JPS5847159B2 - 微生物による凝集活性物質の製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物による凝集剤の製法、更に詳しくは黒色
菌科（Ｄｅｍａ ｔ ｉ ａｃｅａｅ）のデマチューム
属（Ｄｅｍａｔｉｕｍ）に属する凝集活性物質産生菌で
ある微工研菌寄番号Ａ４２５７の菌を培養して対蛋白質
のみならず、有機質、無機質、鉱物質、生物菌体等に対
し凝集活性を有する凝集活性物質を産出する方法に関す
るものである。

従来においても微生物による蛋白質凝集活性物質の製法
については例えば特開昭５１−８６１８９号並びに特開
昭５１−１１５９９３号等に提案されているが、本発明
はこれらに開示された微生物とは別個の微生物を用いし
かも蛋白質に対してのみならず、有機質、無機質、鉱物
質、生物菌体等が液体に懸濁、分散、浮遊している広範
なコロイド状物質に対し優れた凝集活性を有する凝集活
性物質を生産する方法を提供したものである。

本発明法に用いられる微生物は微工研菌寄番号ｉ４２５
７号の菌であり、この本発明の菌は黒色菌科（Ｄｅｍａ
ｔｉａｃｅａｅ）のデマチューム属（Ｄｅｍａｔ ｉｕ
ｍ ）に属する凝集活性物質産生菌であり、以下その菌
学的特徴を説明すると次の通りである。

分離菌の菌学的特徴 コロニーは初め表明平滑で灰白色、粘液性、光沢ある油
滴状（脂肪様）の酵母様に発育し、その周縁から糸状の
菌体が放射状に成長し、ちぢれた様な糸状で丁度樹枝状
発育をする。

この糸状菌体は培地表面のみならず地培中にもよく発育
する。

しばらくするとコロニー表面に淡暗褐色の斑点が点々と
現われ次第に黒色の斑点になり遂に全面が暗黒色となる
。

この糸状菌体に淡褐色の楕円又は卵形の多数の分生子を
側止する。

この分生子は容易にばらばらになる。

一方油滴状のコロニーの表面にも点々と分生子をつける
。

糖類を含んだ培養液は非常に粘稠性となり、液面に厚い
コロニーで皮革の黒色培苔を生ずる。

最適発育温度は２０〜２５℃でブドウ糖、ショ糖などの
糖類からアルコール類、有機酸類を生成し、又特有の芳
香を有する。

■、培養的特徴＊（注） ■ 固体培地：バレイショ、グルコース寒天培地上最初
コロニーは表面平滑、透明、光沢ある油滴状、粘稠性の
灰白色の酵母様で、コロニーの周縁から放射状にちぢれ
た糸状様の丁度樹枝状の菌体が発育し、この糸状様菌体
に培地表面のみならず、培地中にもよく発育する。

やがてその樹枝様のところどころの部分が黒褐色になる
。

培養して３〜４日たつとコロニー表面に淡暗褐色の斑点
が点々と現われるが、以後次第に淡暗黒色になり全面に
広がり、遂に全体が黒色になる（培養７日）。

尚ツアペック寒天培地上では発育がおそいが、培養的特
徴は前記の様であるコロニー表面が全面黒色になるのに
３週間くらいかかる。

◎ 液体培養：バレイショ、グルコース培地中点々と浮
遊状態に菌体が発育しく培養３日）、次第にコロニーが
増え、やがて（培養７日）液中に粘性のコロニーが充満
する。

モして管壁に暗黒色の草葺が現われ、次第に液面にも出
来る（培養１５日）。

この菌蓋はゼラチナスな粘性のある厚いものである。

尚ツアペック培地中にも同様に発育するが非常におそく
菌体も少く、約３週間培養で液面にかなりの黒色草葺を
つくる。

２、形態的特徴 若い細胞は透明な糸状のちぢれた樹枝状で、菌体は（糸
状様）ところどころから黒く卵形の胞子様のものが側止
する。

又油滴状のコロニーはその中に点々と黒色の胞子様のも
のが着生する。

これは衝撃をあたえるとばらばらになる。３、生理的特
徴 最適発育温度は２０〜２５℃、グルコース、シュークロ
ーズなどから粘性物を生成又グルコースなどの糖類から
、アルコール類、有機酸類を生ずる特有の芳香を有する
。

