JPS582679B2

JPS582679B2 - Ｌ− システインノセイゾウホウ

Info

Publication number: JPS582679B2
Application number: JP6939075A
Authority: JP
Inventors: 熊谷英彦; 山田秀明; 大岸治行
Original assignee: Mitsubishi Chemical Industries Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1975-06-09
Filing date: 1975-06-09
Publication date: 1983-01-18
Also published as: JPS51146421A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は主として微生物の生産するシスデインデスルフ
ヒドラーゼを用いてＬ−システインを製造する方法の改
良に関する。

Ｌ−システインは準必須アミノ酸であり、輸液解毒剤、
食品添加剤等として有用であり、さらに医薬品の製造中
間体としても有用である。

また、Ｓ−メチルーＬ−システインおよびＳ−アリルー
Ｌ−システインを酸化して得られるスルホキシドは、血
液および肝臓中のコレステロールの上昇を抑制すること
が知られている。

従来、Ｌ−システインの製法としては、（１）入毛等の天然物の加水分解物からシスチンを抽出
し、これを還元する方法（２）ペンジルクロ口メチルスルフイドとジエチル
フタルイミドマロネートを縮合させて後加水分解し還元
する方法（３）Ｎ−チオベンゾイルセリンと塩化チオニルを反応
さぜで得られるチアゾリン誘導体を加水分解する方法および、（４）酵素を用いて合成する方法等が知られている。

このうちで有機合成によりＬ一システインを得る方法は
、工程が複雑で、Ｄ，Ｌ分割を必要とする等、コスト的
に有利ではない。

酵素を用いて合成する方法としては、（１）Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａのシス
テインシンセターゼを用いてセリンと硫化水素からシス
テインを合成する方法（ＯＬ８２，２２５．７９７
；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４２．１２
（１９６７））（２）セリンと硫化水素からセリ
ンスルフヒドラーゼの存在下、合成する方法（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｃｈｅＺｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ，３３６
，２５８〜２７３（１９６２））（３）Ｌ−セリン
とアセチルＣｏＡをセリントランスアセチラーゼの存在
下反応させて得られる〇一アセチルーＬ−セリンと懺化
水素からＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの存在
下Ｌ一システインを合成する方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ− ＋帽り，４９５５（１９６６））（４）動物の表皮組織の酵素を利用してメチオニンおよ
びセリンからシステインを合成する方法（特公昭４７
−１６０１９；ＣｈｅｍｉｃａｌＡｂｓｔ
ｒａｃｔｓ，５７＋５］５０ｉ）お
よび（５）β−クロロアラニンと硫化水素からセリンスルフ
ヒドラーゼの存在下合成する方法等が知られているが、これらの酵素的方法は、Ｌ，一シ
ステインの工業的製造法としては必ずしも適当でない。

これに対し、本発明方法によれば、高収率で、かつ工業
的有利にＬ−システインを合成することができる。

本発明者らは、特定の微生物がシステインデスルフヒド
ラーゼを生産することを見出す一方、本酵素はβ一置換
一Ｌ−アラニンおよび硫化水素，金属硫化物、金属水硫
化物、硫化アンモニウム、水硫化アンモニウム、または
多硫化アンモニウムからＬ−システインを収率良く生成
することを見出したＣ特願昭４９−．５１４９６、特願
昭４９−５１９２６、特願昭５０−４８４４０）。

その後更に研究を進めた結果、−Ｌ記反応を行なうに際
し、アルデヒド、ケトン、α−ケト酸等のカルボニル化
合物を添加するとＬ−システインの収率が増加すること
を見出し，本発明に到達したものである。

本発明を詳細に説明すると本発明で原科として用いられ
るβ一置換−Ｌ−アラニンとしては、例エハβ−クロロ
−Ｌ−７ラニン、β−ブロモーＬ一アラニン、β−ヨー
ドーＬ−アラニン等ノβーハロゲノーＬ−アラニン、０
−メチルーＬ−セリン、０−エチルーＬ−セリン、０−
（ｎ−ヘキシル）−Ｌ−セリン等のＯ−アルキルーＬ−
セリン、？−フエニルーＬ−セリン等の０−アリールー
Ｌ一セリン、０−ベンジルーＬ−セリン等のＯ−アラル
キルーし−セリン、Ｓ−メチルーＬ−システイン、Ｓ一
エチルーＬ−システイン、Ｓ−（ｎ−ヘキシル）一Ｌ−
システイン等のＳ−アルキルーＬ−システイン、Ｓ−フ
エニルーＬ−システイン等のＳ−アリールーし−システ
イン、Ｓ−ベンジルーし−システイン等のＳ−アラルキ
ルーし−システイン、Ｓ−アリルーＬ−システイン、Ｌ
−セリン、０−アリルーＬ−セリンなどを例示すること
ができるが、特にβ−クロローＬ−アラニン、Ｓ−アル
キルーＬ−システイン、Ｌ−セリン等が好ましい。

