JPS597694B2 - 不活化トロンビンゲルによるアンチトロンビン３の精製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はアフイニテイークロマトグラフイーにおいて、
不活化トロンビンをリガンドとして結合させた親水性ゲ
ルを用い、緩衝液と中性塩溶液及び血漿タンパク質混合
液とから成る溶離液をカラムを用いて通液させるか、あ
るいは回分法により容器内で両者を混合することにより
ゲルと接触させ、アンチトロンビン■を特異的に吸着さ
せることにより分離精製する方法に関するものである。

さらに詳しくは、トロンビンの反応中心セリン残基がデ
ヒドロアラニン残基に変換した不活化型トロンビンを基
体としたアフイニテイーゲルを用い、アンチトロンビン
■のトロンビンとの親和力を利用して分離精製する方法
に係るものである。

血液は、赤血球、白血球、血小板から成る有形成分と血
漿と呼ばれる無形成分とから成り、血漿中には１００種
類以上のタンパク質が含まれる。

これらのタンパク質は電気泳動的にアルブミン、α、β
およびγ−グロプリンおよびフィブリノーゲンに分類さ
れる。

アンチトロンビン■は、α２ −グロプリンに属する糖
タンパク質である。

血漿中に通常３０〜５ ０ ｍｇ／ｄｌの割合で含まれ
ているのみである。

しかし、トロンビンや活性型Ｘ因子等と反応し、複合体
をつくることにより、血漿凝固反応を阻害し、血管内で
の凝固反応の調節に大きな役割をはたしている。

アンチトロンビン■の分離精製法としては従来（１）硫
酸アンモニウムなどの中性塩添加、ポリエチレングリコ
ール等の水溶性高分子の添加による分別沈澱法 （２）分子の荷電を利用したイオン交換クロマトグラフ
イー法 （３）分子の大きさを利用した分子篩クロマトグラフイ
ー法 （４）分子の等電点の差を利用する電気泳動法（５）ヘ
パリンとの親和力を利用するアフイニテイーク口マトグ
ラフイー法 などが知られており、これらの方法の一つ又は幾つかを
組み合せた方法が用いられている。

これらの方法のうち、（５）のアフイニテイークロマト
グラフイー法を除《他の組み合せは爽雑タンパク質の分
離除去が難しく、何回も操作をくり返さねばならないこ
とから、回収量が少ないこと操作が繁雑であるといった
欠点がある。

一方、リガンドとの特異的な親和力により分離するアフ
イニテイークロマトグラフイー法は、アンチトロンビン
■のもつ特異的な性質を利用することから精製操作が簡
単であり爽雑物の分離がよく、活性回収率もよい利点を
もつ。

ところで、従来使用されているヘパリンを基体としたア
フイニテイーク口マトグラフイー法は、アンチトロンビ
ン■がヘパリンと結合することを利用したものであり、
他の方法に比べ、簡単で効率的である。

しかしながら、現在工業的に広く行なわれている冷エタ
ノール法による副分画からこの方法によってアンチトロ
ンビン■を精製すると収率がきわめて低い。

また、加熱処理血漿より精製した場合においても収・率
が低い。

すなわち、この方法はアンチトロンビン■のヘパリン結
合部位であるリジン残基付近の構造に依存するものであ
るので、この部分の構造が低温エタノール処理、熱処理
に対し不安定であるため効率が悪いものと推定される。

したがって、アフイニテイーク口マトグラフイーに利用
する構造としては、アンチトロンビン■中の他の構造部
位である、アルギニン反応中心残基付近の構造を利用す
ることが望ましい。

本発明者らは、前述の点に着目しこれらの欠点を改善す
べく鋭意研究の結果、アンチトロンビン■のアルギニン
反応中心を利用したアフイニテイークロマトグラフイー
により、血漿中および冷エタノール分画等の血漿タンパ
ク質混合液中に含有されるアンチトロンビン■を効率良
《、分画することが出来る方法を見出し本発明を完成し
たものである。

