JPS6036754B2 - グリセリンの測定法 - Google Patents
グリセリンの測定法Info
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- JPS6036754B2 JPS6036754B2 JP56014455A JP1445581A JPS6036754B2 JP S6036754 B2 JPS6036754 B2 JP S6036754B2 JP 56014455 A JP56014455 A JP 56014455A JP 1445581 A JP1445581 A JP 1445581A JP S6036754 B2 JPS6036754 B2 JP S6036754B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は一定のグリセリンオキシダーゼを用いてグリセ
リンを酵素的に測定するための方法に関する。
リンを酵素的に測定するための方法に関する。
トリグリセリド（長鏡脂肪酸のグリセリンェステル）の
測定は医学的診断にとって非常に重要である。
測定は医学的診断にとって非常に重要である。
皿中の上昇したトリグリセリド含量は動脈硬化症の主要
な危険因子である。高いトリグリセリド値、すなわち高
トリグリセリド症の場合、低いトリグリセリド値におけ
るより冠状動脈不全及び心臓硬茎がいよいよ起こる。高
トリグリセリド症により動脈硬化症及び冠状動脈症にか
かりやすくなるので、これを早期に発見し、ちようどよ
い時期に治療を開始しなければならない。従って、迅速
で信頼のできるトリグリセリドもしくはグリセリンの測
定法は大きな意義を有する。使用可能な公知のトリグリ
セリド測定法はリパーゼ／ェステラーゼを用いてのトリ
グリセリドの酵素的加水分解及び例えばグリセロキナー
ゼ／ピルピン酸キナーゼ／乳酸デヒドロゲナーゼを用い
ての又はグリセリンオキシダーゼを用いての遊離グリセ
リン測定を基礎とする（西ドイツ特許公告第２８１７０
８７号公報）。
な危険因子である。高いトリグリセリド値、すなわち高
トリグリセリド症の場合、低いトリグリセリド値におけ
るより冠状動脈不全及び心臓硬茎がいよいよ起こる。高
トリグリセリド症により動脈硬化症及び冠状動脈症にか
かりやすくなるので、これを早期に発見し、ちようどよ
い時期に治療を開始しなければならない。従って、迅速
で信頼のできるトリグリセリドもしくはグリセリンの測
定法は大きな意義を有する。使用可能な公知のトリグリ
セリド測定法はリパーゼ／ェステラーゼを用いてのトリ
グリセリドの酵素的加水分解及び例えばグリセロキナー
ゼ／ピルピン酸キナーゼ／乳酸デヒドロゲナーゼを用い
ての又はグリセリンオキシダーゼを用いての遊離グリセ
リン測定を基礎とする（西ドイツ特許公告第２８１７０
８７号公報）。
しかしながら、この公知法は大きな欠点を示す。
すなわち、グリセロキナーゼ法においてのこの試薬の安
定性は多くの不安定な補酵素及び酵素が存在するので僅
かであり、常に試料の空値測定を実施しなければならな
い。公知のグリセリンオキシダーゼ法においては、この
酵素がこれを含有する公知の微生物中に全くわずかにし
か存在せず、更に３０Ｕ／の９程度の低い比活性を示す
という重要な欠点がある。従って、本発明の課題は従来
公知のグリセリンオキシダーゼ法の欠点を示さず、かつ
その利点を保持するよなトリグリセリドもしくはグリセ
リンの新規測定法をみし、だすことである。
定性は多くの不安定な補酵素及び酵素が存在するので僅
かであり、常に試料の空値測定を実施しなければならな
い。公知のグリセリンオキシダーゼ法においては、この
酵素がこれを含有する公知の微生物中に全くわずかにし
か存在せず、更に３０Ｕ／の９程度の低い比活性を示す
という重要な欠点がある。従って、本発明の課題は従来
公知のグリセリンオキシダーゼ法の欠点を示さず、かつ
その利点を保持するよなトリグリセリドもしくはグリセ
リンの新規測定法をみし、だすことである。
この課題は本発明によりグリセリンオキシダーゼの存在
下に酸素で酸化し、酸素消費量又は比０２一形成量を測
定し、グリセリンを測定する際に、アスベルギルスｓｐ
ｅｃ．（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｐｅｃ．）ＢＭＴＵ
Ｉ９９７−１（ＤＳＭ１７２９）（徴工研菌寄託番号第
５８６び号）からのグリセリンオキシダーゼを使用する
ことよりなるグリセリンの測定法により解決する。
下に酸素で酸化し、酸素消費量又は比０２一形成量を測
定し、グリセリンを測定する際に、アスベルギルスｓｐ
ｅｃ．（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｐｅｃ．）ＢＭＴＵ
Ｉ９９７−１（ＤＳＭ１７２９）（徴工研菌寄託番号第
５８６び号）からのグリセリンオキシダーゼを使用する
ことよりなるグリセリンの測定法により解決する。
本発明は公知のグリセリンオキシダーゼ含有微生物に比
較して約数１Ｍ音高いグリセリンオキシダーゼ含量を示
すだけでなく、更に非常に高い比活性を有するグリセリ
ンオキシダーゼをも含有する微生物アスベルギルスｓｐ
ｅｃ．ＢＭＴＵＩ９９７一１（ＤＳＭ１７２９）の意想
外な発見に基づく。
較して約数１Ｍ音高いグリセリンオキシダーゼ含量を示
