JPS5877896A - 酵母の発現ベクタ−及びそれを利用したポリペプチドの生産方法 - Google Patents

酵母の発現ベクタ−及びそれを利用したポリペプチドの生産方法

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JPS5877896A
JPS5877896A JP57147499A JP14749982A JPS5877896A JP S5877896 A JPS5877896 A JP S5877896A JP 57147499 A JP57147499 A JP 57147499A JP 14749982 A JP14749982 A JP 14749982A JP S5877896 A JPS5877896 A JP S5877896A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、分子生物学の分野に関し、より詳しくは酵母
中の遺伝子物質の種々のレベルにおける発現のために好
適なプラスミド・ベクターに関する。
近年、酵母中の複製ベクターとして使用することができ
るプラスミドが開発されるようになってきた（　８ｔｒ
ｕｈｌ　　ほか（１９７９）　ＰＮＡ８　７６　１０３
５と　Ｋｉｎｇｓｍａｎ　ほか（１９７９）　Ｇｅｎｅ
　　７　１４１　）。
酵母の複製ベクターは、酵母の宿主有機体の中で自己複
製することができ、そのため酵母に外来ＤＮＡを導入す
るのに好適である。
ベクターは、またより高度の分析のために、酵母ＤＮＡ
の構成部分を単一するために使用されている。このよう
な公知の系は、酵母の宿主有機体内で１ｌｌＥｋ複製す
ることができるが、それら自体が挿入されたＤＮＡをか
なりの程度まで発現することができるというわけではな
い。
組み換えＤＮＡ技術の利用による有用で興味深いポリペ
プチドの生産は、従来主として宿主−ベクター系として
の大腸１１によりなされてきた（Ｍａｒｔｉａｌ　　ほ
か（１９７９）　　５ｃｉｅｎｃｅ亜６０５とＮａｇａ
ｔａ　ほか（１９８０）　　Ｎａｔｕｒｅ　　２８４　
３１６　）　ｅ一般的にはこれらの発現系は、大腸−の
プロモータ配列、リポソーム結合部位（シャインーデル
ガ−／　（＋９ｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ　）配列）
それに゛しばしば１外来“コード配列が結合される大腸
−のコード配列の最初の数コードンを含むプラスミド・
ベクターに依存している（　Ｈａｌ　ｊｅｗｅｌ　Ｉと
Ｊｉｋｎｔａｇｅ（１９８０）Ｑｅｎｅ　　９　２７　
）ｅ他く歳近、大腸緬のアミノ緻配残の付着していない
”外米１タンパク質を合成することかできる方法が開発
されたが、このような理由により多くの場合、融合タン
パク質が合成されている（　（３ｕａｒｅｎｔｅ　ほか
（１９８０）　Ｃｅ１ｌ　　２０５４３）。
場合により、大ａｍはホスト−ベクター系としては適当
でな〜・こともある。例えば、大ｗｋ繭は、有用な薬剤
となり５るものからは取り除かなければならない多（の
有毒な発熱性因子を待っているのである。勿論、精製さ
れなければならない度合は、製品によって異る。また、
大腸■中のタンパク質分解作用により、有用な製品の生
産量が大輪に減少させられることもある（例えば　Ｉｔ
ａｋｕｒａほか（１９７７）　８ｃｉｅｎｃｅ　　１９
８　１０５６　）。真核生物の産物の生産が興味深いと
いうこともあり、これらや他の理由により代替となる宿
主−ベクター系、！に真核生物系の使用への関心が高ま