注）＊文献として ＧｅｏｒｇｅＳＭＩＴＨ著 応用蘭学指針（Ａｎ １
ｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｉｎｄｕｓｔｒｉａ
ｌｍｙｃｏｃｏｇｙ ） （Ｐ ６８〜９７ ）応用微
生物学各論（Ｐ８３〜８７） に準拠。

菌の分離と凝集性の検出 菌の分離培地として原糖の５係の溶液を作り、常法で殺
菌し、１００ｍ１の三角フラスコに２０ｒｎ１分注しｐ
Ｈを微酸性に調整後再度殺菌し、この液体培地に下記に
記述した原液を１ｍｌづつ添加し、静置法で（室温２５
〜３０℃）培養し、−日毎にサンプリングして凝集性を
調べた。

即ち通常凝集試験に使用するカオリン（放出薬品製の試
薬特級）の１係溶液を作り、ｐＨを微酸性として供試液
とした。

上記の原液はグラニユー糖、原糖に含まれている高分子
多糖の分離、分析中ビーカーに長時間放置していた原糖
の希薄溶液（２４人（径口）のセルローズ膜で透析した
液）の粘性が高くなっている事に気付き、再度透析をす
る為に済過をしたものである。

その操作に於て珪藻土又は活性炭素を少量添加した時本
溶液が非常に著しい凝集性、即ち硅藻土又活性炭素が一
瞬にしてビーカー底部に凝固し他の市販凝集剤には見ら
れない凝集力がある事を発見した。

更に本溶液に種々の物質、カオリン、ベントナイト等の
ケイ酸アルミニュームを主成物とする物質又無機物質、
即ち炭酸カルシウム、硫酸バリューム、塩化銀等の中性
塩、有機物質を添加するといづれも著しい凝集をする事
を定性的に確認した。

この凝集試験には本供試液を５０ＴＬｌの試験管に２５
ｍ１取り、これに培養液を１ｍｌ添加し上下に１０回攪
拌後３分間静止しその上澄液の濁度を光電比色計を使用
して７２０“ｐｈｌ ０ ｍｉ／ｃｅｌ ｌ で濁度を測定した。

又上澄液中に残留するカオリン量を重量法で測定し凝集
性を調べた。

その結果は第１図ないし第９図の通りである。

初期培養時間の培養液からその凝集性は著しい。

この事は培地中に代謝される本凝集活性物質は微量で凝
集作用がある事を示唆している。

尚培養時間の経過と共に（９６時間）アセトン、ブタノ
ール臭が強くなった。

そこで培養時間を７２時間として、この培養を１０回く
り返して凝集力の強い培誉液でアセトン、ブタノール臭
がなく、本培養液特有の香気（バラの花の香気）を有す
る培養液を選びこの液から本草の純粋分離を行った。

本草の純粋分離〜原糖又シュークローズ←蔗糖）の５係
溶液を作りｐＨ５〜６に調製し更に粉末酵母エキス（放
出薬品製）を０．２ ％添加し寒天（０，１６係）を加
え常法により加熱殺菌し、シャレーに分注して分離培地
とした。

これに培養液を殺菌水で１００倍、２００倍、５００倍
に釈釈してシャーレに１ｍ１分注し３０℃で培養した。

その結果３種類のコロニーを検出し、更にスラント培養
、液体培養をくり返して３種類の菌を純粋に分離した。

培養初期のコロニーは（培養時間４８時間前後）全べて
クリーム色であるが、時間の経過とともにコロニーの表
面中央部が黒色となり更に時間が経過するとコロニーの
裏面に黒い菌糸がコロニーを中心にして培地に種根状に
延びてくる菌を分離菌Ｉとする。

