JPS58502182A - 複特異性抗体決定子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 複特異性仇体決定子 それぞれ軽（Ｌ）鎖と重（Ｈ）鎖とよりなる２種の半分子から構成されたＩｇＧ 抗体が知られている。両半分のＲ鎖はジスルフィド結合により結合され、この結 合は選択的還元によって破壊することができる。２種の異なるＩｇＧ試料につき この過程を行なえば、半分子を組合せて雑種抗体を形成させることができる。こ れは、完全うさぎグロブリンを用いて達成されている〔ニソノフ等、（１９６４ ）、サイエンス誌、第１３４巻、第３７６〜３７９頁〕。

さらに、完全抗体ではなく　ＩｇＧ抗体のｐ（ａｂ’）を断片を使用して雑種が 形成されており、すなわち免疫特異性を与えない分子のＦ　（ｅ）の部分を、た とえばパパインのような適当なプロテアーゼでの分ｍＫよって父雑前に除去する 。この方法は、二ツノ７等、（１９６ｏ　）Ａｒｅｈ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ　、　Ｂｉｏｐｈ）’ｓ　、　、第８９巻、第２３０〜２４４頁 並びにニソノ７及びリバース（１９６０）　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ　、　、第９５巻、第４６０〜４６２頁に記載されている。後に 最初の論文においてニソノフは、カレント・コンテンツ（１９８２年１１月２日 ）第４４巻、第２５頁に次のように記載している： 従来、この方法はその用途か主として抗′フエリチン抗体と細胞表面抗原に対す る抗体との雑種を使用することにより、主として細胞表面を７エリチンで染色す ることのみに限られていた。さらに雑種抗体の使用は、薬剤を所望の組織表面へ 特異的に接触させる手段と考えられていた。

この種の雑種を細胞毒性薬剤の供給のために使用することも、ラン及びグリフイ ン（１９７Ｂ　）　Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ。

第３７巻、第１３５０頁に示唆されている。

ミルスタイン（１９８１）　Ｐｒｏｃ−１’１Ｓｏｃ　−Ｌｏｎｄ　・第Ｂ２１ １巻、第３９３〜４１２頁は、「腫瘍の特異的処理のために毒性物質の担体とし てモノクローン抗体」を使用する可能性を示唆して、次のように述べている：「 Ｆａｂ断片は完全抗体より良好なターゲット剤となりうる」。

さらに、雑種抗体は、それぞれ異なる抗体を生成しつる２種の細胞を融合させて 雑種抗体を生成しうる雑種細胞を作成することによっても生成されている。この 種の方法は、シュペーパー等（１９７４）、Ｐ−Ｎ−Ａ−８−１ＵＳＡ、第７１ 巻、第２２０３〜２２０７頁に記載されている。ねずみ骨随腫細胞をひとリンパ 球に融合させ、得られた融合細胞は「ひと重鎖及び軽鎖と組合せてねずみ免疫グ 四′プリンの成分を含有する雑種抗体分子」を生成した。ひと抗体成分はモノク ローンでなく、不明確であった。

さらに、シュペーパー等は、ねずみ抗体とひと抗体とを充分強力に還元してＬ鎖 とＨ鎖との間の結合を破壊させ、次いで「ランダムに再結合させる」という試験 管内の実験を記載している。

コツトン等（１９７３）、ネイチャー誌、第２４４巻、第４２〜４３頁には、ね ずみ骨随腫細胞をラッテ腫瘍細胞に融合させて「特別成分」を生成する融合体を 生産させる実験が記載されており、前記特別の成分は「恐らく雑種のねずみ−ラ ツテ軽鎖二量体」並びに「各親型の１つの軽鎖で構成された非対称分子」であっ た。

他の論文、すなわちラン等（１９８１）、カンサー・リサーチ、第４１巻、第２ ０７３〜２０７８頁は、ひとＩｇＧ　Ｆ（ａｂ　’　）１断片に対するうさぎ抗 体Ｆ（ａｂ’入断片の不純な試料の生成を記載している。うさぎ抗体断片は還元 により開裂され、かつアンチリシン重鎖Ｆ（ａｂ’）、断片と再結合された。こ の二重特異性二量体を目標とする薬剤供給実験に使用した。この論文は次のよう に述べている：この研究に使用した２種類の精製抗体は、通常の異質抗血清から 単離した。したがって、これら２種のものを・融合させる際、複雑な種類の親和 性と特異性との組合せが生ずるはずである。均質なヒブリドーマ由来の抗体が発 生することは、雑種抗体の各生成分の結合親和性に対し絶対的な制御をもたらし 、この均一性は供給ベヒクルとしてその最終的効果を著しく増大させるはずであ る。