すだけでなく、更に非常に高い比活性を有するグリセリ
ンオキシダーゼをも含有する微生物アスベルギルスｓｐ
ｅｃ．ＢＭＴＵＩ９９７一１（ＤＳＭ１７２９）の意想
外な発見に基づく。
本発明方法の範囲において、これに関して自体公知の方
法により酸素消費量又は生じた日２Ｑを測定することが
出釆る。酸消費量は酸素電極を用いてポラロメトリーに
より測定するのが有利である。それというのもこの方法
に自動操作に好適であるためである。これに関して西ド
イツ国特許公開第２１３０３４び号、同第２１３０３０
８号公報に記載された水性媒体中の酸素消費量のポラロ
メトリ一柳定法が好適である。他の好適な方法はガスク
ロマトグラフイ‐である。形成された日２０２は滴定法
によっても、ポテンシオメトリー、ポーラログラフイー
及び比色定量法並びに酵素法によっても測定できる。
法により酸素消費量又は生じた日２Ｑを測定することが
出釆る。酸消費量は酸素電極を用いてポラロメトリーに
より測定するのが有利である。それというのもこの方法
に自動操作に好適であるためである。これに関して西ド
イツ国特許公開第２１３０３４び号、同第２１３０３０
８号公報に記載された水性媒体中の酸素消費量のポラロ
メトリ一柳定法が好適である。他の好適な方法はガスク
ロマトグラフイ‐である。形成された日２０２は滴定法
によっても、ポテンシオメトリー、ポーラログラフイー
及び比色定量法並びに酵素法によっても測定できる。
カタラーゼ及びベルオキシダーゼを使用しての酵素法は
有利である。それというのもこれは非常に特異的であり
、かつ信頼出来るものであるだけでなく、過酸化水素を
形成する主反応と最も簡単な方法で組合わせることがで
き、特に８ージケトン、例えばアセチルアセトン及びメ
タノールもしくはエタノール又はメチレングリコールの
存在下でのカタラーゼを用いての測定並びに１個以上の
色原体の存在下でのベルオキシターゼを用いての測定が
好適であることが判明する。カタラーゼ、アセチルアセ
トン及びメタノールを用いての測定において、メタノー
ルはアセチルアセトンと共に呈色反応を起こすホルムア
ルデヒドーこ酸化され、これを測定することができる。
ベルオキシターゼを用いて測定を行なう場合、反応後灘
光法により測定することができる化合物を色原体として
使用する。好適な色原体の例は２，２−アミノベンズチ
アゾＩＪンースルホン酸である。他の有利な例はトリン
ダー（Ｔｒｉｎｄｅｒ）による指示薬システムであり（
抑ｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第６巻（１９６９年
）、第２４〜２７頁）、ここではフェノールを４−アミ
ノアンチピリン（４−ＡＡｐ）とベルオキシダーゼ（Ｐ
ＯＤ）の存在下に、比０２の作用下に酸化的に結合させ
色素とする。フェノールのかわりにフェノール誘導体、
アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール務導体、ナフ
チルアミン、ナフチルアミン誘導体、アミノキノリン、
ヒドロキシキノリン、ジヒドロキシフェニル酢酸及び同
じように反応する物質を使用することができる。４−ア
ミノアンチピリンの代わりに４−アミノアンチピリン誘
導体、フェニレンジアミンスルホン酸、ＭＢＴＨ（メチ
ルベンゾチアゾロンヒドラゾン）、Ｓ−ＭＢＴＨ（スル
ホン化メチルベンゾチアゾロンヒドラゾン）、ＭＢＴＨ
誘導体、Ｓ−ＭＢＴＨ譲導体並びに同様に反応する物質
を使用することができる。
有利である。それというのもこれは非常に特異的であり
、かつ信頼出来るものであるだけでなく、過酸化水素を
形成する主反応と最も簡単な方法で組合わせることがで
き、特に８ージケトン、例えばアセチルアセトン及びメ
タノールもしくはエタノール又はメチレングリコールの
存在下でのカタラーゼを用いての測定並びに１個以上の
色原体の存在下でのベルオキシターゼを用いての測定が
好適であることが判明する。カタラーゼ、アセチルアセ
トン及びメタノールを用いての測定において、メタノー
ルはアセチルアセトンと共に呈色反応を起こすホルムア
ルデヒドーこ酸化され、これを測定することができる。
ベルオキシターゼを用いて測定を行なう場合、反応後灘
光法により測定することができる化合物を色原体として
使用する。好適な色原体の例は２，２−アミノベンズチ
アゾＩＪンースルホン酸である。他の有利な例はトリン
ダー（Ｔｒｉｎｄｅｒ）による指示薬システムであり（
抑ｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第６巻（１９６９年
）、第２４〜２７頁）、ここではフェノールを４−アミ
ノアンチピリン（４−ＡＡｐ）とベルオキシダーゼ（Ｐ
ＯＤ）の存在下に、比０２の作用下に酸化的に結合させ
色素とする。フェノールのかわりにフェノール誘導体、
アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール務導体、ナフ
チルアミン、ナフチルアミン誘導体、アミノキノリン、
ヒドロキシキノリン、ジヒドロキシフェニル酢酸及び同
じように反応する物質を使用することができる。４−ア
ミノアンチピリンの代わりに４−アミノアンチピリン誘
導体、フェニレンジアミンスルホン酸、ＭＢＴＨ（メチ
ルベンゾチアゾロンヒドラゾン）、Ｓ−ＭＢＴＨ（スル
