JPS58120607A - 蛋白質吸着能を有する液体クロマトグラフィー用担体及びその製造方法 - Google Patents

蛋白質吸着能を有する液体クロマトグラフィー用担体及びその製造方法

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JPS58120607A
JPS58120607A JP57003940A JP394082A JPS58120607A JP S58120607 A JPS58120607 A JP S58120607A JP 57003940 A JP57003940 A JP 57003940A JP 394082 A JP394082 A JP 394082A JP S58120607 A JPS58120607 A JP S58120607A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は蛋白質吸着能を有する担体及びその製造方法に
関する。詳細には、水溶性高分子で親水化された表面を
もつ架橋スチレン系重合体多孔体にメチロール基を導入
してなる蛋白質吸着能を有する担体及びその製造方法に
関する。
近年、生体関連物質と特異的相互作用を有する担体の重
要性が増しつつある０例えば、生体関連物質の分析手段
として鍋速液体クロマトグラフィーが多用され、より佛
れた相互作用を有する担体の開発が各方面で要望されて
いる。特に尿や血清等、比較的採取し易い物質のクロマ
トグラフから種々の知見を得べく高速液クロマトグラフ
イーが重要視されている。又、上述の尿や血清中で分散
し、特定の含有物質と相互作用を担体が有すればアフィ
ニティー分離に適用し得、更には、抗原抗体反応等の場
を提供するものとして重要であることは云う迄もない。
本発明は臀に、蛋白質吸着能に優れている担体及びその
製造法に関し、具体的には、本発明の担体は親水性の表
面を具備する多孔体であり、孔内は表面よりも疎水性が
大きく、又、通常の血清蛋白が担体孔内に入り得る排除
限界分子量を有する孔径を具備する物質であることを特
徴としている。
本発明の担体は表面が親水性に富む為、水、各種バッフ
ァー液、血清、尿中等で良く分散し、蛋白質を孔内で大
量に疎水吸着する。又、血清中等に含まれる親水性の高
い低分子量物質とは表面及び内部とも難吸着性の為、親
水性低分子量物質分離用担体、蛋白除去プレカラム用担
体又は抗原抗体号の反応用担体として応用範囲の広い有
用な担体である。
従来、多孔性架橋スチレン系重合体の製造法としては細
孔調節剤の存在下スチレン及びこれと共重合可能な架橋
剤を水中で懸濁重合する方法が知られている。例えばス
チレン−ジビニルベンゼンの場合はＪ、　Ｐｏｌｙｍｅ
ｒ、　８ｃｉ、　Ｐａｙｊ　Ａ−２，８３５（１９６４
）に詳細に述べられている。この場合水溶性−分子を懸
濁剤として主に使用すると微粒子を作ることは可能であ
るが、架橋スチレン夏合体微粒子表面に水溶性高分子が
付層し、くり返し洗浄を行っても完全に付着した水溶性
高分子を取り除くことは不可能である。表面に存在する
水溶性＾分子は例えば有機溶媒系ゲルパーミェーション
クロマトグラフィー（ＧＰＯ）寺に用いられる場合、粘
性による圧力の増加やある棟の相互作用を生じ好ましく
ないので、このような液体クロマトグラフィ用の担体と
してＦｉ便用されなかつ友、一方、水に難溶性のリン酸
塩、例えばリン酸カルシウム、リン酸マグネシウム等の
リン酸塩が用いられる時は生成し次微粒子ｔ−酸等で洗
浄することにより、容易にリン酸塩を除去することがで
き、比較的純粋な架橋スチレン系重合体を得ることがで
