JPH1180199A - 抗ｎｍｔモノクローナル抗体、ハイブリドーマ及びｎｍｔを検出する方法 - Google Patents
抗ｎｍｔモノクローナル抗体、ハイブリドーマ及びｎｍｔを検出する方法Info
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- JPH1180199A JPH1180199A JP9256071A JP25607197A JPH1180199A JP H1180199 A JPH1180199 A JP H1180199A JP 9256071 A JP9256071 A JP 9256071A JP 25607197 A JP25607197 A JP 25607197A JP H1180199 A JPH1180199 A JP H1180199A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規なＮ−ミリストイルトランスフェラーゼ
を特異的に認識するモノクローナル抗体を提供する。 【解決手段】 Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ分
子中の次式 Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌ
ｅｕ で示されるオリゴペプチドを特異的に認識することがで
きる抗ＮＭＴモノクローナル抗体である。該抗ＮＭＴモ
ノクローナル抗体は、８８ｋＤａ、６３ｋＤａおよび５
７ｋＤａのＮ−ミリストイルトランスフェラーゼを特異
的に認識する特徴を有する。
を特異的に認識するモノクローナル抗体を提供する。 【解決手段】 Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ分
子中の次式 Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌ
ｅｕ で示されるオリゴペプチドを特異的に認識することがで
きる抗ＮＭＴモノクローナル抗体である。該抗ＮＭＴモ
ノクローナル抗体は、８８ｋＤａ、６３ｋＤａおよび５
７ｋＤａのＮ−ミリストイルトランスフェラーゼを特異
的に認識する特徴を有する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｎ−ミリストイル
化を触媒する酵素Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ
に対する特異的なモノクローナル抗体に関する。
化を触媒する酵素Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ
に対する特異的なモノクローナル抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】例えば、エイズウィルス、及び発ガン遺
伝子産物の構成タンパク質には、Ｎ−ミリストイルトラ
ンスフェラーゼおよび該酵素によりアミノ基末端がミリ
ストイル化された蛋白質が見いだされている。Ｎ−ミリ
ストイルトランスフェラーゼが関与して生成された物質
には次のようなものが知られている。
伝子産物の構成タンパク質には、Ｎ−ミリストイルトラ
ンスフェラーゼおよび該酵素によりアミノ基末端がミリ
ストイル化された蛋白質が見いだされている。Ｎ−ミリ
ストイルトランスフェラーゼが関与して生成された物質
には次のようなものが知られている。
【０００３】例えば、アミノ基末端がＮ−ミリストイル
トランスフェラーゼによりミリストイル化された細胞由
来のタンパク質には、ｃＡＭＰ−依存性プロテインキナ
ーゼをはじめ、ホスホプロテインホスホターゼであるカ
ルシニューリンＢ、ＮＡＤＨ−シトクロームｂ5 レダク
ターゼ、ＢＣ3 Ｈ1 筋細胞系の細胞内タンパク質、ｐｐ
６０v-src （ｓｒｃ−ｇｅｎｅ遺伝子産物，チロシンキ
ナーゼ）のｐ３６Ｋ基質タンパク質、マクロファージ内
の細胞内タンパク質、インシュリンレセプター、ビンキ
ュリン等が知られている。
トランスフェラーゼによりミリストイル化された細胞由
来のタンパク質には、ｃＡＭＰ−依存性プロテインキナ
ーゼをはじめ、ホスホプロテインホスホターゼであるカ
ルシニューリンＢ、ＮＡＤＨ−シトクロームｂ5 レダク
ターゼ、ＢＣ3 Ｈ1 筋細胞系の細胞内タンパク質、ｐｐ
６０v-src （ｓｒｃ−ｇｅｎｅ遺伝子産物，チロシンキ
ナーゼ）のｐ３６Ｋ基質タンパク質、マクロファージ内
の細胞内タンパク質、インシュリンレセプター、ビンキ
ュリン等が知られている。
