JPS5854128B2 - リンパ球の分離方法およびその装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、血液、体液またはこれらを処理して得られる
血球浮遊液から、リンパ球を純度、収率良く、簡単な操
作で短時間に分離する方法と、その装置に関するもので
ある。

さらに詳しく述べると、血球浮遊液をまず、白血球を捕
捉するフィルターに通し、白血球と他の成分とを分離し
た後、該フィルターに捕捉された白血球を回収し、次に
、この白血球浮遊液を顆粒球、単球を捕捉するフィルタ
ーに通し、白血球浮遊液から顆粒球、単球を除いて、リ
ンパ球浮遊液を得る方法および上記の方法を達成するた
めの装置に関するものである。

白血球は一般に顆粒球、単球とリンパ球が大部分からな
り、このため白血球浮遊液から顆粒球、単球を除去すれ
ばリンパ球浮遊液となる。

近年、免疫学の進歩とともに、リンパ球を血液から純粋
に取り出し、このリンパ球浮遊液を用いて、組織適合抗
原や細胞性免疫等の免疫学の研究を行ったり、また種々
の疾患の免疫療法に用いることが行われるようになり、
また、このリンパ球をＴ細胞やＢ細胞などのサブポピュ
レーショ／に分離したり、ヘルパーＴ細胞やサプレッサ
ーＴ細胞などのサブセットに分離する試みが、各地の病
院、研究機関で検討されている。

しかし、これらの目的に用いるリンパ球浮遊液を血液な
どから比較的大量に、簡単な操作で、純度、収率良く得
る方法としては、従来適当なものがなかった。

このような目的のために使用できる従来のリンハ球分離
法としては、フィコール・コンレイ法すどの密度勾配遠
心分離法や、細胞電気泳動法、血液に赤血球凝集剤を加
えて赤血球を沈澱、除去し、得られた白血球浮遊液を、
顆粒球、単球を粘着、付着または吸着する物質に接触さ
せ、顆粒球、単球を除去してリンパ球浮遊液を得る方法
などが存在するが、多量のリンパ球を純度、収率良く短
時間に得ることは困難であり、また得られたリンパ球浮
遊液を人体に輸血する際、問題となる場合も存在する。

そこで、本発明者らは、多量の血液から簡単な操作で、
短時間にリンパ球を純度、収率良く分離でき、人体にこ
のリンパ球浮遊液を輸血しても問題とならない方法を鋭
意検討した結果、白血球を捕捉する白血球分離フィルタ
ーと、顆粒球、単球を捕捉する顆粒球分離フィルターを
組合せた方法によって、これが達成できることを発見し
、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、血液、体液またはこれらを処理し
て得られる血球浮遊液を、白血球を捕捉するフィルター
に通し、白血球と他の成分を分離したのち、上記フィル
ターに捕捉された白血球を回収し、つぎにこの白血球以
外の部分が少ない白血球浮遊液を、顆粒球、単球を捕捉
するフィルターに通し、顆粒球、単球を除去し、リンパ
球以外の成分の少ないリンパ球浮遊液を得ることを特徴
とするリンパ球の分離方法であり、また該方法の実施に
直接使用する装置として、血球浮遊液入口と、リンパ球
出口と、上記出入口間に形成される液体流路中に、直列
の位置関係に配置された白血球分離用フィルターと顆粒
球分離用フィルターを主要部としてなるリンパ球分離装
置である。

本発明でいう血液、体液またはこれらを処理して得られ
る血球浮遊液とは、血液や体液、たとえば腹水や骨髄液
それ自身、およびこれらの液に何らかの処理、たとえば
デキストランやヒドロキシエチルスターチなどの赤血球
凝集剤のような血球凝集剤を加えて得た血球浮遊液や、
密度勾配遠心分離などのような遠心分離操作により得た
血球浮遊液、細胞電気泳動により得られる血球浮遊液な
どをいう。

本発明による方法は、これらの血球浮遊液を、白血球分
離フィルターと顆粒球分離フィルターの両方を用いて、
リンパ球を得るものである。

従来、顆粒球、単球が種々の物質、たとえば、綿、ポリ
エステル繊維、ナイロン繊維、シリコン処理ガラスウー
ルなどに粘着または付着し、またリンパ球もこれらの物
質に弱く粘着することはよく知られた現象である。

しかし、血液にこれらの物質を接触させるだけでは、血
液中の顆粒球、単球や、ごく少量のリンパ球が除去され
るのみで、多量の赤血球が大部分のリンパ球とともに回
収され、リンパ球のみを得るには、この赤血球を除去す
る操作が必要である。