きる。しかし乍らこの場合には表面が疎水性のため水、
各檀ババソファー液、血清、尿中で良好に分散すること
ができないので蛋白質を孔内に吸収することができず、
本発明の目的とする機能を有する担体を提供するといり
課題を達成することができなかった。
本発明者等は鋭意研究の結果、水溶性高分子保護剤を懸
濁剤として重合した多孔性架橋スチレン系１合体を乾燥
後に化学反応によりメチロール基を導入するととＫより
、上記の問題点がなく表面は極めて親水性に富み且つ細
孔内は一部親水化を受けるが表面よりも疎水性に富む担
体を得ることが可能であり、血清、尿中等で良好に分散
し得るだけでなく多孔内に蛋白質を容易にとり込み吸着
することのできる担体を得ることに成功したものである
。
以下本発明の詳細な説明する。
本発明の素材である多孔性架橋スチレン重合体はスチレ
ン系単量体すなわち、スチレン、ａ−メチルスチレン、
クロルメチルスチレン等４Ｌ＜Ｈこれら単量体相互の混
合物及びこれらと共電合し得る架橋剤とを細孔調節剤の
存在で水溶性−分子水溶液中で懸濁重合することによっ
て得られる。
スチレン系単量体と共重合し得る架橋剤としてはジビニ
ルベンゼン、トリアリルイノシアヌレート、多価アルコ
ールのジメタクリル酸エステル、ジアクリル酸エステル
、ジアリルフタレート等が便用され、特にジビニルベン
ゼンは住処塩が’１４Ｊｊｂなため好ましい。架橋剤量
は単量体と架橋剤の全量に対し３０〜７０重量％の範囲
で用いることが好ましい。
本発明に使用する水溶性部分子としてはポリエチレンオ
キサイド、ポリ酢酸ビニルケン化物、ポリビニルピロリ
ドン、メチルセルローズ等の一般の水溶性高分子がめり
、本発明では籍に重合体表面に親水性を付与する為に単
量体と架橋剤の全量１００重量部に対し５乃至６０重量
部の範囲、好ましくはｌＯ乃至４０重量部の範囲で水溶
性高分子を使用する。５重量部以下では表面に親水性を
与えることが不光分でろ、９．６０重量部以上では糸の
粘性が大きく、完全な微小球体が得られないばかシか後
述するようにメチロール化に悪影響を与える。この際、
ハイドロオキシアパタイト等の極少量のリン酸系懸濁剤
又は極少量の陰イオン界面活性剤全添加し得る。粒径の
コントロールは水溶性高分子の量、七ツマ一対水の量比
、攪拌力又は界面活性剤の量により調節可能である。本
発明では通常１μ乃至３００μ程度の球状粒子が好まし
い。
細孔調節剤は粒子のポアサイズを調節するものでめ夛、
七ツマ−に溶解する有機溶剤であればよく、例えばベン
ゼン、トルエン等の芳香族炭化水素；トリクロロエチレ
ン、クロロホルム、四塩化炭素等の塩素系溶剤；ｎ−ヘ
キサン、ｎ−へブタン、ｎ−オクタン、ｎ−ドデカン等
の脂肪族系溶剤が単独又は混合して用いられる。前記細
孔ａｌ１節剤はその種類、ｔを変えることにょ＃）細孔
の大きさを容易にコントロールすることができるが通常
単量体と架橋剤の総量ｌｏｏ′ｉＬ菫部に対し２０〜ａ
ｏｏｚ量部用いることが好ましい０本発明において細孔
の大きさは蛋白質を奴看するために極めて重要であり、
ポリスチレンを用いて測だした場合の排除限界分子１ｔ
ｔ３万以上好ましくは５万以上にすることが心安である
。排除限界分子量の上限は特に限定されないが、排除限
界分子量が極度に大きいものは担体の５Ｍ度が弱くなる
ので５００万根［１での排除限界分子量のものが通・に
用いられる。
重合開始剤としては過酸化ベンゾイル、過安息香酸ブチ
ル等の有機過酸化物；アゾビスイノブチロニトリル等の
アゾ化合物等の一般にビニル系単量体のラジカル懸濁重
合に用いられる重合開始剤が使用できる。％に破水性高
