JPH11514872A

JPH11514872A - ハイブリダイゼーション用の固体支持体を調製する方法および非特異的バックグラウンドを低減する方法

Info

Publication number: JPH11514872A
Application number: JP9516062A
Authority: JP
Inventors: ネス，ジェフリーバン
Original assignee: ダーウィンモレキュラーコーポレイション
Priority date: 1995-10-18
Filing date: 1996-10-17
Publication date: 1999-12-21
Also published as: KR19990064358A; WO1997014815A1; US5994065A; ATE230032T1; DE69625510T2; DE69625510D1; EP0862655B1; EP0862655A1; AU723889B2; AU7517496A; CA2235671A1

Abstract

(57)【要約】ハイブリダイゼーション用の固体支持体に関する方法を開示する。本発明は、固体支持体上の非特異的バックグラウンドが低減されるような、固体支持体を調製するための手順、およびそれらのハイブリダイゼーションアッセイにおける使用を提供する。非特異的バックグラウンドの低減は、通常、非特異的結合により覆い隠される低レベルの特異的結合の検出を可能にする。この方法は、オリゴヌクレオチドのような核酸を含む、種々の標的リガンドおよびプローブに対して適用可能である。

Description

【発明の詳細な説明】ハイブリダイゼーション用の固体支持体を調製する方法および非特異的バックグラウンドを低減する方法技術分野本発明は、一般に、ハイブリダイゼーション反応において使用するための固体支持体を調製する方法に関する。本発明は、より詳細には、非特異的バックグラウンドが、支持体の化学的処理により低減されるように、ハイブリダイゼーション固体支持体を調製するための手順に関する。発明の背景ハイブリダイゼーション技術は、互いに相補的関係を有する分子対を同定するための強力なツールである。このような技術は、核酸およびタンパク質を含む、種々のタイプの分子に適用されている。例えば、核酸のハイブリダイゼーションは周知であり、そして特異的核酸配列を同定するための方法は、書物などに典拠を挙げられている。核酸のハイブリダイゼーションは、相補的核酸鎖の塩基対合に基づいている。一本鎖の核酸が、適切な緩衝液中でインキュベートされる場合、相補的塩基配列は、二本鎖の安定な分子を形成する。このような対合の存在または非存在は、当該分野において周知の、多くの異なる方法により検出され得る。以前に記載された大部分のハイブリダイゼーションアッセイは、例えば、Dunn およびHassell、Cell 12：23(1977)に記載されたハイブリダイゼーション技法のような、複数の工程を含む。核酸の複雑な集団において、標的核酸を検出するための代表的なハイブリダイゼーションアッセイのプロトコルは、一般に、以下のように記載され得る。標的核酸は、ゲルマトリックス（電気泳動）上でサイズにより分離されるか、またはクローン化および単離されるか、またはプールへと細分されるか、または複雑な集団において使用される。次いで、標的核酸は、トランスファーされるか、またはスポットされるか、またはそうでなければ固体支持体（例えば、ナイロン膜またはニトロセルロース膜）上に固定化される。（この「固定化」はまた、「配列（arraying）」と称され得る）。この固定化された核酸は、次いで加熱工程またはUV照射（これらは、核酸を非可逆的に固定化する）に供される。この膜は、次いで１以上の伝統的な「ブロッキング剤」中に浸漬される。これらの試薬には、デンハルト(Denhardt)試薬（Denhardt、Biochem．Biophys．Res．Comm．23：641 (1966)）、ヘパリン（SinghおよびJones、Nucleic Acids Res．12：5627(1984) ）および脱脂粉乳（Jonesら、Gene Anal．Tech．1：3(1984)）が含まれる。しばしば、これらの試薬は、一本鎖DNAおよびドデシル硫酸ナトリウム（SDS）のような界面活性剤と組合せて使用される。豊富でない配列のノーザン分析、またはRN Aプローブを使用するハイブリダイゼーション、または単一コピーのサザンハイブリダイゼーションにおいて、デンハルト試薬は、一般に、0.5％SDSおよび断片化された変性DNA 100μg/mlと共に使用される。（50x デンハルト試薬は、１％( w/v)Ficoll（タイプ400、Pharmacia）、１％(w/v)ポリビニルピロリドン、１％( w/v)ウシ血清アルブミン（フラクション５）からなる）。ブロッキング剤は、ニトロセルロースが使用される場合、一般に、予備ハイブリダイゼーション工程およびハイブリダイゼーション工程の両方に含められる。しかし、核酸がナイロン膜上に固定化される場合、ブロッキング剤は、一般に、ハイブリダイゼーション溶液から除かれる。なぜなら、高濃度のタンパク質は、プローブのその標的核酸に対するアニーリングを妨げるからである。後者の問題は、短いプローブ（例えば、オリゴヌクレオチド）を用いた場合、特に顕著である。次いで、標的核酸は、ストリンジェントハイブリダイゼーションの条件下で、代表的には、標識された「シグナル」核酸によって探査(probe)される。次いで、シグナル核酸は、しばしば結合酵素（結合酵素は、その中にリガンド対の１つのメンバーを有する）を使用して検出される。シグナル核酸は、リガンド対の他のメンバーを含有する。次いで、非結合酵素は、洗い流され、そして膜は、基質溶液中に浸漬される。次いで、シグナルは、基質タイプに依存して、比色手段により、蛍光によりまたは化学発光により検出される。簡潔には、ハイブリダイゼーションアッセイプロトコルは、以下のように要約され得る：標的核酸は、固体支持体上に固定化される。この固体支持体は、ブロッキング剤によって処理され、プローブの疑似結合（非特異的結合；またバックグラウンドとして知られる）を防ぐ。次いで、固体支持体は、プロービングされ、そしてシグナルは、種々の手段により検出される。非特異的結合を低減するためのブロッキング剤の使用は、多くの理由のために必須である。この理由には、低レベルの特異的結合（非特異的結合がブロックされなければ、非特異的結合によって覆い隠される）を検出し得ることが含まれる。不幸なことに、伝統的なブロッキング剤（上記のようなもの）の使用は、再現可能な方法では決してなかった。学術書には、この問題について記載されているが、例えば、ニトロセルロース膜またはナイロン膜の８インチ×12インチ片を、 Ficoll（タイプ400、Pharmacia）、ポリビニルピロリドン、ウシ血清アルブミン（フラクション５、Sigma）、断片化された一本鎖核酸、ミルク産物などからなるブロック試薬の組合せまたはカクテルを使用して、一様に「ブロックする」ことは、実質的に不可能である。本明細書中に記載されるような本発明の方法は、従来の方法のこの制限を克服する。ハイブリダイゼーション反応において非特異的バックグラウンドを低減するための現在のアプローチに関連する問題のために、当該分野において新規な方法に対する必要性が存在する。本発明は、この必要性を満たし、そしてさらに他の関連した利点を提供する。発明の要旨簡潔に述べれば、本発明は、ハイブリダイゼーション固体支持体を調製する方法およびハイブリダイゼーション反応におけるそれらの使用を提供する。１つの局面において、本発明は、非特異的バックグラウンドを低減するハイブリダイゼーション固体支持体を調製する方法を提供し、この方法は：(a)ハイブリダイゼーション用の固体支持体と標的リガンドとを、標的リガンドを固体支持体に固定化するに十分な条件下で接触させる工程；および(b)固定化標的リガンドを含有する固体支持体と化合物とを、非特異的部位をブロックするに十分な条件下で反応させ、それにより固定化標的リガンドを含有するブロックされた固体支持体を生成する工程を包含し、上記化合物は以下の式を有する：ここで、R₁からR₁₇は、独立してH、OH、CH₃、CH₂-CH₃、CH=CH-CH₃、X、CH₂X、CH X₂、CH₂-CH₂X、CH₂-CHX₂、CX₃、CX₂-CX₃、CX₂-CX₂-CX₃およびC(=O)CH₃から選択され、そして、R₁およびR₃、またはR₂およびR₄、またはR₅およびR₆は、一緒になって=CH₂ であり得、そして、R₅およびR₆は一緒になって=Oであり得、そして、ここで各X は、独立してハロゲンから選択される。好ましい実施態様において、本発明の方法は、工程(b)の後に、固定化標的リガンドを含有する上記ブロックされた固体支持体と反応しなかった上記化合物のすべてを実質的に排除することを含む工程をさらに包含する。また、本発明はまた、上記方法のいずれかに従って調製される、固定化標的リガンドを含有する固体支持体を含む、キットを提供する。