本発明は各複特異性決宇子がジスルフィド結合により結合された２種のＬ−４半 分子よ）構成され、各Ｌ−Ｈ半分子が互いに異なるものであって、異なる抗原決 定子に対し特異性であシ、かつモノクローンエｇＧ抗体の少なくともＦ（ａｂ’ ）、部分よ多構成された同一の複特異性抗体決定子の均質試料を提供する。

本発明の複特異性抗体決定子は次の方法により作成される。慣用の方法を用いて 、２ｍの異なるモノクローンＩｇＧ抗体試料を生成させ、この場合各抗体は２つ の所望の特異性の一方を有する。次いで、所望に応じ、各試料をたとえばパパイ ンのような適当なプロテアーゼに露呈させて抗体分子のＦ　（ｃ）部分を開裂さ せ、それによりＦ（ａｂ’）、断片を生成させる。次いで、各試料をＬ−Ｈ半分 子を結合するジスルフィド結合の少なくとも幾つかを破壊するのに充分な条件に かけて、抗体の少なくとも幾つかを２つの半分子に開裂させる。

次いで、これら２種の試料を、各決定子の少なくとも幾つかの半分子を他の決定 子の少なくとも幾つかの半分子と結合させうる条件下で組合せて本発明の複特異 性抗体決定子を生成させる。

次いで、この複特異性抗体決定子分子を混合物の残部から分離する。１つの分離 方法は混合物を複特異性抗体決定子の両半分のいずれかに特異的に結合しうる抗 原を含有した親和性マトリックスと接触させ、次いで結合したマトリックス結合 材料を溶出させ、この材料を他の半分子を特異的に結合しうる抗原を含有した親 和性マ）　ＩＪラックス接触させることである。この第２のマトリックスに結合 した材料は所要の二重特異性を有する。

複特異性抗体決定子の半分の一方が、巨大分子（約１ｏｏ’ｏダルトン以上の分 子量を有する分子）である抗原決定子に対し特異性を有する場合には、他の分離 方法を使用することもできる。この方法は、巨大分子抗原決定子を精製すべき複 特異性抗体決定子を含有する試料に添加して免疫複合体を生成させることからな り、これをたとえばゲル濾過又は電気泳動によって異なる分子量を有するサブフ ラクションに分離することができる。所望の複特異性抗体決定子と巨大分子抗原 との複合体の分子量に等しい分子量を有するサブフラクションを他のサブフラク ションから分離し、次いで所望に応じ巨大分子抗原を常法により除去する。

図面において、 第１図は複特異性抗体決定子により結合された２種の異なる抗原決定子の略図で あり、 第２図及び第３図は複特異性抗体決定子を用いる電極の略図であり、 第４図は複特異性抗体決定子を用いる自己組立ネットワークの略図であり、 る。

本発明の複特異性抗体決定子は広範囲の用途に有用である。第１図を参照して、 これらの用途は全て、動物における抗体生産を刺戟しうる任意の２種の抗原決定 子Ａ及びＢ、たとえば有効な蛋白質、ポリペプチド、炭水化物、核酸若しくはハ プテンを遊離状態で又は粒子の表面上に不動化させた状態で特異的部位Ａ１及び Ｂ１を介して結合させる高度に特異的なリンカとして作用するこれら決定子の能 力から出発する。

本発明の複製異性抗゛体決定子の１用途は、所望の抗原性物質を不動化された異 なる抗原決定子を有する所望の表面へ結合させるための薬剤としての使用である 。たとえば、粒子又は膜上に不動化された酵素を同相触媒として使用することが できる。特にこの種の不動化の利点は、酵素活性に悪影響を与えない抗体を選択 しうること、並びに純粋表酵素を不純な混合物から不動化させうろことである。

さらに、複製異性抗体決定子を、たとえば医学的障害の診断に使用される免疫分 析法のだめの高度に特異的な複製異性試薬として、或いは生物学系における抗原 決定子間の関係を研究するための分子試料として使用である。現在使用されてい る酵素電極は、しばしば酵素源として組織スライスを使用する。たとえば、グル タミンを測定するだめの電極は、グルタミナーゼの原料としての腎臓スライス物 と組合せた慣用のＮＨ３電極を使用して作成されており、この酵素はグルタミン を分解して測定可能なＮＨ３イオンを生成させる〔レヒニツツ（１９８１）、サ イエンス誌、第２１４巻、第２８７〜２９１頁〕。