ってきた。
真核生物の中で、利用するのに好適であり、恐らく最も
扱い易いものは酵母のサツカロミセス０セレビシｘ　（
８ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓ＋ａｅ
　）である。
酵母は、安価且つ大量増殖が容易であり、しかも高度に
発達した遺伝系統を持って（・る。
本発明の目的は、挿入されたポリペプチドのコード配列
を発現させることができる酵母のベクター系を提供する
ことである。
本発明に従って、我々は酵母の選択マーカ、酵母の複＄
１８．それに制限部位に挿入されたポリペプチドのコー
ド配列から発現されるように唯一の制限部位に関連して
位置している酵母のプロモータからなる酵母の発現ベク
ターを提供するものである。好ましくは、発現ベクター
は微生物プラスミドの少くとも一部分を含むほうがよい
、このことにより、酵母の発現ベクターを砿生豐の宿主
糸（例えば大腸菌）で操作することがｑ能となる。
我々は、２種類の酵母の（ｉｌｌ製源と当該技術分野で
は酵母の複製ベクター構造とし工知られて〜・る選択マ
ーカを使用した。鍛初のものは、自然酵母のグラスミド
２μ（２ミクロン）の複製領域に基づいている。このプ
ラスミドは不可解なところがあり、容易に検出できる表
現型を持っていなくて、細胞あたり約１００のコピー数
が存在している。特別の実験では、２μプラスミド誘導
物ＰＪＤＢ２１９（Ｂｅｇｇｓ　（１９７８）　Ｎａｔ
ｕｒｅ　２７５１０４　）からの１３．２５ｋｂ断片を
使用したつ当該断片は、次のような２個のＥｃｏ旧断片
（２，５ｋｂと０．７ｓｋｂ　）から成つ又いる。
０．７５　ｋｂ　　　　　　　２．５　ｋｂＨｃｏＲＩ
　　ＥｃｏＲＩ　　　　　　　ＥｃｏＲＩ（ｉＩＡ尺通
りではない） ＬｇＵ２選択マーカは、内部のＥｃｏＲＩ　ｓ位を取り
巻いており、この部位における開裂により分断され得る
。２μ配夕１１につ−・てはｆｆ−細にａＩ２明されて
おり（ＨａｒｔｌｅｙとＤｏｎｅｌｓｏｎ　（１９８０
）　Ｎａｔｕｒｅ　２８６５６０）、またＬＥＵ２領域
についても今まで研究対象トナッテいル（Ｄｏｂｓｏｎ
はが（１９８１）　Ｇｅｎｅ１６１３３　）。上に示し
た３、２５　ｋｂ　　ＥｃｏＲＩ断片は、本発明の発現
ベクターで選択−複製の基本単位として使用した。この
断片を含む本発明の発現ベクターは、細胞あたり約５０
〜１００プラスミドのコピー数を有する酵母中に安定に
保存しておくことができろ。
２番目の４１類の酵母の複製源とマーカ配列は、酵母の
染色体ＤＮＡから得られた自己ＯＬ製配外１（Ａｌ１）
に依存している。これらの配列の中の最も％微的なもの
は、酵母のＴＲＰＩ遺伝子とＡｌ１（Ａ）１８１）の両
方を含ん、で（・る１、４５　ｋｂｐ　ＥｃｏＲ１断片
である（　Ｋｉｎｇｓｍａｎほか（１９７９）　Ｇｅｎ
ｅ　　７１４１と８ｔｒｕｈｌ　ｌｌかＰ、Ｎ、Ａ、８
．７６１０３５　）。この断片をｐＢＲ３２２（微生物
ベクター）に仲人すると、ＹＲｐ７として知られている
グラスミドがでさ、これは太Ｍｋ菌と酵母の宿主系の内
方で＠　＃　”Ｉ　ｓＬである。Ａｌ１に基づいたプラ
スミドは非常に不女定であり、選択がない場合には殆ん
ど全て失なわれ、選択がある場合には５０％位しか保た
れず、２番目の配タリを除いて、Ａ）１８安定化配りＩ
ｌｌちＡｓｓ　）は、Ａ）１８配列に共有結合的につな
°がっている。現在のところＡＳ８は、動原体のＤＮＡ
配列であルト思われる（　Ｌ、Ｃ１ａｒｋｅとＪ　、　
Ｃａｒｂｏｎ（１９８Ｇ　）　Ｎａｔｕｒｅ　２８７５