【０００４】次に、アミノ基末端がＮ−ミリストイルト
ランスフェラーゼによりミリストイル化されたウィルス
の構成タンパク質については、ラウシャーとモロニーの
マウス白血病ウィルスのＰｒ６５gag コアタンパク質、
ＦｅＳＶのｇａｇ−ｏｎｃタンパク質、モロニーのマウ
ス白血病ウィルスのチロシンプロテインキナーゼ、ラウ
ス肉腫ウィルス（以下ＲＳＶと言う）のｐｐ６０V-src
タンパク質〔A.M.Suhultz, et al. Science, 227, 427
(1985)]、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）ウィルス（以
下、ＨＴＬＶ−１と言う）のｐ１９gag タンパク質、後
天性免疫不全症候群（エイズ）の原因ウィルス（以下、
ＨＩＶ−１と言う）のｐ１７gag タンパク質〔S.Shoji,
et al. J.Biochem.,103,747-749(1988)] 、ポリオーマ
ウィルス及びＳＶ４０の外被タンパク質ＶＰ２、メーソ
ン−ファイザーモンキーウィルスのコアタンパク質、肝
炎Ｂ型ウィルス（以下、ＨＢＶと言う）のＳＩコアタン
パク質〔C.H.Streuli, et al. Nature (London), 326,
619(1987) 〕、ポリオウィルスのコアタンパク質ＶＰ４
等が知られている。また、ヒト癌遺伝子（ｓｒｃ−ｇｅ
ｎｅ）産物であるｐｐ６０c-src 、グアノシントリフォ
スフェート（ＧＴＰ）結合タンパク質のα−サブユニッ
トにミリストイル基が見出され、また免疫グロブリンに
もミリストイル基の結合が示唆されている。
ランスフェラーゼによりミリストイル化されたウィルス
の構成タンパク質については、ラウシャーとモロニーの
マウス白血病ウィルスのＰｒ６５gag コアタンパク質、
ＦｅＳＶのｇａｇ−ｏｎｃタンパク質、モロニーのマウ
ス白血病ウィルスのチロシンプロテインキナーゼ、ラウ
ス肉腫ウィルス（以下ＲＳＶと言う）のｐｐ６０V-src
タンパク質〔A.M.Suhultz, et al. Science, 227, 427
(1985)]、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）ウィルス（以
下、ＨＴＬＶ−１と言う）のｐ１９gag タンパク質、後
天性免疫不全症候群（エイズ）の原因ウィルス（以下、
ＨＩＶ−１と言う）のｐ１７gag タンパク質〔S.Shoji,
et al. J.Biochem.,103,747-749(1988)] 、ポリオーマ
ウィルス及びＳＶ４０の外被タンパク質ＶＰ２、メーソ
ン−ファイザーモンキーウィルスのコアタンパク質、肝
炎Ｂ型ウィルス（以下、ＨＢＶと言う）のＳＩコアタン
パク質〔C.H.Streuli, et al. Nature (London), 326,
619(1987) 〕、ポリオウィルスのコアタンパク質ＶＰ４
等が知られている。また、ヒト癌遺伝子（ｓｒｃ−ｇｅ
ｎｅ）産物であるｐｐ６０c-src 、グアノシントリフォ
スフェート（ＧＴＰ）結合タンパク質のα−サブユニッ
トにミリストイル基が見出され、また免疫グロブリンに
もミリストイル基の結合が示唆されている。
【０００５】以上のように、ミリストイル化されたタン
パク質は種々の細胞内タンパク質、ウイルス構成タンパ
ク質及び発ガン遺伝子産物等で見出されている。特に、
前記したようにウィルス構成のタンパク質にミリストイ
ル基が多く発見されていることは、ウィルスの機能にと
ってタンパク質のミリストイル化が必須であると推定さ
れている。
パク質は種々の細胞内タンパク質、ウイルス構成タンパ
ク質及び発ガン遺伝子産物等で見出されている。特に、
前記したようにウィルス構成のタンパク質にミリストイ
ル基が多く発見されていることは、ウィルスの機能にと
ってタンパク質のミリストイル化が必須であると推定さ
れている。
【０００６】このミリストイル化を行うＮ−ミリストイ
ルトランスフェラーゼを特異的に認識するモノクローナ
ル抗体を提供することは、前記各ミリストイル化合物の
形成の予知、検出等に役立ち、特にウィルス、殊にＨＩ
Ｖ−１、及び発ガン遺伝子産物に関連する分析、治療、
診断等に役立つものとして期待される。
ルトランスフェラーゼを特異的に認識するモノクローナ
ル抗体を提供することは、前記各ミリストイル化合物の
形成の予知、検出等に役立ち、特にウィルス、殊にＨＩ
Ｖ−１、及び発ガン遺伝子産物に関連する分析、治療、
診断等に役立つものとして期待される。
【０００７】従来、Ｎ−ミリストイルトランスフェラー
ゼを特異的に認識する抗体については、６３ｋＤａのＮ
