JPH1198978A - トリペプチド高生産性ラクトバチルス・ヘルベチカス乳酸菌 - Google Patents

トリペプチド高生産性ラクトバチルス・ヘルベチカス乳酸菌

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JPH1198978A JP9277949A JP27794997A JPH1198978A JP H1198978 A JPH1198978 A JP H1198978A JP 9277949 A JP9277949 A JP 9277949A JP 27794997 A JP27794997 A JP 27794997A JP H1198978 A JPH1198978 A JP H1198978A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】ラクトトリペプチドを大量に産生しうる乳酸菌
株及び血圧降下活性及びストレス緩和作用を有する成分
を多く含み、かつ飲食に供しやすい発酵乳製品を提供す
る。 【解決手段】特定の菌学的性質を有し、無脂乳固形分を
９重量％以上含む獣乳を培地として培養した際に、培養
液中にトリペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ及び／又は
Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ換
算量で６０μｇ／ｍｌ以上生産し、且つ菌体外プロテイ
ナーゼ活性４００Ｕ／ＯＤ590以上を示すことを特徴と
するラクトバチルス・ヘルベチカスに属する乳酸菌、ラ
クトバチルス・ヘルベチカスＣＭ４株（工業技術院生命
工学工業技術研究所 寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６０
６０）、及び獣乳をこれら乳酸菌を用いて発酵させて得
た発酵乳製品。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、獣乳培地中におい
て培養することにより、強い血圧降下作用及びストレス
緩和作用を有するトリペプチドを産生することができ、
かつ菌体外プロテイナーゼ活性が高いラクトバチルス・
ヘルベチカス(Lactobacillus helveticus)に属する乳酸
菌に関する。
【０００２】
【従来の技術】ラクトバチルス・ヘルベチカスは、古く
から代表的な酪農乳製品用乳酸菌スターターとして、発
酵乳等の製造に用いられている。ラクトバチルス・ヘル
ベチカスは強い蛋白分解活性を有し、特に高い活性を有
する菌体外プロティナーゼは、獣乳の発酵性に対して重
要な働きをする。即ち、菌体外プロティナーゼは獣乳蛋
白質を分解し各種のペプチド断片を生成する。生成され
たペプチドはペプチダーゼ群の作用を受けて、さらに低
分子のペプチドになる。蛋白質分解酵素群の作用により
培地中に生成したペプチドの一部は、乳酸菌菌体内へ取
り込まれて、窒素源として利用されることが知られてい
る。一方、培地中に生成したペプチドには、血圧上昇作
用の原因物質であるアンギオテンシン変換酵素(Angiote
nsin Converting Enzyme、以下ＡＣＥと称す）に対して
阻害活性を有するものが存在することが報告されている
（J. Dairy Sci. 78:777-783(1995))。
【０００３】ＡＣＥの酵素活性を阻害し、血圧上昇を抑
制することを目的としたペプチドについては、既に乳蛋
白質、大豆蛋白質あるいは魚肉蛋白質分解物等から、多
くの有効ペプチドが報告されているが、ラクトバチルス
・ヘルベチカス発酵乳中のＡＣＥ阻害活性を有するペプ
チドは、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｒｏとＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｒｏ（以下、それぞれＶＰＰ及びＩＰＰと略す。またこ
れらを合わせてラクトトリペプチドと称す。）であるこ
と、さらにこれらラクトトリペプチドは強い血圧降下作
用を有することが自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）を用
いた実験により確認されている(J. Dairy Sci.78:1253-
1257(1995))。さらに、ラクトトリペプチドは、血圧降
