JPS5821167A - 生物学的液体中のグリコシル化蛋白質を測定するための方法及び試薬セツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 多数の症例において、よく知られているように、糖部症
の変動を示す糖尿病患者において、血液レベルのグリコ
ース全厳密なコントロール下に保つことは極めて重要で
ある。

糖尿病の進行性二次的合併症の発展が患者の代謝挙動の
コントロールの強さに密接に関連する故に、文献上公知
の糖部症の迅速な変動とは独立のデータ全供給すること
ができ、かつ多（の変数によって生ずる）ξラメーター
が探索されている。

その様な患者における糖部症の状態を確認する一つのル
ートは、非酵素的にグリコジル化された蛋白質を測定す
ることである（　Ｙｕｅ、　Ｋ、等、Ｄｉａｂｅｔｅｓ
　２９　：　２９６．１９８０年参照）。その様な反応
は、多くの蛋白質に共通しており、一つのグルコース−
遮断過程である（　Ｄａｙ、　Ｊ、Ｆ、等Ｊ、　Ｂｉｏ
ｌ。

Ｃｈｅｍ、　２５４　：　５９５．１９７９年参照）。

この過程を監視することは、糖部症の上昇がグリコジル
化の程度を絶えず上昇させていることが証明されている
ので、糖尿病患者における代謝の程度を確立するために
相当な徴候を与えるものである。

グリコジル化されたヘモグロビン（Ｈｂ　Ａｌ　）　ｋ
計量することは、その様な蛋白質の寿命は極めて長イ（
１２０日）ので、長期間の糖部症のコントロールとして
役立つ可能性がある。他方、治療処理の進行を追跡した
いと思う場合には、この測定は余り役立たないことが判
明するかもしれない。後者の目的のためには、ヘモグロ
ぜンの寿命よりもアルブミンの寿命はより短かいのでア
ルブミンのグリコジル化の程度を評価することがより興
味深い可能性である。グリコジル化へモグロｅンは全ヘ
モグロビンから弱酸性樹脂上でイオン交換クロマトグラ
フにより単離され、次いで比色計により計量される。

Ｈｂ　Ａｌは、酸性処理により生成する５−ヒドロキシ
メチルフルフラール（ＨＭＦ　）　＠、、５量をチオバ
ルビッル酸（ＴＢＡ　）と反応させることにより測定す
ることにより、求めることも可能である。アルブミンの
グリコジル化に関連して、このパラメータ−は、ある種
の特別の染料上におけるアフイニテイクロマトグラフに
より単離した後ＴＢＡと反応後比色計測定による方法、
或いは又別法として、イオン交換クロマトグラフを行っ
た後この様にして得られた両分の光学密度全読取ること
により測定するという方法等により評価されている。

いずれも比色計により評価されるグリコジル化されたア
ルブミンの量とグリコジル化された血清蛋白質（５ｅｒ
ａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　）の量との間に、極めて緊密な
相関関係があることが証明された後に、後者を測定する
方法が提案され、この様にしてアルブミン全血清から単
離する操作を省略することにより試験に必要な時間並び
に試験方法の簡便性の両見地から相当な利点がもたらさ
れた。

後で示された如（、極めて残念なことには、その様な測
定法においては遊離のグルコース（又はそめ他の炭水化
物）が妨害因子となり、それを除去することは絶対的に
必要となることである。

この欠点を除去するために、Ｋｅｎｎｅｄｙ等（Ｄｉａ
ｂｅｔｅｓ　、　２９　：　４１．３　（１９８０）参
照）は、適当な塩水に対して４℃における１５時間の加
水分解を提案した。この方法によれば分析に必要とされ
る時間力１相当に延長され、分析方法がより複雑なもの
となる。

要するに、分析前に血清グルコース（ｓｅｒａｌｇｌｉ
ｃｏｓｅ　）　　’に除去する要件も考１＃すると、Ｋ
ｅｎｎｅｄｙ等によって提案された方法（Ｄｉａｂｅｔ
ｅｓ、　２９　：’　４１３（１，９８０）参照）は次
のように要約される。