すなわち、本発明は、アフイニテイーク口マトグラフイ
ーにおいて従来用いられていたりガンドに代わり、不活
化トロンビンすなわち、アンチトロンビン■と反応し共
有結合性の複合体形成はしないが、親和性をもつトロン
ビンを用い、緩衝液、中性塩溶液および血漿タンパク質
からなる混合液を接触させ、アンチトロンビン■を特異
的に吸着せしめ、それを溶出することにより迅速かつ簡
便に効率よく分離精製する方法を提供するものである。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明に用いる不活化トロンビンは精製人トロンビンを
ｐＨ８．０イオン強度０．０５のトリス塩酸ＭＵＵ？で
、フエニルメタンスルホニルフルオリドと反応させ、活
性中心セリン残基とエステル結合を形成せしめ、トロン
ビン活性を失わせた。

その後ｐＨ９．０に調整し、低温に保ち、エステル結合
を解離させると共にセリン残基をデヒドロアラニン残基
に変換した。

次に、ベンズアミジンを基体とするアガロースゲルを用
い、アフイニテイーク口マトグラフイーを行い、親和性
を示す分画を採取し、アンヒドロトロンピンとして用い
たものである。

なお、本発明における精製トロンビンは、低温エタノー
ル法（ Ｅ， Ｊ ．Ｃｏｈｈ ： Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅ
ｔｙ， ６ ８ ： ４ ５ ９（１９４６））により
得られたコーンペースト■分画より、ポリエチレングリ
コール沈澱およびＢａＣ■２沈澱によりプロトロンビン
複合体を精製し、牛脳より抽出したトロンボプラスチン
により活性化し、その後に、ＤＥＡＥセファデツクス力
ラムクロマトグラフイーおよびベンズアミンセファロー
スカラムクロマトグラフイーにより精製したトロンビン
を用いた。

そして、該リガンドをアガロースに固定したゲルに血漿
タンパク質混合液を接触することにより、アンチトロン
ビン■を特異的に吸着し、それを溶出することにより分
離精製するものである。

本発明において該リガンドを結合するのに用いられる担
体ぱ通常用いられている親和性の担体から任意に選ぶこ
とができる。

架橋アガロースゲル（商品名：セファロース４Ｂ、およ
び６Ｂ）架橋デキストランゲル（商品名：セファデツク
スＧ１００、Ｇ１５０、Ｇ２００）架橋アクリルアミド
ゲル（商品名：セフアクリルＳ２００、Ｓ３００）など
を挙げることができる。

本発明において、血漿タンパク質混合液の吸着には、ｐ
Ｈ６〜８かつイオン強度０〜ＩＯの緩衝液と中性塩溶液
とからなる溶離液を用いるものである。

溶離液中の緩衝液はｐＨ ６〜８域を示す緩衝液を任意
に選ぶことができるが特にトリス緩衝液、リン酸緩衝液
が好ましく、中性塩溶液は通常用いられる中性塩溶液か
ら任意に選ぶことができるが、特にＮａＣｌ，ＫＣＩの
水溶液が好ましい。

本発明における吸着アンチトロンビン■分画の溶出液に
はｐＨ ５、０〜５．５イオン強度１〜４の緩衝液かあ
るいは、ｐＨ４．０〜５．５の基質類似物を用いるもの
である。

緩衝液はｐＨ４．０〜５．５のｐＨ域を示す緩衝液を任
意に選ぶことができるが、特に酢酸緩衝液がよく、中性
塩溶液は通常用いられる中性塩溶液から任意に選ぶこと
ができるがＮａＣｌの水溶液が好ましい。