ホン化メチルベンゾチアゾロンヒドラゾン）、ＭＢＴＨ
誘導体、Ｓ−ＭＢＴＨ譲導体並びに同様に反応する物質
を使用することができる。
本発明の方法に使用するグリセリンの測定試薬としては
アスベルギルスｓｐｅｃ．ＢＭＴＵＩ９９７一１（ＤＳ
Ｍ１７２９）からのグリセリンオキシダーゼ及び比０２
の測定システムから成る試薬をあげることができる。有
利にこの試薬はェステル化グリセリンの鹸化のための付
加的な薬剤、特にルぐ−ゼ／ェステラーゼ又はェステラ
ーゼを含有する。このために好適な試薬は専門家に公知
であり、ここで更に詳細に説明する必要はない。有利な
実施形式によれば、該試薬は主にグリセリンオキシダー
ゼ、カタラーゼ、アセチルアセトン、メタノール及び緩
衝剤から、個別に又混合してなる。
アスベルギルスｓｐｅｃ．ＢＭＴＵＩ９９７一１（ＤＳ
Ｍ１７２９）からのグリセリンオキシダーゼ及び比０２
の測定システムから成る試薬をあげることができる。有
利にこの試薬はェステル化グリセリンの鹸化のための付
加的な薬剤、特にルぐ−ゼ／ェステラーゼ又はェステラ
ーゼを含有する。このために好適な試薬は専門家に公知
であり、ここで更に詳細に説明する必要はない。有利な
実施形式によれば、該試薬は主にグリセリンオキシダー
ゼ、カタラーゼ、アセチルアセトン、メタノール及び緩
衝剤から、個別に又混合してなる。
もう１つの有利な実施形式は主にグリセリンオキシダー
ゼ、ベルオキシダーゼ、少なくとも１種の色原体及び緩
衝剤から、個別に又は混合してなる。グリセリンオキシ
ダーゼとは以下常にア ス ベ ル ギ ル ス ｓｐ
ｅｃ．ＢＭＴＵＩ９９７ 一 １（ＤＳＭ１７２９）か
らのグリセリンオキシダーゼのことを示す。色指示シス
テムはトリンダーによるシステムが有利である。前記の
有利な試薬組成物は前記の必須成分の他に付加的に常用
の溶剤、安定剤又は／及び界面活性物質を含有してよい
。
ゼ、ベルオキシダーゼ、少なくとも１種の色原体及び緩
衝剤から、個別に又は混合してなる。グリセリンオキシ
ダーゼとは以下常にア ス ベ ル ギ ル ス ｓｐ
ｅｃ．ＢＭＴＵＩ９９７ 一 １（ＤＳＭ１７２９）か
らのグリセリンオキシダーゼのことを示す。色指示シス
テムはトリンダーによるシステムが有利である。前記の
有利な試薬組成物は前記の必須成分の他に付加的に常用
の溶剤、安定剤又は／及び界面活性物質を含有してよい
。
これら添加物すべては専門家に公知であり、過酸化水素
のための検出システムにおいて常用である、緩衝剤とし
てはｐＨ５〜１０、有利にｐＨ６〜９を緩衝する物質が
好適である。好適な緩衝剤の典型的な例は燐酸塩緩衝剤
、トリス−緩衝剤、ＴＲＡ−緩衝剤、酢酸塩緩衝剤及び
Ｈｅｐｅｓ−緩衝剤（Ｎ−２−ヒドロキシェチルピベラ
ジン−Ｎ−ェタンースルホン酸）である。前記の試薬配
合物は次の量比で王なる成分を含有する：グリセリンオ
キシダーゼ ２〜１５０Ｕ／の【、ベルオキシター
ゼ ０．５〜１００Ｕ／私、少なくとも１種の
色原体０．０５〜２０ミリモルノ夕、 並びに 少なくとも１種の界面活性剤 ０．００１〜０．１ｇ
／私緩衝剤 ＰＨ６〜９。
のための検出システムにおいて常用である、緩衝剤とし
てはｐＨ５〜１０、有利にｐＨ６〜９を緩衝する物質が
好適である。好適な緩衝剤の典型的な例は燐酸塩緩衝剤
、トリス−緩衝剤、ＴＲＡ−緩衝剤、酢酸塩緩衝剤及び
Ｈｅｐｅｓ−緩衝剤（Ｎ−２−ヒドロキシェチルピベラ
ジン−Ｎ−ェタンースルホン酸）である。前記の試薬配
合物は次の量比で王なる成分を含有する：グリセリンオ
キシダーゼ ２〜１５０Ｕ／の【、ベルオキシター
ゼ ０．５〜１００Ｕ／私、少なくとも１種の
色原体０．０５〜２０ミリモルノ夕、 並びに 少なくとも１種の界面活性剤 ０．００１〜０．１ｇ
／私緩衝剤 ＰＨ６〜９。
動力学的測定のために試薬配合物を使用すべき場合、次
の量比が有利である：グリセリンオキシダーゼ １００
〜２５０ＫＵ／夕、ベルオキシターゼ ５〜５
皿Ｕ／そ、色原体 ０．２〜５ミリモ
ル／〆及び場合により少なくとも１種の界面活性剤
１〜５ｇ／そ又はこれらの数倍量、及び緩衝剤 ｐＨ
６．８〜８．０グリセリンオキシダーゼを獲得するため
に使用した微生物アスベルギルスｓｐｅｃ．ＢＭＴＵＩ
９９７一１（ＤＳＭ１７２９）の培養は主成分としてグ
リセリン、麦芽エキス及び酵母エキス、その他に緩衝剤
、塩及び徴量元素を含有する培地を使用して自体公知法
で行なう。
の量比が有利である：グリセリンオキシダーゼ １００
〜２５０ＫＵ／夕、ベルオキシターゼ ５〜５
皿Ｕ／そ、色原体 ０．２〜５ミリモ
ル／〆及び場合により少なくとも１種の界面活性剤
１〜５ｇ／そ又はこれらの数倍量、及び緩衝剤 ｐＨ
６．８〜８．０グリセリンオキシダーゼを獲得するため
に使用した微生物アスベルギルスｓｐｅｃ．ＢＭＴＵＩ
９９７一１（ＤＳＭ１７２９）の培養は主成分としてグ
リセリン、麦芽エキス及び酵母エキス、その他に緩衝剤
、塩及び徴量元素を含有する培地を使用して自体公知法
で行なう。
予培地としては有利にグリセリン１〜１０雌／夕、麦芽
エキス１〜５０ｇ／〆、酵母エキス１〜１雌／ぞ、綿の
実粉１〜１０雌／夕並びにＫ２ＨＰ０４．２ＬＯＯ．２
〜５ｇノ〆（又は他のＫ２ＨＰ０４一調剤の当量）、Ｋ
Ｎ０３０．２〜５ｇ／そ、ＣａＣ０３０．１〜斑／そ、
ＮａＣＩ Ｏ．１〜１ｇ／そ、ＦｅＳ０４０．００１〜