−ミリストイルトランスフェラーゼを認識する抗血清
〔perimental cell research, 223, 348-356(1996)〕、
及び５７ｋＤａのＮ−ミリストイルトランスフェラーゼ
を認識するモノクローナル抗体〔J.Biol.Chem.,270,232
26-23233(1995)〕が知られている。
ゼを特異的に認識する抗体については、６３ｋＤａのＮ
−ミリストイルトランスフェラーゼを認識する抗血清
〔perimental cell research, 223, 348-356(1996)〕、
及び５７ｋＤａのＮ−ミリストイルトランスフェラーゼ
を認識するモノクローナル抗体〔J.Biol.Chem.,270,232
26-23233(1995)〕が知られている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】これまで、種々の動物
組織や培養細胞からＮ−ミリストイルトランスフェラー
ゼが、生化学的・免疫化学的に検出され、様々なイソ型
の存在が示唆されてきたが、８８ｋＤａのイソ型の発見
例は無かった。
組織や培養細胞からＮ−ミリストイルトランスフェラー
ゼが、生化学的・免疫化学的に検出され、様々なイソ型
の存在が示唆されてきたが、８８ｋＤａのイソ型の発見
例は無かった。
【０００９】そこで本発明は、生化学的分析、各種疾病
の治療、診断等に有用なＮ−ミリストイルトランスフェ
ラーゼを特異的に認識する新規なモノクローナル抗体を
提供することを目的とする。
の治療、診断等に有用なＮ−ミリストイルトランスフェ
ラーゼを特異的に認識する新規なモノクローナル抗体を
提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者は、Ｎ−ミリス
トイル化を触媒する酵素Ｎ−ミリストイルトランスフェ
ラーゼ（略語：ＮＭＴ）について８８ｋＤａの存在を見
いだした。即ち、本発明者は、８８ｋＤａのＮＭＴは癌
細胞においてよく発現していることを見いだし、８８ｋ
ＤａのＮＭＴに対するモノクローナル抗体を創製すれ
ば、癌の診断等に利用できる可能性があり、有用である
ことに着目した。さらに、本発明者は、ＨＩＶ−１感染
細胞において、８８ｋＤａのＮＭＴの発現が著しく減少
していることを見出し、８８ｋＤａのＮＭＴに対するモ
ノクローナル抗体を創製すれば、ＨＩＶ−１感染の診断
等に利用できる可能性があり、有用であることに着目し
た。
トイル化を触媒する酵素Ｎ−ミリストイルトランスフェ
ラーゼ（略語：ＮＭＴ）について８８ｋＤａの存在を見
いだした。即ち、本発明者は、８８ｋＤａのＮＭＴは癌
細胞においてよく発現していることを見いだし、８８ｋ
ＤａのＮＭＴに対するモノクローナル抗体を創製すれ
ば、癌の診断等に利用できる可能性があり、有用である
ことに着目した。さらに、本発明者は、ＨＩＶ−１感染
細胞において、８８ｋＤａのＮＭＴの発現が著しく減少
していることを見出し、８８ｋＤａのＮＭＴに対するモ
ノクローナル抗体を創製すれば、ＨＩＶ−１感染の診断
等に利用できる可能性があり、有用であることに着目し
た。
【００１１】本発明者は、ヒトＮＭＴに対する特異的な
モノクローナル抗体を調製するために、抗原としてのヒ
トＮＭＴのアミノ酸配列をもとにＣｈｏｕ−Ｆａｕｓｍ
ａｎ法によりその二次構造を推定し、抗原として適当と
考えられるアミノ酸配列を次のように決定した。
モノクローナル抗体を調製するために、抗原としてのヒ
トＮＭＴのアミノ酸配列をもとにＣｈｏｕ−Ｆａｕｓｍ
ａｎ法によりその二次構造を推定し、抗原として適当と
考えられるアミノ酸配列を次のように決定した。
【００１２】本発明者は、ヒトＮＭＴのアミノ末端より
３８８−３９４残基に位置し、α−ヘリックス構造およ
びβ−シート構造のつなぎ目で折れ曲がった構造をとっ
ていると推測されている箇所のオリゴペプチドに着目
し、また生物種間でよく保存されている次式（１）（配
列番号１） Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ … 式（１） で表されるオリゴペプチドを抗原として使用して本発明
を完成させた。
３８８−３９４残基に位置し、α−ヘリックス構造およ
びβ−シート構造のつなぎ目で折れ曲がった構造をとっ
ていると推測されている箇所のオリゴペプチドに着目
し、また生物種間でよく保存されている次式（１）（配
列番号１） Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ … 式（１） で表されるオリゴペプチドを抗原として使用して本発明
を完成させた。