基質類似物としては、ペンズアミジン、ニトｏベンズア
ミジン、アミノベンズアミジンを挙げることができる。

０．ＩＮＮａＯＨ を用い、ｐＨ４．０〜５．５とし
て用いるものである。

次に本発明において使用される血漿タンパク質の状態に
ついて説明する。

血漿タンパク質の一つにフイブリノーゲンがある。

血液が体外に出ると凝固するが、これはフィブリノーゲ
ンがフイブリンとなって血栓をつくることが原因となっ
ている。

したがってクロマトグラフイーにおいてもフイブリンが
折出し、担体に付着する。

この現象を防ぐため、フイブリンを除く前処理を施した
方が好ましい。

血漿を６０℃で数分間加熱し、フイブリノーゲンを除去
後、用いることができる。

血漿を低温でエタノールを用いてフイブリノーゲンを除
去すると共に沈澱、濃縮処理を行った後溶離緩衝液に溶
解して用℃・ることかできる。

血漿に水溶性高分子を共存させてフイブリノーゲンを除
去する前処理として利用することができる。

また、中性塩を共存させ、フイプリノーゲンを予め除去
後、塩強度を１．０以下になるように水で希釈し、用い
ることができる。

したがって、本発明における血漿タンパク質を含む溶液
とは、水溶液、水溶性高分子、中性塩、またはアルコー
ル類を共存する水溶液を用いるものである。

水溶性高分子とは、ポリエチレングリコール、ポリビニ
ルアルコール、ポリビニルピロリトン、ポリアクリル酸
、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルデン
プンを挙げることができる。

また、中性塩としては、ＮａＣｌ，ＫＣＩ、ＮＨ４Ｃｌ
，Ｎａ２ＳＯ４，Ｋ２ＳＯ４、（ＮＨ４）２Ｓ０４を挙
げることができる。

アルコール類としては、炭素数２〜５を有するアルコー
ルを挙げることができる。

以上、述べたように溶離液および血漿タンパク質を含む
溶液を通液あるいは混合し、不活化トロンビンゲルに吸
着させ、それを溶出液で回収しアフイニテイークロマト
グラフイーを行うものである。

本発明においてカラム法を用いる場合は不活化トロンビ
ンゲルはガラス製のカラム内に充填されたものをはじめ
処理量にみあった任意の大きさの種々のカラム内に充填
されて使用される。

該カラムはあらかじめ溶離液を通し平衡化させてお《方
が望ましい。

溶離液の流速は種々変化させることが出来るが、本発明
はアフイニテイークロマトグラフイー法を基本とするた
め、流速は０． ５ ｍｌ／ｃｒ；ｌ以下であることが
より好ましい。

流速をさらに高めることは、溶離液中に１〜５単位／１
ｒｌｌのヘパリンを共存させることにより可能である。

溶出液の流速は、使用した担体の機械的強度の範囲にお
いて変化させることができる。

また、溶出液に基質類似物を含む水溶液を用いた場合は
、本法による分離精製後、基質類似物を除去するためｐ
Ｈ７．０、イオン強度１．０以上の緩衝液中で、透析あ
るいは分子篩クロマトグラフイーを行い該物質の除去す
ること望ましい。

本発明において回分法を用いる場合も血漿タンパク質を
含む溶離液とゲルの量は処理量にみあって変化させるこ
とができる。

ゲルと溶液の混合時間は攪拌の度合あるいは容器の形状
により異なるが一般に２時間以上行なうことが望ましい
。

この操作でアンチトロンビン■を吸着されたゲルは、ガ
ラスフィルター上等で溶離液により洗浄を行なった後、
前述のカラム法に準じ溶出液で洗浄しアンチトロンビン
■を回収するものである。

以上の操作はアンチトロンビン■の活性を安定に保存す
るため低温で行うことが望ましい。

以上、説明したように本発明は不活化トロンビンゲルを
用い種々の血漿タンパク混合液と接触させ、アンチトロ
ンピン■を特異的に吸着せしめ、それを溶出することに
より、迅速かつ簡便に、効率よ《分離精製できるもので
ある。

以下、本発明を実施及び比較例により詳細に説明する。

実施例 １ アンヒドロトロンビンは人トロンビンから次に示す方法
により調製した。

精製したヒトα一トロンビン（７１００００単位、３０
０雫）を５０ｒｒＬＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に溶
解し、２１℃で１０００倍量のフエニルメタンスルホニ
ルフルオライドを加え３０分間放置し、トロンビン活性
を消失させた。

