JPS5816680A - 可溶性肝臓ウリカ−ゼ、その製法及び尿酸の測定法 - Google Patents
可溶性肝臓ウリカ−ゼ、その製法及び尿酸の測定法Info
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- JPS5816680A JPS5816680A JP57117076A JP11707682A JPS5816680A JP S5816680 A JPS5816680 A JP S5816680A JP 57117076 A JP57117076 A JP 57117076A JP 11707682 A JP11707682 A JP 11707682A JP S5816680 A JPS5816680 A JP S5816680A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、低いｐＨ値でも可溶性の肝臓ウリカーゼ、そ
の製法及び尿酸の測定にそれを使用することに関する。
の製法及び尿酸の測定にそれを使用することに関する。
ウリカーゼは、広く動物界に分布し、殊に動物の肝臓中
に存在する酵素であり、これは、酸素の存在下に、次の
反応式に示すように尿酸を酸化してアラントイン、Ｈ２
Ｏ２及びＣｏ２を形成する反応に触媒作用をする： ２Ｈ２０＋尿酸＋０２ →アラントイン＋Ｈ２Ｏ２＋
Ｃ○２ 前記反応に基づき、肝臓ウリカーゼは、反応生成物殊に
Ｈ２Ｏ，をそのために慣用の方法で測定することによる
尿酸の測定のために好適であるはずである。しかしなが
ら、肝臓ウリカーゼの重大な１つの欠点は、この酵素は
比較的高いｐＨ値、通例９〜１１においてのみ可溶性で
あることである。従って、肝臓ウリカーゼにより触媒作
用をうけた反応を、例えば生じたＨ２Ｏ２の酵素による
測定のために必要であるような他の反応と連結すること
は困難である。それというのも、そのためには一般にほ
ぼ中性のｐＨ値が必要であるからである。
に存在する酵素であり、これは、酸素の存在下に、次の
反応式に示すように尿酸を酸化してアラントイン、Ｈ２
Ｏ２及びＣｏ２を形成する反応に触媒作用をする： ２Ｈ２０＋尿酸＋０２ →アラントイン＋Ｈ２Ｏ２＋
Ｃ○２ 前記反応に基づき、肝臓ウリカーゼは、反応生成物殊に
Ｈ２Ｏ，をそのために慣用の方法で測定することによる
尿酸の測定のために好適であるはずである。しかしなが
ら、肝臓ウリカーゼの重大な１つの欠点は、この酵素は
比較的高いｐＨ値、通例９〜１１においてのみ可溶性で
あることである。従って、肝臓ウリカーゼにより触媒作
用をうけた反応を、例えば生じたＨ２Ｏ２の酵素による
測定のために必要であるような他の反応と連結すること
は困難である。それというのも、そのためには一般にほ
ぼ中性のｐＨ値が必要であるからである。
中性ｐＨ値でも充分に可溶性であるウリカーゼも公知で
あるが、これらは、微生物例えばカンジダ・ウチリス（
Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ ） 又はアスペルギ
ルス拳フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕ
ｓ）から得られるはずであり、従ってその分析の目的の
使用性を制限する程度に著しく高価である。このことは
、ヨーロッパ特許出願公告第００１２４４６号明細書か
ら公知のストレストマイセスからの酸性ウリカーゼにも
あてはまる。
あるが、これらは、微生物例えばカンジダ・ウチリス（
Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ ） 又はアスペルギ
ルス拳フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕ
ｓ）から得られるはずであり、従ってその分析の目的の
使用性を制限する程度に著しく高価である。このことは
、ヨーロッパ特許出願公告第００１２４４６号明細書か
ら公知のストレストマイセスからの酸性ウリカーゼにも
あてはまる。
従って、本発明は、肝臓例えば豚肝臓から９エク高いｐ
Ｈ値で溶出させることのできる入手容易な酵素を、前記
欠点を除き、この酵素を中性又は酸性の媒体中でも使用
することができるように変えることを課題としている。
Ｈ値で溶出させることのできる入手容易な酵素を、前記
欠点を除き、この酵素を中性又は酸性の媒体中でも使用
することができるように変えることを課題としている。
この課題は、本発明により、担体物質としての水溶性の
多糖類、ポリ酸無水物、ポリビニルピロリｒン又は酸無
水物に共有結合していて、なお６エジ低いｐＨ値でも可
溶である肝臓ウリカーゼにより解決される。
多糖類、ポリ酸無水物、ポリビニルピロリｒン又は酸無
水物に共有結合していて、なお６エジ低いｐＨ値でも可
溶である肝臓ウリカーゼにより解決される。
本発明は、意外にも、前記種類の水溶性物質に結合され
た肝臓ウリカーゼは、その他のその特性をあまり変える
ことなしに、中性ｐＨ値においてだけでなく、酸性領域
でも極めて可溶性である事実に基づいている。従って、
本発明による調製物は、１〜１１のｐＨ−値での溶解性
に関して優れている。
た肝臓ウリカーゼは、その他のその特性をあまり変える
ことなしに、中性ｐＨ値においてだけでなく、酸性領域
でも極めて可溶性である事実に基づいている。従って、
本発明による調製物は、１〜１１のｐＨ−値での溶解性
に関して優れている。