本発明は、１種若しくはそれ以上の酵素によ）作用を受Ｇｉ測定可能なイオン若 しくは化合物を発生する未知量の物質の試料中における測定を行なうための電極 装置を提供し、ここで発生したイオン若しくは化合物は未知物質の尺度となる。

この電極装置は、測定可能なイオン若しくは化合物を測定するための手段と、こ の手段に関連して、測定すべき物質に作用する各酵素の複数の分子及び各酵素の 分子に結合された複数の同一の複製異性抗体決定子を有する膜とを備える。各決 定子はジスルフィド結合により結合された２種の異なるＬ−Ｈ半分子よシ構成さ れ、各半分子はモノクローンＩｇＧ抗体の少なくともＦ（ａｂ’）１部分を有す る。一方の前記Ｌ−Ｈ半分子はそれが結合される酵素分子の抗原部位に対し特異 性であり、他方の半分子は複製異性抗体決定子が結合されて膜に対し不動的に結 合される膜上の抗原決定子に対し特異性である。

この電極を使用して、たとえばＮＨｓ　、　ＣＯ２、Ｃ１，若しくはＨ＋のよう な測定可能のイオン若しくは化合物を生成し又は消費するように酵素又は酵素の 組合せ物により代謝されうる任意の物質を測定することができ、ただし各酵素は 不動化された複製異性抗体決定子上の部位に対し特異的に結合することができる 。

反応は２種以上の酵素を必要とするものとすることができる。このような場合、 必要とされる酵素の全部を、電極に固定化される複製異性抗体決定子に不動化さ せることを必要とする。第２図及び第３図は２−酵素系における酵素不動化の２ つの方式を示しており、これら２種の酵素は適当なイオン若しくは化合物に特異 的な膜電極によシ測定しうるイオン若しくは化合物まで物質を変換させる際の連 続反応を触媒する。

第３図を参照して、電極４の膜２けスペーサアーム３及び５上に所望割合で異々 るハプテンＡおよびＢを保持し、これらハプテンにそれぞれハブテン特異性部位 Ａ′及びＢ１を有する異なる複製異性抗体決定子を不動化させる。各複製異性抗 体決定子上の第２の部位は、それぞれ測定すべき物質を測定可能な化合物若しく はイオンまで分解する連続工程を触媒するような酵素Ｃ及びＤの部位を結合する のに特異的である。

第４図を参照して、電極８の膜６はスペーサ７上にハプテンＡを保持し、このハ プテンにハプテンＡ−特異性部位Ａ１を有する複製異性抗体決定子を固定化させ 、さらにこの決定子は測定すべき物質を測定可能な化合物若しくは・ｆオンまで 分解するのに必要な２種の酵素の一方の部位Ｂを接合するのに特異的な第２の部 位Ｂ゛を有する。第２の複製異性抗体決定子は第１の酵素における抗原結合部位 Ｃに対・し特異的な部位ＣＩ　と、測定可能な化合物若しくはイオンの生成に必 要とされる第２の酵素の異なる抗原結合部位りに対し特異的な第２の部位Ｄ゛と を有する。第４図に示した装置の利点は、２種の反応を効率的に組合せるよう２ 種の酵素を緊密に連携させうろことである。

複製異性抗体決定子を用いて作成した酵素電極は、従来の酵素電極よりも幾つか の利点を有する。１つの利点はその正確な自己組立性である。すなわち、所望の 電極アセンブリは、適当なハプテンを膜（電極膜若しくは電極と関連する別の膜 ）へ付着させ次いでハプテンによる膜を適当な複製異性抗体と酵素と・を含有す る溶液中に浸漬させることにより簡単に得られる。さらに、この組立容易性は、 長期使用により劣化が生じた後に電極を容易に再充填しうろことを意味する。

これら電極の他の利点は、さらに複製異性抗体決定子の特異性の機能である。任 意所定の酵素は、抗体の特異性部位に結合しうる多数の抗原部位を有する。しか しながら、これら部位の多くにおける結合は５酵素の失活を生ぜしめる。複製異 性モノクローン抗体決定子の場合、この問題は、決定子が＃素の失活を生ぜしめ ない部位においてのみ酵素と結合するように選択されるので防止される。

他の利点は、電極の組立て又は再充填を不純な酵素混合物で行ないうろことであ る。何故なら、複製異性抗体決定子の独特な特異性は、不純な混合物からの適切 な酵素の選択を確実にするからである。

成る場合、不動化酵素を含有する膜を第２の半透過性膜で覆って電極アセンブリ の劣化を遅延させることができ、或いはアセンブリをグルタルアルデヒドでの処 理により安定化させることができる。