別の局面において、本発明は、ハイブリダイゼーション反応において、非特異的バックグラウンドを低減する方法を提供し、この方法は：(a)ハイブリダイゼーション用の固体支持体と標的リガンドとを、標的リガンドを固体支持体に固定化するに十分な条件下で接触させる工程；(b)固定化標的リガンドを含有する固体支持体と化合物とを、非特異的部位をブロックするに十分な条件下で反応させ、それにより固定化標的リガンドを含有するブロックされた固体支持体を生成する工程を包含し、上記化合物は以下の式を有する：ここで、R₁からR₁₇は、独立してH、OH、CH₃、CH₂-CH₃、CH=CH-CH₃、X、CH₂X、CH X₂、CH₂-CH₂X、CH₂-CHX₂、CX₃、CX₂-CX₃、CX₂-CX₂-CX₃およびC(=O)CH₃から選択され、そして、R₁およびR₃、またはR₂およびR₄、またはR₅およびR₆は、一緒になって=CH₂であり得、そして、R₅およびR₆は一緒になって=Oであり得、そして、ここで各Xは、独立してハロゲンから選択される；(c)固定化標的リガンドを含有する上記ブロックされた固体支持体とプローブとを、この固定化標的リガンドに対する特異的結合に十分な条件下で接触させる工程；および(d)この固体支持体上の該プローブの存在を検出し、それにより該標的リガンドとこのプローブとの間のハイブリダイゼーションを測定する工程を包含する。好ましい実施態様において、本発明の方法は、工程(b)と工程(c)の間に、固定化標的リガンドを含有する上記ブロックされた固体支持体と反応しなかった上記化合物のすべてを実質的に排除することを含む工程をさらに包含する。好ましい別の実施態様において、本発明の方法は、工程(c)と工程(d)の間に、上記固定化標的リガンドに結合しなかった上記プローブのすべてを実質的に排除することを含む工程をさらに包含する。好ましい別の実施態様において、本発明の方法は、工程(b)と工程(c)の間に、固定化標的リガンドを含有する上記ブロックされた固体支持体と反応しなかった上記化合物のすべてを実質的に排除することを含む工程をさらに包含し、そして工程(c)と工程(d)の間に、上記固定化標的リガンドに結合しなかった上記プローブのすべてを実質的に排除することを含む工程をさらに包含する。好ましい実施態様において、上記化合物は、式Iに従い、ここで、R₁およびR₂ の両方がCH=CH-CH₃、またはCH₂X、またはCX₃、またはCX₂-CX₃、またはCX₂-CX₂-C X₃であり、各Xは、独立してハロゲンから選択される。好ましい他の実施態様において、上記化合物は、式IIに従い、ここで、R₁〜R₄がHであり；または、R₁がC H₃であり、そしてR₂〜R₄がHであり；または、R₂およびR₄がHであり、そしてR₁およびR₃が一緒になって=CH₂であり；または、R₁およびR₂がHであり、そしてR₃およびR₄がC(=O)CH₃である。好ましい他の実施態様において、上記化合物は、式II Iに従い、ここで、R₁〜R₄がHであり；または、R₁がCH₃であり、そしてR₂がHであり；または、R₁およびR₂がCH₃であり；または、R₁がXであり、そしてR₂がHであり；または、R₁およびR₂がXであり；各Xは、独立してハロゲンから選択される。好ましい他の実施態様において、上記化合物は、式IVに従い、ここで、R₁〜R₆が Hであり；または、R₁〜R₆がHであり、そしてR₆がCH₃であり；または、R₁およびR₃ がCH₃であり、そしてR₂、R₄、R₅およびR₆がHであり；または、R₁〜R₄がHであり、そしてR₅およびR₆がCH₃であり；または、R₁〜R₄がHであり、そしてR₅がCH₃であり、ならびにR₆がCH₂CH₃であり；または、R₁〜R₆がXであり；または、R₁およびR₂がHであり、そしてR₃およびR₄がC(=O)CH₃であり、ならびにR₅およびR₆が一緒になって=Oである。好ましい他の実施態様において、上記化合物は、式VIに従い、ここで、R₇〜R₉がHである。好ましい他の実施態様において、上記化合物は、該化合物が式VIIに従い、ここで、R₁₀〜R₁₃がHである。好ましい他の実施態様において、上記化合物は、式VIIIに従い、ここで、R₁₄およびR₁₇がXであり、そしてR₁₅およびR₁₆がHであり；または、R₁₄〜R₁₇がXであり；または、R₁₄がOHであり、そしてR₁₅〜R₁₇がHである。本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明の参照によって明白となる。発明の詳細な説明上記に示したように、伝統的なブロッキング剤の使用は、ハイブリダイゼーション固体支持体に対する非特異的結合を一様にブロックするための再現性のある方法では決してなかった。本発明の方法は、ハイブリダイゼーション固体支持体（例えば、ニトロセルロース膜またはナイロン膜）上の非特異的部位の一様なレベルのブロッキングを達成することによって、先行技術の方法の制限を克服する。本発明は、ハイブリダイゼーション領域において、非特異的バックグラウンドの減少が、ノイズに対するシグナルの比率を実質的に高めるという顕著な改善を表す。これは、例えば、放射標識されたプローブと化学的に標識されたプローブ（これは、蛍光シグナルシステムまたは化学発光シグナルシステムに適合する）との置換を可能にする。さらに、伝統的なブロッキング剤に対する必要性を排除することにより、本発明は、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼの混入の危険性を低下させかつ大規模のハイブリダイセーションを行う費用を低下させる、さらなる利点を有する。ハイブリダイゼーションアッセイは、選択された分子に結合し得る分子を同定するために有用である。本明細書中で使用されるように、用語「ハイブリダイゼーション」は、任意の２つの分子の間の特異的結合を言い、そして、例えば、２つの核酸分子の間の結合を含む。このようなハイブリダイゼーションアッセイは、代表的には、一般に、上記のように記載され得る一連の工程を含む。要約すれば、分子（すなわち標的リガンド）は、固体支持体上に固定化される。固体支持体は、ブロッキング剤（単数または複数）によって処理され、プローブ分子の非特異的結合を低減させる。固定化された標的分子を含有する固体支持体は、結合パートナー候補（すなわちプローブ分子）を用いてプロービングされる。固体支持体に結合したプローブ分子の存在または非存在は検出され、それによりハイブリダイゼーションが標的リガンドとプローブとの間に起こっているかどうかを測定する。上記に示したように、プロービングの工程の前に、固体支持体は、標的分子がそれに固定化され、そして非特異的結合部位がブロックされるように調製される。種々の固体支持体が、本発明中でハイブリダイゼーションマトリックスとして使用され得、そしてこれは当該分野で周知である。結合パートナーに結合するその能力を有意に損なうことなく標的リガンドを固定化し得る、任意の固体支持体が適切である。標的リガンドを固定化するための予備活性化表面を有する固体支持体は、当業者にとって周知であり、そして市販されている。固体支持体は、多孔性固体支持体および非多孔性固体支持体の両方を含む。多孔性固体支持体は多孔性膜を含む。多孔性膜の例として、ニトロセルロース膜（例えば、SchleicherおよびSchuell、Keene、NH）およびナイロン膜（例えば、Amersham、Arlington He ights、IL、またはSchleicherおよびSchuell、Keene、NH）が挙げられる。非多孔性固体支持体は、マイクロビーズ、ガラス表面および溶融シリカを含む。非多ン、シリカおよびラテックスが挙げられる。磁性ビーズは、PerSeptive Diagnos tics（Cambridge、MA）またはDynal（Oslo、Norway）から得られ得る。ラテックス、シリカおよび他のタイプのビーズは、Polysciences（Warrington、PA）から得られ得る。標的リガンドが核酸の場合、特に好ましい固体支持体は、ニトロセルロース膜、ナイロン膜またはガラス表面である。標的リガンドがタンパク質の場合、特に好ましい固体支持体は、ニトロセルロース膜またはナイロン膜である。標的リガンドは、上記のように固体支持体上に固定化される。種々の分子が、本発明中で標的リガンドとして使用され得る。固体支持体上に固定化し得る任意の分子が適切である。標的リガンドは、核酸、タンパク質および小有機分子、または生物有機（例えば、天然物）分子を含む。本明細書中で使用されるように、用語「核酸」は、デオキシリボ核酸（遺伝子DNAおよびcDNAを含むDNA）、リボ核酸（mRNA、rRNAおよびtRNAを含むRNA）、オリゴヌクレオチドおよび核酸アナログを含む。本明細書中で使用されるように、用語「タンパク質」は、タンパク質（例えば、酵素および抗体）、ポリペプチド、ペプチド（すなわち、２つより多いアミノ酸）、タンパク質複合体およびアミノ酸アナログを含む。負に荷電した「タンパク質」は、好ましいタンパク質標的リガンドである。標的リガンドは、種々の方法（市販供給源、生物学的な供給源からの精製、組換え産物および合成化学的調製を含む）で得られ得る。上記のような標的リガンドの選択に際して、それは固体支持体上に固定化される。種々の固定化手順が、本発明中で使用され得、そしてこれは当業者に周知である。結合パートナーを結合するその能力を有意に損なうことなく標的リガンドを堆積または付着する、任意の固定化手順が適切である。固体支持体上に固定化するための伝統的な手段は、加熱およびUV照射を含む。加熱による固定化（例えば、真空下でのベーキング）に関して、温度は、代表的には、約１分から60分の時間で約50°から100°の範囲にある。照射による固定化に関して、UV出力は、代表的には、約10秒から５分の時間で約1,000から1,000,000μJ/Cm²の範囲にある。標的リガンドの存在下において固体支持体をこのような種々の反応条件の１つに供することにより、標的リガンドは、固体支持体上に非可逆的に固定化される。上記に示したように、本発明は、ハイブリダイゼーション反応における使用のために調製された固体支持体上の非特異的結合部位をブロックするための異なる手順を提供する。