クリーム色コロニーが時間の経過で変色せずもりあがる
菌を分離菌■、更にクリーム色が培養時間とともに褐色
になる菌を分離菌■とする。

分離した３種類の菌を本文に記述した組成の培養液で静
置培養し、その培養液の凝集力をカオリン１係溶液を使
用して調べた。

その結果は分離菌１１即ちコロニー表面が時間の経過と
ともに黒色となり更に裏面に黒い菌糸が種根状に延びる
菌にのみ凝集性があり、本培養液の見掛上の粘性は培養
時間とともに増加し、更に本草に特有の香気（バラの花
の香気）を検出した。

他の分離菌■。■の培養液には凝集性を検出せず、分離
菌■ではアセモノ臭を、分離菌■では酪酸臭を検出した
。

上記の分離菌Ｉが本発明の対象とする黒色菌科（Ｄｅｍ
ａｔ １ａｃｅａｅ）のデマチュームのｅｍａｔｉｕｍ
）属に属する凝集活性物質産生菌（以下これを単に本発
明菌と称する）である。

純粋分離した分離菌Ｉの顕微鏡写真の説明、〜純粋分離
した分離菌Ｉを下記組成の培地にスラント培養し更にこ
の培地組成で液体静置培養した写真を参考写真１〜１２
に示す。

培地組成 Ｃｚａｐｅｋｓ ＝Ｇｌｕｃｏｓｅ ５ ％〜Ｓｕ’
ｃｒｏｓｅ ５％ Ｐｏｔａｔｏ、ｅｘｔｒａｃｔ −Ｇｌｕｃｏｓｅ
５ ％〜５ｕｃｒｏｓｅ ５ ％ Ｙｅａｓｔ、ｅｘｔｒａｃｔ ＝Ｇｌｕｃｏｓｅ ５
％〜５ｕｃｒｏｓｅ ５ （ｉ） Ｋｏｊｉ、Ｗａｓｓｅｒ＝Ｇｌｕｃｏｓｅ ５％〜５
ｕｃｒｏｓｅ ５ ％ 参考写真１〜５はこの培養組成に分離菌Ｉを５１ａｎｔ
、Ｃｕｌ ｔｕｒｅ （斜面培養）したカラー写真で表
面が黒色になっている。

参考写真６〜１１は５１ａｎｔ、Ｃｕｌ ｔｕｒｅ （
斜面培養）した菌を同一の培地組成で液体培養（静置法
）した写真で各培養液とも非常に粘性が増大した。

尚どの培地とも本草特有の香気を検出した。

参考写真１２は本培地で培養した１つの胞子を培養した
コロニーでありコロニー表面が黒色になっている。

以下の顕微鏡写真は写真１２のコロニーから分離した菌
である。

図面代用の顕微鏡写真第１０図ないし第１８図は本分離
菌■の″６０倍写真、１５０倍、６００倍の写真で菌糸
、成長した胞子、隔壁、菌糸又胞子表面に耐着している
粘性物質が見られる。

本発明者が分離した分離菌Ｉを使用しての培養と凝集物
質の生産 本文に記載した如く純粋に分離した菌Ｉ （Ｄｅｍａ ｔ １ａｃｅａｅのＤｅｍａｔｉｕｍ属）
を使用しての凝集物質の生産、培養条件の結果は下記の
通りである。

炭素源としてグリコース、フラクトース、ガラクトース
等のヘキソーズ又シュークローズ等の三糖類、澱粉等の
多糖を使用しこれに酵母エキスを０．２ ％添加して静
置法で培養し１週間後に培養液の凝集性を調べたがいず
れの場合も凝集性を有する培養液を得た。