試　　薬　　　　　試験　空試験　　操作の詳細血　　
清　　　　　　　１．．０　　−　　１５時間透析透析
血清　　　　　　０，１　　０．１生理浴液（ｐＨ７，
４）　　　０．９　　−生理溶液→−ＮａＢＨ４０，９ トリクロロ酢酸　　　　１．．０　　１，０　　遠心分
離上澄液　　　　　１．５　１．５ 分析に必要とされる全時間は２１〜２２時間（その内１
５時間は透析に必要なもの）及び数個の操作工程は実際
には固相なものではないが、少なくともある種の場合に
おいては、習慣的な常套手段には余り合致しない要件を
示すものである。

前記説明においである程度概訣１シたことは、非酵素的
にグリコジル化された蛋白質の測定が干渉因子による分
析誤差を生じ、又従来技術により提案された唯一の較正
手段が試料の予備的な透析である、ということである。

本発明は、前述の方法に代わる二つの代替法゛を提供す
るものである。即ち、一方において透析段階が蛋白質に
結合しない炭水化物を抑制する酵素工程あるいは酸処理
のいずれかにより置換されるか、及び他方において、試
験が遊離の炭水化物の存在下において、しかし、その様
な炭水化物が妨害することのできないような分析条件（
例えばコントロールされた加水分解）下において行われ
ることである。後者の場合において、酸性加水分解は、
２％時間に等しいか或いはそれより短い時間内に行われ
る。こねらの二つの代替的方法の最初のものが選択され
る場合には、本発明においては試料のインキュベーショ
ン予備処理が提案される。

津実、本発明の目的は、生物学的液体特に、血清中に存
在する非酵素的にグリコジル化された蛋白質の改良測定
法を提供することであり、該方法は試験試料を８（）℃
を越女る温度で酸性環境内において加水分解処理し、こ
こにおいて該加水分解処理に先んじて必要に応じてイン
キュベーション予備処理を行い、そして炭水化物及び／
又は妨害物質全除去し、引続いて蛋白質を沈澱させ、液
相全労離し、その液相に炭水化物及び／又はそれらの誘
導体の存在を検出する試薬を添加し、そして最終的に試
料及び空試験双方の光学密度を読取ることを特徴とする
ものである。

炭水化物及び異った性質のその他の妨害物質の除去はよ
り具体的には以下に述べる二つの方法に従って行われる
。

第一の手法によれば、全ての存在する（ｉｎ　ｐｌａｙ
）蛋白質全多くの試薬より選ばれる特別の沈澱剤全これ
らの試薬は、アルコール類、多価アルコール類、カルＰ
ニル化合物、有機酸或いはそれらの塩のような有機化合
物の種類に属するものである。

更に、無機酸の塩も、又使用することができる。

なかんず（，１−）ルエンスルホン酸、トリクロロ酢酸
、過塩素酸、酢酸ウラニル、スルホサリチル酸、ｆｆｔ
ｉＨアンモニウム及び硫酸ナトリウムが好ましい。温度
は環境の温度以下の値に維持される。

炭水化物及び／又はその他の妨害性物質の除去は酵素的
に行うことができ、血液媒体ＱｐＨヲ適当な値に調整し
た後に行うことができる。この場合において、その様な
妨害性物質を、最早妨害性でない生成物に転換するよう
に適当に選ばれた酵素が添加される（異った時に別々に
、或いは相互に混ぜ合わされて添加される）。

これらの酵素類は、そのまま導入することもでき□或い
は、例えば繊維内に閉じこめるか或いは天然（或いは合
成）重合体基材に（共有的に或いはその他で）結合する
、といったように適切に固定化することができろ。