現在は、この操作を密度勾配遠心分離操作や、赤血球を
低張液と接触させ破壊することにより達成している。

しかし、これらの操作は手間がかかり、また大量の血液
を処理するのは困難である。

そこで、本発明者らは、顆粒球分離フィルターと組合せ
てリンパ球を得る方法を種々検討した結果、白血球分離
フィルターと顆粒球分離フィルターを組合せれば、血液
から簡単な操作で、短時間にリンパ球を純度、収率良く
分離できることを発見した。

白血球分離フィルターとしては、血液から白血球を捕捉
でき、フィルター内を白血球が回収されないような生理
的溶液、たとえば生理食塩水などで洗浄することにより
、白血球以外の成分を大部分除去でき、またフィルター
内の白血球を容易に回収できるものであればよい。

この一例としては、カラムに繊維状物質を詰め、繊維状
物質に対する白血球の粘着作用や、繊維状物質がつくる
空間に白血球をひっかけて捕捉することを利用したもの
がある。

これらはリンパ球が捕捉できるように上記の点が考慮さ
れている点で、従来知られている顆粒球分離フィルター
などとは異なるものである。

なかでも、平均直径１０μ以下の繊維状物質を用いたフ
ィルターは、白血球が粘着できる表面積を大きくできる
上に、繊維状物質がつくる空間を小さくできるので用い
るのが好ましい。

この場合、繊維状物質とは、平均直径に比べ長さが非常
に長いものである。

また平均直径りとは、そのものＳ重さをＸ′？、長さを
ｙｃＩｒＬ、密度をρ１／−とすると、Ｄ＝２１＝Ｙ（
ｃＩｒＬ）テ定義すレルモノヲイρｙ う。

捕捉された白血球を回収する方法としては、たとえば白
血球がフィルター内の物質と何らかの粘着を起している
場合は、粘着阻害剤を加えたり、物理的外力を与えなが
ら液を流すことにより、また白血球がフィルター内の物
質かつ（る空間にひっかかっている場合は、空間の大き
さを変えたり、また外部から物理的な力を与えながら液
を流すことにより、回収が可能となる。

また顆粒球分離フィルターは、リンパ球がフィルター内
の物質がつくる空間にひっかかることがなく、またリン
パ球を非特異的に粘着したりしないものであり、顆粒球
、単球をよく捕捉できるものである。

この一例としては、カラムにポリエスチル繊維、ナイロ
ン繊維などを詰めた市販のフィルターがある。

第１図は本発明によるリンパ球分離装置の一つの例を示
す説明図である。

図中１は液が入る入口、２は液が出る出口、３は白血球
分離フィルター、４は顆粒球分離フィルター、５はこれ
らを接続する部分である。

入口１から入った血球浮遊液は、白血球分離フィルター
３および顆粒球分離フィルター４を通り出口２から出て
いく。

この間に、白血球と二部の他成分が白血球分離フィルタ
ー３に捕捉される。

次に入口１から洗浄液を流し、白血球分離フィルター３
および顆粒球分離フィルター４に入っている白血球以外
の成分を出口２から流し出す。

この後、入口１から白抽球を回収するための液を送り、
白血球分離フィルター３に捕捉されている白血球を回収
し、顆粒球分離フィルター４でこの白血球浮遊液中の顆
粒球、単球を除去し、出口２からリンパ球浮遊液を取り
出すものである。

なお、液を送るためには、ポンプを用いるか、重力によ
って液を送るようにすればよい。

第２図も本発明によるリンパ球分離装置の一つの例を示
す説明図である。

図中１はリンパ球分離装置の入口、２は出口、３は白血
球分離フィルター、４は顆粒球分離フィルター、５は接
続部分、６は液を送るためのポンプである。

この図では、第１図と同様の操作でリンパ球浮遊液を得
ることができる。

第３図も本発明によるリンパ球分離装置の１例を示す説
明図である。

図中１はリンパ球分離装置の入口、２は出口、３は白血
球分離フィルター、４は顆粒球分離フィルター、５は接
続部、６はポンプ、７は上記２以外の出口、８は上記１
以外の入口、９は血球浮遊液を入れておく容器、１０は
洗浄液を入れてお（容器、１１は白血球を回収する液を
入れておく容器、１２は液を適切なところに送るための
コックである。