更に、本発明により変性された酵素は、ｐＨ５，０まで
で、可溶性であるだけでなく、活性でもあり、例えばｐ
Ｈ７，０では、ｐＨ９，５の最適ｐＨ値で測定した活性
の約手○係をも有する。
で、可溶性であるだけでなく、活性でもあり、例えばｐ
Ｈ７，０では、ｐＨ９，５の最適ｐＨ値で測定した活性
の約手○係をも有する。
従って、これは、中性媒体中での尿酸の測定のためにも
極めて好適である。
極めて好適である。
天然の肝臓ウリカーゼは、一般に、９．５エク高いｐＨ
値ではじめて溶解し、９．０ニジ低いｐＨ値では溶液か
ら再び沈殿する。しかしながら、本発明に工９変性され
た形では、ｐＨ１までもその溶解性が残存する。本発明
による肝臓ウリカーゼは、その特性に基づき、すべての
公知のウリカーゼとは容易に区別することができる。
値ではじめて溶解し、９．０ニジ低いｐＨ値では溶液か
ら再び沈殿する。しかしながら、本発明に工９変性され
た形では、ｐＨ１までもその溶解性が残存する。本発明
による肝臓ウリカーゼは、その特性に基づき、すべての
公知のウリカーゼとは容易に区別することができる。
更に、本発明により変性された肝臓ウリカーゼは、その
免疫学的特性は不変のまま保持し、従−って担体結合し
た形でも、免疫学的には肝臓ウリカーゼとして認められ
、他の起源のウリカーゼとは区別することができる。
免疫学的特性は不変のまま保持し、従−って担体結合し
た形でも、免疫学的には肝臓ウリカーゼとして認められ
、他の起源のウリカーゼとは区別することができる。
酵素の特性を担体固定にエフ変えることができることは
公知である。例えば、活性の変化、最適ｐＨ値の移動、
ミカエリス定数、特異活性及び酵素の安定性の変化は文
献に記載されている。しかしながら可溶性担体への結合
により１酵素の溶解特性を、本発明の生成物におけるよ
うに著しく変えることができることは公知ではなかった
。エンチーム（Ｅｎｚｙｍｅ ） ２６巻（１９８１年
）４９〜５３頁の記載から、酵母ウリカーゼ（Ｃａｎｄ
ｉｄａ ｕｔｉｌｉｓからの）をポリエチレングリコー
ルに結合し、この際に、その免疫学的特性に関して検査
した可溶性生成物が得られたことは公知である。この場
合、溶解性の変化は報告されていない。
公知である。例えば、活性の変化、最適ｐＨ値の移動、
ミカエリス定数、特異活性及び酵素の安定性の変化は文
献に記載されている。しかしながら可溶性担体への結合
により１酵素の溶解特性を、本発明の生成物におけるよ
うに著しく変えることができることは公知ではなかった
。エンチーム（Ｅｎｚｙｍｅ ） ２６巻（１９８１年
）４９〜５３頁の記載から、酵母ウリカーゼ（Ｃａｎｄ
ｉｄａ ｕｔｉｌｉｓからの）をポリエチレングリコー
ルに結合し、この際に、その免疫学的特性に関して検査
した可溶性生成物が得られたことは公知である。この場
合、溶解性の変化は報告されていない。
可溶性担体物質としては、本発明の範囲では多糖類が優
れている。特に水溶性デキストランが優れている。しか
しながら、他の可溶性の多糖類例えば殊に可溶性デンプ
ン、糖又は合成糖ポリマーを用いても良好な結果が得ら
れた。糖類としてはサツカライド、例えばサッカロース
が特に好適であることが立証された。土糖類及び二糖類
と例えばエビハロゲンヒドリンとの反応にニジ得られる
ような高分子量のポリマーも好適であることが立証され
、本発明の範囲での多糖類の中に入る。
れている。特に水溶性デキストランが優れている。しか
しながら、他の可溶性の多糖類例えば殊に可溶性デンプ
ン、糖又は合成糖ポリマーを用いても良好な結果が得ら
れた。糖類としてはサツカライド、例えばサッカロース
が特に好適であることが立証された。土糖類及び二糖類
と例えばエビハロゲンヒドリンとの反応にニジ得られる
ような高分子量のポリマーも好適であることが立証され
、本発明の範囲での多糖類の中に入る。
しかしながら、好適な担体物質は、多糖類のみに限られ
るものではなく、酸無水物、ポリ酸無水物又はポリビニ
ルピロリｒンも好適である。好適な酸無水物の例は無水
コハク酸であり、ポリ酸無水物の例は、メチルビニルエ
ーテルと無水マレイン酸とのコポリマーである。スクシ
ンイミド誘導体も好適である。都立証された。
るものではなく、酸無水物、ポリ酸無水物又はポリビニ
ルピロリｒンも好適である。好適な酸無水物の例は無水
コハク酸であり、ポリ酸無水物の例は、メチルビニルエ
ーテルと無水マレイン酸とのコポリマーである。スクシ
ンイミド誘導体も好適である。都立証された。
ミカエリス定数〜及び最大速度■ｍａｘは、本発明によ
り変性された酵素では、天然の肝臓ウリカーゼに比べて
いくらか変えられている。
り変性された酵素では、天然の肝臓ウリカーゼに比べて
いくらか変えられている。
この変化は、ある程度、担体物質の分子量に依り決まる
ことは明らかである。この場合ＫＭ−値はまったく影響
されず、■エアは担体の分子量に反比例して小さくなる
。殊に高分子量の担体物質例えばデンプン及びデキスト
ランでは、最低１００ｏの分子量が存在すべきである。
ことは明らかである。この場合ＫＭ−値はまったく影響
されず、■エアは担体の分子量に反比例して小さくなる
。殊に高分子量の担体物質例えばデンプン及びデキスト
ランでは、最低１００ｏの分子量が存在すべきである。
本発明にニジ変性された肝臓ウリカーゼの分子量は、担
体物質の分子量に依り決まる。例えばデキストランＴＩ
Ｏで変性された酵素ニ対しテハ、１δｏＯＯＯ〜２ｏＯ
ｏ００ダルトンの分子量が測定され、デキストランＴ４