前記の如く、放置すれば引続き行われる分析操作の進行
の間に妨害する可能性のある潜在的妨害因子を除去する
観点から妨害性物質の除去に関連した操作は、その操作
に先立って試料のインキュベーション処理を行うことが
できる。代表例としては、適当な酵素（例えばシアリダ
ーゼ、ガラクトキシダーゼなと）或いは酸類全周いて８
０℃〜１００℃の温度範囲において３０分以内の時間で
試料全予備処理することである。

利用される酸類は、好ましくは蓚酸、硫酸、塩酸、スル
ホサリチル酸、及びｐｌルエンスルホン酸及びこれらの
酸の混合物或いは他の酸の混合物よりなる群から選ばれ
るのが好ましい。

次いで、本発明による方法は、酸性環境内において、２
３Ａ時間を越える時間及び８（Ｉ　Ｔ；　’に越える温
度におけろ加水分解段階に進む。次いで、蛋白質を沈澱
させ、上記と同一の沈澱剤を用いてこれを行うことがで
き、る。この工程の後に、同相を上澄液から分離し、上
澄液は次いで二つの両分に分けられる。液相の一方には
炭水化物検出試薬（及び／又はチオノ々ルビツル酸のよ
うなそれらの誘導体を検出するための試薬）が添加され
、もう一つの液相には水が添加され、ＮａＢＨ４が使用
されない場合の空試験が得られろ。最終的に、試料及び
空試験の両方について光学密度が読み取られる（適当な
波長において）。上記説明した方法は、如何なる性質及
び発生源の生物学的液体に含まれるグリコ−シル化蛋白
質の測定に適用することができる。

この方法の採用は、抽清試料内に含有されるグリコジル
化蛋白質の測定に特に有利であることが判明した。従っ
て、本出願人は本明細書中に４女。

られる具体例をそのような用途の著しい重要性により、
その特別の場合に限定すること全有用であるとみなした
。しかしながら、異った発生源の試料に本発明の方法を
適用することも如何なる困難も生ずるものではなく、本
明細書において例示される方法の拡張は、本発明の範囲
及び趣旨に存在する自明の常套的な操作である。　。

グリコジル化蛋白質の測定方法が本発明の主たる目的と
すれば、第二の重要な目的は、この様な方法全実行する
ために使用することのできる手段を提供することである
。これらの手段は、下記よりなる群から選ばれた試薬を
別々の容器に単独で或いは同一の容器内に別々に配瞳し
て含むキット（試薬セット）である： ａ）媒体−酸性化剤 ｂ）蛋白質沈澱剤 Ｃ）ケトン−遷元剤 ｄ）炭水化物及び／又はそれらの誘導体用検出試薬 より詳細には、本発明による診断試薬のキットは、前記
説明事項と首尾一貫して、蓚酸或いは酢酸、トリクロロ
酢酸（ＴＣＡ　）、水素化ホウ素ナトリウム及びチオ・
々ルビツル酸（ＴＢＡ）より構成される。以下、具体例
により、前記本発明の操作の詳細その他の詳細金より明
らかにするが、これらの具体例は本発明を限定するもの
ではない。

例１ ３．３ｒｎｔｐの蛋白質に等価の血清部分を微量のオク
チルアルコールを添加後、０．１５−モルＮａＣ１（Ｐ
ＢＳ）及び０．８５−モル水素化ホウ素ナトリウムを含
有する１ｍｇのリン酸緩衝液（０，０１モル、ｐＨ７，
４）で稀釈する。この試料全室温で１時間放置し、次い
で４°Ｃで１８時間放置する。この操作は空試験を調製
すること全目的とするものである。