分子がグラフトしやすい過酸化ベンゾイル等が好ましい
。次に上述の表向に親水性闘分子が付着又はグラフトし
た多孔性架橋スチレン重合体を担体として使用すると水
に分散することはできるがまだ親水性が不充分でるり、
親水性物質が多孔内へ拡散し難く、蛋白質吸着能が不充
分であるという問題点がある。更に表面に水溶性高分子
が存在するために粘性が大きく、例えばカラムにバッキ
ングし九場合、流通時の圧力の増力ａが大きいので高流
速で流体を流せず又溶出に対して再現性が之しい。
本発明では、前記担体にメチロール基を導入することに
より、前述の問題点を解消し得九ものである。メチロー
ル基の導入方法としてはクロルメチル化後加水分解する
方法が公知であり、本発明ＫＭ用し得る。クロルメチル
化法としては、例えば触媒として塩化亜鉛を用いホルム
アルデヒド又はそのｔｓ４体と塩化水素を用いる方法、
触媒として塩化アルミ又は四塩化スズの存在下でクロル
メチルメチルエーテルヲ便用する方法等ｔ１ＭＪ示し得
る。前記クロルメチル化反応の場合、担体表向の水溶性
高分子も化学反応をうけ、水溶性高分子が無い場合と比
較すると増色が大きく表面は茶褐色に変化する。化学反
応を受は喪水溶性尚分子は一部担体から離脱する。その
為、担体表向の水溶性高分子に起因する粘性は大幅に低
下する。クロルメチル化後、アルカリ系でＮ温もしくは
鍋温で加水分解してメチロール基（−ＯＨ，ＯＨ）に変
換する。
加水分解反応ははｙ完全に行なわれ得る。クロルメチル
化のＩＩＭ＃は芳香族環１個に対し１分子以上のクロル
メチル基を導入することが過性な親水性を付与するため
好ましい。例えばクロルメチルメチルエーテルを用いる
場合、クロルメチルメチルエーテルと架橋スチレン重合
体の比は２Ｇ：１〜１１：ｌが好ましく反応中の蒸＠に
よ”るクロルメチルメチルエーテルの損失ならびに攪拌
性を考慮し少くとも５　：　１程度であることがより好
ましい。又、クロルメチル化に用いられる触媒は前述の
如く、無水のＺｎ０ｊ１．ＡＺＯｊｌ＠　８ｎＯ１４が
一般に用いられるが、触媒活性、クロルメチル化後の後
処理の容易さ等を考慮し、８ｎ（Ｖ４が多用される。ク
ロルメチルメチルエーテルと触媒の比は１００：３０〜
１００：０，５の範囲であり、クロルメチル化の程度に
より適宜選択される。反応は通常０℃乃至５８℃（クロ
ルメチルメチルエーテルの沸点）前後で行なわれる。
前述の如き方法によって得られる本発明の担体は、メチ
ロール化により表面の親木性が増加し、水系で極めてよ
く分散する。さらに、細孔内も親水性が付与されて蛋白
質や史には低分子量親水性化合物が担体内に自由に入り
得る。又、細孔内には単にメチロール化が行なわれるだ
けで水溶性高分子の付着がないため、粒子表面に比し親
水性が比較的小さく、疎水性部分を残存しており細孔内
に入った蛋白質はほぼ完全に担体内に疎水吸着され得る
。又クロルメチル化に伴って余分の水溶性高分子は離脱
し、粘性は極めて低下するので、カラムに充填した場合
にも尚流速が得られ、又再現性も良好で且つ低分子量の
親水性高分子を極めて良く分離することができる等の利
点を本発明の担体は具備している。
本発明は上述したように多孔性架橋スチレン重合体の表
面を水溶性高分子で一旦被傍し表面を親水化した後メチ
ロール化により水溶性高分子の親水性という利点を残存
させたま＼、前述の問題点を除き、且つ細孔内を適度に
親水性にすることにより、親水性低分子量＠質分離用担
体、蛋白質除去プレカラム用担体、抗豪抗体等の反応用
担体等として応用範囲の広い有用な担体ｔ−提供するこ
とを可能としたものである。