更に基質に対する生産量、ｐＨの変化、残存糖は第２図
の通りである。

又通常使用する合成培地例えばＣｚａｐｅｋｅ （ツア
ベク）培地に炭素源としてグルコース等を入れるだけで
凝集物質を培養液に生産する。

上述の如く本発明菌は炭水化物を主成分とする単純な培
地組成で凝集物質を培養液に産出する事がわかった。

例えば原糖を炭素源として使用すれば他の栄養素（Ｎ素
源 無機質等）を添加する事が必要でない。

原糖のみを培養組成として培養した時の凝集物質成虫結
果を第３図に示す。

炭素源の培養濃度を５〜２０係にして培養した結果、濃
度が増加するにつれて基質に対する凝集物質の生産量が
低下し、５％前後が良い事が判明した。

即ち本凝集物質の粘度が非常に高い為、本物質が一定濃
度になると菌の成長が物理的に阻害されると判断した。

ｐＨは初期に微酸性に調整しておけば特に厳密な調整を
必要としない。

培養経過中に多少酸性に低下する。

静置又振盪培養とも凝集物質を産出するが、振盪培養の
方が凝集物質族生が早い事が判明した。

本凝集物質の基質（炭素源）に対する収量は１ｏ％以上
であり、基質濃度に逆比例する。

実施例として炭素源としてグルコース、シュークローズ
、フラクトース、原緒を使用して、２００ｍ１の三角フ
ラスコに培地を５０ＴｒＬｌ入れて静置培養した結果を
第４図に示す。

培養条件、培地組成 炭素源 グルコース 濃度５係 フラクトース ５係 グラニユー糖 ５係 原糖 ５係 Ｎ素源 粉末酵母を原糖以外の培養に０２係添刃口 ｐＨ５，０にＨＣｌで調整 温度 ２８〜３０’Ｃ 接種菌は本分離菌〜Ｉを７日間振盪培養した培養液をＩ
ＴＬｌ添加した。

分離菌Ｉが産出する凝集物質の分離精製法■前出の培養
条件の培地に分離菌Ｉ（黒色菌科のＤｅｍａｔｉｕｍ属
）を接種して培養した培養液を加熱しく１００℃１５分
）、遠沈処理３．００Ｏｒｐｌ／ｍｉｎ ｊ、て菌体を
除去又濾過、分離して菌体を除去し分離液にエタノール
を３０〜４０係濃度になる様に添加すすると（アセトン
、メタノールでもよい）エタノールと培養液の液面に薄
膜が生じ、攪拌すると瞬時に繊維状又綿状の物質が１ケ
所に凝集する。

凝集した物質を遠心分離又攪拌棒に耐着させて分離し、
再度水に溶解させエタノールを添加し再凝集させ、分離
後減圧乾燥すると凝集物質が得られる。

分離した凝集物質は灰白色で粉末状にする事は容易であ
る。

図面代用写真第１９〜第２２に分離した凝集物質の電子
走査顕微鏡写真を示す。

尚本物質は低濃度のエチルアルコールで瞬時に凝集する
事から均一な高分子量物質である事が推論される。

分離精製法■ 未来培
養液中の凝集物質は酸性に於て、アルミニュームイオン
を添加すると著しい凝集をし、アルカリ性に於てはカル
シュームイオンにより凝集する事を見出した。

添加するアルミニュームイオンとしては硫酸アルミニュ
ーム又その重合体で、カルシュームイオンは塩化物とし
て、又石灰等である。

特定無機イオンによる本物質の凝集結果は第５図の通り
である。

この性質から培養液中の凝集物質を分離する方法を確立
した。

即ち培養液を加熱み埋装（１００℃１５分）濾過又遠心
処理で菌体を除し、菌体を除去した液に０．０５〜０．
１０φの無機イオン、即ち液を酸性にした時はアルミニ
ューム化合物、アルカリの時はカルシューム化合物を加
え攪拌すると本凝集物質が完全に凝集してくる。