トロンビンのエステラーゼ活性を測定したところ９９。

９５％が失なわれた。その後５０ｍＭ｝リス緩衝液（ｐ
Ｈ９．０）で平衡化した脱塩カラム（商品名一セファデ
ツクスＧ−２５）で脱塩を行ない、そのまま４℃で１昼
夜放置した，この分画を５ ０ ｍＭ ｝リス緩衝液（
ｐＨ ７．５ ）で平衡化したペンズアミジンアガロ
ース力ラム（ゲル床容積３０ｍｌ）に通液し、同緩衝液
で洗浄した１５ｒＩｌｌづつ分取し、２ ８ ０ ｎｍ
の吸光度とＦｏｌｉｎ法によるタンパク量を測定したと
ころ第１図に示される如《不活化トロンビンの大半はこ
のカラムに吸着し基質結合能を有することが示された。

これは第１図に示されるごとく、０．２Ｍペンズアミジ
７（ｐＨ ７．５ ）で溶出され、ＩＭＮａＣｌを含む
５０ｍＭトリス緩衝液（ ｐＨ ７．５ ）で透析し、
ペンズアミジンを除去し、アンヒドロトロンピンとした
。

つぎに、アンチトロンビン■にあらかじめアンヒドロト
ロンビンを加え３７℃でインキュベートし、トロンピン
と混和し、フイブリノーゲン液に加え凝固時間を測定す
ることによりその活性の阻害率を調べアンチトロンビン
活性を測定した。

アンヒドロトロンピンと共に加温することによりアンチ
トロンビン活性は低下し、アンチトロンビン■とアンヒ
ドロトロンビンが相互作用することが示された。

また、アンヒドロトロンビンをトロンビンに加えてもそ
の活性が上昇しないことから、アンヒドロトロンビンが
活性を示さないことが確かめられた。

該アンヒドロドロンビンを０．１ＭＮａＨＣ０３（ ｐ
Ｈ ８．３ ）で透析し、活性化架橋アガロースゲル（
商品名一活性化ＣＨセファローズ４Ｂ）と混合スること
によりアンヒドロトロンビンセファローズゲルを合成し
た。

実施例 ２ 血漿を６０℃に３分間加熱後、低温にて遠心分離し、上
澄みを集め０．２μのポアーサイズを有するフィルター
を用いて濾過し、その４７７１ｌを不活化トロンビンセ
ファローズ力ラム（ケル床容積４７７１ｌ）に通液し、
５０ＴｒＬＭトリス緩衝液（ ｐＨ ７．５ ）につづ
いて０．１ＭＮａＣｌを含む同緩衝液で洗浄後、ＭＮａ
Ｃ１を含む５ ０ ｍＭ酢酸緩衝液（ ｐＨ ５．５
）で吸着タンパク質を溶出した。

流速は１ｒｎｌ／ｍｉｎとした。

その結果溶出物は波長２８０ｎｒｎの紫外部吸光度測定
により第２図に示す如く、爽雑タンパク質よりなるピー
クの他にｐＨ５．５で溶出した分画があった。

この分画のアンチトロンビン■活性を測定し、アンチト
ロンビン■が含まれること、また第３図に示す如《、電
気泳動像より、極少量の爽雑タンパク質のみを含む、純
度の高いアンチトロンビン■分画であることが確認され
た。

表１に示される如く、添加した加熱脱フイブリン血漿よ
り該アンチトロンビン■分画へのアンチトロンビン■の
活性回収率は９０％であり、Ｆｏｌｉｎ法により測定し
たタンパク質量当りの活性の値は加熱脱フイプリン血漿
に比べて１７５倍に上昇した。

電気泳動像においてみとめられる微量の爽雑タンパク質
は、陰イオン交換樹脂カラムクロマトグラフイー（商品
名一ＤＥＡＥセファデックスＡ一５０）により除去しさ
らに高純度のアンチトロンビン■を得ることができた。

（表１参照）実施例 ３ 実施例２において用いた溶出液を０．２Ｍペンズアミジ
ン（ ｐＨ ５．５ ）と変えｆＤＬ外は実施例２と同
様な操作・測定を行った。

ただし、アンチトロンビン■分画は、ＩＭＮａＣｌを含
む５０ｒｒＬＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で透析した
。