０．１ｇノ〆（７水和物として測定）及びＭｇＳＱＯ．
１〜５ｇ／〆（７水和物として測定）を有する培地を使
用する。主塔地にはグリセＩＪン２０〜２００ｇ／〆、
麦芽エキス５〜１０雌／〆、酵母エキス０．５〜舵／そ
、燐酸−水素カリウム０．２〜５ｇノ夕、ＫＮ０３０．
２〜聡／そ、ＣａＣ０３ ０．１〜５ｇ／そ、ＮａＣＩ
Ｏ．１〜１ｇ／そ、硫酸第１鉄０．００１〜０．１ｇ
ノそ及び硫酸マグネシウム０．１〜５ｇ／夕を有する培
地を使用するのが有利である。
エキス１〜５０ｇ／〆、酵母エキス１〜１雌／ぞ、綿の
実粉１〜１０雌／夕並びにＫ２ＨＰ０４．２ＬＯＯ．２
〜５ｇノ〆（又は他のＫ２ＨＰ０４一調剤の当量）、Ｋ
Ｎ０３０．２〜５ｇ／そ、ＣａＣ０３０．１〜斑／そ、
ＮａＣＩ Ｏ．１〜１ｇ／そ、ＦｅＳ０４０．００１〜
０．１ｇノ〆（７水和物として測定）及びＭｇＳＱＯ．
１〜５ｇ／〆（７水和物として測定）を有する培地を使
用する。主塔地にはグリセＩＪン２０〜２００ｇ／〆、
麦芽エキス５〜１０雌／〆、酵母エキス０．５〜舵／そ
、燐酸−水素カリウム０．２〜５ｇノ夕、ＫＮ０３０．
２〜聡／そ、ＣａＣ０３ ０．１〜５ｇ／そ、ＮａＣＩ
Ｏ．１〜１ｇ／そ、硫酸第１鉄０．００１〜０．１ｇ
ノそ及び硫酸マグネシウム０．１〜５ｇ／夕を有する培
地を使用するのが有利である。
個々の塩は前記予培地で記載したものと相応するもので
ある。予塔地は通気下に２５〜４０ｏ○の温度で振縄塔
地として行なうのがよい。
ある。予塔地は通気下に２５〜４０ｏ○の温度で振縄塔
地として行なうのがよい。
培養期間は一般に２０〜６餌時間である。温度及び培養
期間は主塔地においても同様である。
期間は主塔地においても同様である。
小さな発酵器中で空気０．５〜１〃／分／そ塔地を導入
する際特に良好な結果が得られる。培養終了後、この生
物塊を常法で分離し、この細胞を砕解する。常用の砕解
法を使用することができるが、機械的に砕解するのが有
利である。砕解溶液を例えば遠心分離又は吸引濠過する
ことにより除去する。この得られた溶液をそのまま直接
グリセリン測定に使用することができる。しかし更にこ
の酵素を精製するのが有利である。精製は酵素分割のた
めに常用の生物学的方法により行なうことができる。
する際特に良好な結果が得られる。培養終了後、この生
物塊を常法で分離し、この細胞を砕解する。常用の砕解
法を使用することができるが、機械的に砕解するのが有
利である。砕解溶液を例えば遠心分離又は吸引濠過する
ことにより除去する。この得られた溶液をそのまま直接
グリセリン測定に使用することができる。しかし更にこ
の酵素を精製するのが有利である。精製は酵素分割のた
めに常用の生物学的方法により行なうことができる。
しかし特に好適であるのは酵素分割において常用されな
い方法、つまりトリクロル酢酸での沈殿であることが判
明した。通常、トリク。ル酢酸添加は、蛋白質を有さな
い溶液にのみ興味がある場合、蛋白質の完全な沈殿、す
なわち蛋白質除去のためのみ行なわれる。意ｖ想外にも
、本発明による酵素がトリクロル酢酸により活性損失な
いこ、かつ高い濃縮効率で沈殿するということが判明し
た。この際、この沈殿を、府５．４〜４．６の範囲の解
値までトリクロル酢酸を添加することにより行なう。分
離した沈殿中に比活性約３００Ｕ／雌を有する所望の酵
素が見い出された。更に精製が所望の場合には、アセト
ン沈殿、引き続き硫酸アンモニウム分割並びに弱塩基性
交換樹脂での最後の処理により行なうのが有利である。
い方法、つまりトリクロル酢酸での沈殿であることが判
明した。通常、トリク。ル酢酸添加は、蛋白質を有さな
い溶液にのみ興味がある場合、蛋白質の完全な沈殿、す
なわち蛋白質除去のためのみ行なわれる。意ｖ想外にも
、本発明による酵素がトリクロル酢酸により活性損失な
いこ、かつ高い濃縮効率で沈殿するということが判明し
た。この際、この沈殿を、府５．４〜４．６の範囲の解
値までトリクロル酢酸を添加することにより行なう。分
離した沈殿中に比活性約３００Ｕ／雌を有する所望の酵
素が見い出された。更に精製が所望の場合には、アセト
ン沈殿、引き続き硫酸アンモニウム分割並びに弱塩基性
交換樹脂での最後の処理により行なうのが有利である。
アセトン沈殿の際、この溶液にアセトン０．２５〜０．
３５容量を加える。硫酸アンモニウム分割を０．５〜２
．０のモル濃度で実施するのが有利である。この操作は
すでに８００Ｕ／雌より高い比活性に導びく。弱塩基性
イオン交換樹脂、有利にジェチルァミノェタノール基含
有網状デキストラン（ＤＥＡＥ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ）で
の処理は更に３〜１ぴ音の精製を与え、約２５００〜８
０００Ｕ／の９の比活性を有するグリセリンオキシダー
ゼに導びく。本発明により使用した微生物をもちいて、
すでに１５００００〜２０００００Ｕ／その培地の活性
が得られるので、この方法でグリセリン測定に必要なグ
リセリンオキシダーゼ量が急激に減少し、この製造は著
しく安くなる。前記培養法及び精製法は酵素を培養の間
培地に放出しないということを前提とする。
３５容量を加える。硫酸アンモニウム分割を０．５〜２
．０のモル濃度で実施するのが有利である。この操作は
すでに８００Ｕ／雌より高い比活性に導びく。弱塩基性