０では、３５００００〜５０００００ダルトンノ分子童
が存在した。この分子量測定はクエン酸塩緩衝液（ｐＨ
５，６）中でのゲルクロマトグラフィにより実施した。
体物質の分子量に依り決まる。例えばデキストランＴＩ
Ｏで変性された酵素ニ対しテハ、１δｏＯＯＯ〜２ｏＯ
ｏ００ダルトンの分子量が測定され、デキストランＴ４
０では、３５００００〜５０００００ダルトンノ分子童
が存在した。この分子量測定はクエン酸塩緩衝液（ｐＨ
５，６）中でのゲルクロマトグラフィにより実施した。
天然の肝臓ウリカーゼの分子量は、この条件下では、酵
素の不溶解性に基づき測定できない。 、。
素の不溶解性に基づき測定できない。 、。
ミカエリス定数ＫＭ及び最大速度■ を天ａｘ
然のウリカーぜ及び酵素用担体物質としての前記の２種
のデキストランに関して測定した。結本発明にニジ変性
された肝臓ウリカーゼは、硫酸アンモニウムでもはや沈
殿可能ではないが、アセトンでは良好に沈殿する。アセ
トン沈殿は、活性の保狩下に可逆的である。従って、こ
れは、殊に本発明の酵素の単離のためにも好適である。
のデキストランに関して測定した。結本発明にニジ変性
された肝臓ウリカーゼは、硫酸アンモニウムでもはや沈
殿可能ではないが、アセトンでは良好に沈殿する。アセ
トン沈殿は、活性の保狩下に可逆的である。従って、こ
れは、殊に本発明の酵素の単離のためにも好適である。
高温度（６０℃）でのこの酵素の温度安定性は、天然酵
素におけるＬｖも著しく良好である。後者はこの温度で
２００分後に当初活性の５係のみを有するが、本発明に
よる酵素の活性は、同じ時点でなおδ２憾であった。６
０℃で２４０分の後には、天然酵素゛は不活性であり、
本発明による酵素は当初活性のなお７９壬を有する。
素におけるＬｖも著しく良好である。後者はこの温度で
２００分後に当初活性の５係のみを有するが、本発明に
よる酵素の活性は、同じ時点でなおδ２憾であった。６
０℃で２４０分の後には、天然酵素゛は不活性であり、
本発明による酵素は当初活性のなお７９壬を有する。
本発明による酵素の製造は、公知方法で行なう。即ち水
溶液中のウリカーゼに、水溶液中でＮＨ２−基と反応す
る基少なくとも１個を有する溶けた担体物質を、９〜１
１のｐＨ値で反応させる。
溶液中のウリカーゼに、水溶液中でＮＨ２−基と反応す
る基少なくとも１個を有する溶けた担体物質を、９〜１
１のｐＨ値で反応させる。
ブロムシアン又は塩化シアヌルで活性化された○Ｈ−基
を有する担体物質を用いて特に良好な結果が得られた。
を有する担体物質を用いて特に良好な結果が得られた。
このカップリングは、ｏ℃〜室温の温度範囲で行なうの
が有利であるが、それエリ高い温度も低い温度も使用で
きる。１０．０〜１１．ＯのｐＨ値でこのカップリング
を行なうのが有利である。
が有利であるが、それエリ高い温度も低い温度も使用で
きる。１０．０〜１１．ＯのｐＨ値でこのカップリング
を行なうのが有利である。
しかしながら、当業者に公知の他の酵素固定法を使用す
ることもできる。
ることもできる。
できるだけ高い活性収率を得るために、酵素対担体分子
のモル比を、酵素のＮＨ−基の比較約手部分のみが変性
されるように選択するのが有利であると立証された。こ
のことは、殊に、低分子量の担体物質の場合にあてはま
る。その都度の好適な量比は、種々の担体量を用いる予
備実験で、その都度の所望活性収率に応じて容易に決定
することができる。
のモル比を、酵素のＮＨ−基の比較約手部分のみが変性
されるように選択するのが有利であると立証された。こ
のことは、殊に、低分子量の担体物質の場合にあてはま
る。その都度の好適な量比は、種々の担体量を用いる予
備実験で、その都度の所望活性収率に応じて容易に決定
することができる。
カップリング反応の終結後に、本発りによる酵素は、例
えばアセトンの添加［エフ沈殿させかつ単離させること
ができる。しかしながら、得られた溶液を有利に透析に
より予め精製した後に凍結乾燥させるのが有利である。
えばアセトンの添加［エフ沈殿させかつ単離させること
ができる。しかしながら、得られた溶液を有利に透析に
より予め精製した後に凍結乾燥させるのが有利である。
この凍結乾燥時に、酵素の凍結乾燥時に通例使用される
ような安定剤を添加するのが有利である。特に、凍結乾
燥用の安定化性添加物として、サッカロース及びマン二
′ソトが好適であることが立証され、これらは単独で又
は混合して使用することができる。
ような安定剤を添加するのが有利である。特に、凍結乾
燥用の安定化性添加物として、サッカロース及びマン二
′ソトが好適であることが立証され、これらは単独で又
は混合して使用することができる。
本発明Ｖｃよる酵素調製物は、前記のように、尿酸の測
定のために極めて好適である。このために好適な本発明
による試薬は、本発明による可溶性肝臓ウリカーゼ、緩
衝液、Ｈ２Ｏ２、アラントイン又はＣＯ２の測定用の系
より成る。存在する尿酸量の尺度として、例えば酸素電
極を用いる酸素吸収を測定することも可能である。
定のために極めて好適である。このために好適な本発明
による試薬は、本発明による可溶性肝臓ウリカーゼ、緩
衝液、Ｈ２Ｏ２、アラントイン又はＣＯ２の測定用の系
より成る。存在する尿酸量の尺度として、例えば酸素電
極を用いる酸素吸収を測定することも可能である。
次に実施例につき本発明を説明する。
例 １
ウリカーゼ（８Ｍ１５０７４６．３０〜５０ｇ、／ｍｉ
！、 ９〜ｌ ＯＴｒｉ／蛋白質ｍ９）５．９を、４℃