【００１３】即ち、本発明の抗ＮＭＴモノクローナル抗
体は、Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ分子中の前
記式（１）で示されるオリゴペプチドを特異的に認識す
ることができる抗ＮＭＴモノクローナル抗体であること
を特徴とする。
体は、Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ分子中の前
記式（１）で示されるオリゴペプチドを特異的に認識す
ることができる抗ＮＭＴモノクローナル抗体であること
を特徴とする。
【００１４】また本発明の抗ＮＭＴモノクローナル抗体
は、８８ｋＤａ、６３ｋＤａおよび５７ｋＤａのＮ−ミ
リストイルトランスフェラーゼを特異的に認識すること
ができることを特徴とする。
は、８８ｋＤａ、６３ｋＤａおよび５７ｋＤａのＮ−ミ
リストイルトランスフェラーゼを特異的に認識すること
ができることを特徴とする。
【００１５】本発明のハイブリドーマは、Ｎ−ミリスト
イルトランスフェラーゼ中のＧｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−
Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ分子を特異的に認識す
ることができ、或いは８８ｋＤａ、６３ｋＤａおよび５
７ｋＤａのＮ−ミリストイルトランスフェラーゼを特異
的に認識することができるモノクローナル抗体生産能力
を有するハイブリドーマである。
イルトランスフェラーゼ中のＧｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−
Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ分子を特異的に認識す
ることができ、或いは８８ｋＤａ、６３ｋＤａおよび５
７ｋＤａのＮ−ミリストイルトランスフェラーゼを特異
的に認識することができるモノクローナル抗体生産能力
を有するハイブリドーマである。
【００１６】本発明の免疫学的にＮ−ミリストイルトラ
ンスフェラーゼを検出する方法は、８８ｋＤａ、６３ｋ
Ｄａまたは５７ｋＤａのＮ−ミリストイルトランスフェ
ラーゼを含むと疑われるヒトまたは動物の組織、体液、
細胞またはセルラインを含む試料に対して、前記モノク
ローナル抗体を接触させて、８８ｋＤａ、６３ｋＤａま
たは５７ｋＤａのＮ−ミリストイルトランスフェラーゼ
を検出することを特徴とする。
ンスフェラーゼを検出する方法は、８８ｋＤａ、６３ｋ
Ｄａまたは５７ｋＤａのＮ−ミリストイルトランスフェ
ラーゼを含むと疑われるヒトまたは動物の組織、体液、
細胞またはセルラインを含む試料に対して、前記モノク
ローナル抗体を接触させて、８８ｋＤａ、６３ｋＤａま
たは５７ｋＤａのＮ−ミリストイルトランスフェラーゼ
を検出することを特徴とする。
【００１７】本発明で適用可能な免疫化学的な検出方法
には、例えば、凝集反応法、凝集阻止法、免疫拡散法、
免疫比漏法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、競合反応
法（固相法、第二抗体法等）、サンドイッチ法、イムノ
メトリック法、リポソームイムノライシスアッセイ（Ｌ
ＩＬＡ）等があり、また標識物質を用いる検出方法に
は、ラジムオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、エンザイムイ
ムノアッセイ（ＥＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩ
Ａ）、化学発光イムノアッセイ、金属イムノアッセイ、
スピンイムノアッセイ等が挙げられる。
には、例えば、凝集反応法、凝集阻止法、免疫拡散法、
免疫比漏法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、競合反応
法（固相法、第二抗体法等）、サンドイッチ法、イムノ
メトリック法、リポソームイムノライシスアッセイ（Ｌ
ＩＬＡ）等があり、また標識物質を用いる検出方法に
は、ラジムオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、エンザイムイ
ムノアッセイ（ＥＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩ
Ａ）、化学発光イムノアッセイ、金属イムノアッセイ、
スピンイムノアッセイ等が挙げられる。
【００１８】