イオン交換樹脂、有利にジェチルァミノェタノール基含
有網状デキストラン（ＤＥＡＥ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ）で
の処理は更に３〜１ぴ音の精製を与え、約２５００〜８
０００Ｕ／の９の比活性を有するグリセリンオキシダー
ゼに導びく。本発明により使用した微生物をもちいて、
すでに１５００００〜２０００００Ｕ／その培地の活性
が得られるので、この方法でグリセリン測定に必要なグ
リセリンオキシダーゼ量が急激に減少し、この製造は著
しく安くなる。前記培養法及び精製法は酵素を培養の間
培地に放出しないということを前提とする。
しかしながら、界面活性剤の存在下に培養することによ
り培地中に少なくとも活性の１部が移る。同機に、得ら
れた細胞からの界面活性剤での抽出も可能である。しか
しながら、この結果は機械的砕解、例えば高圧分散にお
ける結果より劣っている。本発明に使用する酵素は従釆
公知のグリセリンオキシダーゼと特に著しく低い分子量
により異なっている。例えば従来グリセリン測定に使用
したグリセリンアルデヒド形成グリセリンオキシダーゼ
が分子量少なくとも３０００００を示すのに対し、本発
明に使用する酵素はわずか約９００００の分子量を示す
。更に、本発明による酵素の活性は硫酸鋼又は酢酸鉛に
より抑制されず、一方ＳＨ−試薬は阻止する。それに反
し、前記の公知グリセリンオキシダーゼの場合はＳＨ−
試薬は安定化させ、硫酸銅及び酢酸鉛は活性を約９０％
まで抑制する。その他の主な差は公知の酵素の比活性が
約３０Ｕ／のりであるのに対し本発明に使用する酵素の
比活性は２０００〜８０００Ｕ／雌であるということで
ある。更に、該酵素の安定性はｐＨ５．０もしくはｐＨ
１０．０で著しくより良好であり、３７０における１び
分後の活性はこの条件下ではなお５０〜５５％を有し、
それに対し公３印の酵素は６もしくは３％を示す。本発
明の方法はすべての種類の水性媒体、例えば食品抽出物
、体液及び特に血清中のグリセリンもしくはグリセリン
エステル（トリグリセリド）の測定に好適である。
り培地中に少なくとも活性の１部が移る。同機に、得ら
れた細胞からの界面活性剤での抽出も可能である。しか
しながら、この結果は機械的砕解、例えば高圧分散にお
ける結果より劣っている。本発明に使用する酵素は従釆
公知のグリセリンオキシダーゼと特に著しく低い分子量
により異なっている。例えば従来グリセリン測定に使用
したグリセリンアルデヒド形成グリセリンオキシダーゼ
が分子量少なくとも３０００００を示すのに対し、本発
明に使用する酵素はわずか約９００００の分子量を示す
。更に、本発明による酵素の活性は硫酸鋼又は酢酸鉛に
より抑制されず、一方ＳＨ−試薬は阻止する。それに反
し、前記の公知グリセリンオキシダーゼの場合はＳＨ−
試薬は安定化させ、硫酸銅及び酢酸鉛は活性を約９０％
まで抑制する。その他の主な差は公知の酵素の比活性が
約３０Ｕ／のりであるのに対し本発明に使用する酵素の
比活性は２０００〜８０００Ｕ／雌であるということで
ある。更に、該酵素の安定性はｐＨ５．０もしくはｐＨ
１０．０で著しくより良好であり、３７０における１び
分後の活性はこの条件下ではなお５０〜５５％を有し、
それに対し公３印の酵素は６もしくは３％を示す。本発
明の方法はすべての種類の水性媒体、例えば食品抽出物
、体液及び特に血清中のグリセリンもしくはグリセリン
エステル（トリグリセリド）の測定に好適である。
この方法の大きな特異性により遊離のグリセリンだけが
測定される。先ず第１に興味のあるェステル化グリセリ
ンの測定は、この化合物の鹸化により行なわれる。鹸化
を酵素により行なうことが有利である。それというのも
、こうして鹸化を本来のグリセリン測定と同時に行なう
ことができる。次に実施例につき本発明を詳細に説明す
る。
測定される。先ず第１に興味のあるェステル化グリセリ
ンの測定は、この化合物の鹸化により行なわれる。鹸化
を酵素により行なうことが有利である。それというのも
、こうして鹸化を本来のグリセリン測定と同時に行なう
ことができる。次に実施例につき本発明を詳細に説明す
る。
例１１ 微生物の培養
グリセリン１雌／ぞ、麦芽エキス１雌／そ、酵母エキス
聡ノそ、綿実粉１雌／そ、Ｋ２Ｐ０４・細２０ １．鬼
ノク、ＫＮＱ Ｉｇ／そ、ＣａＣ０３２．雌／そ、Ｎａ
ＣＩ Ｏ．５／そ、ＦｅＳ０４・７ＱＯＯ．０１ｇ／そ
及びＭｇＳ０４・７日２０ １．０ｇ／そを含有する予
塔地６０のとをァスベルギルスＳｐｅＣ．ＢＭＴＵＩ９
９７一１（ＤＳＭ１７２９）の胞子で接種し、３０ｏｏ
で４鞘時間通気下に振鶴する。
聡ノそ、綿実粉１雌／そ、Ｋ２Ｐ０４・細２０ １．鬼
ノク、ＫＮＱ Ｉｇ／そ、ＣａＣ０３２．雌／そ、Ｎａ
ＣＩ Ｏ．５／そ、ＦｅＳ０４・７ＱＯＯ．０１ｇ／そ
及びＭｇＳ０４・７日２０ １．０ｇ／そを含有する予
塔地６０のとをァスベルギルスＳｐｅＣ．ＢＭＴＵＩ９
９７一１（ＤＳＭ１７２９）の胞子で接種し、３０ｏｏ
で４鞘時間通気下に振鶴する。
このようにして得られた予培地３６０の‘をグリセリン
１０雌／夕、麦芽エキス４雌／そ、酵母エキス２．舷／
夕、Ｋ２ＨＰ０４・汎２０ １．舷／〆、ＫＮ０３ １
．咳／そ、ＣａＣＱ ２．雌／そ、ＮａＣＩＯ．斑ノク
、ＦｅＳ０４・７日２０ ０．０１ｇ／そ及びＭｇＳ０
４・７日２０ １．雌ノ〆を含有する主塔地１５〆中に