で、炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム−緩衝液（０，
１Ｍ、ｐＨ１０，２）４Ｘ２１に対して透析させる。こ
の際に、澄明な酵素溶液が得られる。
！、 ９〜ｌ ＯＴｒｉ／蛋白質ｍ９）５．９を、４℃
で、炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム−緩衝液（０，
１Ｍ、ｐＨ１０，２）４Ｘ２１に対して透析させる。こ
の際に、澄明な酵素溶液が得られる。
ｂ）デキストランの活性化
ロート社（Ｆｉｒｍａ Ｒｏｔｈ 、 Ｋａｒｌｓｒｕ
ｈｅ ）製の可溶性デキストラン（平均分子量１０００
０ 。
ｈｅ ）製の可溶性デキストラン（平均分子量１０００
０ 。
２００００．４ｏＯｏＯ及び５００００）を、ｐＨ１０
，６でブロムシアン（Ｍｅｒｃｋ社製）で活性化する。
，６でブロムシアン（Ｍｅｒｃｋ社製）で活性化する。
このために、デキストラン３０．９を水３１中に溶かし
、２Ｎ苛性ソーダで、ｐＨ１０，６まで調節する。攪拌
下に、ブロムシアン合計９〜１５１Ｉを３９宛４０分か
かっ一ズこの／？パッチ加える。この場合、ｐＨ値を、
自動滴定装置を用いて２〜５Ｎ苛性ソーダの添加により
ｐＨ１０，６に保持する。活性化反応は、もはや苛性ソ
ーダを消費しなくなる際、（この場合的１．５〜２時間
後）ｖｃ、終了する。
、２Ｎ苛性ソーダで、ｐＨ１０，６まで調節する。攪拌
下に、ブロムシアン合計９〜１５１Ｉを３９宛４０分か
かっ一ズこの／？パッチ加える。この場合、ｐＨ値を、
自動滴定装置を用いて２〜５Ｎ苛性ソーダの添加により
ｐＨ１０，６に保持する。活性化反応は、もはや苛性ソ
ーダを消費しなくなる際、（この場合的１．５〜２時間
後）ｖｃ、終了する。
澄明溶液が得られるから、このｐＨ値を２Ｎ塩酸でＩ）
ＨＩＯ，ＯＫ調節する。このように活性化したデキスト
ランを２時間かかつて、２０℃で水に対して充分透析さ
せる。
ＨＩＯ，ＯＫ調節する。このように活性化したデキスト
ランを２時間かかつて、２０℃で水に対して充分透析さ
せる。
予備調製した酵素溶液ｆａｔを激しい攪拌下に活性化さ
れたデキストラン溶液（ｂｌと一緒にする。
れたデキストラン溶液（ｂｌと一緒にする。
全量３．１〜３．２７． ｐＨ１０゜１−１０．３ｏ
４℃又は室温で１６時間かるく攪拌する。
４℃又は室温で１６時間かるく攪拌する。
この時間の後に、使用した活性の約６Ｑ％がなお存在し
た。パッチは澄明である。
た。パッチは澄明である。
ｄ）変性されたウリカーゼの精製
変性されたウリカーゼを引続き０．０４ Ｍクエン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ５，８、アジ化ナトリウム０．０
１４含有）＆Ｃ対して透析させる。時間は約３時間。引
続き、この溶液にサッカロース３０！／及びマンニット
４５．９を加え、濾過して澄明にする。次いで溶液を凍
結乾燥させる。
トリウム緩衝液（ｐＨ５，８、アジ化ナトリウム０．０
１４含有）＆Ｃ対して透析させる。時間は約３時間。引
続き、この溶液にサッカロース３０！／及びマンニット
４５．９を加え、濾過して澄明にする。次いで溶液を凍
結乾燥させる。
使用した活性の７５係が凍結乾燥物中に存在する。
例２〜１２
条件及び担体物質を代えて、例１の方法を繰コポリマー
例１３
グリセリン中のウリカーゼ５−（△酵素蛋白質２３ ｂ
ｍｇ ）を水４５・祠中に入れ、水浴中で、１５分の間
隔で固体の無水コハク酸２×２５ｍ９を添加する。
ｍｇ ）を水４５・祠中に入れ、水浴中で、１５分の間
隔で固体の無水コハク酸２×２５ｍ９を添加する。
滴定装置を用いてＱ、 ５ ＮａＯＨの添加により、Ｎ
ａＯＨがもはや消費されなくなるまでｐＨ値を９．８で
一定に保持する及次に、ノζツチを水で２５０−まで稀
釈し、更に無水コハク酸２７ｍｇを添加し、ｐｉ（９，
８で前記のように反応停止するまで充分滴定する。活性
はなお４４％である。
ａＯＨがもはや消費されなくなるまでｐＨ値を９．８で
一定に保持する及次に、ノζツチを水で２５０−まで稀
釈し、更に無水コハク酸２７ｍｇを添加し、ｐｉ（９，
８で前記のように反応停止するまで充分滴定する。活性
はなお４４％である。
酵素蛋白質対無水コハク酸の比は３：１である。この・
マツチを引続き１Ｍクエン酸でｐＨ５，５まで調節する
。澄明のままである。
マツチを引続き１Ｍクエン酸でｐＨ５，５まで調節する
。澄明のままである。
引続き、０．０４Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ５，５、
Ｎａ −アジド０，０１％含有）に対して透析させる
。生じるわずかな濁りを遠心分離除去する。活性；３３
％。サッカロース１．２．９及びマンニット１．８ ＃
の添加の後に凍結乾燥。凍結乾燥物：収量３．７ 、Ｆ
、特異活性０． ｌ ７８ ｕ、、／１ｖ；活性ロス
なし。
Ｎａ −アジド０，０１％含有）に対して透析させる
。生じるわずかな濁りを遠心分離除去する。活性；３３
％。サッカロース１．２．９及びマンニット１．８ ＃
の添加の後に凍結乾燥。凍結乾燥物：収量３．７ 、Ｆ
、特異活性０． ｌ ７８ ｕ、、／１ｖ；活性ロス
なし。
安定性：３週間＋４℃＝当初活性の１００％〃＋３５℃
＝ 〃 ６５％ 例１４ グリセリン中のウリカーゼ１−（Δ酵素蛋白１２０１Ｒ
９）を水２４−中に加え、水浴中で、攪拌下に、ガント
