JPS5852277A - 新抗生物質ｙ−ｔ０６７８ｈ物質およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新抗生物質およびその製造法に関する。更ら
に詳しくは１本発明者等によって分離さ°れたクロモバ
クテリウム属に属する細菌を培養して得られる式 で示される化合物（以下Ｙ−ＴＯ６７８Ｈ物質という）
およびこれを製造する方法に関する。

本発明者等は、クロモバクテリウム属に属する菌株が、
抗菌活性物質を産生じていることに着目し、培養液から
その有効物質を純粋に単離したところ、この物質が、上
式（１）で表わされる新抗生物質であることを確認し１
本発明を完成した。

本発明で使用されるクロモバクテリウム属の菌株の一例
としては１本発明者等が、埼玉県入間郡毛呂山町の湖底
土壌から分離したクロモバクテリウム−ニス・ピーＹ−
ＴＯ６７ＲＨを挙げることができる。

この菌株の菌学的性状は、つぎの通りである。

（ａ）形態 肉汁寒天培地で２８Ｃ，４８時間培養時【ておける形態
は、０６〜０．９　Ｘ　１．５〜３　ｌｔ詔り菌で極手
を有し、運動性である。内子は形成せず、ダラム染色は
陰性である。

（ｂ）　　各培地での生育状態 ■　肉汁寒天平板培地（２８Ｃ，２〜６日）コロニーは
紫色で表面がやや隆起した円形を呈す。紫色の色素は培
地中には拡散しな℃・。生育は良好である。

■　肉汁液体培養 培地表面の管壁に菌体による紫色のリングが形成され、
培地は少し濁る。

■　ミルク培養 培養３日目ごろより中性〜アルカリ性を示しながら液化
され（る。

■　肉汁ゼラチン穿刺培養 液化される。

（ｃ）生理学的性質 ■　硝酸塩の還元　　　　　　　＋ ［有］　ｖｐテスト　　　　　　　　　−■　インドー
ルの生成　　　　　− ■　硫化水素の生成　　　　　　− ■　デンプンの加水分解　　　　− 〇　クエン酸の利用（シモンズ培地）十■　色素の産生 肉汁培地の他、各種の培地で培養２日目ごろより、紫色
の色素を産生ずる。この色素は水に不溶で、エタノール
には可溶である。

■　ウレアーゼ　　　　　　　　　− ■　オキシダーゼ　　　　　　　＋ 、ゆ　カタラーゼ　　　　　　　　　＋　・０　生育の
範囲 イ、生育の温度　４Ｃでは生育しない。

１０〜３’３　Ｃで生育するが、３７ Ｃでは生育しない。

口、至適ｐＨｐＨ６〜８で良く生育する。

（ロ）酸素に対する態度 嫌気性条件下で生育（生育は遅い） （Ｈｐ　　Ｑ−１；”テスト　　　Ｆ型Ｊ■　糖分解テ
スト イ、下記の糖を分解し、酸を生成する。

トレハロース、フラクトース、グルコ ース。

口、下記の糖では酸の生成が認められな（・。

Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース。

シークロース、イノシトール、Ｌ−−ｙムノース、ラフ
ィノース、マンニトール。

Ｄ−ガラクトース、マルトース、ラクトース、Ｄ−ソル
ビトール、サリシン、グリ　セ　リ　ツ バ、上記４９口のいずれの糖でもガスの生成は認められ
ない。

［相］　カゼインの加水分解　　十 ・［有］　卵黄反応　　　　　　　十 ０　栄養要求性　　　　　なし 以上のような性状を有する菌種をＢ　ｅ　ｒｇｅｙ＾Ｍ
ａ−ｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ第８版より検索すると、ダラ
ム陰性桿菌で、胞子を形成せず運動性を有し、液体培養
において液表面の管壁に紫色のリングを形成し、非水溶
性の紫色の色素を産生ずる菌として、クロモバクテリウ
ム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）があげられ
る。クロモバクテリウムとしては（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ｖｉｏｌａｃｅｕｍおよびＣｈｒｏｍｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｉｖｊｄｕｍ）’の２種の記載
がある。

Ｙ−ＴＯ６７８Ｈ株と上記２種の性状について比較試験
を行った結果を表１に示す。

表１ 「− 生 カ 卵 嫌 糖 表１の結果より、Ｙ−ＴＯ６７８Ｈ株は　クロモバクテ
リウム・リビダムとは、糖の利用性、卵黄反応、カゼイ
／の氷解性、　ＯＦテスト結果などの点で異なった性状
を示す。クロモバクテリウム力 ・ビオラセ亨ムとは、各種培地での生育状態。