非特異的結合部位は、固体支持体上に固定化された標的リガンドと独立する様式で、結合パートナー候補（プローブ）の固体支持体に対する結合を可能にする。プローブの固定化標的リガンドを有する固体支持体に対する非特異的結合は、プローブが標的リガンドの結合パートナーであることの外観を与える。本発明では、固体支持体上の標的リガンドの固定化に続いて、固体支持体は、以下に記載されるような、１つ以上の化合物と反応し、固体支持体上の非特異的結合部位をブロックする。本発明で使用され得る化合物は、以下の式I〜VII Iにより表される無水物を含む。式Ｉ〜VIIIにより示した化合物は上記したように置換基R₁からR₁₇を有している。R₁からR₁₇のそれぞれは、独立して、以下を包含する置換基から選ばれる（すなわち、１つの置換基の選択は他のいかなる置換基の選択にも左右され得ない。）：H、OH、CH₃、CH₂-CH₃、CH=CH-CH₃、X、CH₂X、CHX₂、CH₂-CH₂X、CH₂-CHX₂ 、C X₃、CX₂-CX₃、CX₂-CX₂-CX₃、およびC(=O)CH₃。各「X」は独立してハロゲン、すなわち、F、Cl、Br、およびIから選ばれる。さらに、同一の環の炭素に結合した置換基は、=CH₂、または=Oとしてひとまとめに扱われ得る。例えば、R₁およびR₃ 、R₂およびR₄、またはR₅およびR₆のいずれか、またはすべてが=CH₂として、ひとまとめにして扱われ得る。同様に、例えば、R₅およびR₆が=Oとしてひとまとめに扱われ得る。種々の無水物は市販されているか（例えば、Aldrich、Milwaukee、 WI）または当該分野で公知の手順を用いて合成され得る（例えば、March、および本明細書中で引用する参考文献に記された手順：J．March，Advanced Organic Chemistry，第２版，McGraw-Hill，New York，N.Y.(1977)）。本開示を考慮すれば、上記化合物の変更が本発明の実施において意図され、そして利用され得、本発明の精神および範囲内であることは、当業者には明白である。適切な化合物を、非特異的部位をブロックするのに十分な条件下で、固定化した標的用リガンドを含む固体支持体と反応させる。簡単に言えば、化合物は一般的に極性溶媒のような溶媒で混合される。一般的に、数分から数時間の間、室温からその溶媒の沸点未満までの温度で固体支持体に溶液を加える。例えば、無水コハク酸を、約 pH７から９で約0.01から0.5Mのホウ酸ナトリウムを含む、m-ピロール、アセトニトリルまたはその他の極性溶媒のような溶媒と混ぜて、最終濃度約0.01から10mg /mlを得る。固体支持体との反応を約20から37℃で約２から60分進行させる。特定の標的用リガンドが化合物と反応し、そしてそのような反応が標的用リガンドのプローブに結合する能力に顕著に影響し得る場合、標的用リガンドと化合物との間のそのような反応に対して保護することが所望され得る。これは、標的用リガンドを保護すること、または化合物を固定化した標的用リガンドを含む固体支持体と反応させる条件を調節することを包含する、種々の方法で達成され得る。例えば、pHを、固体支持体と化合物とは実質的に反応するが、標的用リガンドと化合物とは実質的に反応しないpHに調節し得る。あるいは、例えば、化合物と反応し得る標的用リガンドの官能基を可逆的に保護し得る。標的用リガンドを、化合物との反応を妨げる１つ以上の保護試薬と反応させ、そして化合物を固定化した標的用リガンドを含む固体支持体と反応させた後、保護基を標的用リガンドからはずす。分子の官能基の可逆的保護の技術は当該分野で公知である（例えば、 Greene、および本明細書中で引用する参考文献に記載された手順：T.W．Greene, Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，New York， N.Y.(1981)）。以上に示したように、非芳香族化合物および芳香族化合物の両方とも本発明において使用され得る。化合物の例として次のものを包含する：無水プロピオン酸、無水酪酸、無水イソ酪酸、無水吉草酸、無水(s)-(+)-メチル酪酸、無水トリメチル酢酸、無水ヘキサン酸、無水ヘプタン酸、無水デカン酸、無水ラウリン酸、無水パルミチン酸、無水ステアリン酸、無水ドコサン酸、無水クロトン酸、無水メタクリル酸、無水オレイン酸、無水リノール酸、無水クロロ酢酸、無水ヨード酢酸、無水ジクロロ酢酸、無水トリフルオロ酢酸、無水クロロジフルオロ酢酸、無水トリクロロ酢酸、無水コハク酸類、無水ペンタフルオロプロピオン酸、無水ヘプタフルオロ酪酸、無水メチルコハク酸、無水2,2-ジメチルコハク酸、無水シス-1,2-シクロヘキサンジカルボン酸、無水トランス-1,2-シクロヘキサンジカルボン酸、無水フタル酸類、無水イタコン酸、無水2-ドデセン-1-イルコハク酸、無水ジカルボン酸類、無水シス-アコン酸、無水s-アセチルメルカプトコハク酸、無水(+)-ジアセチル-L-酒石酸、無水マレイン酸類、無水シトラコン酸、無水2 ,3-ジメチルマレイン酸、無水マレイン酸類、無水グルタル酸類、無水安息香酸、無水2,3-ジフェニルマレイン酸、無水2-フェニルグルタル酸、無水ホモフタル酸(homophalic-)、無水イサチン酸、無水N-メチルイサチン酸、無水5-クロロイサチン酸、無水フタル酸、2-スルホ安息香酸環状無水物、無水4-メチルフタル酸、無水3,6-ジフルオロフタル酸、無水3,6-ジクロロフタル酸、無水4,5-ジクロロフタル酸、無水テトラフルオロフタル酸、無水テトラブロモフタル酸、無水3-ヒドロキシフタル酸、無水カルボン酸類、無水3-ニトロフタル酸、無水4-ニトロフタル酸、無水ジフェン酸、および無水ナファリン酸(naphalic-)類。好ましい化合物は以下を包含する：無水クロトン酸、無水クロロ酢酸、無水ジクロロ酢酸、無水トリフルオロ酢酸、無水クロロジフルオロ酢酸、無水トリクロロ酢酸、無水ペンタフルオロプロピオン酸、無水ヘプタフルオロ酪酸、無水コハク酸、無水メチルコハク酸、無水2,2-ジメチルコハク酸、無水イタコン酸、無水マレイン酸、無水シトラコン酸、無水2,3-ジメチルマレイン酸、無水1-シクロペンテン-1,2-ジカルボン酸、無水3,4,5,6-テトラヒドロフタル酸、無水ブロモマレイン酸、無水ジクロロマレイン酸、無水グルタル酸、無水3-メチルグルタル酸、無水2,2-ジメチルグルタル酸、無水3,3-ジメチルグルタル酸、無水3-エチル-3 -メチルグルタル酸、無水ヘキサフルオログルタル酸、3,5-ジアセチルテトラヒドロピラン-2,4,6-トリオン、無水ジグリコール酸、無水3,6-ジフルオロフタル酸、無水3,6-ジクロロフタル酸、無水テトラフルオロフタル酸、無水テトラクロロフタル酸、無水テトラブロモフタル酸、無水3-ヒドロキシフタル酸、および無水2,3-ジブロモマレイン酸。ハイブリダイゼーション反応において、「ブロックされた」固体支持体（標的用リガンドを含む）を使用する前に、固体支持体と未反応のブロッキング化合物すべてを実質的に除去することが所望され得る。本発明の情況において、この除去を行うために種々の方法が使われ得る。未反応の化合物を、例えば、化合物を含まない溶液で固体支持体をリンスすることにより、洗い流し得る。同様に、未反応の化合物を、反応溶液から固体支持体を物理的に除くことにより、除去し得る。あるいは、化学的に反応をクエンチすることにより、未反応の化合物を除去し得る。例えば、未反応の無水物を加水分解または反応溶液に加えられたアミンとの反応により反応しない形態に転換し得る。これらの技術のいずれも、もう一つまたはすべてと組み合わせて使用し得る。未反応化合物の除去は、固定化後または介在時間の後すぐに行われ得る。もし時間間隔が十分に長ければ、無水物は反応しない形態にすでに加水分解されているので何もしなくて良い。さらに、それは未反応化合物の存在が固定化した標的用リガンドを含む固体支持体の特定の用途を妨害しない状態が存在し得る。固定化した標的用リガンドおよびブロックされた非特異的部位を含む固体支持体の調製後、固体支持体をプローブ（候補結合パートナー）と接触させ、プローブが標的用リガンドとハイブリダイズし得るかどうかを決定する。標的用リガンドとして使用する上記の分子のいかなるものもプローブとして使用し得る。従って、プローブは核酸、タンパク質および低分子有機分子または生体有機分子（例えば天然産物）を包含する。例えば、プローブが核酸である場合、核酸は生物のゲノムの全配列もしくはその一部から、メッセンジャーRNA(mRNA)からまたはcDN Aから得られ得る。一旦適切な配列が決定されると、DNAプローブは市販の方法および設備（例えば、Applied BioSystems，Foster City，CA）を用いて好適に化学合成される。例えば、固相法を用いて15から50塩基の間の短いプローブが生成される(Caruthersら，Cold Spring Harbor Symp．Quant．Biol．47:411(1982)) 。ハイブリダイゼーション培地は一般に標準的な緩衝液および界面活性剤を含有する。クエン酸ナトリウム、Tris HCl、PIPES、またはHEPESのような緩衝液は、約0.01Mから0.2Mの濃度で使用され得る。ハイブリダイゼーション培地はまた、代表的に約0.01%から0.5%のイオン性または非イオン性の界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)またはサルコシル(Sigma，St．Louis，MIssouri) ）、約1から10mMの間のEDTA、および約0.1から1MのNaClを含有する。