０４　）。有用な断片は、Ａ２Ｂを持った６２７　Ｓａ
ｕ　３ｍ断片をよむように修紬された次のような１．４
５　ｋｂ　　ＴＲＰ　ｌ　：　Ａｌ１　ＥｃｏＲＩ断片
である。
（縮尺通りではｔ〜・） 直ぐ上に示したＥｃｏＲＩ断片は、本発明の発現ベクタ
ーで選択−ｕｉ製の基本単位として使用した。
この断片を含む本発明の発現ベクターは、細胞あたり約
１プラスミドのコピー数な持った酵母中に安定して保っ
ておくことができる。それらは、有糸分裂と減数分裂で
所定の様式により分離する。
本発明に従って、更に、酵母のプロモータが酵母の解糖
系酵素のコードとなる遺伝子の５領域の少くとも一部分
からなる酵母の発現ベクターを提供する。酵母の解糖系
＃素は、例えばホスホグルコース・イソメラーゼ、ホス
ホフラクトキナーゼ、アルドラーゼ、トリオースリン酸
イノメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒド
ロゲナーぞ、エノラー（、ピルビン酸キナーゼ、ホスホ
グリセリン酸キナーゼである。
４ＩＫ好適なものは、酵母のプロモータが酵母のホスホ
グリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子の５領域の少く
とも一部分から成っている酵母の発現ベクターである。
酵母の解糖系＃票の５領域の少くとも一部分な含む酵母
の発現ベクターは、このよ５なベクターで形質転換され
た酵母の栄１１ｊ＠地中の発１１１性Ｒ素源のＳ度を変
えることＫより発現を調節することができる。好ましい
発酵性尿素源はグルコースである。本発明の更により好
適な態様では、ＰＧＫ遺伝子の５′領域の少くとも一部
分が唯一の制限部位の上流に位置しており、またＰＧＫ
遺伝子の３′領域の少くとも一部分が唯一の制＠部位の
下ｆＩＬＫ位置している酵母の発現ベクターを提供する
。この１上流１と“下流“という用−は、転写と翻訳の
方向に関連したものである。
本発明の他の実施例では、酵母のプロモータがＴＲＰＩ
遺伝子の５領域の少くとも一部分から成つている酵母の
発現ベクターな提供する。
本発明の発現ベクターには、酵母の複製源と酵母の選択
マーカな含む。好グしく・実施例では、これらは酵母の
グラスミド２μ俵投源の少くとも一部分とＬＥＵ２＃母
の選択マーカの少くとも一部分を含む断片から成ってい
てもまい　他の好適な実施例では、これらは自己ＩＩＩ
製配列配列Ｒ８）の少くとも一部分と自己複製配！！１
安定化配列（Ａｓ＆）の少くとも一部分を含む断片から
成っていてもよい。
本発明の酵母の発現ベクターに挿入された遺伝子は１選
択されたベクターに依存する正しく・絖み散り粋にある
融合タンパク質として発現され得る。
本発明の好適な実施例では、ポリペプチド、好ましくは
ヒトのα型インターフェロンのコードとなる遺伝子の少
くとも一部分を含む酵母の発現ベクターを提供する。
本発明の他の態様に使って、上記ポリペプチドのコード
となる４伝子を含む酵母の発現ベクターによって形質転
換された酵母の宿主有機体に上記ポリペプチドを発現さ
せることから成るポリペプチドの生産方法を提供する。
本発明の他の態様に従って、酵−母の発現ベクターの１
キツトを提供する。このキットは、本発明の２個以上の
酵母の発現ベクターから成って（・てモヨイ。コノよう
なキットを提供する目的は、分子生物学ｆＫｍ胞あたり
多くの又は少（・コピー数の及び高い又は低いレベルの
発現性を持った樵々のベクターを提供することによって
、彼等のいつも行５発現の研究を容易にするためである