レツ（ＧＡｒｒＲｘｚ ） ＡＮ ｌ ７９（メチルビ
ニルエーテルと無水マレイン酸とからのコポリマー）２
５ｍｇを加える。ｐＨ値を滴定装置を用いてＱ、 ｌ
Ｎ ＮａＯＨを９，８に保持し、次いで、水２５−をも
う１−加える。
＝ 〃 ６５％ 例１４ グリセリン中のウリカーゼ１−（Δ酵素蛋白１２０１Ｒ
９）を水２４−中に加え、水浴中で、攪拌下に、ガント
レツ（ＧＡｒｒＲｘｚ ） ＡＮ ｌ ７９（メチルビ
ニルエーテルと無水マレイン酸とからのコポリマー）２
５ｍｇを加える。ｐＨ値を滴定装置を用いてＱ、 ｌ
Ｎ ＮａＯＨを９，８に保持し、次いで、水２５−をも
う１−加える。
反応停止後に１Ｍクエン酸でｐＨｔ−５，８まで調節す
る。ノ々ツチは澄明のままである。当初活性の６０％が
なお存在する。安定性：溶液中の活性は、１６時間後に
当初値の３３％まで低下し存２日後に１７％まで、かつ
４日後に１２％まで低下する。
る。ノ々ツチは澄明のままである。当初活性の６０％が
なお存在する。安定性：溶液中の活性は、１６時間後に
当初値の３３％まで低下し存２日後に１７％まで、かつ
４日後に１２％まで低下する。
例１５
ガントレツＡＮ１７９６ｍ９のみを用いて例１４に記載
の方法を繰り返す。ｐＨを５．８に戻した後１６時間後
に、当初活性の４８％、３日後になお３８％が存在する
。１６時間後に濁りが認められる。
の方法を繰り返す。ｐＨを５．８に戻した後１６時間後
に、当初活性の４８％、３日後になお３８％が存在する
。１６時間後に濁りが認められる。
例１６
デキストランＴ４０ ６１を水牛〇−中に溶かし、水浴
中で±０℃に冷却する。次に、塩化シアヌル（２，４，
６−）リクロル−１，３，５−）リアジン）６ｏＯｒｎ
９を低温冷却したダメチャホルムアミド１０−中に溶か
し、ノ々ツチに加える。
中で±０℃に冷却する。次に、塩化シアヌル（２，４，
６−）リクロル−１，３，５−）リアジン）６ｏＯｒｎ
９を低温冷却したダメチャホルムアミド１０−中に溶か
し、ノ々ツチに加える。
０、５ Ｎ ＮａｏＨの添加によりｐＨ値を５．０に調
節し、保持する。
節し、保持する。
反応終了後（もはやｐＨ変化しない）に、この活性化さ
れたデキストランを、低温冷却したアセトン各２倍過剰
量で３回再沈殿させることにより精製する。アセトン沈
殿物をそれぞれ氷水で溶かす。
れたデキストランを、低温冷却したアセトン各２倍過剰
量で３回再沈殿させることにより精製する。アセトン沈
殿物をそれぞれ氷水で溶かす。
この精製したこのデキストランは、溶液としても又は凍
結乾燥物としても、蛋白質固定のために使用することが
できる。
結乾燥物としても、蛋白質固定のために使用することが
できる。
ウリカーゼの固定のために、０．０２５ＭＮａ）Ｔｏｏ
／Ｎａ ００−緩衝液（ｐＨ１０，２）中の酵３
２ ３ 素振白質１ｙ（透析物として）及び活性化されたデキス
トラン（水溶液）を−緒にし、水を充填して３００−と
する。
／Ｎａ ００−緩衝液（ｐＨ１０，２）中の酵３
２ ３ 素振白質１ｙ（透析物として）及び活性化されたデキス
トラン（水溶液）を−緒にし、水を充填して３００−と
する。
引続き、攪拌下に室温で１６時間インキュベートする。
固定及び凍結乾燥の制御：
ノ々ツチを１Ｍクエン酸でｐＨ５，５〜５．８に調節し
、室温で３時間放置する。
、室温で３時間放置する。
この場合、乳白光及び濁りは現われてならない。固定さ
れた酵素を含有する澄明溶液を、サッカロース６ｇ及び
マンニット９ｇの添加の後に、ｐＨ９，０に調節し、カ
ルノ々ミン酸アンモニウム７５０〜を加え、がっ凍結乾
燥させる。活性収率は、使用した活性に対して７５〜δ
・０％である。３５℃で３週間貯蔵の後に、活性は約３
０％だけ低下した。
れた酵素を含有する澄明溶液を、サッカロース６ｇ及び
マンニット９ｇの添加の後に、ｐＨ９，０に調節し、カ
ルノ々ミン酸アンモニウム７５０〜を加え、がっ凍結乾
燥させる。活性収率は、使用した活性に対して７５〜δ
・０％である。３５℃で３週間貯蔵の後に、活性は約３
０％だけ低下した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、 担体物質としての水溶性の多糖類、ポリ酸無水物
、ポリビニルピロリＰン又は酸無水物に共有結合してい
て、なお６エク低いｐＨ値で可溶性であることを特徴と
する、可溶性肝臓ウリカーゼ。 ２．１〜１１のｐＨ値で可溶性である、特許請求の範囲
第１項記載の肝臓ウリカーぜ。 ３、可溶性多糖類はデキストランである、特許請求の範
囲第１項記載の肝臓ウリカーゼ。 ４、可溶性多糖類は、可溶性デンプン、糖又は合成糖ポ
リマーである、特許請求の範囲第１項記載の肝臓ウリカ
ーゼ。 ５、担体物質としての水溶性の多糖類、ポリ酸無水物、
ポリビニルぎロリドン又は酸無水物に共有結合していて
、なお６エジ低いｐＨ値 Ｓで可溶性である肝臓ウリカ
ーゼを製造するために、公知方法で、水溶液中のウリカ
ーゼと水溶液中でＮＨ２−基と反応しうる基少なくとも
１個を有する溶けた担体物質とを、ｐＨ９〜１１で反応
させることを特徴とする、可溶性肝臓ウリカーゼの製法
。 ６、 ブロムシアン又は塩化シアヌルで活性化された多
糖類を担体物質として使用する、特許請求の範囲第５項
記載の方法。 ７ 得られた担体物質結合したウリカーゼの溶液を、サ
ッカロース及び／又はマンニラトラ加えて凍結乾燥させ
る、特許請求の範囲第５項又は第６項のいずれか１項記
載の方法。 ８、担体物質としての水溶性の多糖類、ポリ酸無水物、
