JPS6330888B2

JPS6330888B2 -

Info

Publication number: JPS6330888B2
Application number: JP54043585A
Authority: JP
Inventors: Yoshinori Takenaka; Nobuaki Tsuda; Tooru Kuroda
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1979-04-12
Filing date: 1979-04-12
Publication date: 1988-06-21
Also published as: JPS55135749A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は血液、体液またはこれらを処理して得
られる血球浮遊液から、血小板混入の非常に少な
いリンパ球浮遊液を得るための装置に関するもの
である。

さらに詳しく述べると、血球浮遊液から簡単な
操作で短時間に血小板の混入の少ないリンパ球浮
遊液を得るための、構成の異なる三つの部分から
なる装置に関するものである。

近年、免疫学，免疫遺伝学の進歩に伴ない、リ
ンパ球を血液から純粋に取り出し、このリンパ球
浮遊液を用いて、ヒトの主要組織適合抗原
（HLA）を測定することが多くなつてきた。これ
はHLAが移植の成否を決めるだけでなく、多く
の疾患がHLAの特定の型とよく相関することが
明らかにされてきたからである。

このHLAタイピングには、HLA抗原をもつて
いるリンパ球と、抗HLA抗体を反応させて、補
体の存在下で死んだリンパ球を測定する方法がよ
く行われているが、HLA−Ａ，Ｂ，Ｃは血小板
もこの抗原を持つているため、血小板が多く混入
すると、このHLAタイピングに誤差を生じる結
果となる。このため現在は、フイコール・コンレ
イ法などで得た血小板を多く含むリンパ球浮遊液
にトロンビンなどの血小板凝集剤を加え、遠心分
離して血小板を沈降させる操作を数回くり返し
て、血小板混入の少ないリンパ球浮遊液を得てい
る。

この方法は、遠心分離を数回くり返すため手間
がかかり、また、フイコール・コンレイ法では白
血球中の単球が除去されないなどの欠点を有す
る。

本発明者らは、これまで操作の容易なフイルタ
ーを用いるリンパ球の分離方法について種々検討
し、比較的血小板の混入の少ない方法を確立して
きたが、更に混入する血小板を減少させるため鋭
意研究したところ、血小板を吸着する物質を詰め
た部分を白血球捕捉部分、顆粒球捕捉部分ととも
に用いることにより、血小板の混入が非常に少な
く、純度・収率よくリンパ球を得ることができる
ことを発見し、本発明を完成させるに到つた。す
なわち本発明は、容器に平均直径が5μ以上、20μ
以下の繊維をかさ密度0.04ｇ／cm³以上、0.4ｇ／
cm³以下で詰めた部分と、平均直径が10μより大き
く60μ以下であり、かつ平均直径が前記部分の繊
維よりも大きい繊維を詰めた部分と、血小板を吸
着する物質を詰めた部分とを有し、平均直径が
5μ以上、20μ以下の繊維を詰めた部分が、これよ
りも大きい平均直径を有する繊維を詰めた部分よ
りも血球浮遊液の排出側に配置されていることを
特徴とするリンパ球浮遊液を得るための装置を要
旨とするものである。

本発明に係る装置は三つの構成の異なる部分か
らなるが、平均直径が５〜20μの繊維をつめた部
分は血球浮遊液中の白血球を捕捉するものであ
り、平均直径10〜60μの繊維をつめた部分は白血
球のうち、顆粒球・単球を捕捉するもの、血小板
を吸着する物質をつめた部分は血小板を捕捉する
ためのものである。

本発明で繊維とは、合成繊維，半合成繊維，再
生繊維，天然繊維，無機繊維等の人造または天然
の繊維から選ばれるが、繊維自身あるいは繊維に
付着している物質が血液を変性させるようなもの
であつてはならない。

繊維の平均直径（Ｄcm）とは一本の繊維の重さ
（ｘｇ），長さ（ｙcm）、材料の密度（ｇ／cm³）
から、次式で定義されるものをいう。尚、この場
合繊維の断面は、円形のものを標準とするが断面が
天然木綿繊維や人造繊維にみられる種々の非円形
断面であつてもよい。