さらに、複製異性抗体決定子の他の用途は、たとえば分子微細回路として使用す るための自己組立ネットワークの形成におけるその使用である。この種のネット ワークを第４図に図示し、ここでＡ、Ｂ、Ｃ，ＤＳＥ及びＦは抗原決定子を示し 、かつＡ゛、Ｂｏ、Ｃ’、Ｄ’、ｌ及びＦ’はそれぞれ対応する抗体決定子を示 す。これから判かるように、結合される特異性決定子の個数は実質的に無制限で あり、さらにネットワークは高度に複雑かつ二次元にも三次元にもすることがで きる。特に重要なことに、このネットワークはいかに複雑であっても独特に規定 された方法で完全に自己組立性である。

この種の自己組立ネットワークの１例は、たとえば化学分析、或いは工業工程に おける特定化学物質の製造に使用するための多層アセンブリでおる。たとえば、 血清中における物質を分析するために現在使用されているアセンブリは、低多孔 質の膜の間に保持させた一連の酵素層を使用する。測定すべき物質を含有した試 料をアセンブリの外表面に載置し、かつ層中を流下させて底部層において測定結 果たとえば螢光若しくは色の変化が生ずるまで保持酵素と順次に反応させる。こ の結果は試料中の測定される物質の尺度である。

本発明の多層アセンブリは、順次に作用しうる２種若しくはそれ以上の酵素を結 合させるため複製異性抗体決定子を使用し、これを第４図に示す（１−１１７は 異なる酵素を示す）。かくして、このアセンブリの低多孔質膜は多くの場合不必 要であり、酵素間の立体関係は既に複製異性抗体決定子に対するその付着により 固定される。さらに、酵素を結合させるための複製異性抗体決定子の使用は、中 間体の拡散時間を短縮することにより反応の効率を向上させる。

本発明の多層アセンブリにおいで、複製異性抗体決定子により結合された抗原決 定子は成る場合には酵素でなく、たとえば微生物菌体のような他の触媒である。

これは、たとえば本方法の目標が化合物の測定でなく一連の化学反応を介する所 望薬品の製造であるような成る種の工業工程の場合である。

以下の特定例によシ、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲に限定を 加えるものではない。

次の方法を使用して、各複製異性決定子が酵素グルコースオキシダーゼの独特な 抗原部位に対し特異的な部位と酵素β−ガラクトシダーゼの独特な抗原部位に対 し特異的な部位とを有する同−複製異性抗体決定子の均質試料を製造した。

第１の工程は、２種の酵素すなわちグルコースオキシダーゼ及びβ−ガラクトシ ダーゼに対するモノクローン２ 一群のＢＡＬＢ／Ｃねずみを各酵素に対し免疫化させて行なった。

免疫化の後、免疫化動物の肺細胞を調製し、これをガ＃７し等、（１９８１）、 メンラド・イン・エンテモロジー、第７３巻、第３〜４６頁に記載された方法を 用いてＭＯＰＣ−２１骨随腫細胞（ＳＰ２１０−Ａｇ１４　）の誘動体と融合さ せた。雑種細胞をヒポキサ／チン−アミノグチリン−チミジン媒体中で選択し、 クローン化させ、そしてガル７し等、上記に記載された方法で所望の酵素に対す る抗体の生成につき選別した。所望酵素に対する抗体を生成することが判明した クローンを次いで選別して、その酵素に対し高度の親和性を有すると共に酵素の 失活を生ぜしめないＩｇＧ種類の抗体を生成するクローンを選択した。興味ある クローンを、使用するまで液体窒素中で貯蔵した。抗体は、クローン化細胞をス ピナフラスコ中で５チ胎児牛血清を含有するズルベツコの改変イーグル培地にお いて繁殖させることによシ調製した。或いは、ブリスティン処理したねずみの腹 腔内における腹水腫瘍として細胞を成長させる標準技術により、一層高い抗体収 率が得られる。

次いで、グルコースオキシダーゼとβ−ガラクトシダーゼとに対する所望のＩｇ Ｇ抗体を、アイ等（１９７８）、イミュノケミストリー、第１５巻、第４２９〜 ４３６頁に記載されたように蛋白質入−セファロース上の親和性クロマトグラフ ィーにより媒体又は腹水液から精製した。