本発明でもう一つの原料として用いられる硫化物、水硫
化物、または多硫化アンモニウムは水に可溶なものが好
ましく、例えば硫化ナ｝ｌ）ウム、硫化カリウム、硫
化リチウム、硫化マグネシウム、硫化カルシウム、硫化
ストロンチウム、硫化バリウム、硫化アンモニウム、硫
化水素等の硫化物；水硫化ナトリウム、水硫化カリウム
、水硫化リチウム、水硫化マグネシウム、水硫化カルシ
ウム、水硫化ストロンチウム、水硫化バリウム、水硫化
アンモニウム等の水硫化物；二硫化アンモニウム、三硫
化アンモニウム、四硫化アンモニウム、五硫化アンモニ
ウム、九硫化アンモニウムまたはこれらの混合物を含む
多硫化アンモニウムを挙げることができる。

本発明で使用されるシステインデスルフヒドラーゼは、
Ｌ−システインをピルビン酸、アンモニアおよび硫化水
素に分解する反応で触媒となる公知の酵素である（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．＆ｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．５
９，７８９（１９７４））。

本酵素は微生物によって容易に生産されるが、本酵素の
生産菌としては、例えばプレビバクテリウム属、サルシ
ナ属、コリネバクテリウム属、アース口バクター属、シ
ュードモナス属、プロテウス属、マイクロコツカス属、
エシエリシア属、セラチア属、アルカリゲネス属、バチ
ルス属、アグロバクテリウム属、エンテロバクター属（
エーロバクター属）、シトロバクター属、クレブシーラ
属、サルモネラ属に属する微生物が挙げられるが、これ
らのものに限られるものではなく、本酵素生産菌であれ
ば何でもよい。

具体的にはサルシナ・ルテア（ＩＡＭ１０９９）コリ
ネバクテリウム・エクイ（ＩＡＭ１０３８）、ア
ース口バクター・シムプレツクス（ＩＦ０３５３
０″）．プレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｉ
ＦＯ１２０７１）、シュードモナス・フルオレツセンス
（ＩＦＯ３０８１）、プロテウス・モルガニー（Ｉ
Ｆ０３８４８）、マイクロコツカス・ローゼウス（
ＩＦＯ３７６４）、シトロバクター・フロインディ
ー（ＩＦＯ１２６８１）、エシエリシア・コリ（Ｉ
ＦＯ３３０１）、セラチア・マルセツセンス（ＩＦ
Ｏ３０５４）、アルカリゲネス・フエカリス（ＩＡ
Ｍ１０１５）、バチルス・ズブチリス（ＩＦＯ３００
９）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（ＩＡ
Ｍ１０３７）、エンテロバクター・千一ロケネス（
エーロバククー・エーロゲネス）（ＩＦ０３３２０）、
エンテロバクター・クロアカエ（ＩＦＯ１２００９）、
クレブシーラ・ニューモニアエ（ＩＦＯ３５１２）
、サルモネラ・テイフイムリウム（ＩＦＯ１２５２
９）などが挙げられる。

これらの微生物を利用して本発明に使用されるシステイ
ンデスルフヒドラーゼを生産する方法を概説すれば次の
通りである。

微生物の培養に必要な栄養源としては、通常炭素源とし
てはグルコース、スクロースｙフラクトース、マンノー
ス、マンニトール、キシロース、グリセロール、ソルビ
トール、糖蜜、澱粉加水分解物等の糖質，酢酸、フマル
酸等の有機酸およびｎ−パラフィン等が使用される。

窒素源としては、アンモニアならびに塩化アンモニウム
、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニ
ウム等の有機酸および無機酸のアンモニウム塩類、硝酸
ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム等の硝酸
塩、コーンステイープリカー、酵母エキス、肉エキス、
酵母粉末、綿実粉、大豆粉、大豆加水分解物、ペプトン
、ポリペブトンなどが挙ケられる。

また、無機塩としては、リン酸カリウム，リン酸ナトリ
ウム、硫酸マグネシウムなどが利用される。

培養温度は、２０〜８０℃特に２５〜５０゜Ｃが好適で
ある。

培養は１０〜７２時間好気的に行われる。

また、培養中のｐＨは７〜１１に保つことが望ましい。

培地中に０．１〜１重量％程度のＬ一システイン、Ｌ−
シスチン、Ｓ−メチルーＬ −システイン、Ｓ一エチル
ーＬ−システイン、Ｌーセリン、Ｏ−メチルーＬ−セリ
ンから選ばれるアミノ酸の少くとも１種が存在すると酵
素の生産量を更に高めることができる。