糖の利用性、生理的な各種の性質、などの点で類似して
（・るが、生育温度範囲、嫌気条件下での生育速度など
の点では異なった性質を示す。

又、Ｙ−ＴＯ６７８Ｈ株の産生ずる紫色の非水溶性色素
は、シリカゲル薄層クロマトグラフ（１１）を行って比
較するとクロモバクテリウム・ビオラセウムの産生する
色素（ビオラセイン）と夫々同じＲｆ値を示した。これ
らの事よりＹ−ＴＯ６７８Ｈ株はクロモバクテリウム・
ビオラセウム（Ｃｈｒｏ−ｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｖ
ｉｏｌａｃｅｕｍ　）と近縁の種であると思われるが、
生育温度および嫌気性条件下での発育などにお（・て一
致しない。従って、この菌株をクロモバクテリウム・ニ
ス拳ピー（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅ−ｒｉｕｍ　ｓｐ、
　）Ｙ−ＴＯ６７８Ｈと命名した。本菌株は。

工業技術院微生物工業技術研究所に、受託番号微工研菌
寄第６１４４号（ＦＥＢＭ　Ｐ−６１４４）として寄託
されている。

（注１） 各溶媒系におけるＲｆ値はつぎの通りである。

酢酸エチル：メタノール（４：１）　　　Ｒｆ０８７ベ
ンゼン：アセトノ（１：ｌ）　　ＲｆＯ，５９クロロホ
ルム：メタノール（４：１）　　　Ｒｆｏ、６８本発明
により、新抗生物質　Ｙ−ＴＯ６７８Ｈ物質を得るには
９本菌株をクロモバクテリウム属に属する菌株の培養に
通常使用される培地中で培養し、培養物のｒ液から分離
する。

培地としては２種々のものが用いられるが。

炭素源として２例えばＤ−キシロース、グルコース、Ｌ
−ラムノース、デキストリン、ｉ糖。

乳糖、稠密、殿粉、水あめ、グリセリン、油脂類（例え
ば、大豆油、オリーブ油など）が適宜用いられ、また、
窒素、源としては１例えば粉末フイヨン、コーノスチー
フリカー、クルテンミール、綿実粕、肉エキス、大豆粉
、ペプトン。

魚粉、乾燥酵母、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、硝酸アンモニウム、その他の有機または無機の
窒素源などが利用される。

金属塩としては１例えばＮａ、　Ｋ、　Ｍｇ、　Ｃａ、
　Ｚｎ、　Ｆｅなどの硫酸塩、硝酸塩、塩化物、炭酸塩
、燐酸塩などが必要）て応じて用いられ、また、ビタミ
ン類、核酸塩基類、アミノ酸などを適宜添加することも
ある。

培養方法としては、好気的条件下で培養するのが一般的
で、温度は２０Ｃ〜３０Ｃの範囲が望ましく、殊に好適
には、２７Ｃ附近で行なわれる。

培地のＰＨは約５〜１０．好ましくは約６〜８の範囲に
保持するのが好結果が得られる。培養期間は培地の組成
φ温度などによって変動するが。

一般に１〜５日程度でよく、培養方法としては振とう培
養法、深部通気攪拌培養法等の液体培地を使用するのが
好ましい、培養中１発泡の著るしい時には１例えば、大
豆油、オクタデカノール、テトラデカノール、ヘプタデ
カノール等の高級アルコール類、シリコンｆヒ合物等の
消泡剤を適宜添加すれば良℃・。

培養物より目的の抗生物質を単離採取するには通常の微
生物の培養物より抗生物質を単離する方法が適用される
。抗生物質Ｙ−ＴＯ６７８Ｈ物質は培養液中に含有され
るので、遠心分離又は濾過により菌体を除去したのち、
ｆ５過液から有効物質の抽出を行う。すなわち適当な溶
剤に対する溶解性及び溶解度の差、溶液からの析出性お
よび析出速度Ω差９種々の吸着剤に対する吸着親和性の
差、２種の液相間における分配の差などを利用する一般
の抗生物質の製造に用いられる手段によって、まず混合
物が分離、採取。

精製される。この方法は必要に応じて単独に用いられ、
ある（・は任意の順序に組合せまた反覆して適用出来る
。　さらにこの混合物からの物質の分離、採取、精製は
上記と同じような操作によって行うことが出来る。