〔実施例１〕ハイブリドーマの確立 ： 次式（１） Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ … 式（１） で表されるオリゴペプチドをポリＬ−リジンによる枝分
かれ構造の先端に抗原ペプチドを連結させ、次式（２） Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ポリＬ−リジン （８） … 式（２） で表されるマルチプル抗原ペプチド（８）〔略語：ＭＡ
Ｐ（８）〕として免疫原性を高めた。本実施例１で使用
したマルチプル抗原ペプチド（８）の構造は、アミノ酸
を１文字標記法によって表した図１の化学構造式によっ
て示される。該マルチプル抗原ペプチド（８）を固相に
結合して免疫抗原とした。マウス一匹当たり該免疫抗原
の２００μｇを１週間毎に４回腹腔投与し、次いで３週
間後にマウス一匹当たり該免疫抗原の４０μｇを静脈注
射し、その３日後にマウスを舎血致死させ、脾細胞を得
た。
かれ構造の先端に抗原ペプチドを連結させ、次式（２） Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ポリＬ−リジン （８） … 式（２） で表されるマルチプル抗原ペプチド（８）〔略語：ＭＡ
Ｐ（８）〕として免疫原性を高めた。本実施例１で使用
したマルチプル抗原ペプチド（８）の構造は、アミノ酸
を１文字標記法によって表した図１の化学構造式によっ
て示される。該マルチプル抗原ペプチド（８）を固相に
結合して免疫抗原とした。マウス一匹当たり該免疫抗原
の２００μｇを１週間毎に４回腹腔投与し、次いで３週
間後にマウス一匹当たり該免疫抗原の４０μｇを静脈注
射し、その３日後にマウスを舎血致死させ、脾細胞を得
た。
【００１９】常法に従い、ポリエチレングリコールを用
いてＰ３Ｕ１と細胞融合させ、ＨＡＴ培地によりハイブ
リドーマの選別を行った。抗体産生ハイブリドーマは、
マルチ−ピン法により合成した抗原ペプチドを用い、マ
ルチ−ピン−酵素結合免疫吸着アッセイ法（Ｍｕｌｔｉ
−Ｐｉｎ−ＥＬＩＳＡ法）により２回スクリーニング
後、限界希釈法により抗ＮＭＴモノクローナル抗体産生
ハイブリドーマを確立した。
いてＰ３Ｕ１と細胞融合させ、ＨＡＴ培地によりハイブ
リドーマの選別を行った。抗体産生ハイブリドーマは、
マルチ−ピン法により合成した抗原ペプチドを用い、マ
ルチ−ピン−酵素結合免疫吸着アッセイ法（Ｍｕｌｔｉ
−Ｐｉｎ−ＥＬＩＳＡ法）により２回スクリーニング
後、限界希釈法により抗ＮＭＴモノクローナル抗体産生
ハイブリドーマを確立した。
【００２０】このハイブリドーマは、平成９年８月８日
から工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１６３７７として寄託されている。
から工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１６３７７として寄託されている。
【００２１】〔実施例２〕抗ＮＭＴモノクローナル抗体の精製 ：抗ＮＭＴモノクロ
ーナル抗体の大量調製及び精製は常法に従い行った。成
熟Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔に５００μｌ／マウスの用
量でプリスタン２，６，１０，１４−テトラメチルペン
タデカンを投与し、７〜１０日後にハイブリドーマの移
植を行った。単クローン抗体産生ハイブリドーマは、
１．０×１０7 ｃｅｌｌ／２００μｌ／マウスになるよ
うにＨＢＳＳ緩衝液に細胞を懸濁したものをマウス腹腔
に移植した。１０〜１４日後にハイブリドーマの増殖に
より、肥大したマウスの腹部を切開し、腹水を回収し
た。回収した腹水は、遠沈により細胞と血清に分離後、
血清のみを回収し、５０％飽和になるように飽和硫安を
添加し、４℃に放置後、遠沈によりグロブリン画分を得
た。これを適量のＰＢＳ（−）に溶解し、ＰＢＳ（−）
に対して透析を行った後、部分精製抗体とした。透析
後、プロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂカラムを用
いてさらに精製を行い、得られたＩｇＧ画分をＰＢＳ
（−）に対して透析を行うことにより精製抗体とした。
ーナル抗体の大量調製及び精製は常法に従い行った。成
熟Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔に５００μｌ／マウスの用
量でプリスタン２，６，１０，１４−テトラメチルペン
タデカンを投与し、７〜１０日後にハイブリドーマの移
植を行った。単クローン抗体産生ハイブリドーマは、