かくして得られるシステインデスルフヒドラーゼは主と
して微生物の菌体内に存在しており、その分離、精製に
ついては、超音波処理、硫安分別、イオン交換クロマト
グラフイなどの公知の方法が適用できる。

得られた酵素は分子量１５〜５０万であり、その活性発
現にはピリドキサールリン酸が補酵素として必要である
。

本発明方法に従ってＬ−システインを製造するには、か
くして得られる微生物起源等のシステインデスルフヒド
ラーゼおよびカルボニル化合物の存在下、通常ｐＨ６〜
１２、好ましくは７〜１１の水性媒質中でβ一置換−Ｌ
−アラニンと硫化物、水硫化物または多硫化アンモニウ
ムとを反応させる。

用いる酵素は精製結晶化されたものに限らず、微生物培
養液、生菌体、乾燥菌体、菌体磨砕物、菌体抽出物など
酵素活性を有するものであれば、何れでもよく、その使
用量は乾燥菌体量として、通常０１〜２０ｇ／ｔ、
好ましくは１〜５＆／ｔ程度である。

反応温度は２０〜８０℃、好ましくは３０〜５０゜Ｃが
適当である。

反応時間は、酵素の活性、基質濃度およびその種類なら
びに反応温度によって変わるが１〜１００時間、通常２
〜４８時間の範囲から選ばれる。

基質であるβ一置換一Ｌ−アラニンと硫化物、水硫化物
または多硫化アンモニウムの濃度はそれぞれ１〜４０重
量％、好ましくは３〜２０重量％程度である。

本発明方法に従って添加されるカルボニル化合物として
は、ピルビン酸、α−ケト酪酸、α−ケトグルタル酸等
炭素数３〜２０のα一ケト酸；ホルムアルデヒド、アセ
トアルデヒド、プロピオンアルデヒド、イソブチルアル
デヒド、ベンズアルデヒド等炭素数１〜２０のアルデヒ
ド；アセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトン、
メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン、ペンヅフ
エノン、アセトフエノン、ベンジル等炭素数３〜２０の
ケトン等を挙げることができるが、特にアセトン、ピル
ビン酸、α−ケ１・酪酸等が好ましい。

反応液中の上記カルボニル化合物の濃度は、通常０．０
１〜２０Ｍ、好ましくは０．０５〜ＩＯＭである。

上記反応液中に通常０．００１〜１ｍＭ、好ましくは０
．００５〜０．１ｍＭのピリドキサールリン酸を存在さ
せると、システインデスルフヒドラーゼの活性をさらに
高め、本反応の反応速度をさらに増大させることができ
る。

反応終了後、常法に従って、例えばイオン交換樹脂処理
等によりＬ−システインを分離する。

β−１−Ｌ−アラニンをシステインデスルフヒドラーゼ
の存在下に硫化物、水硫化物、または多硫化アンモニウ
ムと反応させてＬ−システインを得る方法は、（１）原
料が安価であること、（２）反応条件が温和であること
、（３ル型のみが得られること等の利点を有するが、本
発明方法によりカルボニル化合物の存在下この反応を行
なえば、より高収率でＬ−システインを得ることができ
る。

次に参考例、実施例を示し、本発明方法を更に具体的に
説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の
実施例に限定されるものではない。

なお、生成したＬ−システインの定性および定量はアミ
ノ酸分析器によった。

参考例ＩＬ−システイン・ＨＣＩ０．１％、酵母エキス０．
５％、肉エキス０．５％，ポリペプ１ヘン０．５％、．
ＮａＣｌＯ．２％の組成からなるｐＨ７．５の培地
１００ｒｒＬｌを５００ｒＩｌｌ容の振とうフラスコに
注入し、殺菌後、第１表に示す各種のバクテリアを寒天
斜面から接種して３０℃で１６時間培養を行った後、菌
体を遠心分離により集菌した。

得られた菌体を生理食塩水で洗浄し、リン酸塩緩衝ｉ１
１０７７Ｉｌに懸濁した後、超音波処理によって破壊し
、遠心分離によりシステインデスルフヒドラーゼ活性を
示す細胞抽出液を得た。

結果を第１表に示す。なお、活性の測定は、上記抽出液
１ｒｒｔｌを１×１０’Ｍｌ−リスーＨＣｌ緩衝液（
１）Ｈ９）２．ｏｍｔ：、ＩＸＩＯ−３Ｍピリドキ
サールリン酸０．４ｍ．ｌ、ＩＸＩＯ−２ＭＬ−シ
ステインｌｏｒｎｌを含む溶液４．Ｏｒｄに加え、３０
℃で２０分間システインの分解反応を行い、生成したピ
ルビン酸をＦｒｉｅｄｍａｎｎ，Ｔ．ＥおよびＨａｕｇ
ａｎ，Ｇ．Ｅ．の方法（Ｊ．ＢｉｏｉＣｈｅｍ．１
４７，４１５（１９４３年）に従って定量した。