その結果、実施例２とほぼ同様の純度を保ち、アンチト
ロンビン■の活性も同程度に回収されることが確認され
た。

実施例 ４ 低温エタノール法を用いて人血漿タンパク質を分画する
方法は古＜Ｃｏｈｎらにより系統的な分画法が開発され
（ Ｅ ， Ｊ ， Ｃｏｈｎ ： Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅ
ｔｙ ， ６ ８ ： ４ ５ ９（１９４６））現在
も工業的に広く利用されている。

ネ【 この
方法で分画されたＩＶ−１ペイスト（湿重１グ）を４ｍ
ｌの５０７７１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し
、０．２μのポアーサイズを有するフィルターを用いて
濾過し、実施例２と同様な操作でアンチトロンビン■を
分離精製した。

波長２８０ｎｍの吸光度測定の結果、順次溶出するタン
パク質は実施例１と同様なピークに分れることを確認し
た。

実施例２と同様にｐＨ５．５イオン強度４の溶出液で溶
出されるピークを採取したところ、表２に示される如《
、アンチトロンビン■の活性回収率は８０％であり、効
率よく回収されていることが確認された。

また、タンパク当りのアンチトロンビン■の活性の比も
カラムに添加前に比べ１７７倍に上昇した。

（表２参照）実施例 ５ 血漿に終濃度５ ０ ｍＭになるようにトリスアミノメ
タンを加え、０．ＩＮ塩酸でｐＨ７．５とし冷却しなが
ら５０％ポリエチレングリコール４０００溶液を加え、
ポリエチレングリコールの最終濃度を１５％とする。

低温にて遠心分離し上澄みを集め、フィルターを用いて
濾過し４ＴｆＬｌを不活化トロンビンゲル力ラム（ゲル
床容積４ｍｌ）に添加し、実施例２とほぼ同程度の純度
のアンチトロンビン■を同程度の効率で回収できること
がわかった。

回収率は８５％比活性はクロマトグラフイーの前後で１
６５倍上昇した。

実施例 ６ 実施例２において用いた溶離液を５０ＴｒＬＭトリス緩
衝液（ｐＨ８．０）と変えた以外は実施例２と同様な操
作・測定を行った。

その結果得られたアンチトロンビン■は、実施例とほぼ
同程度の純度であったが、活性の回収率は６０％であっ
た。

実施例 ７ 実施例２において用いた溶離液をＩＭＮａＣｌを含む５
０ ｍＭ ＩＪン酸緩衝液（ ｐＨ ６．０ ）と変
えた以外は実施例２と同様な操作・測定を行った。

その結果アンチトロンビン■は、実施例とほぼ同程度の
純度であったが、活性の回収率は５０％と牛や低かった
。

実施例 ８ 血漿に低温で終濃度２０％となるように （ ＮＨ４ ） ２ ＳＯ４の粉末を加え、３０分間放
置後、遠心分離し、上澄を取り、５０ｍＭト’Ｊス緩衝
液（ｐＨ７．５）で１００倍に希釈した。

その後、フィルターを用いて濾過４００ｍｌを実施例２
と同様な純度のアンチトロンビン■を回収率約８０％で
精製することができた。

実施例 ９ 回分法によりアンチトロンビン■を精製した。

実施例２と同様な操作で加熱によりフイブリノーゲンを
除去した血漿１００Ｔｎｌを得た。

それに５０ｍｌのアンヒドロトロンビンゲルを加え、４
℃で３時間攪拌した。

グラスフィルター上で吸引しながらゲルを回収し、さら
に２５０ｍｌの０． １ ＭＮａＣ １を含む５０ｍＭ
｝リス緩衝液（ ｐＨ ７．５ ）で洗浄後、１００ｒ
／Ｌｌの５０ｍＭ酢酸緩衝液（ ｐＨ ５．５ ）でア
ンチトロンビン■分画を溶出した。