また、容器は一般にカラムと呼ばれる円筒形
状、円錐台形状とするのが使用操作上一般的であ
るが他の形状の容器であつても支障はなく、繊維
の充填室とその両側に血球浮遊液の入口と被処理
液の出口を設ければよい。容器の材質はガラス
や、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレ
ン、ポリ塩化ビニール等の合成樹脂を選ぶとよ
い。かさ密度とは、使用繊維重量（ｇ）を繊維の
かたまりが占める体積（cm³）で割つた値（ｇ／
cm³）である。

容器内の繊維はなるべく均一な充填密度でつめ
られることが好ましい。

容器内に収納する繊維は、一本一本の単繊維に
予め均しくほぐすのが好ましく、また各単繊維は
繊維相互に絡合して全体として繊維群の塊り形状
を保つ程度の長さであるのが望ましい。繊維が短
かいと分離される血液成分中に浮遊してくる危険
があり、このため通常は市販の紡織繊維程度以上
の長さの繊維を使用するのが好都合である。

特に、切れ目のないフイラメントを30cm程度以
上の長さで切断し、容器につめたフイルターは、
繊維がもれ出ることが全くなく、用いるのに好ま
しい。繊維の充填量は、被処理血球浮遊液の量、
通過速度によつて任意に決定することができる。

本発明は、基本的には白血球を捕捉する部分
と、顆粒球・単球を捕捉する部分で、血液中のリ
ンパ球を純度・収率よく回収し、また血小板を吸
着する物質を詰めた部分で血小板を吸着・除去す
るものである。白血球を捕捉する部分に詰める繊
維の平均直径は5μ以上、20μ以下である。本発明
者らのこれまでの検討によると、繊維の平均直径
が小さいほど、白血球の捕捉力が強く、従つて血
球浮遊液中の白血球を、白血球を捕捉する部分に
充分捕捉するためには、白血球を捕捉する部分内
の繊維の平均直径は20μ以下、好ましくは10μ以
下である必要がある。また、繊維の平均直径が小
さすぎると白血球の捕捉力が強すぎ、フイルター
から白血球を回収することが困難であり、白血球
を捕捉する部分内の繊維の平均直径は5μ以上、
好ましくは7μ以上が必要である。白血球を捕捉
する部分内のかさ密度は0.04ｇ／cm³以上、0.4
ｇ／cm³以下である。かさ密度が低すぎるとリンパ
球を充分捕捉できず、また、かさ密度が高すぎる
と、残存する赤血球が多くなり、またリンパ球が
回収されにくくなる。白血球を捕捉する部分内の
繊維の平均直径が10μ以下の場合は、かさ密度は
0.25ｇ／cm³以下が好ましい。

顆粒球・単球を捕捉する部分内の繊維状物質
は、平均直径が10μより大きく、60μ以下であり、
かつ白血球を捕捉する部分に用いた繊維状物質よ
りも平均直径が大きいものである。

平均直径が10μ以下になると、顆粒状・単球は
よく捕捉・除去できるが、リンパ球も捕捉され、
リンパ球の回収率が低下する。また平均直径が
60μを越えると、顆粒状・単球捕捉力が小さく、
これらの血球が多く混入するようになる。また顆
粒球・単球を捕捉する部分に用いる繊維は白血球
を捕捉する部分のものより平均直径が大きい方
が、リンパ球を多量白血球を捕捉する部分に送る
ことができる。

顆粒球・単球を捕捉する部分内の繊維状物質の
かさ密度は、血球浮遊液が顆粒球・単球を捕捉す
る部分を通過する際の速度や温度に著しく影響を
受けるが、0.05ｇ／cm³以上、0.5ｇ／cm³以下が好
ましく0.1ｇ／cm³以上、0.4ｇ／cm³以下であれば更
に好ましい。