下活性に加え、ストレス緩和作用を有することが示唆さ
れている。
【０００４】従って、ラクトトリペプチドについては、
天然物由来の、低毒性で安全性が高く、経口的に摂取で
きる降圧剤又はストレス緩和剤として、実用化が検討さ
れている。
【０００５】しかしながら、獣乳等を従来のラクトバチ
ルス・ヘルベチカス株により発酵させて得たラクトトリ
ペプチド含有発酵乳は、発酵の進行に従い多量に生成さ
れる乳酸に起因して高い酸度を示すため、直接飲食する
ことは困難であるという問題点がある。
【０００６】生成乳酸量に対してラクトトリペプチドを
より多く含む発酵乳を製造することができれば、各種の
飲食品へ発酵乳を少量配合することによっても、機能性
を維持したまま飲食しやすい形態の製品を簡便に製造し
消費者へ提供することが可能になる。従って、ラクトト
リペプチドをより多く産生する乳酸菌株が求められてい
る。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ラク
トトリペプチドを大量に産生しうる乳酸菌株を提供する
ことにある。
【０００８】本発明の別の目的は、血圧降下活性及びス
トレス緩和作用を有する成分を多く含み、かつ飲食に供
しやすい発酵乳製品を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、以下の
菌学的性質を有し、無脂乳固形分を９重量％以上含む獣
乳を培地として培養した際に、培養液中にトリペプチド
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ及び／又はＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｒｏを、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ換算量で６０μｇ／ｍ
ｌ以上生産し、且つ菌体外プロテイナーゼ活性４００Ｕ
／ＯＤ590以上を示すことを特徴とするラクトバチルス
・ヘルベチカスに属する乳酸菌が提供される。
【００１０】形態学的性質 １）細胞の形状；桿菌 ２）運動性；なし ３）胞子の有無；なし ４）グラム染色性；陽性生理学的性質 １）カタラーゼ；陰性 ２）インドール生成；陰性 ３）硝酸塩の還元；陰性 ４）酸素に対する態度；通性嫌気性菌 ５）グルコースによりホモ乳酸発酵によりＤ（−）乳酸
を生成し、ガスの産生はない； ６）各種炭水化物の分解性 グルコース；＋ ラクトース；＋ マンノース；＋ フラクトース；＋ ガラクトース；＋ シュークロース；− マルトース；− キシロース；− ラムノース；− セルビオース；− トレハロース；− メルビオース；− ラフィノース；− スタキオース；− マンニトール；− ソルビトール；− ユースクリン；− サリシン；− また、本発明によれば、前記ラクトバチルス・ヘルベチ
カスに属する乳酸菌であって、ラクトバチルス・ヘルベ
チカスＣＭ４株（工業技術院生命工学工業技術研究所
寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６０６０）であることを特
徴とするラクトバチルス・ヘルベチカスに属する乳酸菌
が提供される。
【００１１】さらに本発明では、前記ラクトバチルス・
ヘルベチカスに属する乳酸菌であって、その染色体ＤＮ
Ａの制限酵素ＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩによる二重分解物
が１５〜１７ｋｂの特徴的ＤＮＡ断片を含むことを特徴
とするラクトバチルス・ヘルベチカスに属する乳酸菌が
提供される。
【００１２】さらに本発明では、獣乳を、前記乳酸菌を
用いて発酵させて得た発酵乳製品が提供される。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明の乳酸菌は、ラクトバチル
ス・ヘルベチカスに属する乳酸菌であり、無脂乳固形分
を９重量％以上含む獣乳を培地として培養することによ
り、培養液中にトリペプチドＶＰＰ及び／又はＩＰＰ
を、ＶＰＰ換算量で６０μｇ／ｍｌ以上、好ましくは７
０μｇ／ｍｌ以上生産し、且つ菌体外プロテイナーゼ活
性４００Ｕ／ＯＤ590以上、好ましくは４３０Ｕ／ＯＤ
590以上を示す。ＶＰＰ及び／又はＩＰＰの生産量の上
限については、特に限定されないが、培地中の蛋白質に