タンパク質量とアンチトロンビン■活性を測定したとこ
ろ、回収率は約８０％であること比活性はクロマトグラ
フイー前後で１５０倍に上昇し、純度は実施例２に近い
ものであることが確認された。

さらに、ＤＥＡＥセファデックスカラムク口マトグラフ
イーを行ったところ高純度の標品が得られた。

実施例 １０ 実施例５と同様な操作で血漿にポリエチレングリコール
を加え、フイブリノーゲンを除去した後その１５０ｍｌ
を実施例９と同様な操作で回分法によりアンチトロンビ
ン■の分離精製を行った。

回収率、純度とも実施例７と同程度であった。

比較例 １ ヘパリンをリガンドとしたアガロースゲル（商品名一ヘ
パリンセファロース（ＣＬ６Ｂ）を充填したカラム（ゲ
ル床容積２０ｍｌ）にコーンＩＶ−１ペイスト（湿重５
グ）を２０ｍｌの５０ｒｒＬＭトリス緩衝液（ｐＨ７．
５）に溶解し濾過後添加した。

同緩衝液１００１ｒＬｌでカラムを洗浄後０〜２，ＯＭ
ＮａＣ１で直線的に濃度勾配をつけた同緩衝液で吸着タ
ンパク質を溶出した。

流速は０． ３ ｍｌ／ｍｉｎであった。

該溶出液は５ｍｌ毎に分取し、２８０ｎｍの吸光度測定
およびアンチトロンビン■活性の測定を行った。

その結果第４図に示す如く溶出される２つの爽雑タンパ
ク質ピークは各々アンチトロンビン■活性を示した。

したがってアンチトロンビン■は三つのピークに分かれ
るが、その純度からアンチトロンビン■分画として採取
されるのは第３のピークのみである。

表３に示す如く、この分画のタンパク質当りのアンチト
ロンビン■活性は添加前と比べ１５０倍に上昇し、純度
が高い標品であることがわかった。

しかし、アンチトロンビン■活性の回収率は３０％と低
い値であり、効率が悪い。

（表３参照）

【図面の簡単な説明】

第１図はアンヒドロトロンビンのペンズアミジンセファ
ローズアフイニテイークロマトグラムである。 ■． アンヒドロトロンビン 第２図および第４図はアンヒドロトロンビンセファロー
ズアフイニテイークロマトグラフイーにより分離された
血漿タンパク質混合液のクロマトグラムである。 ２．アンチトロンビン■ 第３図は、アンヒドロトロンビンセファローズアフイニ
テイクロマトグラフイーにより精製されたアンチトロン
ビン■のポリアクリルアミドディスク電気泳動像である
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 親水性担体にアンヒドロトロンビンを結合した吸着
   剤に、緩衝液、中性塩溶液および血漿タンパク質混合液
   を含むｐＨ ６〜８かつイオン強度Ｏ〜１の溶離液を接
   触させることにより、アンチトロンビン■を特異的に吸
   着せしめ、ｐＨ４．０〜５．５の中性塩溶液あるいは基
   質類似物により溶出することを特徴とするアンチトロン
   ビン■の分離精製法。 ただし、ここでいう基質類似物とは、トロンビンの競合
   阻害剤のことである。 ２ 緩衝液力瓢 トリス緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩
   衝液である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 中性塩溶液が、ＮａＣ １ 、ＫＣ ｌ ， ＮＨ
   ４Ｃ １、（ＮＨ４） ２Ｓｏ，である特許請求の範囲
   第１項ないし第２項記載の方法。 ４ 基質類似物がペンズアミジン、アミノベンズアミ
   ジン、ニトロベンズアミジンである特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 ５ 血漿タンパク質を含む溶液が水溶液である特許請求
   の範囲第１項ないし第４項のいずれかの項記載の方法。 ６ 血漿タンパク質を含む溶液が中性塩を共存する溶液
   である特許請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかの
   項記載の方法。 ７ 血漿タンパク質を含む溶液がポリエチレングリコー
   ルなどの水溶性高分子を共存する水溶液である特許請求
   の範囲第１項ないし第４項のいずれかの項記載の方法。