以上の、白血球を捕捉する部分と顆粒球・単球
を捕捉する部分を組合せることにより、血液など
の血球浮遊液からかなり血小板の除去されたリン
パ球浮遊液を得ることができるが、本発明者らは
血小板を吸着する物質を詰めた部分を白血球を捕
捉する部分、顆粒球・単球を捕捉する部分の少な
いリンパ球浮遊液を得ることができることを発見
した。この血小板を吸着する物質は、血液成分を
変性することなく、血小板を良く吸着し、白血球
成分はあまり吸着しないものならば基本的には使
用可能であるが、特にガラスビーズや他の無機物
ビーズ、金属ビーズなどが、用いるのに好まし
い。これらのビーズは、径が小さい方が表面積が
大きく、少量でもよく血小板を吸着できる、余り
径が小さいと、リンパ球なども非特異的に捕捉さ
れる。

本発明者らの検討では、ビーズの直径は50μ以
上、1000μ以下、好ましくは70μ以上、300μ以下
であれば、リンパ球を余り捕捉しないで、血小板
をよく吸着・除去できることがわかつた。

血小板を吸着する物質をつめた部分の大きさ
は、白血球を捕捉する部分、顆粒球・単球を捕捉
する部分と同様、処理血液量などに左右される
が、大体１〜100ml位の大きさであれば、少量か
ら多量の血液が処理できる。

第１図は、本発明の装置の一例を示す模式図で
ある。血小板を吸着する物質を詰めた部分１は、
顆粒球・単球を捕捉する部分２の後に置かれ、白
血球を捕捉する部分３は、一番後に配置されてい
る。また、顆粒球・単球を捕捉する部分の前に
は、血球浮遊液の導入口である出入口４があり、
白血球を捕捉する部分の後には、血球浮遊液の出
口である、出入口５が取り付けられている。血小
板を吸着する物質を詰めた部分には、ビーズ状物
質７が入つており、またこの部分には、ビーズの
もれ出るのを防ぐためメツシユ６が入つている。
白血球を捕捉する部分と顆粒球・単球を捕捉する
部分には、それぞれ繊維状物質９，８がよく開繊
されて、詰められている。

第２図も、本発明の装置の一例を示す模式図で
ある。この例では三つの部分の位置関係は第１図
と同じであるが、この三つの部分は別々の容器に
入れられ、顆粒球・単球を捕捉する部分と、血小
板を吸着する物質をつめた部分は結合部１０で、
また血小板を吸着する物質を詰めた部分と、白血
球を捕捉する部分は結合部１１で、それぞれ連結
されている。これらの結合部は、ただの導管でも
よくまた容易にとりはずせる構造のものでもよ
い。

第３図も、本発明の装置の一例を示すものであ
るが、第２図と異なり、血小板を吸着する物質を
詰めた部分が最初におかれ、次が顆粒球・単球を
捕捉する部分となつている。また、血小板を吸着
する物質を詰めた部分が一番後に配置されている
例を示したものが第４図である。以上の例のよう
に、血小板を吸着する物質を詰めた部分は、他の
２つの部分の位置の如何んにかかわらず、どこに
でも配置することが可能であるが、白血球を捕捉
する部分と、顆粒球・単球を捕捉する部分の位置
関係では、顆粒球・単球を捕捉する部分が、白血
球を捕捉する部分の前、すなわち血球浮遊液の導
入側に配置されなければならない。このように配
置することにより、まず顆粒球・単球を捕捉する
部分で血液中の顆粒球・単球を除いてから、白血
球を捕捉する部分での残りの白血球、すなわちリ
ンパ球を捕捉することができる。

また、第５図は、２つの部分が同一の容器に入
つた構造のものを示したものであり、特に第６図
のように、血小板を吸着する物質は、顆粒球・単
球を捕捉するための繊維とよく混合して入れても
よい。

なお、１０，１１の結合部をはじめ、１２，１
３，１４，１５，１６，１７などの結合部は、た
だの導管でもよくまた取りはずせて、そこから液
を入れることができる構造でもよく、また第７図
のような三方活栓であつてもよい。