含まれる全てのＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ及びＩｌｅ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｒｏの配列がトリペプチドとして切り出された
際の量が上限となる。また、菌体外プロテイナーゼ活性
の上限については、特に限定されないが、通常は８００
Ｕ／ＯＤ590である。
【００１４】前記無脂乳固形分を９重量％以上含む獣乳
としては、通常の、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ及びＩｌｅ
−Ｐｒｏ−Ｐｒｏの配列を含む蛋白質を含む獣乳を挙げ
ることができる。
【００１５】また、前記培養の方法としては、前記獣乳
に乳酸菌を接種後、３７℃で２４時間培養する方法を挙
げることができる。
【００１６】本発明の乳酸菌の一例として、ラクトバチ
ルス・ヘルベチカスＣＭ４株が工業技術院生命工学工業
技術研究所 寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６０６０とし
て寄託されている。ラクトバチルス・ヘルベチカスＣＭ
４株は、以下に示す菌学的性質を有する。
【００１７】菌学的性質： １．形態学的性質 １）細胞の形状；桿菌 ２）運動性；なし ３）胞子の有無；なし ４）グラム染色性；陽性 ２．生理学的性質 １）カタラーゼ；陰性 ２）インドール生成；陰性 ３）硝酸塩の還元；陰性 ４）酸素に対する態度；通性嫌気性菌 ５）グルコースによりホモ乳酸発酵によりＤ（−）乳酸
を生成し、ガスの産生はない。
【００１８】６）各種炭水化物の分解性 グルコース；＋ ラクトース；＋ マンノース；＋ フラクトース；＋ ガラクトース；＋ シュークロース；− マルトース；− キシロース；− ラムノース；− セルビオース；− トレハロース；− メルビオース；− ラフィノース；− スタキオース；− マンニトール；− ソルビトール；− ユースクリン；− サリシン；− 以上の菌学的性質を光岡らの方法（臨床検査１８、１１
６３（１９７４））により同定すると公知株ラクトバチ
ルス・ヘルベチカスＮＣＤＯ−０９９と同一である。但
し、光岡らの方法に記載されていない下記の性質につい
ては明らかにＮＣＤＯ−０９９とは異なっている。
【００１９】７）低温殺菌乳での発酵性；９５℃、５分
間殺菌後の９重量％脱脂乳を用いて３７℃、２４時間発
酵した場合の乳酸酸度２．０重量％以上を示す発酵性 ８）菌体外プロティナーゼ活性；４００Ｕ／ＯＤ590以
上の活性 ９）ラクトトリペプチド生産性；９重量％脱脂乳を用い
３７℃で２４時間培養した発酵液中に２種のトリペプチ
ド（ＶＰＰ及び／又はＩＰＰ）を、ＶＰＰ換算量で６０
μｇ／ｍｌ以上含有 なお、前記菌体外プロティナーゼ活性は、Twiningらの
方法(Twining,S. Anal.Biochem. 143 3410（1984）)を
もとにしたYamamotoらの方法(Yamamoto,N.ら J.Bioche
m.(1993)114,740)に従った反応条件において、１％の蛍
光強度を生じる酵素量を１Ｕ／ＯＤ590とした場合の値
である。
【００２０】また、ラクトトリペプチド生産性は、９重
量％脱脂乳培地で３７℃、２４時間培養した発酵乳を１
ｍｌとり、そのまま１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心
分離して得た上清中のＶＰＰ及びＩＰＰ量を測定し、Ｖ
ＰＰ量に換算した値である。前記換算は、ＩＰＰの重量
当りのＡＣＥ阻害活性はＶＰＰの１．７倍であることか
ら、以下の式によりＶＰＰ換算量を求める。
【００２１】ラクトトリペプチド換算量（ＶＰＰ換算μ
ｇ／ｍｌ）＝ＩＰＰ量（μｇ／ｍｌ）×１．７＋ＶＰＰ
量（μｇ／ｍｌ） 本発明の乳酸菌株は、例えば以下に示すスクリーニング
方法により得ることができる。
【００２２】（１）一次スクリーニング （ＡＣＥ阻害活性の高い発酵乳の選択）９重量％脱脂乳
培地を用いてスクリーニング株を３７℃、２４時間培養
する。培養終了後に乳酸菌数、乳酸酸度、ＡＣＥ阻害活
性を測定する。乳酸菌数１×１０8個／ｍｌ以上、乳酸
酸度１．６重量％以上、ＡＣＥ阻害活性４０ユニット／
ｍｌ以上の菌株を選択する。なお、ＡＣＥ阻害活性は、
CushmanとCheungの方法(Cushman,D.W. and Cheung,H.S.