実施例に基づいて本発明管より詳細に説明する。
しかし乍ら、下記実施例のみに本発明は限定される本の
ではない。
実施例１及び比較例１ 水１２５ｆにメチルセルロース２．Ｏｆを溶解すせ、更
に２クリル硫酸ナトリウム０．０２５　ｆ　ｔ−加えて
後に３０００Ｃアンプルに入れた。これに、メチレフ３
，２フ？、ジビニルベンゼン（１００％換算）２．７３
９．細孔調節剤としてトルエン及びｎ−ドデカンをそれ
ぞれ６．１５？、　２．２５ｆを加え、開始剤としてベ
ンゾイルパーオキサイドを用いて６０℃で１７時間攪拌
しながら反応させた。水、アセトンで洗浄後、室温で減
圧下乾燥した。粒径は２０μ前後でほぼ谷粒径は均一で
あった。得られ九生成物を担体として用い、各徨既知分
子量のポリスチレンを溶出させＧＰＯ４−測定した所、
排除限界分子量は約１０万を示した。この担体全担体Ａ
と称する。担体Ａとは別途、細孔調節剤としてトルエン
９ｆのみを用いて排除限界分子量約７０００の担体會全
く同様な方法で比較例として作成した。このものを担体
Ｂと称する。担体Ａ、Ｂをそれぞれｓｔとｔ）、クロル
メチルメチルエーテル３５ｍ及び無水四塩化スズ１．５
−を添加し、５０〜６０℃で６時間リフラックス下、ク
ロルメチル化をそれぞれ行った。反応が進むにつれて担
体の色は次第に黒系色となった。反応後の担体を塩酸含
有メタノール中で繰り返し洗浄し、最後にアセト／で洗
浄した。最終的に担体の色は黄土色になつ九。クロルメ
チル化により担体の赤外吸収スペクトルは１２６０ｚ−
”、　６７０儒−１に新しい吸収ピークが認められ念。
前記クロルメチル化された担体Ａ及びＢ’ｌそれぞれ別
途にメタノール１００ｔに苛性ソーブ２５ｔを溶解させ
た溶液中に添加し、６０℃で１５時間反応させ、メチロ
ール化した”　ｌＯｇ□ａ１１−＋に−０）（、ＯＨ基
導入にともなう新しい籍１Ｂ−吸収ピークがそれぞれ認
められた。
メチロール化された担体Ａと担ｆＢは、水、各宿バッフ
ァー液、尿等に極めて艮く分散し、凝集する様なことは
認められなかっ友。メチロール化されｆＩ−前記担体Ａ
と担体Ｂをそれぞれ４畷僅、長さ５００■のステンレス
カラムに充填し、高速液クロマトグラフイーにセットし
次。
溶離液として１／２０Ｍリン酸バッファーを用いて、牛
血清アルブミン溶液（溶剤として溶離液を便用）を流し
、次いで溶離液ｔ−流速Ｉ　ＣＣ／　ｍｉｎで流し要所
、メチロール化担体Ａを充填したカラムはアルブミンを
吸着して溶出しなかつ良のに対し、メチロール化担体Ｂ
ｔ−充填したカラムはアルプミ≦ ンを溶出し九。例えば、メチロール担体Ａの場合１０％
牛血清アルブミン溶液を５０ｐｌずつ計５０回注入して
も、アルブミンの溶出は全く認められなかった。これに
反してメチロール化担体Ｂは５０μ／１回の注入でアル
ブミンは溶出した。
本発明の軛囲内にあるメチロール化担体Ａが如何に蛋白
質をよく吸着するかが判明し九。
次に溶ｍ喉に尿酸、クレアチニン、ｐ−アミノ安息香酸
、アルブミンを溶解させ次試料２０μ！をメチロール化
担体人を充填し九力２ムに注入した。アルブミンは全く
溶出しなかつ九がクレアチニン、ｐ−アミノ安息香酸、
尿酸は完全に分離され九。溶出状態を碓付図に示す、こ
の時の圧力は流速ＩＯＣ／ｍｉｎで２５Ｋｇ／３”ｆ示
した。
比較例２ メチルセルローズ、ラウリル硫酸ナトリウムのかわりに
第三リン酸カルシウム１３．９ｆ、　ｎ−ドデシルベン
ゼンスルホン酸ナトリウム４．０７ｑ　を懸濁剤とする
以外は実施例１と同様の処方でスチレン−ジビニルベン
ゼン共重合体を合成した。水で洗浄して後に粒径１０μ
〜２０μのものを採取した。しかし乍ら粒径の分布は実