ポリビニルピロリＰン又は酸無水物に共有結合していて
、なお６エり低いｐＨ値で可溶性である肝臓ウリカーゼ
を尿酸の測定に使用することを特徴とする、尿酸の測定
法
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19813126759 DE3126759A1 (de) | 1981-07-07 | 1981-07-07 | Loesliche leber-uricase, verfahren zu ihrer herstellung und verwendung |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5816680A true JPS5816680A (ja) | 1983-01-31 |
| JPS5841836B2 JPS5841836B2 (ja) | 1983-09-14 |
Family
ID=6136304
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57117076A Expired JPS5841836B2 (ja) | 1981-07-07 | 1982-07-07 | 可溶性肝臓ウリカ−ゼ、その製法及び尿酸の測定法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4460683A (ja) |
| EP (1) | EP0069379B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5841836B2 (ja) |
| AT (1) | ATE27967T1 (ja) |
| DE (2) | DE3126759A1 (ja) |
| DK (1) | DK159688C (ja) |
| IE (1) | IE53578B1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6467186A (en) * | 1987-09-04 | 1989-03-13 | Kanebo Ltd | Modified superoxide dismutase |
| JPH0269180A (ja) * | 1988-09-02 | 1990-03-08 | Daicel Chem Ind Ltd | 高分子化酵素及びその製造方法 |
Families Citing this family (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3515586A1 (de) * | 1985-04-30 | 1986-11-06 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Stabilisiertes sarcosinoxidase-praeparat |
| DE3541186A1 (de) * | 1985-11-21 | 1987-05-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | Wasserloesliche, stabilisierte peroxidasederivate, verfahren zu ihrer herstellung und verwendung zur bestimmung von wasserstoffperoxid |
| USD299556S (en) | 1986-09-16 | 1989-01-24 | Marshbanks, Inc. | Electric candle |
| JPH0648982B2 (ja) * | 1986-10-06 | 1994-06-29 | 株式会社日立製作所 | アミラーゼの分離精製方法およびそれに用いる吸着剤およびその分離精製装置 |
| EP0320483B1 (en) * | 1987-12-11 | 1994-04-06 | Monsanto Company | Encapsulation method |
| DE4011084A1 (de) * | 1990-04-05 | 1991-10-10 | Boehringer Mannheim Gmbh | Saccharid-modifizierte, wasserloesliche proteine |
| FR2733914B1 (fr) * | 1995-05-11 | 1997-08-01 | Sanofi Sa | Composition de liquide stable contenant de l'urate oxydase et composition lyophilisee pour sa preparation |
| US6541606B2 (en) | 1997-12-31 | 2003-04-01 | Altus Biologics Inc. | Stabilized protein crystals formulations containing them and methods of making them |
| US6451572B1 (en) | 1998-06-25 | 2002-09-17 | Cornell Research Foundation, Inc. | Overexpression of phytase genes in yeast systems |