Pharmacol., 20 1637(1971))に基づいて測定する。
【００２３】（２）二次スクリーニング （ラクトトリペプチド高生産性株の選択）一次スクリー
ニングにより選択された菌株の培養液を遠心分離機にて
１５，０００ｒｐｍ、１０分間処理後の上清を用いて、
ＨＰＬＣによりラクトトリペプチドの定量分析を行う。
ラクトトリペプチド含量（ＶＰＰ換算量）３０μｇ／ｍ
ｌ以上の菌株を選択する。
【００２４】（３）三次スクリーニング （菌体外プロティナーゼ高活性株の選択）二次スクリー
ニングにより選択された菌株を９重量％脱脂乳培地中で
ｐＨ６に維持しながら培養して、対数増殖期中期でサン
プリング後に、クエン酸ナトリウムを１重量％になるよ
うに添加し、５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を
行い菌体を回収する。次いで、５０ｍＭβ−グリセロリ
ン酸にて菌体を洗浄後に、菌体を５０ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ７．８）緩衝液に懸濁して、濁度（ＯＤ590）１
に調整し菌体表面のプロティナーゼ活性を測定する。測
定結果は、二次スクリーニングにおいて選択されるラク
トトリペプチド高生産株と相関することが確認できる。
【００２５】以上のスクリーニング方法により選択され
たラクトバチルス・ヘルベチカスに属する乳酸菌株と他
の乳酸菌株との識別は、前記ラクトトリペプチド生産
性、菌体外プロティナーゼ活性等から同定することがで
きる。
【００２６】また、選択されたラクトバチルス・ヘルベ
チカスに属する乳酸菌の染色体ＤＮＡの制限酵素による
分解物のＤＮＡ断片の特徴的分子量分布より、同種に属
する他の菌株とはより明確に識別することができる。具
体的には例えば、染色体ＤＮＡの制限酵素ＰｓｔＩ及び
ＥｃｏＲＩによる二重分解物が１５〜１７ｋｂの特徴的
ＤＮＡ断片を含むものを、本発明の乳酸菌として識別す
ることができる。
【００２７】前記１５〜１７ｋｂの特徴的ＤＮＡ断片
は、具体的には、染色体ＤＮＡをLeenhoutsらの方法(Le
enhouts,K.(1990) Appl.Environ.Microbiol. 56:2726)
で抽出し、ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩによる切断を行い０．
８％のアガロースゲル電気泳動し、その泳動パターンの
分析を行うことにより確認することができる。その際、
ＤＮＡのサイズマーカーとして、λファージＤＮＡの制
限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ分解物等を平行して泳動すること
により、明確にその存在を確認することができる。
【００２８】本発明の発酵乳製品は、培地を、前記乳酸
菌を用いて発酵させて得たものである。
【００２９】本発明の発酵乳製品を得るための前記培地
としては、牛乳、山羊乳、馬乳又はこれらの脱脂乳等の
乳培地等を挙げることができる。
【００３０】前記発酵の条件としては、発酵温度は２５
−５０℃、さらに好ましくは３０−４５℃とすることが
でき、発酵時間は６−３０時間、さらに好ましくは１０
−２４時間とすることができる。また、前記発酵は、好
ましくは、乳製品中のラクトトリペプチド量がＶＰＰ換
算量で６０μｇ／ｍｌ以上となるよう行うことが好まし
い。具体的には例えば培地として牛乳を使用した場合、
２５−４０℃で１２−４８時間発酵させることにより、
ラクトトリペプチド量をＶＰＰ換算量で７０μｇ／ｍｌ
以上含有する発酵乳製品を得ることができる。
【００３１】前記発酵により得られた本発明の発酵乳製
品は、そのまま製品とすることができるが、必要に応じ
約５℃に冷却し保存した後、他の成分との配合などを行