これを濾過又は遠心処理して分離し乾燥して固型粉末の
凝集物質を得る事が出来る。

分離精製法■ 培養液を加熱処理後（１００℃１５分）菌体を除去し、
菌体を含有しない液を濃縮しく １０ ％前ｆｆ１）で
凝集剤とする。

工業的に凝集剤として使用する時は本物質が非常に安定
した物質である事と、使用時に溶解の必要性がない事な
ど使用上、製造上液体で取扱う事が非常に合理的である
。

下表に本物質（凝集物質）の分離、精製法を一括して示
す。

無機塩添加による本物質の分離、分離法■は本物質と無
機塩が定量的に反応する為に培養液中の本物質の濃度を
定量しておき計算量の無機頃を添加する。

尚分離渋川の残液は多少炭素源が残留している為に培養
に適したｐＨに調整してくり返し使用する。

添加したアルミニューム等の無機イオンは本発明菌の培
養阻害剤にはならない。

凝集剤としての使用又利用〜分離菌Ｉ即ち黒色菌科のＤ
ｅｍａｔｉｕｍ属を培養し、発明者らが発明した分離法
で得られた。

液体、固体又無機イオンを含む固体凝集物質は非常に微
量で、即ち液量に対してｏ、 ｉ ｐｐｍ〜３．Ｏｐ−
添加する事により水又水を含む液体に分散、懸濁、コロ
イド状、浮遊する有機、無機物質又生物菌体を完全に凝
集沈澱させる性質がある事を近見した。

尚本物質の凝集作用は現有市販凝集剤（無機、有機）に
比較すると著しく強いと言える。

又微生物の代謝物質である為に凝集剤による二次汚染の
問題もないメリットを有している。

凝集時の条件は■至適ｐＨの範囲は酸性〜微酸性でアル
カリ性では凝集力は示さない。

ｐＨの変化による本凝集物質の凝集力の結果を第６図に
示す。

■反応温度は常温から高温まで凝集力に関係ない。

■本凝集物質添加後、緩やかな攪拌を必要とする。

■凝集剤としての使用量はｏ、 ｉ ｐｐｍ〜３、Ｏｐ
Ｉ）ｍでよく、使用量は特殊物質を除いて凝集させられ
る物質には関係ない。

実施例としてカオリンの１係水溶液を使用して実験した
本物質の凝集性を第７図に示す。

酸性側に於て本凝集活性物質では凝集しない物質、例え
ばセルローズ粉末、澱粉粒子等の水溶液では本凝集活性
物質を添加攪拌後、添加した凝集活性物質の１／３０〜
１／４０量のアルミニュームイオンを添加して攪拌する
と、セルローズ粉末、澱粉粒子等は一瞬にして凝集沈澱
する事を発見した。

この事により、酸性側に於て水に懸濁、分散、浮遊、コ
ロイド状で存在する有機、無機物質は全べて凝集沈澱さ
せる事ができた。

尚本物質とアルミニュームイオンの凝集試験の結果を第
８図に示す。

アルカリ側に於ける本凝集活性物質の凝集力は非常に微
弱であるが、カルシュームイオンを添加する事によりそ
の凝集力は酸性側に於ける本物質の凝集力と同様になる
事を発見した。

アルカリ側に於けるカルシュームイオン添加の試験結果
を表−９に示す。

カルシュームイオンの添加量は酸性側に於けるアルミニ
ュームイオン添加量より多く、添加した本凝集物質量の
２０〜３０倍量、即ち４０〜８Ｑｐｐｍを必要とする。

この実験結果から全べてのｐＨ領域に於て本凝集活性物
質は微量で水に懸濁、分散、浮遊、コロイド状に存在す
る有機、無機物質を凝集沈澱させる事が出来る事を可能
にした。

本物質の凝集作用は、本物質がきわめて均一な高分子量
で水に対する親和力が非常に高いので（この推論は低濃
度のアルコールで瞬時に凝集する事から出来る）あたか
も水の中にきめのこまかい網を均一に詰めこんだ状態で
水と水和しているが、これに電荷した微粒子又無機物質
が入ると、その分散した網が電気的にバランスを失い凝
集する時、あたかも網で魚を捕える様に物質を捕えると
推論する。