酵素活性は１分間に１μモルのＬ−シスデインを分解す
る酵素ｔ−＜ｔ’＋を１ｕで表わす。

参考例２参考例１と同一組成の培地４０ｔにサルシナ・ルテア（
ＳａｒｃｉｎａｌｕｔｅａＩＡＭ１０９９）を接種
し３０℃で１５時間培養した。

得られた菌体を０．１ＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７
．０）に懸濁した後、超音波処理し遠心分離によって菌
体抽出液を得た。

この菌体抽出敵を硫酸アンモニウム分画し、システイン
デスルフヒドラーゼ活性区分（０〜０．４飽和）を透析
したのちＤＥＡＥ−セファデツクスのカラムに流し、酵
素を吸着させた。

カラムを、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄
したのち、酵素を０．３ＭＩＪン酸緩衝ｉｆｆｌ
（ｐＨ７．０）で溶出した。

かくして得られたシステインデスルフヒドラーゼ含有溶
出液に硫酸アンモニウムを５０％飽和に加え、酵素を濃
縮したのち透析した。

透析酵素液をセファデツクスＧ−１５０、ついでＧ−２
００でゲル戸過し活性区分をフラクションコレクターで
分果した。

かくして得られたシステインデスルフヒドラーゼ含有溶
出液を再び硫酸アンモニウム分画し（０〜３０％飽和）
精製酵素標品を得た。

このようにして得られたシステインデスルフヒドラーゼ
の精製酵素標晶は、ディスク電気泳動分析で単一たんぱ
く付としての挙動を示し、約２５ｕ／ｍ９の活性
を示した。

実施例ＩＬ−システイン０．２％、グルコース１．０％、酵母粉
末１．０％、大豆加水分解液４．０％、ＫＨ２Ｐ０４０
．２％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００．１％、
ＦｅＳＯ，−７Ｈ２００．００１％、（ＮＨ４）２８０
４０．１％の組成からなるｐＨ７．２の培地中で
エンテロバクター・クロアカエ（エーロバクター・クロ
アカエ）（ＩＦ０１２００９）を３０℃で１８時間好
気的に培養し、培養液を遠心分離して集菌した。

培地ＬＯｒｕｌより得られる菌体（酵素活性２０ｕｎｉ
ｔｓ）を、β−クロローＬ−アラニン５ｍｍｏｌ
ｅ．硫化ナ｝ＩＪウム５ｍｍｏｌｅ，界面活性剤Ｓ
ＤＳ５■、ピリドキサールリン酸０．００１ｍ
ｍｏｌｅを含む５Ｘ１０−’Ｍアンモニア緩衝液（ｐ
Ｈ９．５）■０ｒｒＬｌに加え第２表に示す濃度の各種
カルボニル化合物の存在下３０℃で３時間反応を行なっ
た。

その結果、反応液中には第２表に示す量のＬ−システイ
ンが生成した。

なお比較のために、カルボニル化合物を添加し；ないで
、反応を行った。

その結果を同じく第２表に示す。

実施例２エンテロバクター・クロアカエ（エーロバクター・クロ
アカエ）（ＩＦＯ１２００９）を実施例１と同じ
条件で培養し、培養液を遠心分離して集菌した。

培地１０ｒＩｌｌより得られる菌体（酵素活性２０ｕｎ
ｉｔｓ）を、β−クロローＬ−アラニン５ｍｍｏｌｅ、
第３表に示す各種硫化物または水硫化物５ｍｍｏｌｅ、
界面活性剤ＳＤＳ５７Ｑ、およびピリドキサールリン酸
０．００１ｍｍｏｌｅを含む５×１０’Ｍア
ンモニア緩衝液（ｐＨ９．５）］．Ｏｍｌに；加
え、第３表に示す濃度の各種カルボニル化合物の存在下
３０℃で６時間反応を行なった。

その結果、反応液中には第３表に示す量のＬ−システイ
ンが生成した。

なお比較のために、カルボニル化合物を添加し；ないで
反応を行なった。

その結果を同じく第３表に示す。

Claims

【特許請求の範囲】１下記一般式（１）（上記式中でＸはハロゲン原子、−ＯＲ基、またはーＳ
Ｒ基を示す。（但し、上記一〇Ｒ基および−ＳＲ基中でＲは水素原子
、アルキル基、アリール基、アラルキル基またはアリル
基を示す。））で表わされるβ一置換一Ｌ−アラニンをシステイン
デスルフヒドラーゼの存在下、硫化水素、金属硫化物、
金属水硫化物、硫化アンモニウム、水硫化アンモニウム
または多硫化アンモニウムと反応させてＬ−システイン
を製造するに際し、カルボニル化合物の存在下、上記反
応を行なうことを特徴とするＬ−システインの製造法。