次いで、２穆の精製抗体のそれぞれを、バケット等、（１９８１）イミュノロジ ー、第４巻、第２０７〜２１５頁の方法にしたがい下記するようにペプシンでの 処理によってＦ（ａｂ　’入断片まで変換させた。４岬の精製免疫グロブリン（ ＩｇＧ）をＱ、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，６）中に溶解させ、これを４０Ｍｇの ペプシンと共に３７℃で培養した。２０時間後、この混合物をトリス緩衝液でｐ Ｈ８，１に調整し、蛋白質Ａ−セファロースのカラムに通し、次いでセファデッ クスＧ−５０上でのゲル濾過により精製した。

次いで、２種のＦ（ａｂ“）、断片を結合させて下記するように複製異性決定子 を生成させた。先ず、断片のいずれか一方を１０ｍＭのメルカプトエチルアミン 塩酸塩により３７℃で窒素雰囲気下にて１時間緩和に還元して、この断片をＨ鎖 とＬ鎖との間の結合を破壊することなしに半分子に分離した。次いで、混合物を ダウエックス−５０のカラムにｐＨ５で通して還元剤を除去した。次いで、流出 物を直ちに、ラン及びグリフイン、ジャーナル・イミュノロジー（１９８０）、 第１２５巻、第２６１０〜２６１６頁に記載されたようにα０２Ｍの燐酸ナトリ ウム（ｐＨ＆Ｑ）と５ｍＭのＥＤＴＡとにおいて２ｍＭの翫５“−ジチオビス（ ２−ニトロ安息香酸）と反応させた。

このように生成されたＦａｂ”−チオニトロ安息香酸誘導体ヲ、次いでセファデ ックスＧ−１００上てのゲル濾過により０．２Ｍの燐酸す）　ＩＪウム（ｐＨ８ ，ｏ＞において精製した。他方のＦ（ａｂ’）、断片も同様に還元しかつダウエ ックス−５０で処理し、そして得られたＦａｂ　’誘導体を直ちに等モル量のＦ ａｂ　’　−チオニトロ安息香酸誘導体と混合し、２０℃で３時間培養して高収 率の同−複製異性抗体決定子を含有する混合物を生成させ、ここで各決定子はジ スルフィド結合によシ結合された２種のＦ（ａｂ’）２Ｌ−Ｈ半分子より構成さ れる。同一の複製異性抗体決定子の均質試料を得るため、この混合物をＱ、　Ｉ 　Ｍ　）　ＩＪス（ｐＨ７，５）で平衡化させたセファロース４Ｂのカラムに通 し、セファロースはこれに共有結合されたβ−ガラクトシダーゼを含有する。次 いで、カラムを０．１　Ｍ　ｌ−リス（ｐＨ７，５）で洗浄し、次いで抗−β− ガラクトシダーゼ決定子を［ＬＩＭのグリシン（ＰＨ２−５）で溶出させ、次い でトリスによシ中和した。

次いで、溶出物をＣＮＢｒ活性化により共有結合されたグルコースオキシダーゼ を有するセファロース４Ｂの第２のカラムに通した。このカラムをＱ、ＩＭのト リス（ｐＨ７５）で洗浄し、次いで複製異性抗−グルコースオキシダーゼ、抗− βガラクトシダーゼ決定子をＱ、１Ｍグリシン（ｐＨ２，５）で溶出させ、次い でトリスにより中和した。溶出物は、所望の同−複製異性抗体決定子の均質試料 を構成した。

例　２ 例１で使用したと同じ手順を用いて、同一の複製異性抗体決定子の均質試料を調 製し、この場合一方の抗体部位は例２の複製異性抗体決定子が特異性である部位 とは異なる酵素グルコースオキシダーゼ上の抗原部位に対し特異性であり、かつ 第２の抗体部位は型Ｉコラーゲン上の抗原部位に対し特異性である。

例　３ 次の方法により、乳糖を測定するための酵素電極を作成した。先ず、市販のＯ７ 電極に被嵌させるよう成形したコラーゲン膜を、カルベ等、（１９７２）、第４ ７巻、第５１〜５４頁に記載されたように白金電極を使用するコラーゲンヒブリ ル懸濁物の電気分解により調製した。

例２からの複製異性抗体決定子と１０倍若しくはそれ以上のモル過剰のゲルコー ルオキシダーゼとのＱ、１Ｍ燐酸塩緩衝液（１）Ｈ７，Ｏ）における溶液を調製 した。グルコースオキシダーゼは純粋である必要はない。このコラーゲン膜をこ の溶液中に浸漬し、２０℃で１時間培養し、この時間の後緩衝液で洗浄し、次い で例１からの抗体と１０倍若しくはそれ以上のモル過剰のβ−ガラクトシラーゼ とをαＩ　Ｍ、燐酸塩緩衝液中に含有する溶液に移し、ここで２０℃にて１時間 培養した。次いで、膜を緩衝液中で迅速に洗浄し、０，１Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ ７，０）中における［１．５％グルタルアルデヒドに３分間浸漬して安定化させ た。