以上のようにして得られるＹ−ＴＯ６７８Ｈ物質はつぎ
の理化学性状を示す。

（、）　　外観：微黄白色粉末 （ｂ）　　紫外部吸収スペクトル　λ　　（Ｅ　　）　
：　２２０（８９４）。

ｒｎｍｘ　　　　　　ｌσ ２５０（４５０）、２５８ｓｈ（４０８）、２７３ｓｈ
（２９０）、２７８ｓｈ（３４２）、２８３（３７６）
、２８９ｎｍ（３６６）（ｃ）　　赤外線吸収スペクト
ル　ｖ　ＫＢｒ　：　３１５０．１６５０゜１６１０、
１５７０．１５３０．１４８０．１４６０．１４ｏＯ。

１３４０、１２８０．１２３０．１１７５．１１５０．
１１００゜１０２０、９４０．８４０．８００．７６０
．７１０．６７０　ｃｍ−’（ｄ）　　’Ｈ−ＮＭＲδ
　　（Ｈｚ）　：６．８（ＩＨ，ｄ、　Ｊ＝１．９５）
。

２９ｍ ６．８　（ＬＨ，ｄｄ、　Ｊ＝９．０３．　Ｊ＝　１．
９５）、　７．５（ＩＨ，ｄ。

Ｊ　＝　９．０３）、　１０．３　（ＩＨ，ｂｒｏａｄ
　）、　１２．０（ＬＨ，ｂｒｏａｄ　）（ｅ）　　１
３Ｃ−、ＮＭＲδ　　、　１６５．５．１６４．９．１
６０．５．１２２．０゜２９ｍ １１３．０．１０６．９．９５．１ （ｆ）マススヘクトル＝ｒｒ／ｅ１５１（Ｍｌ）Ｃ７Ｈ
５ＮＯ３（ｇ）　　融点：２４７Ｃ（分解点） （ｈ）　　旋光度：〔α〕甘せ°（ＣＯ，５ＭｅＯＨ）
（ｉ）　　元素分析値：　ＣＩＬｅｃｄ、ｆｏｒ　Ｃ７
ＨｓＮＯ３Ｃ：５５．６４　Ｈ：３．３３　Ｎ：９．２
７０：３１．７６ｏｕｎｄ Ｃ：５５．３８　Ｈ：３．２１　Ｎ：９．０６　（％）
（ｊ）　　呈色反応：塩化第二鉄　　　陽性クロリン−
トリジ／　　陽性　弱い ドラーゲンドルフ　　陽性　　弱い ニンヒドリ／　　陰性 （ｋ）塩基性中性酸性の区別：酸性物質（１）　　溶解
性：メタノール、エタノール、アセトン、ジメチルスル
ホキシド、アル カリ水に易溶、ｎ−ブタノールに 可溶、水、酢酸エチルに難溶。

クロロホルム、ベンゼン、ｎ−ヘ キサン、石油エーテルに不溶 （ｍ）　　安定性：酸およびアルカリに安定（ｎ）薄層
クロマトグラフィー：シリカゲル６０Ｆ２５４　（メル
ク社）使用 検出：　ＵＶ　２５４　ｎｍ 以上の理化学的性状より本発明のｙ−ＴＯ６７８Ｈ物質
は下記化学構造式で表わされる６−ハイドロキシ−３−
オキソ−１２−ベノズイソキサゾリ／と決定された。

１ 本Ｙ−ＴＯ６７８Ｈ物質の各種細菌に対する最少発育阻
止濃度は表２に示した通りであり、グラノ・陰性菌て対
しても著効が認められ、医薬として使用出来る。

表２ 注：接種菌１ｉ１０’個 以下に本発明を更に詳細に説明するための実施例を掲記
するが、この実施例はなんら本発明を限定するものでは
ない。

実施例　１ ベネ、ト寒天培地上に生育させたクロモバクテリウム・
ニス・ピー・Ｙ−ＴＯ６７８Ｈ株の菌体をかきとり、デ
キストリノ２０％、大豆粉３０％、硫酸マグネシウム・
７水塩ｏ２％、炭酸マグネシウム１．０％）、’（’ｐ
Ｈ７，０）を含む培地を５００　ｍｌ三角フラスコ各５
０・ｐ部 城ずつ分注し１２０　ｔ：”　２０分間滅菌したものに
接種して２７Ｃで２４時間培養を行ない種培養とする。

っキＬ’Ｕ　りＩＪ−１＝ニリン１％、大豆粉２９％、
リン酸二カリウム０１％（ｐＨ７，０）を含む培地１５
００ｍｌを５００　ｍ１（１）三角フラスコに各々５０
　ｍｌずつ分注し、　１２００２０分間滅菌したものに
種培養より３％の割合に接種して。