この事はアルミニュームイオンを本凝集活性物質の水溶
液に微量添加した時の凝集を観察する事により明瞭とな
る。

又本凝集活性物質の溶液にエタノールを添加するとその
境界面に薄膜がコロヂオン膜を作る時の様に生じこの様
な膜がいくえにも重っている事を観察出来る。

尚本凝集活性物質は使用時に於て水溶液として使用する
。

又精製法用こよって得られた アルミニューム含有凝集
物質、カルシューム含有凝集活性物質は使用時にアルカ
リ又酸性の水溶液として使用する。

本活性物質の物理化学的性質〜エタノールで分離精製し
た本凝集活性物質は水に可溶でその０．１係の水溶液の
比粘度は４〜５であり砂糖の４０係溶液の粘度に相当す
る。

本凝集活性物質のアンスロン、モーリッシュ、ビューレ
ット反応はいずれものであり、カルバゾール反応による
一ＣＯＯＨ基の定性反応も■でその定量値をガラクチュ
ロン酸で示すと、その含有量は１０〜１５係である。

又■Ｎ Ｈ２ＳＯ４で２４時間加水分解した際に未分解
物質が残留し加水分解液の糖組成はペーパークロマトで
、グルコース、ガラクトース、マンノース等の糖を検出
した。

更に本凝集活性物質の赤外クロマトの結果を第２３図に
示す。

この赤外では−ＣＯＯＨの吸収が確認されたが、アミド
基等についてはその吸収が明瞭でなかった。

本凝集活性物質はグルコース、ガラクトース等を主構成
成分とする、有機酸を含有した高分子量の物質と推定さ
れる。

培養液から精製分離した凝集活性物質の粘度エチルアル
コールに対する溶解性 濃度（アルコール）係 ４０係以下 可溶 ４０〜４５係 不溶、卵白状になる。

保水性大 ４５係以上 卵白状又は膜状（コロジオン膜）になるが
攪拌すると綿状の凝集物となる。

精製分離した凝集活性物質の 臭 気 無臭 味 無味 吸湿性 弱い（常温） 色 灰褐色の繊維状物質 本物質（凝集活性物質）の稀範溶液（濃度１〜１０１０
０ｐｐにＣａ＋＋、Ａ７−−−、Ｍｇ、Ｚｎ、 Ｐｄ等
の二価又は三価の無機イオン又重金属イオンを添加（等
量又そのＸ。

以下）すると本物質が完全に凝集して繊維状となる。

この無機イオンとの反応は定量的である。

【図面の簡単な説明】

第１図ないし第９図は本発明方法で生産される凝集活性
物質の培養収量、凝集性等を試験した図表であり、第１
０図ないし第１８図は本発明法に用いた微生物顕微鏡写
真で、胞子、菌糸、隔壁又は胞子、菌糸に耐着している
粘質物質の写真である。 第１９図ないし第２２図は分離、精製した凝集活性物質
の電子走査顕微鏡写真で、１００倍、７００倍、１，０
００倍のものである。 第２３図は分離した凝集活性物質の赤外吸収スペクトル
の図である（ＫＢｒ法）。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 黒色菌科（Ｄｅｍａ ｔ １ａｃｅａｅ）のデマチ
   ューム属（Ｄｅｍａｔｉｕｍ ）に属する微工研菌寄番
   号Ｍ４２５７の凝集活性物質産生菌を培養することを特
   徴とする微生物により凝集活性物質の製法。 ２、特許請求の範囲第１項に記載の培養が炭水化物を主
   炭素源とした培地に接種して行なわれることを特徴とす
   る微生物による凝集活性物質の製法。 ３ 凝集活性物質が液体に懸濁、分散、浮遊してコロイ
   ド状に存在する有機質、無機質、鉱物質、生物菌体等に
   対し凝集活性を有していることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項又は第２項記載の微生物による凝集活性物質
   の製法。