次に、本発明の装置の使用方法を説明する。第
１図の装置では、まずポンプなどの液を移動させ
る器具を５の出入口に取り付け、４の出入口から
血液などの血球浮遊液を装置に導入する。導入さ
れた血液はまず顆粒球・単球を捕捉する部分２で
顆粒球・単球を除去され、次に血小板を吸着する
物質をつめた部分１で血小板が吸着・除去され
る。次に血液は白血球を捕捉する部分３に入り、
ここでリンパ球が捕捉される。この後、白血球を
捕捉する部分内の赤血球や血漿を除去するため、
出入口５から生理食塩水などの生理的溶液からな
る洗浄液を入れ、出入口４から出す。次に白血球
を捕捉する部分内のリンパ球を回収するため、生
理的溶液からなる回収液を高速流で出入口４から
入れる。この場合、回収液の量は白血球を捕捉す
る部分の空間の体積の量ぐらいが好ましい。

第２図の装置では、血液を第１図と同様装置に
導入し、リンパ球を白血球を捕捉する部分に集め
る。次に、洗浄液を白血球を捕捉する部分に入れ
るのであるが、これには出入口５から入れる、
１１の部分をとりはずし、この部分から入れ
る、１１が第７図のような三方活栓１８のとき
は、導管１９を通つて入れる、などの方法があ
る。また回収時は回収液を高流速で白血球を捕捉
する部分に入れてもよいが、また回収液を流しな
がら、白血球を捕捉する部分の容器を木の棒など
でたたくこともできる。

第３図の装置は第２図とほぼ同様の操作で扱う
ことができるが、第４図では、最初血液を装置に
入れ、顆粒球・単球を捕捉する部分と、白血球を
捕捉する部分を通つた血液は、１５の所から三方
活栓で装置外に出す方が、出入口５から出すより
も好ましい。次に洗浄液を１５の所か、又は１４
の所から白血球を捕捉する部分に入れ、最後に白
血球を捕捉する部分に血清成分を入れ、次に血清
成分を含む回収液を１４の所から白血球を捕捉す
る部分に入れ、リンパ球を回収し、これを血小板
を吸着する物質をつめた部分に通して、５の出入
口から出す。

このようにして得たリンパ球浮遊液には、血小
板の混入が非常に少なく、また赤血球や顆粒球・
単球の混入も少ない。また装置の操作も非常に簡
単である。得られたリンパ球は種々の機能がよく
保たれており、バイアビリテイーも高い。またＴ
細胞・Ｂ細胞の比率も、フイルターの条件により
もとの血液とほぼ同じものや、変化したものを得
ることができる。

以上のように、本発明の装置を用いることによ
り、血液等の血球浮遊液から簡単な操作で、純
度・収率よくリンパ球を分離でき、また無菌操作
も容易なため、各種医療施設・研究機関におい
て、リンパ球を用いた研究が容易に行えるもので
ある。

実施例１第３図のように、本発明による装置を構成し
た。即ち、内径15mm，長さ76mmの円筒容器に、直
径0.1mmのガラス・ビーズを一ぱいに詰めた血小
板を吸着する物質を詰めた部分１，内径10mm，長
さ75mmの円筒容器に、平均直径20.7μのポリアミ
ド繊維を、かさ密度0.15ｇ／cm³（重量にして
0.884ｇ）で詰めた顆粒球・単球を捕捉する部分
２，内径10mm，長さ25.5mmの円筒容器に、平均直
径8.2μのポリアクリロニトリル系繊維を、かさ密
度0.132ｇ／cm³（0.264ｇ）で詰めた白血球を捕捉
する部分３を、第３図のように配置した。また、
フイルターの結合部は容易に取りはずしができる
ようにした。