加える。６０比．ｐ．ｍ．で壇拝し、空気１０夕／分で
通気された２５発酵器中で３０午○で主培養を行なった
。
１０雌／夕、麦芽エキス４雌／そ、酵母エキス２．舷／
夕、Ｋ２ＨＰ０４・汎２０ １．舷／〆、ＫＮ０３ １
．咳／そ、ＣａＣＱ ２．雌／そ、ＮａＣＩＯ．斑ノク
、ＦｅＳ０４・７日２０ ０．０１ｇ／そ及びＭｇＳ０
４・７日２０ １．雌ノ〆を含有する主塔地１５〆中に
加える。６０比．ｐ．ｍ．で壇拝し、空気１０夕／分で
通気された２５発酵器中で３０午○で主培養を行なった
。
培養期間２２時間後、活性は１７４８００Ｕ／１であっ
た。
た。
活性測定を０．１モルＴＲＡ−緩衝剤中、ｐＨ ８で、
温度２５℃でｐ−クロルフェノール及び４−アミノアン
チピリンを用いて５４節帆で行なった。２ 酵素の精製 前記のようにして得られた乾燥塊１０雌を０．０２モル
酢酸塩緩衝剤、ｐＨ（６．０）５そ中に懸濁させ高圧分
散により砕解する。
温度２５℃でｐ−クロルフェノール及び４−アミノアン
チピリンを用いて５４節帆で行なった。２ 酵素の精製 前記のようにして得られた乾燥塊１０雌を０．０２モル
酢酸塩緩衝剤、ｐＨ（６．０）５そ中に懸濁させ高圧分
散により砕解する。
引き続き、遠心分離を行ない、沈殿をすてる。上燈に０
．１モルトリクロル酢酸溶液を加え、ｐＨ値を４．８と
する。
．１モルトリクロル酢酸溶液を加え、ｐＨ値を４．８と
する。
この沈殿を遠心分離する。これは比活性３００Ｕ／の９
を示す。３ 精密な精製 トリクロル酢酸沈殿による沈殿を０．１モル、酢酸塩緩
衝剤、ｐＨ（６．０）、５００泌に溶かし、０℃でァセ
トン０．２容量を加える。
を示す。３ 精密な精製 トリクロル酢酸沈殿による沈殿を０．１モル、酢酸塩緩
衝剤、ｐＨ（６．０）、５００泌に溶かし、０℃でァセ
トン０．２容量を加える。
生じた沈殿を遠心分離し、新たに０．１モル酢酸塩緩衝
剤、ｐＨ６．０に溶かす。このようにして得られた酵素
溶液に硫酸アンモニウムをモル濃度１．０まで添加する
。この沈殿を遠心分離する。その比活性は約８００Ｕ／
の９である。この沈殿を新たに硫酸アンモニウム分割に
おけると同じ緩衝剤中に溶かし、同じ緩衝剤に対し透析
し、次いでＤＥＡＥーセフアデックス（Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘ、同じ緩衝剤に対し平衡にする。
剤、ｐＨ６．０に溶かす。このようにして得られた酵素
溶液に硫酸アンモニウムをモル濃度１．０まで添加する
。この沈殿を遠心分離する。その比活性は約８００Ｕ／
の９である。この沈殿を新たに硫酸アンモニウム分割に
おけると同じ緩衝剤中に溶かし、同じ緩衝剤に対し透析
し、次いでＤＥＡＥーセフアデックス（Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘ、同じ緩衝剤に対し平衡にする。
）と混合し、１時間礎拝する。次いで、交ｆ期樹脂を同
じ緩衝剤で洗浄し、０．２モル酢酸塩緩衝剤、ｐＨ６．
０で分別溶雛する。活性のフラクションを合併する。こ
のようにして得られた生成物の比活性は個々のフラクシ
ョンにおいて２５００〜８０００Ｕ／の９の間である。
例２ 日２０−形成を介してのグリセリンの測定；２種類の試
薬を製造する：試薬１： トリエタノールアミン／ ＰＨ８．０ ０．１モル／〆、 ＨＣＩ−緩衝剤 イントリデシルエーテル ３．６ミリモル／夕もしくはを／そ、 コール酸ナトリウム ４．７ミリモル／夕もしくは滋／Ｚ、 ｐークロルフエノール １０ミリモル／Ｚ、ァミノ置
換 ４ーアミノアンチピリン ０．５ミ
リモル／〆、ベルオキシターゼ １０
Ｕ／の【。
じ緩衝剤で洗浄し、０．２モル酢酸塩緩衝剤、ｐＨ６．
０で分別溶雛する。活性のフラクションを合併する。こ
のようにして得られた生成物の比活性は個々のフラクシ
ョンにおいて２５００〜８０００Ｕ／の９の間である。
例２ 日２０−形成を介してのグリセリンの測定；２種類の試
薬を製造する：試薬１： トリエタノールアミン／ ＰＨ８．０ ０．１モル／〆、 ＨＣＩ−緩衝剤 イントリデシルエーテル ３．６ミリモル／夕もしくはを／そ、 コール酸ナトリウム ４．７ミリモル／夕もしくは滋／Ｚ、 ｐークロルフエノール １０ミリモル／Ｚ、ァミノ置
換 ４ーアミノアンチピリン ０．５ミ
リモル／〆、ベルオキシターゼ １０
Ｕ／の【。
試薬２：グリセリンオキシダーゼ ５００Ｕ／
の‘。
の‘。
測定を実施するために試薬１ ２の上試薬２０．２泌を
クベット中に測り入れる。吸光度Ｅ，を測定器を用いて
５４節皿で読み取る。引き続き、試料２岬１を添加し、
反応を開始する。遊離のグリセリンを測定するために、
試料としてすべての種類の水性媒体、例えば食品抽出物
、体液及び特に血清を使用することができ、トリグリセ
リドの測定のためには鹸化の後、使用することができる
。２０分間の反応時間後、吸光度Ｅ２を読みとる。垣温
保持温度は２５ｑｏである。評価は、グリセリン標準溶
液の側定吸光度差△Ｅ＝Ｅ２−Ｅ，をグリセリン濃度も
しくはトリグリセリド濃度に関連させた検量線により行
なう（第２図参照）。
クベット中に測り入れる。吸光度Ｅ，を測定器を用いて
５４節皿で読み取る。引き続き、試料２岬１を添加し、
反応を開始する。遊離のグリセリンを測定するために、
試料としてすべての種類の水性媒体、例えば食品抽出物