| ES2245114T3 (es) | 1998-08-06 | 2005-12-16 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Conjugados de peg-oxidasa de urato y su uso. |
| JP2002524053A (ja) | 1998-08-06 | 2002-08-06 | デューク・ユニバーシティー | 尿酸オキシダーゼ |
| US6783965B1 (en) | 2000-02-10 | 2004-08-31 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates |
| US20060188971A1 (en) * | 1998-08-06 | 2006-08-24 | Duke University | Urate oxidase |
| MXPA01009809A (es) * | 1999-03-31 | 2002-07-30 | Cornell Res Foundation Inc | Fosfatasas con actividad de fitasa mejorada. |
| US6841370B1 (en) | 1999-11-18 | 2005-01-11 | Cornell Research Foundation, Inc. | Site-directed mutagenesis of Escherichia coli phytase |
| US6913915B2 (en) * | 2001-08-02 | 2005-07-05 | Phoenix Pharmacologics, Inc. | PEG-modified uricase |
| ES2597503T3 (es) * | 2001-10-31 | 2017-01-19 | Huvepharma Eood | Alimento para animales que contiene fitasa y método |
| US7309505B2 (en) * | 2002-09-13 | 2007-12-18 | Cornell Research Foundation, Inc. | Using mutations to improve Aspergillus phytases |
| US8148123B2 (en) * | 2005-04-11 | 2012-04-03 | Savient Pharmaceuticals, Inc. | Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase |
| WO2006110761A2 (en) | 2005-04-11 | 2006-10-19 | Savient Pharmaceuticals, Inc. | A variant form of urate oxidase and use thereof |
| US20080159976A1 (en) * | 2005-04-11 | 2008-07-03 | Jacob Hartman | Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase |
| HUE052976T2 (hu) | 2005-04-11 | 2021-06-28 | Horizon Pharma Rheumatology Llc | Urát-oxidáz variáns formái és azok alkalmazása |
| WO2006125452A1 (en) * | 2005-05-23 | 2006-11-30 | Universite De Geneve | Injectable superparamagnetic nanoparticles for treatment by hyperthermia and use for forming an hyperthermic implant |
| US7919297B2 (en) | 2006-02-21 | 2011-04-05 | Cornell Research Foundation, Inc. | Mutants of Aspergillus niger PhyA phytase and Aspergillus fumigatus phytase |
| CN101622270B (zh) * | 2006-04-12 | 2014-01-01 | 萨文特医药公司 | 用阳离子表面活性剂纯化蛋白质的方法 |
| WO2008017066A2 (en) * | 2006-08-03 | 2008-02-07 | Cornell Research Foundation, Inc. | Phytases with improved thermal stability |
| US8192734B2 (en) | 2007-07-09 | 2012-06-05 | Cornell University | Compositions and methods for bone strengthening |
| WO2009120707A1 (en) * | 2008-03-24 | 2009-10-01 | Altus Pharmaceuticals Inc. | Uricase compositions and methods of use |