施例１に比べ広く、シャープではなかった。ポリスチレ
ンを用いて測定した排除限界分子量にはは担体Ａと同様
に約１０万でめった。
得られた担体を塩酸でよく洗浄し第三リン酸カルシウム
を取り除いた所求には全く分散せず、凝集していた。前
記担体を乾燥し、実施例１と同様な方法でクロルメチル
化したが、着色は少なく、淡黄色の担体が得られた。得
られ九担体會実施例１と同様にして後処理をした後、同
方法で一〇Ｈ，ＯＨ基に変換した。親水性は生じたが、
実施例１のメチロール化担体人に比べて乏しく且つ水又
は尿中での分散は実施例１で得られ次メチロール化担体
Ａの方が良好であった。前記担体を実施例１で使用した
カラムと同様なカラムに充填し、牛血清アルブミンを用
いて蛋白吸着テストを行った。蛋白質はダラダラと極め
てブロードに溶出し、完全に吸着がおこなわれると云う
ことはなかつ九。前記担体は実施例１で得られた担体Ａ
に比べ、表面親水性が乏しく、細孔内に光分に蛋白質が
入ることが出来ない為と考えられる。
実施例８ 細孔調節剤としてトルエン４．５ｆとｎ−ドデカン４．
５ｔ′ｔ−用いる以外は実施例１と同様な方法で排除限
界分子量３０万の細孔を持つスチレン−ジビニルベンゼ
ン多孔体微粒子を得た。さらに実施分散した。前記担体
をカラムに充填して、アルブミン吸着テストを行つ要所
、１０％牛血清アルブミン溶液を５０μｔずつ５０回注
入してもアルブミンの溶出は認められなかつ九。
【図面の簡単な説明】
添付図面は実施例１のメチロール化担体Ａにお・ける溶
出ピークをチャートスピード１１／３分、測定波長ｇｓ
ｏ−の条件で測定したチャートを示す図である。 ■・・・・・尿酸、■・・・・・クレアチニン■・・・
・・ｐ−アミノ安息香酸 −簿出鋳署 手続補正書 昭和５７年　２５′″１２１日 特許庁長官　　島　１）春　樹　　　殿１、事件の表示
　昭和５７年　特願第３９４０号２、発明の名称　　蛋
白質吸着能を有する担体及びその製造方法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 ８、補正の内容 （１）　　明細書中、第１０頁１１行目「＃′ｔソ完全
に行なわれ得る」とあるを「約５０−以上性なわれるこ
とが好ましい」と補正する。 （２）同第１０頁１２行目「１分子以上」とあるを「０
．２分子以上」と補正する。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）　　水溶性高分子で親水化された表面を具備し且
    つ排除限界分子量３万以上を有する多孔性の架橋スチレ
    ン系重合体にメチロール基を導入してなる蛋白質吸着能
    を有する担体。
  2. （２）　　細孔調節剤の存在下にスチレン系単量体及び
    これと共重合し得る。架橋剤の混合物１００重量部に対
    し保護剤として水溶性高分子５重量部乃至６０ＩＩＬ量
    部を加え水中にて懸濁重合して得られる排除限界分子量
    ３万以上を有する多孔性架橋スチレン系重合体をメチロ
    ール化することを特徴とする蛋白質吸着能を有する担体
    の製造方法。
  3. （３）　　架１１剤がジビニルベンゼンであることｔ４
    １黴とする特許請求の範囲第（２）項に記載の製造方法
    。
JP57003940A 1982-01-13 1982-01-13 蛋白質吸着能を有する液体クロマトグラフィー用担体及びその製造方法 Granted JPS58120607A (ja)

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