い、チルド商品等の製品とすることもできる。また、加
熱殺菌処理等を行い、さらに必要に応じて噴霧乾燥等に
より粉末化して常温流通商品とすることもできる。
【００３２】本発明の発酵乳製品は、ヨーグルト、乳性
乳酸菌飲料、チーズ、酸乳配合の加工食品、健康食品、
粉末、顆粒状食品、錠剤等の形態として製品にすること
ができる。
【００３３】本発明の発酵乳製品は、高い濃度のラクト
トリペプチドを含むので、ヒトに摂取された場合、血圧
降下作用、抗ストレス作用等を発現することができる。
例えば、血圧が高いヒトの場合、日常の食生活において
本発明の発酵乳製品を１００ｍｌ程度摂取することによ
り、健康を図ることができる。また、ストレスが多いヒ
トの場合にも、同様の摂取量により、効果を発揮させる
ことができる。
【００３４】
【発明の効果】本発明の乳酸菌は、獣乳を培地として培
養することによりラクトトリペプチドを大量に産生する
ことができるので、血圧降下活性及びストレス緩和作用
を有する成分を多く含み、かつ飲食に供しやすい発酵乳
製品を生産することができる。
【００３５】また、本発明の発酵乳製品は、ラクトトリ
ペプチドを多く含有するので、血圧降下作用、抗ストレ
ス作用を有する食品として、機能性食品、健康食品、特
定保健用食品、高齢者用の特別用途食品又はこれらの材
料等に用いることができる。
【００３６】
【実施例】以下実施例によりさらに詳細に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３７】なお、実施例中のラクトバチルス・ヘルベ
ティカス株のうち、ＣＭ４株は工業技術院生命工学工業
技術研究所 寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６０６０とし
て寄託されており、ＡＴＣＣ１５００９、ＮＣＤＯ−０
９９、ＪＣＭ１００６、ＡＴＣＣ１０７９７、ＪＣＭ１
０６２、ＪＣＭ１１０３、ＪＣＭ１１２０及びＪＣＭ１
００４は公知株である。実施例中のこれ以外の株は、出
願人が保有する菌株コレクションより選択されたもので
ある。
【００３８】
【実施例１】（ＡＣＥ阻害活性の高い発酵乳を与える菌
株の選択）各種酪農製品から分離されたラクトバチルス
・ヘルベティカス３６株について、その発酵乳のＡＣＥ
阻害活性を以下の方法で調べた。各ラクトバチルス・ヘ
ルベチカス株を９重量％脱脂粉乳培地で３７℃、２４時
間培養し、新しい同培地に３重量％添加し、さらに３７
℃、２４時間培養した。発酵終了後、乳酸酸度（重量
％）、ホエー内のペプチド量（ｍｇ／ｍｌ）、菌数及び
ＡＣＥ阻害活性（Ｕ／ｍｌ）を測定した。結果を表１に
示す。３６株中７株については発酵性が極めて弱かっ
た。乳酸酸度生成量が１．６重量％以上のものは１５株
であり、さらにそのなかで発酵乳内ホエーのＡＣＥ阻害
活性が４０Ｕ／ｍｌ以上のもの８株を選択した。
【００３９】（発酵乳内ＡＣＥ阻害活性の測定法）ＡＣ
Ｅ阻害活性の測定は、CushmanとCheungの方法(Cushman,
D.W. and Cheung,H.S. Pharmacol., 20 1637(1971))に
基づいて行った。即ち、各種発酵乳を１５，０００ｒｐ
ｍ、５分間の遠心により上清（ホエー）を調製した。そ
のホエーを、測定可能な倍率に適宜希釈した後、その８
０μｌを試験管に移し、次に基質として０．１Ｍホウ酸
緩衝液（０．３Ｍ ＮａＣｌを含む、ｐＨ７．３）で５
ｍＭに調製したヒプリル・ヒスチジン・ロイシン(Hip-H
is-Leu、シグマ社製）０．２ｍｌを加えて、さらに酵素
溶液（０．１Ｕ／ｍｌ、シグマ社製）２０μｌを添加し
て３７℃で３０分間反応させた。その後、１Ｎ塩酸を２
５０μｌ加えて反応を停止させた後、１．７ｍｌの酢酸
エチルを加えて約２０秒間撹拌した。次いで３，０００