| HUP1200205A3 (en) | 2009-06-25 | 2012-09-28 | Savient Pharmaceuticals | Method and kits for perdicting infusion reaction risk and antibody-mediated low of response by monitoring serum uric acid during pegylated uricare therapy |
| CN110234340A (zh) | 2016-11-11 | 2019-09-13 | 好利恩风湿病制药有限责任公司 | 泼尼松和尿酸酶分子的组合疗法及其用途 |
| US20200237881A1 (en) | 2019-01-30 | 2020-07-30 | Horizon Pharma Rheumatology Llc | Reducing immunogenicity to pegloticase |
| US12121566B2 (en) | 2019-01-30 | 2024-10-22 | Horizon Therapeutics Usa, Inc. | Methods for treating gout |
| CN115011586B (zh) * | 2022-07-22 | 2024-07-23 | 江苏恰瑞生物科技有限公司 | 一种提高固定化尿酸酶酶活力的方法 |
| US12269875B2 (en) | 2023-08-03 | 2025-04-08 | Jeff R. Peterson | Gout flare prevention methods using IL-1BETA blockers |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3625827A (en) * | 1968-09-27 | 1971-12-07 | Monsanto Co | Water-soluble polymer-enzyme products |
| JPS6031472B2 (ja) * | 1978-12-14 | 1985-07-22 | 協和醗酵工業株式会社 | 酸性ウリカ−ゼ |
| JPS55135590A (en) * | 1979-04-05 | 1980-10-22 | Mihama Hisaharu | Modified asparaginase and uricase and their preparation |
-
1981
- 1981-07-07 DE DE19813126759 patent/DE3126759A1/de not_active Withdrawn
-
1982
- 1982-06-24 IE IE1510/82A patent/IE53578B1/en not_active IP Right Cessation
- 1982-07-01 DK DK296682A patent/DK159688C/da active
- 1982-07-02 US US06/394,562 patent/US4460683A/en not_active Expired - Lifetime
- 1982-07-05 EP EP82105993A patent/EP0069379B1/de not_active Expired
- 1982-07-05 DE DE8282105993T patent/DE3276637D1/de not_active Expired
- 1982-07-05 AT AT82105993T patent/ATE27967T1/de not_active IP Right Cessation
- 1982-07-07 JP JP57117076A patent/JPS5841836B2/ja not_active Expired
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6467186A (en) * | 1987-09-04 | 1989-03-13 | Kanebo Ltd | Modified superoxide dismutase |
| JPH0269180A (ja) * | 1988-09-02 | 1990-03-08 | Daicel Chem Ind Ltd | 高分子化酵素及びその製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| DE3126759A1 (de) | 1983-01-27 |
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| JPS5841836B2 (ja) | 1983-09-14 |
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| US4460683A (en) | 1984-07-17 |
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| DK159688C (da) | 1991-04-15 |
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| DK296682A (da) | 1983-01-08 |
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