、体液及び特に血清を使用することができ、トリグリセ
リドの測定のためには鹸化の後、使用することができる
。２０分間の反応時間後、吸光度Ｅ２を読みとる。垣温
保持温度は２５ｑｏである。評価は、グリセリン標準溶
液の側定吸光度差△Ｅ＝Ｅ２−Ｅ，をグリセリン濃度も
しくはトリグリセリド濃度に関連させた検量線により行
なう（第２図参照）。
試験配合物中の濃度は次のようである：
トリエタノールアミン／
ＨＣＩ−緩衝剤、ｐＨ８０ ０．０９モル／そ
、イントリデシルエーテル１．礎ノぞ（３．２ミリモル
／〆）、 コール酸ナトリウム ４．３ミリモル／ど、Ｐ−ク
ロルフヱノール ９ミリモル／そ、アミノ置換４−
アミノアンチピリン ０．４５ミリモル／そ
、ベルオキシターゼ ９Ｕ／の【、グ
リセリンオキシダーゼ ４５Ｕ／の‘。
、イントリデシルエーテル１．礎ノぞ（３．２ミリモル
／〆）、 コール酸ナトリウム ４．３ミリモル／ど、Ｐ−ク
ロルフヱノール ９ミリモル／そ、アミノ置換４−
アミノアンチピリン ０．４５ミリモル／そ
、ベルオキシターゼ ９Ｕ／の【、グ
リセリンオキシダーゼ ４５Ｕ／の‘。
例３酸素消費量を用いてのグリセリンの測定
第１図に示した装置を使用する。
この装置は内径１４３肌及び内高２２仇帆を有する透明
なプラスチック製の円筒状の室のかたちの反応容器１か
らなる。この室は０．２モルカリウム燐酸緩衝剤、ｐＨ
６．８中の沃化カリウム１８ミリモル、（ｔ）モリブデ
ン酸アンモニウム７．５ミリモル、塩化ナトリウム８０
０ミリモル及びグリセリンオキシダーゼ５０Ｕの溶液１
．８の‘を含有する。反応容器中には、酸素感受性電極
から成るディテクタ３（ＷＴＷ：ＯＸＩ−Ｅ１ｅｋｔｒ
ｏｄｅＥＯ１６）が突出している。このディテクタは分
析器４と結合している（ＷＴＷ：挿入物ＯＸ１６１皿を
有するディジタルメーターＤＩＧ１６１０）。
なプラスチック製の円筒状の室のかたちの反応容器１か
らなる。この室は０．２モルカリウム燐酸緩衝剤、ｐＨ
６．８中の沃化カリウム１８ミリモル、（ｔ）モリブデ
ン酸アンモニウム７．５ミリモル、塩化ナトリウム８０
０ミリモル及びグリセリンオキシダーゼ５０Ｕの溶液１
．８の‘を含有する。反応容器中には、酸素感受性電極
から成るディテクタ３（ＷＴＷ：ＯＸＩ−Ｅ１ｅｋｔｒ
ｏｄｅＥＯ１６）が突出している。このディテクタは分
析器４と結合している（ＷＴＷ：挿入物ＯＸ１６１皿を
有するディジタルメーターＤＩＧ１６１０）。
反応容器１の底には磁気損梓器５を有する。充填口６を
介してグリセリン含有溶液２叫そを試料として加える。
介してグリセリン含有溶液２叫そを試料として加える。
磁気燈洋器で強力な縄投下に溶液の酸素濃度の減少を測
定する。観測された酸素消費量をグリセリン濃度に対し
て記載する。例４動力学的測定 試料： 水性標準液（グリセリン含有量１０〜１００の９／ｄｌ
）試薬： Ｐｉｐｅｓ−緩衝剤０．１モル／ぐ、日３Ｂ０３１．７
モル／夕、ＰＨ＝７‐Ｏイントリデシルヱーテル
３．雌／ぞ、コール酸ナトＩＪウム
３．雌／そ、アミ／置換４−アミノアンチピリン
０．５ミリモル／〆、Ｐーク。
定する。観測された酸素消費量をグリセリン濃度に対し
て記載する。例４動力学的測定 試料： 水性標準液（グリセリン含有量１０〜１００の９／ｄｌ
）試薬： Ｐｉｐｅｓ−緩衝剤０．１モル／ぐ、日３Ｂ０３１．７
モル／夕、ＰＨ＝７‐Ｏイントリデシルヱーテル
３．雌／ぞ、コール酸ナトＩＪウム
３．雌／そ、アミ／置換４−アミノアンチピリン
０．５ミリモル／〆、Ｐーク。
ルフエノール １０．０ミリモル／〆、ベルオキシタ
ーゼ １０．０ＫＵ／夕、グリセリンオキシ
ダーゼ １２１．雌Ｕ／Ｚ。ゲムゼクーフアストー
アナリユーザー（蛇ｍｓａｅｃ−Ｆａｓｔ一触ａｌｗｅ
ｒ）自動分析器で実施。
ーゼ １０．０ＫＵ／夕、グリセリンオキシ
ダーゼ １２１．雌Ｕ／Ｚ。ゲムゼクーフアストー
アナリユーザー（蛇ｍｓａｅｃ−Ｆａｓｔ一触ａｌｗｅ
ｒ）自動分析器で実施。
温 度 ： ２５℃
測定波長 ５４肋血
試料容量 １０叫Ｚ
希釈剤（水）： ５叫〆
試薬容量 ５００必夕
測定時間
１回目の測定：開始後３９砂
２回目の測定：開始後３１９砂。
次の結果が得られた：
試料：水性標準液
グリセリン（ＵＶ−試験） 再び検出された％（側／
ｄｌ） （本発明によるグリセリンオキシダーゼ）
１１ １０５２１
１０１３２
１００４３
１０１５４
１００６５ ９９７
６ ９９８７
９９９６
１０２動力学的測定において試薬中の次
の軍比で作業するのが有利である：Ｐｉｐｅｓ−緩衝剤
０．０５〜０．５モル／そ、馬Ｂ０３０．５〜２．０モ
ル／夕、ｐＨ６．８〜８．０イントリデシルエーテル
１〜強／〆、コール酸ナトリウム １〜舵
／そ、アミ／置換４−アミノアンチビリン ０．
２〜５ミリモル／夕、Ｐ−クロルフエノール ５〜５０
ミリモル／そ、ベルオキシターゼ ５〜５皿Ｕ
／夕、グリセリンオキシダーゼ １００〜２５皿Ｕ／そ
。
ｄｌ） （本発明によるグリセリンオキシダーゼ）
１１ １０５２１
１０１３２
１００４３
１０１５４
１００６５ ９９７
６ ９９８７
９９９６
１０２動力学的測定において試薬中の次
の軍比で作業するのが有利である：Ｐｉｐｅｓ−緩衝剤
０．０５〜０．５モル／そ、馬Ｂ０３０．５〜２．０モ
ル／夕、ｐＨ６．８〜８．０イントリデシルエーテル