。押入されたＤＮＡの絖み取り枠は、またキットから１
当なベクターを選んで選択可能としてもよい。好ましい
実施例では、それぞれのベクターがＴ）ＬＦＩ　：ＡＲ
５Ｉ：Ａ１９Ｓ又はＩＪＵ２：２μＩｋ製源選択マーカ
、複製系それＫＴＲＰＩ又はＰＧＫ　　ｒ；領域の酵母
プロモータのどちらかの少くとも一部分のうちの（・ず
れかを有する４個以上の酵母の発現ベクターからなるキ
ットを提供する。
以下、本発明を図面な＃照しながら、下記の実施例に基
づいて説明する。
図において、制限工／ドヌクレアーゼ地図は、縮尺通り
に描かれているわけではない。場合により、制限部位は
次のように略称するっ ＲＩ　＝　ＥｃｏＲＩ　、Ｐａｔ又はＰ＝ＰｓｔＩ、Ｂ
ａｍ又はＢａ　＝Ｂａｍ　　ＨＩ、　Ｂｇ＝Ｈｇｌ　　
ＩＩ、　Ｐｖ＝Ｐｖｕ　　ＩＩ、８ｍｌ又は５＝８ａｌ
　　Ｉ　、　Ｈａ　　３＝Ｈａｅ　　ＩＩＩ　。
Ｈ３＝Ｈｉｎｄ　　ＩＩＩ 次に説明する酵母の発現ベクターは、細胞のプラスミド
ｐ　Ｂ　）Ｌ　３２２に基づいており、上述した酵母の
複製源基本単位及び酵母の選択マーカ基本単位のいずれ
か１つを使用する。両者の基本単位はｍｃ　ｏＲＩ断片
であり、そのため容易に操作することができる。
標準的な技法を使用して、上述した犬ａｍペク１−１）
ＢＲ３２２ト２μ酵母グラスミドの一部分を含むＥｃｏ
ＲＩ断片がら成る９ＭＡ３と呼ばれるベクターを作った
っこのグラスミドは、多くの公知の中メ２的酵母のグラ
スミドに反して比較的安定しているようであり、細胞あ
たり約５０〜１００プラスミドというコピー数の多さで
酵母中に保たれる。
また、標準的技法を使用して上述の大腸菌ベクターｐ　
Ｂ　Ｒ３２２とＡｌ１：Ａ２Ｂ　　ＥｃｏＲＩ断片から
成る９ＭＡ９１と呼ばれる２番目のベクターを作った。
このプラスミドも酵母中で安定しているが、コピー数が
１個で存在している。
２個のベクターｐＭＡ３と９ＭＡ９１は、第１図におけ
る部分的地図により表わされている。それらは本発明の
範囲内に入るベクターではないが、本発明のベクターの
生産には重要な前駆体である。
第１図における各々の図で、太線は酵母のＤＮＡから得
られた配列を示す。
９ＭＡ３と９ＭＡ９１のＤＮＡは、標準的方法で作った
（　ＣｈｉｎａｕｌｔとＣａｒｂｏｎ　（１９７９）　
Ｇｅｎｅ　５１１１　）。９ＭＡ３は、＆ｏＲＩで部分
的に分解し、この分解物は、１優のアガロースゲルで分
離した。
複製の２μ源を含む３．２５ｋｂ２重＆ｏｌ（Ｉ断片と
ＬｎＵ２遺伝子は、ＴａｂａｋとＦｌａｖｅｌｌの方法
（（１９７ｇ　）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
ｓ、　５２３２１　）により精製した。同様に９ＭＡ９
１は、＆ｏＲＩを用いて完全に分解し、ＴＲＰＩ遺伝子
、ＡｌＢ２．Ａ２Ｂを含む１．Ｏｋｂ断片を精製した。
このため、２個のＤＮＡ断片が複製−選択系基本単位と
して使用可能であった。これらは、この後それぞれ２μ
：ＬＥ０２　基本単位、ＴＲＩＪ　：ＡＩ’Ｌ８１　：
ＡＳ、８　基本単位と呼ぶ。
これから説明する本発明の特徴的な実施例では、発現ベ
クターには、２種類の有用な機能的プロモータ配列の内
の１つを含む。最初のものは酵母のＴＲＰ遺伝子の５′
領域から得られるものであり、２番目のものは酵母のＰ
ＧＫ遺伝子の５′領域から得られるものである。幾つか
のベクターの中には、酵母のＰＧＫ遺伝子の３′領域が
含まれる。
酵母のＴＲＰ１遺伝子とＡｌＢ２を含む１．４５　ｋｂ
ｇｃｏＲＩ断片は、完全に合成配列されている（　Ｔｉ