次いで、膜を市販Ｏ１電極の酸素透過性テフロン膜の上に載せ、サトー等（１９ ７６）、バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング、第１８巻、第 ２６９〜２７２頁に記載された蔗糖の測定方法と同様にして乳糖の測定にこの電 極を使用することができる。未知量の乳糖を含有する試料をこの膜と接触させ、 不動化されたβ−ガラクトシダーゼはグルコースへの乳糖の分解を触媒し、次い でとのグルコースは不動化グルコースオキシダーゼによシ作用を受けてＯ７を放 出し、とのＯ７を試料中の乳糖の尺度として測定する。

上記膜の作成においては、抗体に対するモル過剰、の酵素を使用したが、それは β−ガラクトシダーゼとグルコースオキシダーゼとがそれぞれ数種の同一のサブ 単位から構成されるからである。過剰の酵素は、平均的に各酵素分子の単一抗原 部位のみが複合体生成に関与することを確保する。モノマー酵素を使用して他の 電極を作成する場合、モル過剰の酵素は必要でない。等モル量の酵素と複製異性 抗体決定子とを使用する場合、反応は単一段階で進行させることができる。

例　４ 以下は、分析される未知量の物質の尺度として比色、反射又は螢光分析により測 定しうる着色若しくは螢光性物質の生成を用いる種類の分析アセンブリの１例を 説明するものである。

第５図は、乳糖に対する比色指示薬を図示している。

ビオチン置換された再生セルロース膜１０を、一連の反応に関与する不動化酵素 の支持体として使用し、試料中の乳糖はＨ２０２を発生して比色測定しうる結果 を与え、これけ試料中の乳糖量の尺度である。

第５図に示したように、例１で記載した手順により調製された３種の異なる複製 異性抗体決定子へ結合させることによシ酵素を不動化させた。第１の決定子は、 蛋白質アビジンの抗原部位に対し特異的な一方の部位Ａ“と、酵素西洋わさびペ ルオキシダーゼの抗原部位に対し特異的な他方の部位Ｂ゛とを有する。第２の決 定子は、西洋わさびペルオキシダーゼの異なる抗原部位に対し特異的な部位ＣＩ と、グルコースオキシダーゼの抗原部位に対し特異的な第２の部位Ｄ１とを有す る。第５の決定子は、グルコースオキシダーゼの異なる抗原部位に対し特異的な 抗体部位ＥＴ　と、β−ガラクトシダーゼの抗原部位に対し特異的な第２の部位 Ｆ“　とを有する。

置換セルロース膜１０は、たとえば下記するようなりワトレカサス等、（１９６ ８）、Ｐｒｏｃ　、　Ｎａｔ’ｌ　、　Ａｃａｄ　。

Ｓｃｉ　、　ＵＳＡ　、第６１巻、第６３６〜６４３頁に記載された臭化シアノ ーダン法によシ調製した。再生セルロース膜をｃＬｌＭのＮ　ａ　ＨＣＯｓ　中 に４℃で懸濁させ、等容量の２．５１ＣＮＢｒ溶液で処理し、ｐＨを連続的に２ ＮＮａＯＨで１１に調整し、そして温度を４℃に保った。８分間後、セルロース 膜を０．１　Ｍ　ＮａＨＣｌｓ　で洗浄し、次いで水と５０チアセトンと最後に １００アセトンとで洗浄した。

次いで、このセルロース膜を１１ｎｔ当り１岬のε−Ｎ−ビオチニル−Ｌ−リジ ンを含有する０、２ＭのＮ　ａ　ＨＣＯｓ（ｐＨ９）において４℃で２０時間培 養し、（バイエル等、（１９７４）メンラド・イン・エンチモロジー、第３４Ｂ 巻、第２６５〜２６７頁）、次いで激しく水洗した。

次いで、ビオチン置換されたセルロース膜をα１Ｍの燐酸塩緩衝液（ｐＨ７ｏ） に浸漬し、そしてほぼ等モル量のアビジン、西洋わさびペルオキシダーゼ及び部 位Ａ“とＢ”　とを有する複製異性抗体決定子と共に２０℃で１時間培養した。