ｒｐｍで１０分間遠心分離し、酢酸エチル層（上層）
１．４ｍｌを回収し、１２０℃で４０分間加熱し、溶媒
を除去した。溶媒除去後、蒸留水１ｍｌを加えて、約２
０秒間撹拌し抽出されたヒプリル酸の２２８ｎｍにおけ
る吸収の値を測定した。酵素活性ユニットはＡＣＥ活性
の５０％阻害を与える量を１ユニットとして、下記式に
より算出した。
【００４０】酵素量（ユニット）＝（（Ａ−Ｂ）／（Ａ
−Ｃ））×１００×１／５０ Ａ：試料を含まない場合の２２８ｎｍの吸光度 Ｂ：試料を添加した場合の２２８ｎｍの吸光度 Ｃ：酵素及び試料を添加しない場合の２２８ｎｍの吸光
度 （発酵乳内ペプチド量の定量法）ペプチドの定量はＯＰ
Ａ法（Charch,F.C.らJ.Dairy.Sci.66 1219(1883))によ
り行った。検量線の作成には、標準物質として、カゼイ
ンのトリプシン分解物を用いた。
【００４１】
【表１】
【００４２】（ラクトトリペプチド生産性の高い菌株の
選択）続いて、上記ＡＣＥ阻害活性の高い発酵乳使用菌
株８株について、発酵乳内のＶＰＰ及びＩＰＰを測定し
た。
【００４３】発酵乳１ｍｌを、そのまま１５，０００ｒ
ｐｍで１０分間遠心分離し、その上清即ちホエーを回収
した。このホエー０．３ｍｌをSep-Pak Cartridge（ウ
ォーターズ社製）に吸着させ、蒸留水で洗浄した。メタ
ノール５ｍｌで溶出し、遠心処理下で減圧、乾燥させ
た。乾燥物を０．３ｍｌの０．０５％トリフルオロ酢酸
の水溶液に溶解し、以下の条件でＨＰＬＣ分析した。
【００４４】使用機種：日立Ｌ４０００ＵＶディテクタ
ー（２１５ｎｍで検出）Ｌ６２００インテリジェントポ
ンプＬ５０３０カラムオーヴン（３５℃）分離条件：流
速０．５ｍｌ／分溶離液：０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０
５％トリフルオロ酢酸の水溶液カラム：Asahipak GS320
(Φ3.9×600mm)結果を表２に示す。
【００４５】また、ＩＰＰの重量当りのＡＣＥ阻害活性
はＶＰＰの１．７倍であることから、ＩＰＰ量及びＶＰ
Ｐ量からラクトトリペプチドを以下の式によりＶＰＰ換
算量として求めた。結果を表２に示す。
【００４６】ラクトトリペプチド換算量（ＶＰＰ換算μ
ｇ／ｍｌ）＝ＩＰＰ量（μｇ／ｍｌ）×１．７＋ＶＰＰ
量（μｇ／ｍｌ）
【００４７】
【表２】
【００４８】ラクトトリペプチドのＶＰＰ換算量は、Ｃ
Ｍ４株発酵乳のもので最も高く、７８．５μｇ／ｍｌホ
エーであった。それ以外の７株の平均値は３４．２μｇ
／ｍｌホエーであった。
【００４９】（乳内増殖性の比較）上記ラクトバチルス
・ヘルベチカス株の内の分離株１８、分離株２０、分離
株２３、分離株２４、分離株２５、分離株２６、ＪＣＭ
１００６及びＣＭ４、並びに公知株のＪＣＭ１１２０及
びＪＣＭ１００４の計１０株を用いてＣＭ４株の乳内で
の発酵性（増殖性）を評価した。すなわち、９重量％脱
脂粉乳培地で３７℃、２４時間培養したものを、１１５
℃で１５分間、又は９５℃で５分間殺菌した新しい同培
地に３％植菌後、３７℃で２４時間発酵させた。培養終
了後、乳酸酸度を滴定し発酵性を評価した。その結果、
試験された株のうち、９５℃殺菌乳の発酵性が１１５℃
殺菌乳のものより高いものは分離株２５、分離株２６と
ＣＭ４株であった。またさらに９５℃殺菌乳での最終酸
度が２．０重量％以上のものはＣＭ４株発酵乳のみであ
った。
【００５０】（菌体外プロティナーゼ活性の測定）表１
に示した発酵性についての試験結果が比較的良好であっ
た株１６株の菌体外プロティナーゼを、Twiningらの方
法(Twining,S. Anal.Biochem. 143 3410（1984）)をも
とにしたYamamotoらの方法(Yamamoto,N.ら J.Biochem.