１〜強／〆、コール酸ナトリウム １〜舵
／そ、アミ／置換４−アミノアンチビリン ０．
２〜５ミリモル／夕、Ｐ−クロルフエノール ５〜５０
ミリモル／そ、ベルオキシターゼ ５〜５皿Ｕ
／夕、グリセリンオキシダーゼ １００〜２５皿Ｕ／そ
。
この例は、本発明を臨床化学慣用診断実験室中にある重
要な自動分析器で実施することができることを示す。図
面の簡単な説頚 第１図は酸素消費量によりグリセリンを測定する装置を
示す略図である。
要な自動分析器で実施することができることを示す。図
面の簡単な説頚 第１図は酸素消費量によりグリセリンを測定する装置を
示す略図である。
１・・…・反応容器、３……ディテクタ、４…・・・分
析器、５・・・・・・磁気蝿梓器。
析器、５・・・・・・磁気蝿梓器。
第２図は日２０２−形成によりグリセリンを測定する際
の、グリセリン標準液の側定吸光度差△Ｅ＝Ｅ２−Ｅ，
をグリセリンもしくはトリグリセリド濃度に関連させた
検量線を示す。
の、グリセリン標準液の側定吸光度差△Ｅ＝Ｅ２−Ｅ，
をグリセリンもしくはトリグリセリド濃度に関連させた
検量線を示す。
ＦＩＧ．Ｉ
ＦＩＧ．２
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ グリセリンオキシダーゼの存在下に酸素で酸化し、
酸素消費量又はＨ＿２Ｏ＿２−形成量を測定してグリセ
リンを測定するために、アスペルギルスｓｐｅｃ．（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃ．）ＢＭＴＵ１９９７
−１（ＤＳＭ１７２９）（微工研菌寄第５８６０号）か
らのグリセリンオキシダーゼを使用することを特徴とす
るグリセリンの測定法。 ２ 酸素消費量をポラロメトリーにより測定する特許請
求の範囲第１項記載の方法。 ３ 生じたＨ＿２Ｏ＿２をカタラーゼ又はペルオキシダ
ーゼを用いて酵素的に測定する特許請求の範囲第１項記
載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3004129 | 1980-02-05 | ||
| DE3004129.3 | 1980-02-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS56121498A JPS56121498A (en) | 1981-09-24 |
| JPS6036754B2 true JPS6036754B2 (ja) | 1985-08-22 |
Family
ID=6093779
Family Applications (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56014455A Expired JPS6036754B2 (ja) | 1980-02-05 | 1981-02-04 | グリセリンの測定法 |
| JP56014456A Expired JPS6036756B2 (ja) | 1980-02-05 | 1981-02-04 | 酸素反応におけるｈ↓２ｏ↓２−形成の測定法 |
| JP60074564A Granted JPS60259185A (ja) | 1980-02-05 | 1985-04-10 | グリセリンオキシダ−ゼの取得法 |
| JP60074563A Granted JPS60259199A (ja) | 1980-02-05 | 1985-04-10 | グリセリンの測定試薬 |
Family Applications After (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56014456A Expired JPS6036756B2 (ja) | 1980-02-05 | 1981-02-04 | 酸素反応におけるｈ↓２ｏ↓２−形成の測定法 |
| JP60074564A Granted JPS60259185A (ja) | 1980-02-05 | 1985-04-10 | グリセリンオキシダ−ゼの取得法 |
| JP60074563A Granted JPS60259199A (ja) | 1980-02-05 | 1985-04-10 | グリセリンの測定試薬 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4399218A (ja) |
| EP (1) | EP0033540B1 (ja) |
| JP (4) | JPS6036754B2 (ja) |
| AR (1) | AR224669A1 (ja) |
| AT (1) | ATE10013T1 (ja) |
| AU (1) | AU522705B2 (ja) |
| CA (1) | CA1149712A (ja) |
| DD (2) | DD159551A5 (ja) |
| DE (1) | DE3166756D1 (ja) |
| ES (1) | ES499103A0 (ja) |
| SU (1) | SU1554765A3 (ja) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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