容器９に入っている血球浮遊液は、ポンプ６によって入
口１を通り、白血球分離フィルター３に入って出ロアか
ら出る。

次に容器１０に入っている洗浄液をポンプ６で送り、白
血球分離フィルター３の中に入っている白血球以外の成
分を出ロアから流し出す。

この後、容器１１に入っている白血球回収用の液をポン
プ６で白血球分離フィルター３に送り、白血球を回収し
、この白血球浮遊液を顆粒球分離フィルター４に送る。

この時、出口２からリンパ球浮遊液を得ることができる
が、フィルター内に残存しているリンパ球を回収する時
には、容器１０に入っている洗浄液か、または他の顆粒
球、単球が回収されにくい液をポンプ６で入口８から顆
粒球分離フィルター４に少量送り、顆粒球分離フィルタ
ー４内に残存しているリンパ球を回収することができる
。

第４図は本発明により提供者から直接リンパ球を得る装
置の一例を示す説明図である。

図中１はリンパ球分離装置の入口、２は出口、３は白血
球分離フィルター、４は顆粒球分離フィルター、５は接
続部分、６はポンプ、７と１３は２以外の出口、８は１
以外の入口、１０は洗浄液を入れる容器、１１は白血球
を回収する液を入れる容器、１２はコック、１４は大気
開放口をもった容器、１５は静脈血提供接続部、１６は
静脈血返却接続部である。

提供者はまず１００００単位から２００００単位のヘパ
リンを静注しておき、その後、本装置でリンパ球を得る
。

提供者の血液はまず提供接続部１５を通り、入口１を通
って白血球分離フィルター３に入る。

次に出口１３を通って大気開放口をもった容器１４を通
り、ここで気泡を除去した後、返却接続部１６を経て提
供者にもどる。

必要な量の血液をフィルターに送った後、接続部をはず
し、次に容器１０に入っている洗浄液で白血球分離フィ
ルター３内の白血球以外の成分を洗い出し、出ロアから
出す。

この後、容器１１に入っている白血球回収液を白血球分
離フィルター３に送り、白血球を回収する。

この白血球浮遊液を顆粒球分離フィルター４に送り、出
口２からリンパ球を取り出す。

フィルター内に残存しているリンパ球は、第３図の説明
と同様にして取り出すことが可能である。

なお、ヘパリンなどの抗凝固剤は提供者に静注する以外
に、本図の装置の適宜個所において抗凝固剤を血液に加
えるようにしてもよい。

第１図から第４図まで種々の形態のリンパ球分離装置を
説明したが、これらの主要部はすべて第１図の装置を変
形させたものであることは自明であり、接続部５が変化
したことと、出入口の数が変化しているのみである。

なお、第１〜４図は本発明による装置の一部の形態を示
したにすぎない。

たとえば第１図において、二つのフィルターは接続して
いるが、これなどは各部分を切り離し、一旦、白血球分
離フィルター３から取り出した白血球浮遊液を、さらに
顆粒球分離フィルター４に入れるようにしてもよくまた
フィルター内の洗浄液がない場合もありうる３またコッ
クの位置や管の接続についても、図面は一例を示したに
すぎない。

本発明による装置の例として第１〜４図を説明したが、
液を送る力としてはポンプの他、重力を用いることがで
きる場合がある。

またポンプ一つでは提供者に血液を返すことが困難な場
合などは、もう一つ別のポンプを装置に加え、この力で
速く提供者に返すこともできる。

このようにして得たリンパ球浮遊液は、赤血球や血小板
、顆粒球、単球の混入が少なく、またこれを得るための
操作も非常に簡単である。

また得られたリンパ球は種々の分裂原、たとえばフィト
ヘマグルチニンやボーク・ウイード・マイトジェンによ
って幼若化する能力がよく保たれており、またＴ細胞、
Ｂ細胞の比率もフィルターの使用条件により、もとの血
液とほぼ同じものや、変化したものが得られる。

以上のように、本発明によって、血液等の血球浮遊液か
ら簡単な操作で、また無菌的に、純度、収率よくリンパ
球を分離することができ、各種医療施設においてリンパ
球浮遊液を用いた研究や、リンパ球威外輸血が容易に行
えるものである。

実施例 １ ０．７デニールで長さ４ＣｒｒＬから７ｃＩｆＬのポリ
アクリロニトリル系繊維を詰めた白血球分離フィルター
と、１．５デニールで、長さ４ｃｒｒＬから７ｃｒｒＬ
のポリエステル繊維を詰めた顆粒球分離フィルターを用
い、第３図に示した方法により、健康人の、ヘパリンを
１０００単位加えた血液１００ｍＡ’からリンパ球浮遊
液を得た。