他の添加物（種々の極性水溶性試薬（例えば、アニオン性のポリアクリレートまたはポリメタクリレート）を含む体積排除剤、および荷電した多糖類ポリマー（例えば、デキストラン硫酸など）が含まれ得る。本発明のハイブリダイゼーションアッセイは、当業者に公知の、または本明細書中に示したガイドラインに与えられるイムノアッセイの方法論に類似のいずれの方法によっても行われ得る。ハイブリダイゼーションアッセイは代表的には約４から70℃の間の温度で、代表的には約１時間から72時間の間行われる。ハイブリダイゼーション温度は、ハイブリダイズを維持する溶液中に存在する塩、カオトロプスなどの濃度に依存することが公知である。アッセイの好ましい方法はサンドイッチアッセイおよびその変更、ならびに競合または置換アッセイである。ハイブリダイゼーション技術は、一般にNucl eic Acid Hybridization，A Practical Approach，HamesおよびHiggins(編)，IR L Press(1985); GallおよびPardue，Proc．Natl．Acad．Sci．USA．63:378(1969 ); およびJohnら，Nature 223:582(1969)に記載されている。ハイブリダイゼーションに改良がなされる場合、これらは難なく応用されている。ハイブリダイゼーションの特異性（ストリンジェンシー）（すなわち、プローブの標的用リガンドへの結合）は当該分野で公知の多くの異なる方法で制御され得る(例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Sambrookら(編)，Col d Spring Harbor Press(1989))。例えば、特異性は塩濃度、インキュベーション時間および/またはインキュベーション温度を変化させることにより制御され得る。特異性の制御は結合反応の時点または洗浄工程、あるいは両方において影響され得る。例えば、固体支持体上に固定化した標的リガンドとのプローブのインキュベーションの条件は、ストリンジェントな結合のみを許容するものであり得る。あるいは、結合反応のための条件はあまりストリンジェントではないが、（結合反応の後の）洗浄は、ストリンジェントな条件下であり得、固定化した標的リガンドを介して固体支持体に結合したままである任意のプローブの特異性を制御する。本発明の情況において、固定化した標的リガンドに対するプローブの結合の特異性は、上記の方法を含む種々の方法の、いずれのものでも制御され得る。例えば、用いる特定のハイブリダイゼーション溶液に適切な温度および時間でハイブリダイゼーションを行った後、プローブ核酸-ターゲット核酸複合体が結合する固体支持体を、類似の試薬（例えば、NaCl、緩衝液、有機溶媒および界面活性剤）を代表的に含有する溶液に、ハイブリダイゼーション溶液に注ぐのと同様に導入する。これらの試薬はハイブリダイゼーション溶液中と同様の濃度であるが、ハイブリダイゼーションにおいて高いストリンジェンシーを必要とする場合、しばしばより低濃度であり得る。洗浄の時間を約数分から数時間に変更し得る。ハイブリダイゼーションまたは洗浄培地のいずれかはストリンジェントであり得る。適切にストリンジェントな洗浄をした後、正確なハイブリダイゼーション複合体が標識の性質に従って検出され得る。ハイブリダイゼーションの程度の決定は、当該分野で周知のいかなる方法でもなされ得る。ハイブリダイゼーションが全く検出されない場合は、ハイブリダイゼーションの程度は０である。ハイブリダイゼーションは「直接的に」（すなわち、プローブがレポーターグループを含む場合）または「間接的に」（すなわち、レポーターグループが、プローブの存在を検出するために使われる分子上にある場合）検出され得る。種々の標識（シグナル）が本発明の利用に際して適している。標識は、標的配列とその相補シグナル配列との間の二本鎖形成を検出するためのレポーターグループとして作用する。本明細書中で使用されるようなレポーターグループは、物理的または化学的特性を有し、観察、測定または検出され得るグループである。検出性は、色調変化、化学発光、蛍光、または放射能のような特性によって与えられ得る；またはリガンド認識部位として与えられるレポーターグループの能力によって与えられ得る。代表的には、例えば、標識されたシグナル核酸プローブは、核酸ハイブリダイゼーションを検出するために用いられる。相補核酸（シグナルプローブ）は、代表的には、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドの存在を検出するために用いられる、いくつかの方法のうちの１つにより標識され得る。例えば、標識された核酸プローブは、ニックトランスレーションにより標識された二本鎖DNA、組換えM13バクテリオファージにアニールしたオリゴヌクレオチドのプライマー伸張によって調製した一本鎖DNA、放射性標識されたオリゴヌクレオチドプローブまたはビオチンもしくはジゴキシン標識された合成オリゴヌクレオチドプローブ、あるいは原核生物のDNA依存性RNAポリメラーゼ（例えば、バクテリオファージ SP6、T7、またはT3 RNAポリメラーゼ）でin vitro で合成したRNAを包含する。これらのプローブの合成法および利用法は、例えば、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Sambrookら(編)、Cold Spr ing Harbor Press(1989)に記載されている。最も一般的な検出法は、³H、¹²⁵I、³⁵ S、¹⁴C、³²Pで標識されたプローブなどによるオートラジオグラフィーの使用である。他の標識は、標識された抗体、発蛍光団、化学発光試薬、酵素と結合するリガンド、および標識されたリガンドについての特異的な結合対メンバーとして役に立ち得るリガンド、を包含する。必要な感度、プローブとの結合の容易さ、必要な安定性および必要な利便性に依存して標識を選択することは、当業者にとって明らかである。非同位体プローブはシグナル（例えば、発蛍光団、化学発光試薬、酵素および酵素基質）で直接標識されるか、またはそれに結合した検出可能なシグナルを有する部分に結合し得るリガンドと結合することによって間接的に標識され得る。例えば、プローブに共有結合的に結合したビオチンは、検出可能なシグナル（例えば、酵素または光反応性化合物）に共有結合しているストレプトアビジンと結合し得る。リガンドおよびレセプターの組み合わせは広く変更し得る。リガンドが天然の「レセプター」（例えばビオチン、チロキシンおよびコルチゾールのようなリガンド）を有している場合、それはその標識された天然に存在するレセプターと組み合わせて用いられ得る。あるいは、ハプテンまたは抗原を、適切に標識された抗体と組み合わせて用いられ得る。非放射性プローブは、しばしば間接的手段により標識される。一般に、リガンド分子はプローブに共有結合される。次いで、そのリガンドは、本来検出可能であるか、またはシグナルシステム（例えば、検出可能な酵素、蛍光化合物、または化学発光化合物）に共有結合する抗リガンド分子に結合する。リガンドおよび抗リガンドは広く変更され得る。リガンドが天然の抗リガンドを有する場合（例えば、ビオチン、チロキシンおよびコルチゾール）、それは天然に存在する抗リガンドと組み合わせて用いられ得る。あるいは、任意のハプテン化合物または抗原化合物を抗体と組み合わせて用いられ得る。シグナルとしての利用に適した酵素には加水分解酵素（特にホスファターゼ）、エステラーゼ、ウレアーゼ、グリコシダーゼ、オキシドレダクターゼ（特にペルオキシダーゼ）が包含される。適切な蛍光シグナルにはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシルウンベリフェロンなどが包含される。本発明において有用な化学発光物質にはルシフェリン、ルミノール、および1,2-ジオキセタンが包含される。ハイブリダイゼーション溶液中に存在する標識されたプローブの量は広く変更し得る。一般に、標的リガンドの量を上回る、実質的にモル過剰のプローブを、標的リガンドに対するプローブの結合の割合を増大するために用いる。シグナルの検出法は選択されたシグナルにより決定される。例えば、標識が放射性同位体の場合、捕捉され標識されたプローブ-標的リガンド複合体を含有する支持体表面は、Ｘ線写真に露光されるか、あるいはシンチレーションまたはガンマカウンターで解析され得る。標識が蛍光の場合、複合体は特定の波長の光で照射され、そして標識された複合体に吸収され、それにより検出されるより低波長の光の放射がもたらされる。標識が酵素の場合、複合体が酵素の適切な基質とともにインキュベートされ、そして生じたシグナルは、例えば、色の付いた沈殿物、色の付いたまたは蛍光の可溶性化合物または物質、あるいは生物発光または化学発光により生じた光子であり得る。プローブを標識に直接結合し得る。例えば、プローブが放射性である場合、その相補体と会合したプローブはＸ線写真に露光される。標識が蛍光の場合、サンプルをはじめに特定の波長の光で照射し、次いで検出器で放射を捕らえることによりサンプルを検出する（Freifelder，Physical Biochemistry，W.H．Freeman & Co.(1982)，p.532）。標識が酵素の場合、酵素の適切な基質でインキュベートすることによりサンプルを検出する。生じたシグナルは、色の付いた沈殿物、色の付いたまたは蛍光の可溶性物質、あるいは生物発光または化学発光により生じた光子であり得る。例えば、アルカリホスファターゼはリン酸インドキシルを脱リン酸化し、次いで還元反応に関与して、テトラゾリウム塩を濃い色かつ不溶性のホルマザンに転換する。この標識はハイブリダイゼーション複合体の間接的な検出も可能であり得る。