１．０×１０7 ｃｅｌｌ／２００μｌ／マウスになるよ
うにＨＢＳＳ緩衝液に細胞を懸濁したものをマウス腹腔
に移植した。１０〜１４日後にハイブリドーマの増殖に
より、肥大したマウスの腹部を切開し、腹水を回収し
た。回収した腹水は、遠沈により細胞と血清に分離後、
血清のみを回収し、５０％飽和になるように飽和硫安を
添加し、４℃に放置後、遠沈によりグロブリン画分を得
た。これを適量のＰＢＳ（−）に溶解し、ＰＢＳ（−）
に対して透析を行った後、部分精製抗体とした。透析
後、プロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂカラムを用
いてさらに精製を行い、得られたＩｇＧ画分をＰＢＳ
（−）に対して透析を行うことにより精製抗体とした。
【００２２】〔実施例３〕競合アッセイ ：各種競合ペプチドとして、ＧＩＧＤＧＮ
Ｌ−ポリＬ−リジン、ＧＩＧＤＧ、ＧＩＧＤ、ＧＮＬ
Ｑ、ＧＤＧＮＬＱを用い、これらの各種競合ペプチドを
１６ｍｇ／ｍｌとなるように競合物質溶解緩衝液（５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2 、０．１％ポリオキシエチレン（２０）ソルビ
タンモノオレアート）に溶解したものを、同緩衝液を用
いて１倍〜５１２倍まで系列希釈した競合物質溶液５０
μｌを調製し、これにプロテインＡ−セファロースＣＬ
−４Ｂカラムにより精製した、坑ヒトＮＭＴモノクロー
ナル抗体を５０μｌ加え、３７℃、１時間のプレインキ
ュベートを行った。この混合溶液を一次抗体として、あ
らかじめ前記式（２）で示される抗原ペプチドを固相化
抗原として吸着させたＥＬＩＳＡプレートに５０μｌ加
え、ＥＬＩＳＡ法により抗体価を測定した。
Ｌ−ポリＬ−リジン、ＧＩＧＤＧ、ＧＩＧＤ、ＧＮＬ
Ｑ、ＧＤＧＮＬＱを用い、これらの各種競合ペプチドを
１６ｍｇ／ｍｌとなるように競合物質溶解緩衝液（５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2 、０．１％ポリオキシエチレン（２０）ソルビ
タンモノオレアート）に溶解したものを、同緩衝液を用
いて１倍〜５１２倍まで系列希釈した競合物質溶液５０
μｌを調製し、これにプロテインＡ−セファロースＣＬ
−４Ｂカラムにより精製した、坑ヒトＮＭＴモノクロー
ナル抗体を５０μｌ加え、３７℃、１時間のプレインキ
ュベートを行った。この混合溶液を一次抗体として、あ
らかじめ前記式（２）で示される抗原ペプチドを固相化
抗原として吸着させたＥＬＩＳＡプレートに５０μｌ加
え、ＥＬＩＳＡ法により抗体価を測定した。
【００２３】ＥＬＩＳＡ法は常法に従い、一次抗体を３
７℃、１．５時間反応後、二次抗体としてペルオキシダ
ーゼ（略語：ＰＯＤ）標識坑マウスＩｇＧを３７℃、４
５分間反応し、発色基質としてＴＭＢＺ（３，３′，
５，５′−テトラメチルベンジジン）、及び発色停止液
として０．３Ｎ Ｈ2 ＳＯ4 を用い、主波長４５０ｎ
ｍ、参照波長６３０ｎｍの吸光度を測定した。その結果
を図２の横軸に競合物質濃度、縦軸に抑制％をとったグ
ラフに示す。
７℃、１．５時間反応後、二次抗体としてペルオキシダ
ーゼ（略語：ＰＯＤ）標識坑マウスＩｇＧを３７℃、４
５分間反応し、発色基質としてＴＭＢＺ（３，３′，
５，５′−テトラメチルベンジジン）、及び発色停止液
として０．３Ｎ Ｈ2 ＳＯ4 を用い、主波長４５０ｎ
ｍ、参照波長６３０ｎｍの吸光度を測定した。その結果
を図２の横軸に競合物質濃度、縦軸に抑制％をとったグ
ラフに示す。
【００２４】前記式（２）で示されるマルチプル抗原ペ
プチドのＩＣ50（５０％阻害濃度）は３３．３ｎｍｏｌ
であった。また、その他の免疫抗原由来のオリゴペプチ
ドも、前記式（２）で示されるマルチプル抗原ペプチド
と同程度のＩＣ50を示した。以上のことから、本抗体は
前記式（１）で示されるペプチドを認識していることが
明らかである。
プチドのＩＣ50（５０％阻害濃度）は３３．３ｎｍｏｌ
であった。また、その他の免疫抗原由来のオリゴペプチ
ドも、前記式（２）で示されるマルチプル抗原ペプチド
と同程度のＩＣ50を示した。以上のことから、本抗体は
前記式（１）で示されるペプチドを認識していることが
明らかである。
【００２５】〔実施例４〕抗ＮＭＴモノクローナル抗体を用いたＮＭＴの検出 ：前
記実施例２で得られた抗ＮＭＴモノクローナル抗体を用
いて、ヒト結腸腺癌細胞（ＣＯＬＯ 320ＤＭ）、白血病
ヒトＴ細胞（ＣＥＭ）のそれぞれ細胞可溶化上清につい
て、ウエスタン・イミュノ−ブロッティング・アッセイ