同一量の蛋白質金含有するもう一つの血清部分１ｐＨ７
のしかし覆元剤を含まない通常のリン酸緩衝液１　ｍｇ
で稀釈する。両試料を１ｍ１３の４（１％　−ＴＣＡで
処理し、室温で１５分間放置して、これらの試料を１５
分間、２５００　ｇ　（重力の２５００倍）で遠心分離
する。沈澱物を１．５ｍｇの２規定酢酸中に再スラリー
化させ、２４時間１００℃に保つ。冷却後このスラリー
を０．５ｍｇの４０係−ＴＣＡで処理し、遠心分離して
透明な上澄液を回収する。谷１．５ｍｌの透明浴液部分
ｋｏ、５ｍ１．のＴＢＡと３０分間４０℃で反応させる
。空試験と試料の４４３　ｎｍにおける光学密度（０，
Ｄ、）の差を適当なプロット［５−ＨＭＦ　（５−ヒド
ロキシメチルフルフラール）を用いた検を線プロット〕
上に記録し、その結果試料内に含有される５　−Ｔ（Ｍ
Ｆのミリモルが計算できるようにする。

この方法は以下のようにまとめろことができる：廂　　
清　　　０．０５ｕ＋ｌＯ，０５ｍｅＰＢ８　　　　　
　　　　　　　　　　１　　ｍ１４０％−ＴＣＡ　　　
１ｍｇ　　　１ｍ１３　　　遠心分離２−規定酢ａｌ　
　１．５＃Ｉ／！　　　１．５ｍ６　２４時間１００°
Ｃに保つＴＣＡ　　　　　　Ｏ，５ｍｙ　　　Ｑ、５　
ｍｌ　　遠心分離上両液　　　　１，５ｒｎｅ１，５ｒ
ｒｒｌ読取り 例２ 予備処理ヲ１００℃において１５分間及びＴＣＡ　（４
０％濃度）を用いた蛋白質の沈＃を含む操作方法を採用
することができる。

血清部分（０，４ｍｇ　）を、０．６規定の蓚酸を用い
てネジ栓を有する試験管内に直接的に１；２〜１：２ｎ
Ｃ１：　５が好ましい）に稀釈し、攪拌しながら１００
℃において１５分間保つ。室温に冷却後、２ｍｇの４０
％−ＴＣＡ　’ｉ添加する。この試料を攪拌し、１５分
間室温に放置し、２５００　ｇで１０分間遠心分離？行
う。上澄液を、逆さまにした試験管全数分間吸い暇り紙
、ｅラド上に乗せて廃棄する。残渣を次いで２．８ｍｇ
の０，６規定蓚酸で補給し、一度試験管を密封し、次い
で沸騰スチームパス上に５時間保持すると、蛋白質に結
合したグルコースは５−ヒドロキシメチルフルフラール
（５−ＨＭＦ　）に転換する。数本の試験管を水槽内で
１０分間室温まで冷却し、１　ｍｌの４０％−ＴＣＡ　
ｋ各試験管に添加する。

更に１０分間室温で放置後遠心分離’ｉ　２５００　ｇ
において行う。透明な上澄液を集め、’？！ｒ１，５ｍ
ｅの二つの部分に分ける。一つの部分子　Ｏ，０５モル
濃度のチオバルビッル酸で補給し、試料とし、他の部分
を水のみで補給して空試験用試料とする。

試料内に含まれる５　−ＨＭＦ量の測定は、試料及び空
試験用試料の４４３　ｎｍにおける各々の光学密度間の
差を算定し、これ全標準５−　ＨＭＦについて得られた
検量線プロットとこのようにして測定された差を比較し
て行われろ。