例えば、標識がハプテンまたは抗原である場合、サンプルを抗体を用いて検出し得る。この系では、シグナルは蛍光または酵素分子を抗体に結合することにより、そしてある場合では放射性化合物に結合することによって生じる(Tijssen，「酵素イムノアッセイの実施および理論」、Laboratory Techniques in Biochemis try and Molecular Biology，Burdon and van Knippenberg(編)，Elsevier(1985 ), p.9.)。プローブの検出の前に、固定化した標的リガンドに結合しなかったすべてのプローブを実質的に除去することが所望され得る。種々の方法が本発明の情況において、この除去を行うために使用され得る。例えば、未結合プローブは例えば固体支持体をリンスすることにより、洗い流され得る。同様に、未結合プローブを、ハイブリダイゼーション反応溶液から固体支持体を物理的に除くことにより除去し得る。あるいは、未結合プローブを、反応をクエンチすることによって除去し得る（すなわち、未結合プローブがもはや検出不可能な形態に転換される）。これらの技術いずれも、もう１つまたはすべてと組み合わせて用いられ得る。次の実施例は例証を示すものであり、制限を示すものではない。実施例実施例１比色定量レポーターを用いる、デンハルトでブロックしたニトロセルロースと比較した、無水コハク酸でブロックしたニトロセルロースによるバックグラウンドの減少の実証本実施例では、DNAをニトロセルロースフィルター上にスポットし、固定し、相補的ビオチン化オリゴヌクレオチドでプロービングする。次いで、ハイブリダイズしたシグナルオリゴヌクレオチドを、比色定量基質を用いてストレプトアビジン／アルカリホスファターゼにより検出する。ニトロセルロースをブロックする化学的手段を、従来のブロッキング剤と比較する。プラスチックで裏打ちしたニトロセルロース（SchleicherおよびSchuell、パーツ番号76489、Keene、NH）を、１×３cm片にカットした。次いで、ニトロセルロースを、50％エタノール中に一端を浸漬し、そしてエタノール中を通過させて簡単に浸漬した。このシートを水中で簡単に３回洗浄し、次いで２×SSC（20×S SCは、最終容量１リットルの水に175.3g NaClおよび88.2gクエン酸ナトリウムを溶解させたものである(pH7.0)）中で振とうしながら５分間浸漬した。100ngのλ 二本鎖DNA(dsDNA)を、300ミクロン間隔でスポットした。DNAを、UV照射により不可逆的に固定化した（30秒以上で120,000マイクロジュール/cm²）。dsDNAを変性するために、シートを50％エタノールで湿らせ、次いで水で２回洗浄した。次いで、シートを変性溶液（0.1N NaOH、0.05mM EDTA）中に室温で１分間浸漬し、水で素早くリンスし、中和溶液（0.1M Tris pH7.2、0.05mM EDTA）中で３回簡単に洗浄し、水中で１回洗浄し、そしてシートをペーパータオルで軽くたたいて乾燥させた。DNAを再度UV照射処理した（30秒以上で120,000マイクロジュール/cm²）。シートを50％エタノールで５分間再水和し、そして水で２回洗浄した。次いで、シートを別々の「ブロッキング」手順のために２つの容器に分けた。１つの容器は、化学試薬である無水コハク酸でブロックしたニトロセルロースシートを含んでいた。シートを無水コハク酸でブロックするために、2.5gの無水コハク酸を25ml m-ピロールに溶解し、そして125ml 0.1Mホウ酸ナトリウム(pH8.5) を添加した。溶液を良く混合し、次いでシートに添加した。穏やかに混合しながら10分間インキュベートした。次いで、シートを、0.01M Trisおよび0.005 EDTA で５回洗浄した。第２の容器中のシートを５×デンハルト溶液でブロックした。これは、10mlの50×ストックデンハルト溶液（５gのFicoll(400型、Pharmacia) 、５gポリビニルピロリドン、５gウシ血清アルブミン(フラクション５、Sigma) 、および水で500mlの総容量にした）を90mlの水に入れ、そして断片化した一本鎖ニシン精子DNAを最終濃度100μg/mlまで添加することによって行なった。溶液を良く混合し、次いでシートに添加した。穏やかに混合しながら30分間インキュベートした。次いで、シートを、0.01M Tris pHおよび0.005 EDTAで５回洗浄した。ビオチン化オリゴヌクレオチド（DMO469(GTTTAACATACTTTCATTT)）を、10ng/ml の最終濃度まで、1000μlの迅速ハイブリダイゼーション溶液（Rapid-Hyb，Amer sham，Arlington Heights，IL）に添加した。ハイブリダイゼーションしたものを42℃まで60分間加熱した。次いで、シートを、１回の洗浄あたり１×SSC/0.1 ％ SDS、１分間で４回リンスした。次いで、シートを、洗浄溶液（0.01M Tris(p H7.2)、0.1M NaCl、0.005M EDTA、0.1％サルコシル）で２回洗浄した。ストレプトアビジン／アルカリホスファターゼ結合体（Vector，Burlingame， CA）を洗浄溶液中で希釈した（1:10,000）。次いで、溶液を、１時間、室温で、振とうしながらシートに添加した。次いで、シートを洗浄溶液で４回洗浄し、検出緩衝液（0.1M NaCl、0.01M Tris(pH8.5)、0.05M MgCl₂）で５分間、１回リンスした。アルカリホスファターゼ基質を、BCIP/NBTタブレット（SchleicherおよびSchuell、パーツ番号78349、Keene、NH）を30ml dH₂O中に溶解させることにより調製した。反応を、４時間、室温で行った。次いで、シートを水でリンスし、そして乾燥させた。結果（表１）は、デンハルト試薬でブロックしたシートと比較して、無水コハク酸で処理したシートにおける「バックグラウンド」色の有意により低いレベルを示した。実施例２蛍光レポーターを用いる、デンハルトでブロックしたニトロセルロースと比較した、無水コハク酸でブロックしたニトロセルロースによるバックグラウンドの減少の実証本実施例では、DNAをニトロセルロースフィルター上にスポットし、固定し、相補的ビオチン化オリゴヌクレオチドでプロービングする。ハイブリダイズしたシグナルオリゴヌクレオチドを、4-メチル-ウンベリフェリル-ホスフェート（4- ヒドロキシ-メチルクマリン）を用いてストレプトアビジン／アルカリホスファターゼにより検出する。ニトロセルロースをブロックする化学的手段を、従来のブロッキング剤と比較する。プラスチックで裏打ちしたニトロセルロース（SchleicherおよびSchuell、パーツ番号76489、Keene、NH）を、１×３cm片にカットした。次いで、ニトロセルロースを、50％エタノール中に、一端を浸漬し、そしてエタノール中を通過させて簡単に浸漬した。このシートを水中で簡単に３回洗浄し、次いで２×SSC中で振とうしながら５分間浸漬した。100ngのλ二本鎖DNAを、300ミクロン間隔でスポットした。DNAを、UV照射により不可逆的に固定化した（30秒以上で120,000マイクロジュール/cm²）。dsDNAを変性するために、シートを50％エタノールで湿らせ、次いで水で２回洗浄した。次いで、シートを変性溶液（0.1N NaOH、0.05m M EDTA）中に室温で１分間浸漬し、水で素早くリンスし、中和溶液（0.1M Tris pH7.2、0.05mM EDTA）中で３回簡単に洗浄し、水中で１回洗浄し、そしてシートをペーパータオルで軽くたたいて乾燥させた。DNAを再度UV照射処理した（30秒以上で120,000マイクロジュール/cm²）。シートを50％エタノールで５分間再水和し、そして水で２回洗浄した。DNAを含むシートを、DNAを含まないコントロールシートとは異なるようにマークした。次いで、シートを別々の「ブロッキング」手順のために２つの容器に分けた。１つの容器は、化学試薬である無水コハク酸でブロックしたニトロセルロースを含んでいた。シートを無水コハク酸でブロックするために、2.5gの無水コハク酸を25ml m-ピロールに溶解し、そして125ml 0.1Mホウ酸ナトリウム(pH8.5)を添加した。溶液を良く混合し、次いでシートに添加した。穏やかに混合しながら10分間インキュベートした。次いで、シートを、0.01M Trisおよび0.005 EDTAで５回洗浄した。第２の容器中のシートを５×デンハルト溶液でブロックした。これは、10mlの50×ストックデンハルト溶液(５gのFicoll(400型、Pharmacia)、５gポリビニルピロリドン、５gウシ血清アルブミン(フラクション５、Sigma)、および水で500mlの総容量にした）を90mlの水に入れ、そして断片化した一本鎖ニシン精子DNAを最終濃度100μg/mlまで添加することによって行なった。溶液を良く混合し、次いでシートに添加した。穏やかに混合しながら30分間インキュベートした。次いで、シートを、0.01M Tris pH7.2および0.005 EDTAで５回洗浄した。ビオチン化オリゴヌクレオチド（DMO469(GTTTAACATACTTTCATTT)）を、10ng/ml の最終濃度まで、1000μlの迅速ハイブリダイゼーション溶液（Rapid-Hyb，Amer sham，Arlington Heights，IL）に添加した。ハイブリダイゼーションしたものを42℃まで60分間加熱した。次いで、シートを、１回の洗浄あたり１×SSC/0.1 ％ SDS、１分間で４回リンスした。