を行った。対照としてＥ．ｃｏｌｉ（ＪＭ１０１）と、
該Ｅ．ｃｏｌｉで発現された組み換えヒトＮＭＴを用い
た。その結果を図３（対照）および図４（ＣＯＬＯ 320
ＤＭ；ＣＥＭ）に示す。図３および図４によれば、本発
明の抗ＮＭＴモノクローナル抗体は、ヒト結腸腺癌細胞
（ＣＯＬＯ 320ＤＭ）、白血病ヒトＴ細胞について、８
８ｋＤａ、６３ｋＤａおよび５７ｋＤａのＮ−ミリスト
イルトランスフェラーゼを特異的に認識していることが
分かる。
記実施例２で得られた抗ＮＭＴモノクローナル抗体を用
いて、ヒト結腸腺癌細胞（ＣＯＬＯ 320ＤＭ）、白血病
ヒトＴ細胞（ＣＥＭ）のそれぞれ細胞可溶化上清につい
て、ウエスタン・イミュノ−ブロッティング・アッセイ
を行った。対照としてＥ．ｃｏｌｉ（ＪＭ１０１）と、
該Ｅ．ｃｏｌｉで発現された組み換えヒトＮＭＴを用い
た。その結果を図３（対照）および図４（ＣＯＬＯ 320
ＤＭ；ＣＥＭ）に示す。図３および図４によれば、本発
明の抗ＮＭＴモノクローナル抗体は、ヒト結腸腺癌細胞
（ＣＯＬＯ 320ＤＭ）、白血病ヒトＴ細胞について、８
８ｋＤａ、６３ｋＤａおよび５７ｋＤａのＮ−ミリスト
イルトランスフェラーゼを特異的に認識していることが
分かる。
【００２６】〔実施例５〕抗ＮＭＴモノクローナル抗体を用いたＨＩＶ−１持続感
染細胞株に対する検出： 前記実施例２で得られた抗ＮＭ
Ｔモノクローナル抗体を用いて、ＨＩＶ−１が未感染
の、ヒトＴ−細胞株Ｈ９、ヒトＴ−細胞株Ｍｏｌｔ−４
及びヒトマクロファージ細胞株Ｕ９３７の３株、並びに
ＨＩＶ−１に感染された、ＨＩＶ−１持続感染ヒトＴ−
細胞株Ｈ９／ＭＮ、ＨＩＶ−１持続感染ヒトＴ−細胞株
Ｍｏｌｔ−４／IIIB及びＨＩＶ−１持続感染ヒトマクロ
ファージ細胞株Ｕ９３７／IIIBの３株のそれぞれ細胞可
溶化上清についてウエスタン・イミュノ−ブロッティン
グ・アッセイを行った。その結果を図５に示す。図５に
示すように、ＨＩＶ−１感染細胞において、８８ｋＤａ
のＮＭＴの発現が著しく減少していることが分かる。
染細胞株に対する検出： 前記実施例２で得られた抗ＮＭ
Ｔモノクローナル抗体を用いて、ＨＩＶ−１が未感染
の、ヒトＴ−細胞株Ｈ９、ヒトＴ−細胞株Ｍｏｌｔ−４
及びヒトマクロファージ細胞株Ｕ９３７の３株、並びに
ＨＩＶ−１に感染された、ＨＩＶ−１持続感染ヒトＴ−
細胞株Ｈ９／ＭＮ、ＨＩＶ−１持続感染ヒトＴ−細胞株
Ｍｏｌｔ−４／IIIB及びＨＩＶ−１持続感染ヒトマクロ
ファージ細胞株Ｕ９３７／IIIBの３株のそれぞれ細胞可
溶化上清についてウエスタン・イミュノ−ブロッティン
グ・アッセイを行った。その結果を図５に示す。図５に
示すように、ＨＩＶ−１感染細胞において、８８ｋＤａ
のＮＭＴの発現が著しく減少していることが分かる。
【００２７】
【発明の効果】本発明の抗ＮＭＴモノクローナル抗体
は、８８ｋＤａ、６３ｋＤａおよび５７ｋＤａのＮ−ミ
リストイルトランスフェラーゼを特異的に認識してお
り、且つＧｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａ
ｓｎ−Ｌｅｕからなるペプチドを含むＮ−ミリストイル
トランスフェラーゼを特異的に認識している。このこと
は、ミリストイル化合物の形成の予知、検出等に役立
ち、特にウィルス、殊にＨＩＶ−１、及び発ガン遺伝子
産物に関連する分析、治療、診断等に役立つものとして
期待される。
は、８８ｋＤａ、６３ｋＤａおよび５７ｋＤａのＮ−ミ
リストイルトランスフェラーゼを特異的に認識してお
り、且つＧｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａ
ｓｎ−Ｌｅｕからなるペプチドを含むＮ−ミリストイル
トランスフェラーゼを特異的に認識している。このこと
は、ミリストイル化合物の形成の予知、検出等に役立
ち、特にウィルス、殊にＨＩＶ−１、及び発ガン遺伝子
産物に関連する分析、治療、診断等に役立つものとして
期待される。
【００２８】
配列番号：１ 配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド
【図１】実施例１で使用したマルチプル抗原ペプチド
（８）の化学構造を、アミノ酸の１文字標記法によって
示す。
（８）の化学構造を、アミノ酸の１文字標記法によって
示す。
【図２】本発明の抗ＮＭＴモノクローナル抗体を用いた
競合アッセイを行った結果を横軸に競合物質濃度、縦軸
に抑制％をとったグラフに示す。
競合アッセイを行った結果を横軸に競合物質濃度、縦軸
に抑制％をとったグラフに示す。
【図３】本発明の抗ＮＭＴモノクローナル抗体を用い