この装置の出入口５にポンプをとり付け、37℃
に加温した健康人のヘパリン加血液５mlを、１
ml／minの流速で出入口４から吸い込み、血液が
すべて装置の導入された後、生理食塩水10mlを、
10ml／minの流速で出入口４から引き続き、吸い
込んだ。この操作によつて、血液は１を通り、つ
づいて２を経て３に入つた。この後、連結部１３
をとりはずし、１３から生理食塩水15mlを第１フ
イルターに４ml／minの流速で吸い込み、次に出
入口５に取り付けたポンプをはずし、生理食塩水
２mlを入れた注射器を結合部１３に取り付け、注
射器の吸子を強く押し、出入口５から２mlのリン
パ球浮遊液を回収した。この液にはリンパ球は元
の血液の40％の濃度で含まれ、顆粒球・単球は白
血球の5.8％含まれていた。また血小板は元の血
液の0.12％の濃度で含まれていた。

実施例２第２図のように、本発明による装置を構成し
た。即ち、内径15mm，長さ40mmの円筒容器に、平
均直径16μのポリエステル繊維をかさ密度0.12
ｇ／cm³（重量にして0.848ｇ）で詰めた２、内径
15mm，長さ50mmの内筒容器に、直径0.1mmのガラ
スビーズを一ぱいに詰めた３、内径10mm，長さ28
mmの円筒容器に、平均直径7.5μのポリアミド繊維
をかさ密度0.13ｇ／cm³（0.286ｇ）で詰めた１を
第２図のように配置した。また、各部分の結合部
は、容易に取りはずしができるようにした。

この装置の出入口５にポンプをとり付け、37℃
に加温した健康人のヘパリン加血液５mlを、１
ml／minの流速で出入口４から吸い込み、血液が
すべて装置に導入された後、ヒトAB型血清５
ml、引き続いて生理食塩水５mlを、１ml／minの
流速で出入口４から吸い込んだ。この後、結合部
１１を取りはずし、１１から生理食塩水18mlを１
に５ml／minの流速で吸い込み、次に出入口５に
取り付けたポンプをはずし、生理食塩水２mlを入
れた注射器を出入口５に取り付け、注射器の吸子
を強く押し、結合部１１から２mlのリンパ球浮遊
液を回収した。この液にはリンパ球は元の血液の
40％の濃度で含まれ、顆粒球・単球は全白血球の
７％含まれていた。また血小板は元の血液の0.1
％の濃度で含まれていた。

【図面の簡単な説明】

第１図，第２図，第３図，第４図，第５図，第
６図は本発明の装置の例を示す模式図、第７図は
詰めた各部分間の結合部の説明図である。１……血小板を吸着する物質を詰めた部分、２
……顆粒球・単球を捕捉する部分、３……白血球
を捕捉する部分、４……出入口、５……出入口、
６……メツシユ、７……血小板を吸着する物質、
８……繊維状物質、９……繊維状物質、１０，１
１，１２，１３，１４，１５，１６，１７……結
合部、１８……三方活栓、１９……導管。

Claims

【特許請求の範囲】１容器に平均直径が5μ以上、20μ以下の繊維を
かさ密度0.04ｇ／cm³以上、0.4ｇ／cm³以下で詰め
た部分と、平均直径が10μより大きく、60μ以下
であり、かつ平均直径が前記部分の繊維より大き
い繊維を詰めた部分と、血小板を吸着する物質を
詰めた部分とを有し、平均直径が5μ以上、20μ以
下の繊維を詰めた部分が、これよりも大きい平均
直径を有する繊維を詰めた部分よりも血球浮遊液
の排出側に配置されていることを特徴とするリン
パ球浮遊液を得るための装置。２繊維が合成繊維，半合成繊維，再生繊維，天
然繊維，無機繊維から選ばれた少なくとも１種で
ある特許請求の範囲第１項記載のリンパ球浮遊液
を得るための装置。３血小板を吸着する物質がカラスビーズ、金属
ビーズ、無機物ビーズから選ばれた少なくとも１
種である特許請求の範囲第１項記載のリンパ球浮
遊液を得るための装置。