次いで、シートを、洗浄溶液（0.01M Tris(p H7.2)、0.1M NaCl、0.005M EDTA、0.1％サルコシル）で２回洗浄した。ストレプトアビジン／アルカリホスファターゼ結合体（Vector，Burlingame， CA）を洗浄溶液中で希釈した（1:10,000）。次いで、溶液を、１時間、室温で、振とうしながらシートに添加した。次いで、シートを洗浄溶液で４回リンスし、検出緩衝液（0.1M NaCl、0.01M Tris(pH8.5)、0.05M MgCl₂）で５分間、１回リンスした。次いで、シートを、１mlの0.5mM 4-メチル-ウンベリフェリルホスフェート（4-ハイドロキシ-メチルクマリン）で別々にインキュベートした。反応を４時間室温で行った。一部の溶液を取り（150μl）、そしてブラックマイクロタイタープレート（Dynatek Laboratories，Chantilly，Va.）中に入れた。次いで、プレートを、Fluoroskan II fluorometer(Flow Laboratories，McLean，Va. )により、励起波長360nmおよびモニター波長456nmを用いて直接読みとった。結果（表２）は、デンハルト試薬でブロックしたシートと比較して、無水コハク酸で処理したシートにおける「バックグラウンド」色の有意により低いレベルを示した。実施例３化学ルミネセンスレポーターを用いる、デンハルトでブロックしたニトロセルロースと比較した、無水コハク酸でブロックしたニトロセルロースによるバックグラウンドの減少の実証本実施例では、DNAをニトロセルロースフィルター上にスポットし、固定し、相補的ビオチン化オリゴヌクレオチドでプロービングする。ハイブリダイズしたシグナルオリゴヌクレオチドを、化学ルミネセンス基質Lumingenを用いてストレプトアビジン／アルカリホスファターゼにより検出する。ニトロセルロースをブロックする化学的手段を、従来のブロッキング剤と比較する。プラスチックで裏打ちしたニトロセルロース（SchleicherおよびSchuell、パーツ番号76489、Keene、NH）を、１×３cm片にカットした。次いで、ニトロセルロースを、50％エタノール中に、一端を浸漬し、そしてエタノール中を通過させて簡単に浸漬した。シートを水中で簡単に３回洗浄し、次いで２×SSC中で振とうしながら５分間浸漬した。100ngのλ二本鎖DNAを、300ミクロン間隔でスポットした。DNAを、UV照射により不可逆的に固定化した（30秒以上で120,000マイクロジュール/cm²）。dsDNAを変性するために、シートを50％エタノールで湿らせ、次いで水で２回洗浄した。次いで、シートを変性溶液（0.1N NaOH、0.05mM ED TA）中に室温で１分間浸漬し、水で素早くリンスし、中和溶液（0.1M Tris pH7. 2、 0.05mM EDTA）中で３回簡単に洗浄し、水中で１回洗浄し、そしてシートをペーパータオルで軽くたたいて乾燥させた。DNAを再度UV照射処理した（30秒以上で1 20,000マイクロジュール/cm²）。シートを50％エタノールで５分間再水和し、そして水で２回洗浄した。DNAを含むシートを、DNAを含まないコントロールシートとは異なるようにマークした。次いで、シートを別々の「ブロッキング」手順のために２つの容器に分けた。１つの容器は、化学試薬である無水コハク酸でブロックしたニトロセルロースを含んでいた。シートを無水コハク酸でブロックするために、2.5gの無水コハク酸を25ml m-ピロールに溶解し、そして125ml 0.1Mホウ酸ナトリウム(pH8.5)を添加した。溶液を良く混合し、次いでシートに添加した。穏やかに混合しながら10分間インキュベートした。次いで、シートを、0.01M Trisおよび0.005 EDTAで５回洗浄した。第２の容器中のシートを５×デンハルト溶液でブロックした。これは、10mlの50×ストックデンハルト溶液（５gのFicoll(400型、Pharmacia)、５gポリビニルピロリドン、５gウシ血清アルブミン(フラクション５、Sigma)、および水で500mlの総容量にした）を90mlの水に入れ、そして断片化した一本鎖ニシン精子DNAを最終濃度100μg/mlまで添加することによって行なった。溶液を良く混合し、次いでシートに添加した。穏やかに混合しながら30分間インキュベートした。次いで、シートを、0.01M Tris pH7.2および0.005 EDTAで５回洗浄した。ビオチン化オリゴヌクレオチド（DMO469(GTTTAACATACTTTCATTT)）を、10ng/ml の最終濃度まで、1000μlの迅速ハイブリダイゼーション溶液（Rapid-Hyb，Amer sham，Arlington Heights，IL）に添加した。ハイブリダイゼーションしたものを42℃まで60分間加熱した。次いで、シートを、１回の洗浄あたり１×SSC/0.1 ％ SDS、１分間で４回リンスした。次いで、シートを、洗浄溶液（0.01M Tris(p H7.2)、0.1M NaCl、0.005M EDTA、0.1％サルコシル）で２回洗浄した。ストレプトアビジン／アルカリホスファターゼ結合体（Vector，Burlingame， CA）を洗浄溶液中で希釈した（1:10,000）。次いで、溶液を、１時間、室温で、振とうしながらシートに添加した。次いで、シートを洗浄溶液で４回洗浄し、検出緩衝液（0.1M NaCl、0.01M Tris(pH8.5)、0.05M MgCl₂）で５分間、１回リンスした。次いで、シートを、1mlのLumingen（Lumingen Inc.，Detroit，MI）とともに別々にインキュベートした。反応は室温で４時間実施した。一部の溶液を取り（200μl）、そして５mm×40mmポリプロピレンチューブ中に入れた。シグナルを、Turner TD 20e luminometer(Turner Designs，Sunnyvale，CA)を用いて、１分の積算時間で測定した。結果（表３）は、デンハルト試薬でブロックしたシートと比較して、無水コハク酸で処理したシートにおける「バックグラウンド」色の有意により低いレベルを示した。実施例４無水コハク酸をブロッキング剤として使用する、ナイロンメンブレンおよびニトロセルロースメンブレンの両方についてのバックグラウンドの減少の実証（ハイブリダイズしたプローブの存在を比色レポーターを使用して検出する）この実施例において、DNAを異なるフィルターのタイプ上に固定化し、相補的ビオチン化オリゴヌクレオチドを用いてプローブする。次いで、ハイブリダイズしたシグナルオリゴヌクレオチドを、比色基質を使用してストレプトアビジン／アルカリホスファターゼで検出する。ニトロセルロースのブロッキングの化学的手段を、従来のブロッキング剤と比較する。この実施例において使用するメンブレンフィルターとしては、Protran Nitroc ellulose（プラスチック裏打ち（plastic-backed）ニトロセルロース）（パート eicher and Schuell，Keene，NH）およびHybond^TM-NおよびHybond^TM-N+ナイロンメンブレン（Amersham，Arlington Heights，IL，60005）が挙げられる。ニトロセルロースおよびナイロンメンブレンフィルターを１×１cmの断片に切断した。次いで、一方の末端を浸漬し、そしてエタノール溶液を通して引くことにより、ニトロセルロースを50％エタノール中に短時間浸した。シートを３回、短時間水中で洗浄し、次いで振とうしながら２×SSC中に５分間浸した。100 ng のλ２本鎖DNAを300ミクロン間隔でスポットした。UV照射（120,000μJ/cm²、30 秒の期間にわたる）により、DNAを不可逆的に固定化した。dsDNAを変性させるために、シートを50％EtOHで湿らし、次いで水で２回洗浄した。次いで、シートを変性溶液（0.1 N NaOH、0.05 mM EDTA）中に室温で１分間浸し、水で迅速にリンスし、３回、短時間中和溶液（0.1 M Tris(pH 7.2)、0.05 mM EDTA）中で洗浄し、水中で１回洗浄し、そしてシートをペーパータオルで軽くたたいて乾燥させた。再度DNAをUV照射（120,000μJ/cm²、30秒の期間にわたる）で処理した。シートを50％エタノールで５分間再水和し、２回、水で洗浄した。次いで、シートを２つの容器中に、別々の「ブロッキング」手順のために分割した。一方の容器は、化学的薬剤である無水コハク酸でブロックしたニトロセルロースシートを含んだ。シートを無水コハク酸でブロックするために、2.5ｇの無水コハク酸を25 mlのm-ピロール（m-pyrol）中に溶解し、そして125 mlの0.1m ホウ酸ナトリウム（pH 8.5）を添加した。溶液を十分混合し、次いでシートに添加した。穏やかに混合しながらのインキュベーションは、10分間であった。次いで、シートを５回、0.01 M Tris、および0.005 EDTAで洗浄した。第２の容器中のシートを５×デンハルト溶液でブロックした。これを、10 mlのデンハルト溶液の50×ストック（５gFicoll（タイプ400，Pharmacia）、５ｇポリビニルピロリドン、５ｇウシ血清アルブミン（Fraction 5，Sigma）および総容量500 mlまでの水）を90 mlの水に入れ、そしてフラグメント化した１本鎖ニシン精子DNAを 100μg/mlの最終濃度に添加することにより調製した。溶液を十分に混合し、次いでシートに添加した。穏やかに混合しながらのインキュベーション、30分間。次いで、シートを５回、0.01 M Tris(pH)、および0.005 EDTAで洗浄した。