て、ウエスタン・イミュノ−ブロッティング・アッセイ
を行ったときの、対照〔Ｅ．ｃｏｌｉ（ＪＭ１０１）〕
およびＥ．ｃｏｌｉ中で発現される組み換えヒトＮＭＴ
の電気泳動の結果を示す写真である。
て、ウエスタン・イミュノ−ブロッティング・アッセイ
を行ったときの、対照〔Ｅ．ｃｏｌｉ（ＪＭ１０１）〕
およびＥ．ｃｏｌｉ中で発現される組み換えヒトＮＭＴ
の電気泳動の結果を示す写真である。
【図４】本発明の抗ＮＭＴモノクローナル抗体を用い
て、ウエスタン・イミュノ−ブロッティング・アッセイ
を行ったときの、ヒト結腸腺癌細胞（ＣＯＬＯ 320Ｄ
Ｍ）、白血病ヒトＴ細胞（ＣＥＭ）についての電気泳動
の結果を示す写真である。
て、ウエスタン・イミュノ−ブロッティング・アッセイ
を行ったときの、ヒト結腸腺癌細胞（ＣＯＬＯ 320Ｄ
Ｍ）、白血病ヒトＴ細胞（ＣＥＭ）についての電気泳動
の結果を示す写真である。
【図５】本発明の抗ＮＭＴモノクローナル抗体を用い
て、ＨＩＶ−１が未感染の各細胞株とＨＩＶ−１に感染
された各細胞株についてウエスタン・イミュノ−ブロッ
ティング・アッセイを行った時の電気泳動の結果を示す
写真である。
て、ＨＩＶ−１が未感染の各細胞株とＨＩＶ−１に感染
された各細胞株についてウエスタン・イミュノ−ブロッ
ティング・アッセイを行った時の電気泳動の結果を示す
写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＣ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (4)
- 【請求項１】 Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ分
子中の次式、 Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌ
ｅｕ で示されるオリゴペプチドを特異的に認識することがで
きる抗ＮＭＴモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 ８８ｋＤａ、６３ｋＤａおよび５７ｋＤ
ａのＮ−ミリストイルトランスフェラーゼを特異的に認
識することができる抗ＮＭＴモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 請求項１または２記載のＮ−ミリストイ
ルトランスフェラーゼを特異的に認識することができる
抗ＮＭＴモノクローナル抗体生産能力を有するハイブリ
ドーマ。 - 【請求項４】 請求項１または２記載のＮ−ミリストイ
ルトランスフェラーゼを含むと疑われるヒトまたは動物
の組織、体液、細胞またはセルラインを含む試料に対し
て、請求項１記載の抗ＮＭＴモノクローナル抗体を接触
させることにより免疫学的に８８ｋＤａ、６３ｋＤａま
たは５７ｋＤａＮ−ミリストイルトランスフェラーゼを
検出する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9256071A JPH1180199A (ja) | 1997-09-04 | 1997-09-04 | 抗ｎｍｔモノクローナル抗体、ハイブリドーマ及びｎｍｔを検出する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9256071A JPH1180199A (ja) | 1997-09-04 | 1997-09-04 | 抗ｎｍｔモノクローナル抗体、ハイブリドーマ及びｎｍｔを検出する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1180199A true JPH1180199A (ja) | 1999-03-26 |
Family
ID=17287500
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9256071A Withdrawn JPH1180199A (ja) | 1997-09-04 | 1997-09-04 | 抗ｎｍｔモノクローナル抗体、ハイブリドーマ及びｎｍｔを検出する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1180199A (ja) |
-
1997
- 1997-09-04 JP JP9256071A patent/JPH1180199A/ja not_active Withdrawn
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20041207 |