(1993)114,740)に従って行った。即ち、各種菌株を９重
量％脱脂粉乳中でｐＨを６．０に維持して培養し、対数
増殖期の中期で集菌した。クエン酸ナトリウムを終濃度
１％になるように添加し、乳培地を透明化し、５，００
０ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い菌体を回収した。
次に、５０ｍＭβ−グリセロリン酸により菌体を洗浄
後、菌体を５０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ７．８の緩衝液に
懸濁し濁度（ＯＤ590即ち５９０ｎｍの吸収で測定）を
１に合わせた。０．４％のフルオレセイン−カゼイン
（シグマ社製）２０μｌに菌体懸濁液３０μｌを加え４
２℃で１時間インキュベートし、５％トリクロロ酢酸を
１２０μｌ加え室温にて約２０分間放置し、１５，００
０回転で１０分間の遠心分離を行った。上清６０μｌを
３ｍｌの５００ｍＭトリス塩酸ｐＨ８．３に加え、蛍光
強度を測定した。蛍光強度は励起波長４９０ｎｍで生じ
る５２５ｎｍの蛍光を測定した。活性は上記反応条件
で、１％の蛍光強度を生じる酵素量を１ユニットと定義
し、それぞれの菌体外プロティナーゼのユニット数を求
めた。結果を表３に示す。
【００５１】
【表３】
【００５２】ラクトバチルス・ヘルベチカスＣＭ４株の
活性が最も高く４５０Ｕ／ＯＤ590であった。一方、そ
の他の１６株の活性平均値は１４１Ｕ／ＯＤ590とＣＭ
４株に比べ約３分の１程度であった。
【００５３】
【実施例２】実施例１で選択したラクトバチルス・ヘル
ベチカス３６株の中から選択した１１株について、染色
体ＤＮＡをLeenhoutsらの方法(Leenhouts,K.(1990) App
l.Environ.Microbiol. 56:2726)で抽出し、いくつかの
制限酵素による切断を行い０．８％のアガロースゲル電
気泳動し、その泳動パターンの分析を行った。
【００５４】その結果、ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩとによる
二重分解物についてＣＭ４株の染色体について特徴的Ｄ
ＮＡ断片が認められた（図１中矢印１）。ＣＭ４以外の
菌株の染色体にはこの断片は認められず、ほとんどの株
でそれより短い断片が認められた（図１中矢印２）。こ
こでＤＮＡのサイズマーカーとしてλファージＤＮＡの
制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ分解物（移動度の低いものから
２３．１ｋｂ、９．４ｋｂ、６．６ｋｂ、４．４ｋｂ、
２．３ｋｂ及び２．０ｋｂ）を同時に電気泳動し、特徴
的断片の分子量を測定したところ約１６ｋｂであった。
従って、ＣＭ４株はその染色体のＥｃｏＲＩとＰｓｔＩ
による二重分解物として、分子量約１６ｋｂの特徴的な
断片を有することが確認された。また、他の株における
ＣＭ４株の前記特徴的断片より短い断片の分子量は、約
１３ｋｂであった。
【００５５】
【実施例３】実施例１で選択されたラクトバチルス・ヘ
ルベチカスＣＭ４株を用いて発酵乳の製造を行った。Ｃ
Ｍ４株を９重量％脱脂乳１００ｇを用いて３７℃、１２
時間培養したものを、新しい同培地３ｋｇに接種し、３
７℃、１２時間培養した。培養終了した発酵乳全量をス
ターターとして用い、９重量％脱脂乳１００ｋｇを３２
℃、２０時間発酵させた。発酵終了時の発酵乳中には、
ラクトトリペプチドが７４．８μｇ／ｍｌ含まれてい
た。
【００５６】得られた発酵乳４３ｋｇにグラニュウ糖４
ｋｇ、水３ｋｇ、ハイメトキシペクチン０．１５ｋｇを
加えた後に均質化して、ドリンクヨーグルト５０ｋｇを
得た。このドリンクヨーグルトはマイルドな好ましい風
味を有し、ｐＨ３．６で、ＣＭ４の生菌数は４．６×１
０8個／ｇであった。
【００５７】
【実施例４】実施例３で得られた発酵乳２６．５ｋｇに