ビオチン化オリゴヌクレオチド（DMO 469（GTTTAACATACTTTCATTT））を1000μ lの迅速ハイブリダイゼーション溶液（Rapid-Hyb，Amersham，Arlington Height s，IL）中10 ng/mlの最終濃度に添加した。ハイブリダイゼーションを42℃に60 分間加温した。次いで、シートを４回、１×SSC/0.1％SDSで１洗浄当たり１分間リンスした。次いで、シートを２回、洗浄溶液（Wash Solution）（0.01 M Tris (pH 7.2)、0.1 M NaCl、0.005 M EDTA、0.1％Tween 20）で洗浄した。ストレプトアビジン／アルカリホスファターゼ結合体（Vector，Burlingame C A）を洗浄溶液で１：10,000希釈した。次いで、溶液をシートに１時間室温で振とうしながら適用した。次いで、シートを４回、洗浄溶液でリンスし、１回検出緩衝液（0.1 M NaCl、0.01 M Tris(pH 8.5)、0.05 M MgCl₂）で５分間リンスした。アルカリホスファターゼ基質を、BCIP/NBT錠剤（Schleicher and Schuell，パート番号78349，Keene，NH）を30 ml dH₂O中に溶解することにより調製した。反応を0.5〜４時間室温で実施した。次いで、シートを水でリンスし、そして乾燥させた。ここで、バックグラウンドの強度を１〜10のスケールで等級付けし、１はほぼ無変化の表面色度（白色）を表し、そして10は強く着色した表面（濃褐色）を表す。結果（表４）は、デンハルト試薬でブロックしたシートに比較して、無水コハク酸で処理したシート上における、有意により低いレベルの「バックグラウンド」の色度を示した。実施例５比色レポーターを使用する、デンハルトでブロックしたニトロセルロースに比較しての、無水プロピオン酸、無水酪酸、無水ジフルオロフタル酸でブロックしたニトロセルロースについてのバックグラウンドの減少の実証この実施例において、３つのタイプの無水物を比較する。無水物のタイプを比較するために、DNAをニトロセルロースフィルター上にスポットし、固定化し、そして相補的ビオチン化オリゴヌクレオチドでプローブした。次いで、ハイブリダイズしたシグナルオリゴヌクレオチドを、比色基質（4-メトキシ-ナフトール（napthol）、4MN）を使用して、ストレプトアビジン／西洋ワサビペルオキシダーセ（SA/HRP）で検出した。ニトロセルロースのブロッキングの化学的手段もまた、従来のブロッキング剤と比較した。プラスチック裏打ち（plastic-backed）ニトロセルロース（Schleicher and S chuell，パート番号76489，Keene，NH）を１×３cmの断片に切断した。次いで、一方の末端を浸漬し、そしてエタノール溶液を通して引くことにより、ニトロセルロースを50％エタノール中に短時間浸した。シートを３回、短時間水中で洗浄し、次いで振とうしながら２×SSC中に５分間浸した。100 ngのλ２本鎖DNAを30 0ミクロン間隔でスポットした。UV照射（120,000μJ/cm²、30秒の期間にわたる）により、DNAを不可逆的に固定化した。dsDNAを変性させるために、シートを50 ％EtOHで湿らし、次いで水で２回洗浄した。次いで、シートを変性溶液（0.1N N aOH、0.05 mM EDTA）中に室温で１分間浸し、水で迅速にリンスし、３回、短時間中和溶液（0.1 M Tris(pH 7.2)、0.05 mM EDTA）中で洗浄し、水中で１回洗浄し、そしてシートをペーパータオルで軽くたたいて乾燥させた。再度DNAをUV照射（120,000μJ/cm²、30秒の期間にわたる）で処理した。シートを50％エタノールで５分間再水和し、そして２回、水で洗浄した。次いで、シートを５つの容器中に、別々の「ブロッキング」手順のために分割した。各々の容器は、化学的薬剤である無水プロピオン酸、無水酪酸、無水ジフルオロフタル酸または無水コハク酸でブロックしたニトロセルロースシートを含んだ（confine）。シートを無水プロピオン酸、無水酪酸、無水ジフルオロフタル酸、または無水コハク酸のいずれかでブロックするために、それぞれの化合物を25 mlのm-ピロール中に１モル濃度の最終濃度に溶解した。次いで、等容量の0 .1 Mホウ酸ナトリウム（pH 8.5）を添加した。溶液を十分混合し、次いでシートに添加した。穏やかに混合しながらのインキュベーションは、10分間であった。次いで、シートを５回、0.01 M Tris、および0.005 EDTAで洗浄した。第５の容器中のシートを５×デンハルト溶液でブロックした。これを、10 mlのデンハルト溶液の50×ストック（５ｇFicoll（タイプ400，Pharmacia）、５ｇポリビニルピロリドン、５ｇウシ血清アルブミン（Fraction 5，Sigma）および総容量500 m lまでの水）を90 mlの水に入れ、そしてフラグメント化した１本鎖ニシン精子DN Aを100μg/mlの最終濃度に添加することにより調製した。溶液を十分に混合し、次いでシートに添加した。インキュベーションは、30分間混合することによった。次いで、シートを５回、0.01 M Tris(pH)、および0.005 EDTAで洗浄した。ビオチン化オリゴヌクレオチド（DMO 469（GTTTAACATACTTTCATTT））を1000μ lの迅速ハイブリダイゼーション溶液（Rapid-Hyb，Amersham，Arlington Height s，IL）中10 ng/mlの最終濃度に添加した。ハイブリダイゼーションを42℃に60 分間加温した。次いで、シートを４回、１×SSC/0.1％SDSで１洗浄当たり１分間リンスした。次いで、シートを２回、洗浄溶液（Wash Solution）（0.01 M Tris (pH 7.2)、0.1 M NaCl、0.005 M EDTA、0.1％Sarkosyl）で洗浄した。ストレプトアビジン／HRP結合体（Vector，Burlingame CA）を洗浄溶液で希釈（１：2,000）した。次いで、溶液をシートに１時間室温で振とうしながら適用した。次いで、シートを４回、洗浄溶液でリンスし、１回、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で５分間リンスした。HRP基質を、25 mg の4-メトキシ-ナフトールを7.5 mlのMeOH中に入れ、これを次に33μlの30％過酸化水素を含有する42.5 ml のPBSに添加することにより調製した。反応を15分間室温で実施した。次いで、シートを５回、水でリンスし、そして乾燥させた。結果は、デンハルト試薬でブロックしたシートに比較して、無水物の１つで処理したシート上における、有意により低いレベルの「バックグラウンド」の色度を示した。ブロッキング工程のタイプ: バックグラウンドの相対的色度（スケール1〜10）無水プロピオン酸２無水酪酸２無水ジフルオロフタル酸３無水コハク酸１デンハルト７バックグラウンドのスケールは１〜10のスケールであり、１は最も明るい強度であり、そして10は最も暗いまたは最も強いバックグラウンドである。結果は、デンハルトブロッキングに比較して、ニトロセルロースシートを化学的に任意の４タイプの無水物でブロックした場合に、バックグラウンドが実質的に減少されることを示す。無水プロピオン酸、無水酪酸、および無水ジフルオロフタル酸はコハク酸ほど有効ではないが、これらはデンハルト溶液を上回った改善である。実施例６比色レポーターを使用する、デンハルトブロックしたスライドに比較しての、無水プロピオン酸、無水酪酸、無水ジフルオロフタル酸ブロックしたガラススライドについてのバックグラウンドの減少の実証この実施例において、３つのタイプの無水物を、非多孔性固体支持体（ガラススライド）を使用して比較した。無水物のタイプを比較するために、オリゴヌクレオチドを、架橋試薬を使用してスライド上に共有的に固定化し、そして相補的ビオチン化オリゴヌクレオチドでプローブした。次いで、ハイブリダイズしたシグナルオリゴヌクレオチドを、比色基質（4-メトキシ-ナフトール、4MN）を使用して、ストレプトアビジン／西洋ワサビペルオキシダーゼ（SA/HRP）で検出した。ガラススライドのブロッキングの化学的手段をまた、従来のブロッキング剤（デンハルト溶液）と比較した。スライド（Sectionlock^TM、Polysciences，Warrington，PAから購入）を３回、水中で洗浄し、次いで４時間２×SSC中でインキュベートした。100 ngのλ２本鎖DNAをマイクロピペッターを使用してスライド上へスポットした。UV照射（120 ,000μJ/cm²、30秒の期間にわたる）により、DNAを不可逆的に固定化した。次いで、dsDNAを変性させるために、スライドを変性溶液（0.1 N NaOH、0.05 mM EDT A）中に室温で１分間浸し、水で迅速にリンスし、そして３回、短時間中和溶液（0.1 M Tris(pH 7.2)、0.05 mM EDTA）中で洗浄した。次いで、スライドを５つの容器中に、別々の「ブロッキング」手順のために分割した。各々の容器は、以下の化学的薬剤の１つでブロックしたスライドを含んだ：無水プロピオン酸、無水酪酸、無水ジフルオロフタル酸または無水コハク酸。スライドを無水プロピオン酸、無水酪酸、無水ジフルオロフタル酸、または無水コハク酸のいずれかでブロックするために、それぞれの化合物を25 mlのm-ピロール中に１モル濃度の最終濃度に溶解した。次いで、等容量の0.1 Mホウ酸ナトリウム（pH 8.5）を添加した。溶液を十分混合し、次いでスライドに添加した。穏やかに混合しながらのインキュベーションは、10分間であった。