まず容器９に入っている１００ｍ１の血液をポンプ６で
白血球分離フィルター３に５ｍｌ／ｍ１ｙｔの流速で通
し、その後、フィルター内の残存赤血球などを除くため
、２０００単位のヘパリンを含む２００ｍ１の生理食塩
水を１０ｍ１／ｍｍの流速で流した。

なお、これらの液は出ロアから出した。次に血漿を含む
生理的溶液１００ｍ１を白血球分離フィルター３に５
ｍｌ／−の流速で流し、物理的外力を加えながら捕捉さ
れていた白血球を回収し、この白血球を含む液を顆粒球
分離フィルター４に通し２からリンパ球浮遊液を得た。

最後に顆粒球分離フィルター４に３０ｍ１の生理食塩水
を３ ｒｎｌ／ｍ１ｙｔの流速で流し、フィルター内に
残存していたリンパ球を流し出し、全量１００ｍ１のリ
ンパ球浮遊液を得た。

この液には、リンパ球はもとの血液の５０％、顆粒球、
単球は８％、赤血球は０．３％、血小板は３％含まれて
いた。

実施例 ２ ０．７デニール、長さ４のから７Ｃ１ｒＬのポリアミド
系繊維を詰めた白血球分離フィルターと、１，５デニー
ル、長さ４ｃｒｒＬから７ｃｍのポリエステル繊維を詰
めた顆粒球分離フィルターを用い、第３図に示した方法
によって、実施例１と同様にして健康人の血液１００ｍ
１からリンパ球浮遊液を得た。

得られたリンパ球浮遊液には、リンパ球はもとの血液の
４６％、顆粒球、単球は８％、赤血球は０．２５％、血
小板は３％含まれていた。

実施例 ３ ０．７デニールで長さが４ｃｒｒＬから７ＣｒｒＬのポ
リアクリロニトリル系合成繊維を詰めた白血球分離フィ
ルターと、１．５デニールで長さが４ｃｒｒＬから７ｃ
ｒｒＬのポリエステル繊維を詰めた顆粒球分離フィルタ
ーを用い、第３図に示した方法によって、健康人の血液
１００ ｍｌに分子量２０万のデキストラン溶液を加え
て得た、赤血球かもとの４％、リンパ球かもとの７０％
を含む液からリンパ球浮遊液を得た６操作は容器９に入
っている血球浮遊液を実施例２と同様の処理を行い、最
後に出口２から１００ｍ１のリンパ球浮遊液を得たが、
この液には、リンパ球はもとの血液の３８％、顆粒球、
単球は２％、赤血球は０．０３％、血小板は０．８％含
まれていた。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図、第３図、第４図はいづれも本発明のリ
ンパ球分離装置の例を示す説明図である。 １・・・・・・リンパ球分離装置の入口、２・・・・・
・リンパ球分離装置の出口、３・・・・・・白血球分離
フィルター４・・・・・・顆粒球分離フィルター、５・
・・・・・接続部、６・・・・・・ポンプ、７・・・・
・・リンパ球分離装置の出口、８・・・・・・リンパ球
分離装置の入口、９・・・・・・血球浮遊液を入れる容
器、１０・・・・・・洗浄液を入れる容器、１１・・・
・・・白血球を回収する液を入れる容器、１２・・・・
・・コック、１３・・・・・・リンパ球分離装置の出口
、１４・・・・・・大気開放口をもった容器、１５・・
・・・・静脈 血提供接続部、 １６・・・・・・静脈血返却接続部。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 血液、体液またはこれらを処理して得られる血球浮
   遊液を、白血球を捕捉するフィルターに通し、白血球と
   他の成分を分離したのち、上記フィルターに捕捉された
   白血球を回収し、つぎにこの白血球以外の成分が少ない
   白血球浮遊液を、顆粒球、単球を捕捉するフィルターに
   通し、顆粒球、単球を除去し、リンパ球以外の成分の少
   ないリンパ球浮遊液を得ることを特徴とするリンパ球の
   分離方法。 ２ 血球浮遊液入口と、リンパ球出口と、上記出入口間
   に形成される液体流路中に、直列の位置関係に配置され
   た白血球分離用フィルターと顆粒球分離用フィルターを
   主要部としてなるリンパ球分離装置。