También, se observó que cada uno de los promotores estudiados mostró una producción mejorada de proteína cuando se combinan con RBS de bacteriófago T5 en comparación con RBS derivado de lac.

Claims

1. Un constructo de ADN recombinante que expresa una proteína en una célula hospedante bacteriana, comprendiendo el constructo una región que codifica la proteína, enlazada operablemente con una región de control que comprende un promotor que promueve la expresión de dicha proteína en la célula hospedante, en el que el promotor comprende la siguiente secuencia de ADN:

5'-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3'.

2. El constructo de ADN recombinante según la reivindicación 1, en el que dicha célula bacteriana es una célula de E. coli.

3. El constructo de ADN recombinante según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicha región de control comprende además un operador para regular la expresión de la proteína.

4. El constructo de ADN recombinante según la reivindicación 3, en el que el operador es el operador lac.

5. El constructo de ADN recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la proteína es hormona paratiroidea humana.

6. El constructo de ADN recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho constructo codifica la proteína GLP-2 que es expresable en una célula hospedante bacteriana.

7. El constructo de ADN recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además ADN que codifica el péptido señal OmpA en la ventana de lectura con la región codificante, promoviendo de ese modo la secreción de la proteína al periplasma de la célula hospedante.

8. El constructo de ADN recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la región de control comprende un sitio de unión a ribosoma T5 que tiene la secuencia de ADN ATTAAAGAGGAGAAATTAAGC.

9. El constructo de ADN recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la región de control comprende la secuencia expresada en la Figura 2.

10. Un vector, que comprende el constructo de ADN recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Una célula hospedante bacteriana, transformada con un vector según la reivindicación 10.

12. Una célula hospedante bacteriana según la reivindicación 11, que es una célula de E. coli.

13. Un procedimiento para la producción de una proteína recombinante, que comprende cultivar una célula hospedante según la reivindicación 11 ó 12 en condiciones por las cuales se produce dicha proteína, y recuperar dicha proteína.