次いで、スライド２回、100％m-ピロールで、次いで５回、0.01 M Tris、および0.005 EDTA で洗浄した。第５の容器中のスライドを５×デンハルト溶液でブロックした。これを、10 mlのデンハルト溶液の50×ストック（５ｇFicoll（タイプ400，Pharma cia）、５ｇポリビニルピロリドン、５ｇウシ血清アルブミン（Fraction 5，Sig ma）および総容量500 mlまでの水）を90 mlの水に入れ、そしてフラグメント化した１本鎖ニシン精子DNAを100μg/mlの最終濃度に添加することにより調製した。溶液を十分に混合し、次いでスライドに添加した。インキュベーションは、30 分間穏やかに混合することによった。次いで、スライドを５回、0.01 M Tris(pH )、および0.005 EDTAで洗浄した。ビオチン化オリゴヌクレオチド（DMO 469（GTTTAACATACTTTCATTT））を1000μ lの迅速ハイブリダイゼーション溶液（Rapid-Hyb，Amersham，Arlington Height s，IL）中10 ng/mlの最終濃度に添加した。ハイブリダイゼーションを42℃で60 分間実施した。次いで、スライドを４回、１×SSC/0.1％SDSで１洗浄当たり１分間リンスした。次いで、スライドを２回、洗浄溶液（Wash Solution）（0.01 M Tris(pH 7.2)、0.1 M NaCl、0.005 M EDTA、0.1％Sarkosyl）で洗浄した。ストレプトアビジン／HRP結合体（Vector，Burlingame，CA）を洗浄溶液で希釈（１：2,000）した。次いで、溶液を各組のスライドに１時間室温で振とうしながら適用した。次いで、スライドを４回、洗浄溶液でリンスし、１回、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で５分間リンスした。HRP基質を、25 mgの4-メトキシ- ナフトールを7.5 mlのMeOH中に入れ、これを次に33μlの30％過酸化水素を含有する42.5 mlのPBSに添加することにより調製した。反応を15分間室温で実施した。次いで、スライドを５回、水でリンスし、そして乾燥させた。結果は、デンハルト試薬でブロックしたスライドに比較して、無水物の１つで処理したスライド上における、有意により低いレベルの「バックグラウンド」の色度を示した。ブロッキング工程のタイプ: バックグラウンドの相対的色度（スケール1〜10）無水プロピオン酸１無水酪酸２無水ジフルオロフタル酸２無水コハク酸１デンハルト４バックグラウンドのスケールは１〜10のスケールであり、１は最も明るい強度であり、そして10は最も暗いまたは最も強いバックグラウンドである。結果は、デンハルトブロッキングに比較して、市販のスライドを化学的に任意の４タイプの無水物でブロックした場合に、バックグラウンドが実質的に減少されることを示す。無水酪酸および無水ジフルオロフタル酸は無水プロピオン酸またはコハク酸ほど有効ではないが、これらはデンハルト溶液を上回った改善である。本明細書中で言及したすべての刊行物および特許出願は、各々の刊行物および特許出願が具体的にそして個々に参考として援用される場合と同じ程度に、本明細書中で参考として援用される。上記から、本発明の具体的な実施態様を例示の目的のために本明細書において記載したが、種々の改変が本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．非特異的バックグラウンドを低減するハイブリダイゼーション固体支持体を調製する方法であって： (a)ハイブリダイゼーション用の固体支持体を、標的リガンドと、該標的リガンドを該固体支持体に固定化するに十分な条件下で接触させる工程；および (b)固定化標的リガンドを含有する該固体支持体を、化合物と、該固体支持体上の非特異的部位をブロックするに十分な条件下で反応させ、それにより固定化標的リガンドを含有するブロックされた固体支持体を生成する工程を包含する方法：ここで、該化合物は以下の式を有し：ここで、R₁からR₁₇は、独立してH、OH、CH₃、CH₂-CH₃、CH=CH-CH₃、X、CH₂X、CH X₂、CH₂-CH₂X、CH₂-CHX₂、CX₃、CX₂-CX₃、CX₂-CX₂-CX₃およびC(=O)CH₃から選択され、そして、R₁およびR₃、またはR₂およびR₄、またはR₅およびR₆は、一緒になって=CH₂であり得、そして、R₅およびR₆は一緒になって=Oであり得、そして、ここで各Xは、独立してハロゲンから選択される。２．ハイブリダイゼーション反応において、非特異的バックグラウンドを低減する方法であって、請求項１に記載の工程(a)および工程(b)を包含し、そしてさらに： (c)固定化標的リガンドを含有する前記ブロックされた固体支持体を、プローブと、該固定化標的リガンドに特異的結合するに十分な条件下で接触させる工程；および (d)該固体支持体上の該プローブの存在を検出し、それにより該標的リガンドと該プローブとの間のハイブリダイゼーションを測定する工程を包含する、方法。３．請求項１または２のいずれかに記載の方法であって、工程(b)の後に、固定化標的リガンドを含有する前記ブロックされた固体支持体と反応しなかった前記化合物のすべてを実質的に排除することを含む工程をさらに包含する、方法。４．請求項２に記載の方法であって、工程(c)と工程(d)の間に、前記固定化標的リガンドに結合しなかった前記プローブのすべてを実質的に排除することを含む工程をさらに包含する、方法。５．請求項２に記載の方法であって、工程(b)と工程(c)の間に、固定化標的リガンドを含有する前記ブロックされた固体支持体と反応しなかった前記化合物のすべてを実質的に排除することを含む工程をさらに包含し、そして工程(c)と工程( d)の間に、前記固定化標的リガンドに結合しなかった前記プローブのすべてを実質的に排除することを含む工程をさらに包含する、方法。６．前記標的リガンドが、核酸である、請求項１、２、３、４または５のいずれかに記載の方法。７．前記固体支持体が、ニトロセルロース膜、ナイロン膜またはガラス表面である、請求項６に記載の方法。８．前記標的リガンドが、タンパク質である、請求項１、２、３、４または５のいずれかに記載の方法。９．前記固体支持体が、ニトロセルロース膜またはナイロン膜である、請求項８に記載の方法。１０．前記標的リガンドが、核酸であり、そして前記プローブが、核酸またはタンパク質である、請求項２、３、４または５のいずれかに記載の方法。１１．前記固体支持体が、ニトロセルロース膜、ナイロン膜またはガラス表面である、請求項１０に記載の方法。１２．前記標的リガンドが、タンパク質であり、そして前記プローブが、タンパク質または核酸である、請求項２、３、４または５のいずれかに記載の方法。１３．前記固体支持体が、ニトロセルロース膜またはナイロン膜である、請求項１２に記載の方法。１４．前記化合物が、式Iに従い、ここで、R₁およびR₂の両方がCH=CH-CH₃、またはCH₂X、またはCX₃、またはCX₂-CX₃、またはCX₂-CX₂-CX₃であり、各Xは、独立してハロゲンから選択される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。１５．前記化合物が、式IIに従い、ここで、R₁〜R₄がHであり；または、R₁がCH₃ であり、そしてR₂〜R₄がHであり；または、R₂およびR₄がHであり、そしてR₁およびR₃が一緒になって=CH₂であり；または、R₁およびR₂がHであり、そしてR₃およびR₄がC(=O)CH₃である、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。１６．前記化合物が、式IIIに従い、ここで、R₁〜R₄がHであり；または、R₁がCH₃ であり、そしてR₂がHであり；または、R₁およびR₂がCH₃であり；または、R₁がX であり、そしてR₂がHであり；または、R₁およびR₂がXであり；各Xは、独立してハロゲンから選択される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。１７．前記化合物が、式IVに従い、ここで、R₁〜R₆がHであり；または、R₁〜R₅ がHであり、そしてR₆がCH₃であり；または、R₁およびR₃がCH₃であり、そしてR₂ 、R₄、R₅およびR₆がHであり；または、R₁〜R₄がHであり、そしてR₅およびR₆がCH₃ であり；または、R₁〜R₄がHであり、そしてR₅がCH₃であり、ならびにR₆がCH₂CH₃ であり；または、R₁〜R₆がXであり；または、R₁およびR₂がHであり、そしてR₃ およびR₄がC(=O)CH₃であり、ならびにR₅およびR₆が一緒になって=Oである、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。１８．前記化合物が、式VIに従い、ここで、R₇〜R₉がHであり、あるいは、該化合物が式VIIに従い、ここで、R₁₀〜R₁₃がHである、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。１９．前記化合物が、式VIIIに従い、ここで、R₁₄およびR₁₇がXであり、そしてR₁₅ およびR₁₆がHであり；または、R₁₄〜R₁₇がXであり；または、R₁₄がOHであり、そしてR₁₅〜R₁₇がHである、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。２０．請求項１または３のいずれかに記載の方法に従って調製された、固体支持体を含むキット。