グラニュウ糖４５．０ｋｇ、ハイマルトース液糖４．７
ｋｇ、水１３．８ｋｇを加えて、撹拌しながら３重量％
ハイメトキシペクチン溶液１０ｋｇを加えた。得られた
混合液をラボラトリーホモゲナイザー（マントンゴーリ
ン社製、形式１５Ｍ−８ＢＡ）を用いて、処理圧力１５
０ｋｇ／ｃｍ2、処理流量２５００ｍｌ／分で均質化処
理を行った。均質化処理液にバニラ系香料を加えて８５
℃達温殺菌を行った。殺菌処理発酵乳を２００ｌ用ガラ
ス壜に熱時充填した。得られた殺菌処理発酵乳製品中の
ラクトトリペプチド量を測定したところ、殺菌前の発酵
乳配合量中に含まれるラクトトリペプチド相当量が含ま
れていた。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例２における、各種ラクトバチル
ス・ヘルベチカス株の染色体ＤＮＡの断片のアガロース
ゲル電気泳動による分析結果を示す写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 屋田 裕一 神奈川県相模原市淵野辺５丁目11番10号 カルピス株式会社基盤技術研究所内

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の菌学的性質を有し、無脂乳固形分
    を９重量％以上含む獣乳を培地として培養した際に、培
    養液中にトリペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ及び／又
    はＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
    換算量で６０μｇ／ｍｌ以上生産し、且つ菌体外プロテ
    イナーゼ活性４００Ｕ／ＯＤ590以上を示すことを特徴
    とするラクトバチルス・ヘルベチカスに属する乳酸菌： 形態学的性質 １）細胞の形状；桿菌 ２）運動性；なし ３）胞子の有無；なし ４）グラム染色性；陽性 生理学的性質 １）カタラーゼ；陰性 ２）インドール生成；陰性 ３）硝酸塩の還元；陰性 ４）酸素に対する態度；通性嫌気性菌 ５）グルコースによりホモ乳酸発酵によりＤ（−）乳酸
    を生成し、ガスの産生はない； ６）各種炭水化物の分解性 グルコース；＋ ラクトース；＋ マンノース；＋ フラクトース；＋ ガラクトース；＋ シュークロース；− マルトース；− キシロース；− ラムノース；− セルビオース；− トレハロース；− メルビオース；− ラフィノース；− スタキオース；− マンニトール；− ソルビトール；− ユースクリン；− サリシン；−。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載のラクトバチルス・ヘル
    ベチカスに属する乳酸菌であって、ラクトバチルス・ヘ
    ルベチカスＣＭ４株（工業技術院生命工学工業技術研究
    所 寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６０６０）であること
    を特徴とするラクトバチルス・ヘルベチカスに属する乳
    酸菌。
  3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載のラクトバチルス
    ・ヘルベチカスに属する乳酸菌であって、その染色体Ｄ
    ＮＡの制限酵素ＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩによる二重分解
    物が１５〜１７ｋｂの特徴的ＤＮＡ断片を含むことを特
    徴とするラクトバチルス・ヘルベチカスに属する乳酸
    菌。
  4. 【請求項４】 獣乳を、請求項１〜３のいずれか１項記
    載の乳酸菌を用いて発酵させて得た発酵乳製品。
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