次いで、この膜を緩衝液てゆすぎ、はぼ等モル量の部位Ｃ′及びＤ’を有する複 製異性抗体決定子と１０倍モル過剰のグルコースオキシダーゼとを含有する溶液 へ移した。２０℃で１時間後、この膜を緩衝液で洗浄し、はぼ等モル量の部位Ｅ １及びＦ“を有する複製異性抗体決定子と１０倍モル過剰のβ−ガラクトシダー ゼとを含有する溶液に移し、そして２０℃にて１時間培養し、次いで緩衝液によ り洗浄した。反復使用が予想される場合、この膜は０．１Ｍの燐酸塩緩衝液にお ける０、５％グルタルアルデヒド中（ｐＨ７）に３分間浸漬して安定化される。

上記方法に使用した酵素は純粋である必要はない。上記の例において、これら酵 素は数種の同一サブ単位から構成されているので、モル過剰のβ−ガラクトシダ ーゼとグルコースオキシダーゼとが必要でおった。単量体酵素のみを使用する場 合は、モル過剰の酵素を必要としない。等モル量の酵素と複製異性抗体決定子と を使用する場合、反応は単一段階で進行させることができる。

乳糖の測定については、膜１０を０．１Ｍの燐酸塩緩衝液（、、ｐＨ７）におけ る未知量の乳糖と０〜０１チの０−ジアニシジンとを含有する試料中に浸漬させ 、或いはこの試料で漏らす。

第５図に示したように、試料中の乳糖は先ずβ−ガラクトシダーゼに作用してグ ルコースを生成し、次いでとのグルコースはグルコースオキシダーゼにより酸素 の存在下で作用を受けてＨ２Ｏ２を放′出し、このＨ２Ｏ２はペルオキシダーゼ により０−ジアニンジンを酸化して４６０ｎｍに吸光性を有する黄色染料を生成 する。他の各種の発色性若しくは螢光性物質を０−ジアニシジンの代りに使用す ることもできる。

手続補正書（方式） 昭和５８年１０月２４日 特許庁長官　若　杉−和夫　殿 補正をする者 事件との関係　特許出願人 補正命令通知の日付　昭和５８年９月１３日補正の対象 ／’　””　’−＝、　、ｙ、、、’−’１　！８＋−１ 委任状および翻訳文　各１通 図面の翻訳文　１通 補正の内容　別紙の通り 図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）国際調査報皆