２７ｒで振盪培養を続ければ２４時間後にはその培養液
の呈する工／エリヒア・コリに一１２株に対する抗菌活
性は最大となる。このようにして得られた培養液にラジ
オライト（商品名）を加えかきまぜた後、吸引１過器を
用いて濾過すると′ｆ−５液１４００ｍ１が得られる。

この１液Ｋ　Ｏ，１規定水酸化ナトリウム水溶液を加え
ｐＨ８，６に調整して１４００　ｍｌの酢酸エチルを加
えよく攪拌の後、酢酸エチル層を除去して水層な得る。

得られた水層に０１規定塩酸水溶液を加えｐＨ４，０に
調整して１４００ｍ１の酢酸エチルを加えよく攪拌の後
、酢酸エチル層を分離して。

これに無水硫酸ナトリウムを加え脱水する。無水硫酸ナ
トリウムをｆ別し酢酸エチル層を減圧濃縮するとアメ状
のＹ−ＴＯ６７８Ｈ物質２００ｍｇが得られる。これに
少量のメタノールを加え、溶解させメルク社製ンリカゲ
ル６０　Ｆ２５４薄層プレートに帯状に塗布し、クロロ
ホルム：メタノール（４：１）を展開溶媒とする薄層ク
ロマリグラフイーを行ないエシェリヒア・コリに一１２
株に抗菌活性を示す部分をかき取る。かき取った抗菌活
性物質を含むシリカゲル粉末をカラムにつめ、クロロホ
ルム：メタノール（２：１）で溶離したのち減圧下濃縮
乾固すると微黄白色粉末として純粋な抗生物質Ｙ−Ｔ０
６７８　Ｈが４０ｍｇ得ラレルう 実施例　２゜ デキストリノ２０％、ニスサンミート３，０％、硫酸マ
グネシウム・７水塩０２％、炭酸カルシウム１．０％、
ｐＨ７，０からなる５０００　ｍｌの培地を５００　ｍ
ｌの三角フラノ４％　５０　ｍｌずつ分注して１２０ｔ
Ｚ’　２０分間滅菌したものに４実施例１＋で示した種
培養より３％の割合で接種して２７Ｃで培養を続ければ
２４時間後には培養液の呈するエシェリヒア・コリに一
１２株に対する抗菌活性は最大となる。このようにして
得られた培養液にラジオライト（商品名）を加えかきま
ぜた後、吸引濾過器を用いて濾過するとｒ液４９００＝
＋ｔが得られる。このｆ液に０５規定塩酸水溶液を加え
ｐＨ４，０に調整して４９００　ｍｌの酢酸エチルを加
えよ（攪拌した後、酢酸エチル層を分離する。

得られた酢酸エチル層４９００　ｍｌに重曹水５００　
ｍｌな加えよく攪拌した後、酢酸エチル層を除去して重
曹水層５００　ｍｌを得る。得られた重曹水層に２規定
塩酸水溶液を加えｐＨ４，ＯＫ調整して５００　ｍｌの
西１酸エチルを加えよく攪拌の後、酢酸エチル層を５０
０ｍ１分離して無水硫酸ナトリウムを加えよ゛（脱水す
る。脱水ののち無水硫酸ナトリウムをｆＪ別し酢酸エチ
ル層を５　ｍｌまで減圧濃縮して５Ｃに放置すると沈殿
が析出する。析出した沈殿をグラスフィルターガロ３を
用（・てｐ取し、さらに冷却した酢酸エチルにてよく洗
浄した後、乾燥させると淡黄白色粉末３００１Ｔ１ｇが
得られる。さらにこの淡黄白色粉末３００１１１ｇをメ
タノール５１ＩｌｔＫよく溶解させた後、５Ｃに放置す
ると沈殿が析出する。析出した沈殿をグラスフィルター
／Ｉ６３を用（・てｉ−１取し、冷却したメタノールで
洗浄した後、乾燥させると微黄白色粉末として純粋な抗
生物質Ｙ−ＴＯ６７８Ｈが２５０　ｆｆ１ｇ得られる。

特許出願人　山之内製薬株式会社 代理人　佐々木児−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ＋１１　　　式　　　　　　　　。 １ で示される　Ｙ−ＴＯ６７８Ｈ物質 （２１Ｙ−ＴＯ６７８Ｈ物質生産能を有するクロモノく
   クテリウム属に属する細菌を培養し、培養液よりＹ−Ｔ
   Ｏ６７８Ｈ物質を採取することを特徴とする新抗生物質
   Ｙ−ＴＯ６７８Ｈ物質の製造法（３）　　クロモバクテ
   リウム属に属する細菌ｈ−クロモバクテリウム・ニス・
   ピーｙ−ＴＯ６７８Ｈ株である特許請求の範囲第２項記
   載の製造法