この例による方法は次の様に要約される：試　薬　　　
　　　　　　　　　　操作の詳細部　　清　　　　　　
　０．４ｍｌ！ ０．６規定蓚酸　　　１．６ｍｇ　　　１００℃におい
て１５分間４０％−ＴＣＡ　　　　　２　　ｍｌＶ　　
　遠心分離４０％−ＴＣＡ　　　　　１．０　ｍｌ！　
　　遠心分離試験試料　空試験試料 上澄液　１．５ｍＡ　　１．５ｍ１ ＴＢＡ　　　　　０１５ｒｎｅ　　　　−出願人代理人
　　　猪　股　　　　清 第１頁の続き ［相］発　明　者　パオロ・ネリ イタリー国ジエナ・ビア・プレ ・カンテイネ１５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　生物学的液体中に含有されろグリコジル化蛋白質を
   測定する方法において、必要に応じてインキュベーショ
   ン予備処理を行うと共に、炭水化物及び／又はその他の
   妨害物質を除去した後、試験試料ｉ　８０　’Ｃｆｆｉ
   越える温度において酸性環境内において処理し、引続い
   て蛋白質を沈澱させ、液相を分離し、そり液相に炭水化
   物及び／又はそれらの誘導体の存在を検出する試薬を添
   加しく試料の場合）、ＮａＢＨ４の遷元剤が使用されな
   い場合には液相の一部に水或いは適当な溶液を添加しく
   空試験の場合）、及び最終的に試料及び空試験の光学密
   度を読み取ることを特徴とする上記測定方法。 ２、試料の酸性処理が最初の操作であり、２３Ａ時間を
   越えない時間内に行われる、特許請求の範囲第１項記載
   の生物学的液体内に含有されるグリコジル化蛋白質の測
   定方法。 ３、下記のａ）〜ｈ）の工程を含んでなる、特許請求の
   範囲第１項記載の生物学的液体中に含有されるグリコジ
   ル化蛋白質の測定方法： ａ）試料のインキュベーション予備処理、ｂ）炭水化物
   及び／又は妨害物質の除去、Ｃ）前工程の残渣の２％時
   間より長時間の酸性処理、 ｄ）蛋白質の沈澱、 ｅ）沈澱物からの液相の分離、 ｆ）°液相の一部への炭水化物及び／又はそれらの誘導
   体検出試薬の添加、 ｇ）液相の一部への前工程における同様割合の水或いは
   適当な溶液の添加、及び ｈ）試料及び空試験試料の光学密度の読取り。 ４、工程ｂ）が試料中に含有される蛋白質全沈澱するこ
   とによって行われる、特許請求の範囲第′３項記載のグ
   リコジル化蛋白質の測定方法。 ５沈澱が試料に、アルコール類、多価アルコール類、酸
   類、有機酸の塩類、カルゼニル化合物のような有機化合
   物よりなる群から選ばれる沈澱剤を添加することにより
   行われる、特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６、沈澱が、試料に無機塩類を添加することにより行わ
   れる、特許請求の範囲第４項記載の方法。 ７、工程ｂ）が、除去すべき炭水化物の特異的酵素を、
   個別的に或いは混合物として及び／又は異った時に添加
   することにより行われる、％許請求の範囲第３項記載の
   方法。 ８、工程ｂ）が固定化酵素を用いて行われる、特許請求
   の範囲第７項記載の方法。 ９　インキュベーション予備処理工程が８０℃〜１００
   °Ｃの温度において行われる、特許請求の範囲第３項記
   載の方法。 １０、インキュベーション予測処理が蓚酸、酢酸、（Ｍ
   ｅ　ｔｌｉｌ、塙酸、スルホサリチル酸、ｐ−トルエン
   スルホン酸及びそれらの混合物よりなる群から選ばれる
   酸の存在下に行われる、特許請求の範囲槙９ｍ記載の方
   法。 １１、工程ｄ）の蛋白質沈澱操作が、特許請求の範囲第
   ５項及び第６項記載の沈澱剤全添加することにより行わ
   れる、特許請求の範囲第３項記載の方法。 １２、下記のａ）〜Ｃ）よりなる群から選ばれた試薬を
   別々の容器に単独で、或いは同一の容器内に別々に配置
   して含まれること全特徴とする、生物学的液体中のグリ
   コモル化蛋白質金測定するだめの診断試薬セット： ａ）媒体−酸性化剤 ｂ）蛋白質沈澱剤 Ｃ）炭水化物及び／又はその誘導体を検出するための試
   薬。 １３、試薬が蓚酸、トリクロロ酢酸及びチオバルビッル
   酸である、特許請求の範囲第１２項記載の試薬セット。