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｔ　同一の複特異性抗体決定子よシなシ、前記各決定子がジスルフィド結合によ り結合された２個のＬ−Ｈ半分子かｌｐ’＆ｊｌ）、前記各Ｌ−Ｈ半分子が異な る抗原決定子に対し特異性であると共にモノクローンエｇＧ抗体の少々くともＦ （ａｂ’）、部分からなることを特徴とする均質試料。 ２２種の異なるモノクローンＩｇＧ抗体決定子より々シ、前記各決定子がジスル フィド結合にょ力結合された２個の同−Ｌ−Ｈ半分子からなり、前記各Ｌ−Ｈ分 子が前記モノクローンＩｇＧ抗体の少なくともＦ（ａｂ’）、部分からなる試料 を調製し、 各試料における前記抗体決定子を前記Ｌ−Ｈ半分子を結合する前記ジスルフィド 結合の少なくとも幾つかを破壊するのに充分な条件にかけて、前記各試料におけ る前記決定子の少なくとも幾つかを２つの半分子に開裂させ、 前記複数試料を各決定子束なくとも幾つかの半分子を他の決定子の少なくとも幾 つかの半分′子と化学的に結合させうる条件下で混合して、同一の複特異性抗体 決定子を生成させ、かつ 前記同一の槍特異性抗体決定子を前記混合物から分離することを特徴とする、同 一の複特異性抗体決定子の均質試料の製造方法。 Ｋ　抗原決定子の少なくとも１つが蛋白質である請求の範囲第１項記載の均質試 料。 ４　蛋白質が酵素である請求の範囲第３項記載の均質試料。 ５．１つの抗原決定子が固体マ）　ＩＪソックス上抗原部位からなり、それによ り複特異性抗体決定子が前記抗原部位において前記マトリックスに結合すること により前記固体マトリックス上に移動化されうる請求の範囲第１項記載の均質試 料。 ６　他方の抗原決定子が酵素上の抗原部位である請求の範囲第５項記載の均質試 料。 ｌ　試料が多層アセンブリからなシ、マトリックス上の抗原部位が前記マトリッ クスに付着されたハプテン分子上の部位であり、 複特異性抗体決定子が前記ハプテン分子に結合され、他方の抗原決定子が第１の 蛋白質分子上の第１の抗原部位からなり、前記複特異性抗体決定子が前記蛋白質 分子に結合され、さらに 前記第１の蛋白質分子にはこの蛋白質分子上の第２抗原部位に前記ハプテン分子 に結合された決定子とは異なる第２の複特異性抗体決定子が結合され、前記各第 ２決定子はジスルフィド結合により結合された２個のＬ−Ｈ半分子からなり、前 記各Ｌ−Ｈ半分子は異なる抗原決定子に対し特異性であや、一方の抗原決定子は 前記第１蛋白質分子上の第２の抗原部位であり、前記各半分子はモノクローンＩ ｇＧ抗体の少なくともＦ（ａｂ’）１部分からなる請求の範囲第５項記載の均質 試料。 ＆　第２の複特異性抗体決定子が特異性である他方の抗原決定子が、第２蛋白質 分子上の抗原部位である請求の範囲第７項記載のアセンブリ。 λ　各第１及び第２蛋白質が酵素である請求の範囲第８項記載のアセンブリ。 １［ｌ物質の測定に有用であシかつ 酵素が、前記物質の尺度となる測定可能な効果を前記物質から生成しうる一連の 反応に関与する請求の範囲第９項記載のアセンブリ。 １ｔ　各複特異性抗体決定子の一方の半分子がβ−ガラクトシダーゼ上の抗原部 位に対し特異性であり、かつ他方の半分子がグルコースオキシダーゼ上の抗原部 位に対し特異性である請求の範囲第１項記載の均質試料。 １２、複特異性抗体決定子の一方の半分子がグルコースオキシダーゼ上の抗原部 位に対し特異性であり、かつ他方の半分子が型Ｉコラーゲン上の抗原部位に対し 特異性である請求の範囲第１項記載の均質試料。 １五各複特異性抗体決定子の一方の半分子がペルオキシダーゼ上の抗原部位に対 し特異性であり、かつ他方の半分子がグルコースオキシダーゼ上の抗原部位に対 し特異性である請求の範囲第１項記載の均質試料。 １４、複特異性抗体決定子の一方の半分子がペルオキシダーゼ上の抗原部位に対 し特異性であり、かつ他方の半分子″がアビジン上の抗原部位に対し特異性であ る請求の範囲第１項記載の均質試料。 １５．１種若しくはそれ以上の酵素により作用を受けて、　・発生したイオン若 しくは化合物が未知物質の尺度となるような測定可能のイオン若しくは化合物を 発生する未知量の物質を試料中で測定するための電極装置において、 前記測定可能なイオン若しくは化合物を測定する手前記測定可能なイオン若しく は化合物を測定する前記手段と関連して、測定すべき物質に作用しかつ前記各酵 素の分子に結合された複数の各酵素の分子、及びそれぞれジスルフィド結合によ シ結合された２個のＬ−Ｈ半分子からなり、各半分子が他方の半分子とは異なシ かつモノクローンＩｇＧ抗体の少なくともＦ（ａｂ’）。 部分からなり一方のＬ−Ｈ半分子がその結合された酵素分子上の抗原部位に対し 特異性でｈＦ）、他方の半分子が前記複特異性抗体決定子の結合されている膜上 の抗原決定子に対し特異性である複数の同−複特異性抗体決定子を有する膜とか らなることを特徴とする電極装置。 １＆測定すべき物質が１種の酵素により作用を受け、複特異性抗体決定子の一方 のＬ−Ｈ半分子が膜に関項記載の電極装置。 １ｚ　測定すべき物質が２種以上の酵素により作用を受け、かつ 酵素の少なくとも１種の分子が、前記酵素分子上の２つの異なる抗原部位におい て２つの異なる複特異性抗体決定子のそれぞれの半分子に結合されている請求の 範囲第１５項記載の電極装置。 １＆測定すべき物質が２種以上の酵素により作用を受け、かつ 酵素の少なくとも２種の分子が、互いに独立して膜に不動化された２種の対応す る異なる複特異性抗体決定子に結合されている請求の範囲第１５項記載の電極装 置。 １ρ測定すべき物質が乳糖であり、 酵素がβ−ガラクトシダーゼ及びグルコースオキシダーゼであシ、かつ 測定可能な化合物が酸素である請求の範囲第１５項記載の電極装置。 ２１　グルコースオキシダーゼの分子が、このグルコースオキシダーゼ分子上の ２つの異なる抗原部位において２つの異なる複特異性抗体決定子に結合されてい る請求の範囲第１９項記載の電極装置。