ｃｈｕｍｐｅｒとＣａｒｂｏｎ　（１９８０）　Ｇｅｎ
ｅ　１０１５７　）。
この断面の構成は第２図に示されており、図中ＴＲＰ１
コード配列の左にある黒い部分は遺伝子の５′領域であ
る。５′調節領域は、イソ−１−チトクロムＣ及び酵母
からのＧＰＤ遺伝子の類似領域と着しい相似性を有して
いる（Ｓｍｉｔｈほか（１９７９）Ｃｅｌｌ　　　１６
　　７５９　　、　）ｌｏｌｌａｎｄ　　と　Ｈｏ１ｌ
ａｎｄ　　（１９７９）ＪＢＣ２５４５４６６）、それ
ぞれ開始コードンからヌクレオチド４８〜７６個上流側
で終わる約３０個のヌクレオチドであるプリンに富んだ
鎖を含む領域がある。また、開始コードンからヌクレオ
チド１０〜１５個上流側にあるＣＡＣＡＣＡ配列もある
。
この６個のヌクレオチドは酵母にだけ見られ、真核生物
におけるｒ；　ＣＡＰ構造とは異るリポソーム結合部位
の存在は疑問と思われるが、この開始コードンへの近さ
は翻訳におけるリポソーム結合部位の存在を意味してい
るのかもしれない（Ｎａｋｓｉａｈｉｍａほか（１９８
０）　Ｎａｔｕｒｅ　　１５６　２２６．８ｔｉｌｅｓ
ほか（１９８１）　Ｃａ目　２５２７７）、遺伝子はｐ
ＢＲ３２２で両装置に断片で発現されるので、ＴＲＰＩ
の発現に必要な信号は、プラスミドｙａｐ７（第２図）
の１．４５　ｋｂ断片上にある５隣接領域内にあるとい
うことは確実である。しかし、開始ＡＴＧＫ対して１０
３個のヌクレオチド５しがなく、また殆んどの真核生物
の遺伝子はこれよりかなり長い５′調節領域を持ってい
るので、’ｒＲＰｔを最大に発現させるための全ての信
号は存在していないようである。ＡｌｕＩ部位は開始Ａ
ＴＧから僅かヌクレオチド８個離れたところにあるため
、１．４５ｋｂｇｃｏＲＩ断片（第２図参照）の最も左
端にある９５ｂｐＥｃｏＲＩ　−ＡｌｕＩ断片は、ＴＲ
ＰＩの発現のために必要な信号を含んでいる筈である。
従って、この断片から上流側の付加配列は、最大に発現
させるためには必要であるかもしれないが、この断片が
潜在的に有用な“可動プロモータ１を提供するのである
。ＴＲＰＩ　　ｍＲＮＡは全ｍＲＮＡの約０．１〜０．
０１　％存在しているので、プロモータからの発現のレ
ベルは相対的に低いと思われる。
２番目に利用可能な酵母のグロモータ配列は、ヒララマ
ンにより最初に単離されたホスホグリセリン酸キナ−４
（ＰＧＫ）遺伝子のものである（　Ｈｉｔｚｅｍａｎほ
か（１９７９）、ＩＣＮ−ＵＣＬＡ８ＹＭＰ、　１４　
５７　）。酵母の解糖系酵素の遺伝子は、炭素源により
調節されており（ＭａｉｔｒａとＬｏｂ。
（１９８１）　ＪＢＣ２４６４７５）、酵母に異種タン
パク質産生のための単純な調節系を発達させる譜在力を
与え【いる。タンパク質と核酸配列の分析により、ＰＧ
Ｋコード配列の位置関係を決めることができた。
要するに、多数及び少数のコピー数の２つのプラスミド
と高い発現性及び低い発現性の２つのプロモータ配列を
酵母の発現系で使用することができる。成る異種タンパ
ク質の発現の特徴が適当なプラスオドを選ぶことにより
極めて簡単に決定することができるようｋ、酵母中に１
有用な”遺伝子が種々のレベルで発現するのに適当な１
組のベクターを提供することが本発明の目的の１つであ
る。
この１組は、２つのプロモータ、ＴＲＰＩとＰＧＫとＴ
ＲＰＩ：ＡｌＢ２：Ａ２ＢとＩＪＵ２：２岸複製源、選
択マーカと複製系の全部で４つの対の組合せから成つ【
いる。加えて、この中ツトには、全部で３コードンの読
み取り枠にある酵母のホスホグリセリン酸キナーゼのア
ミノ末端アミノ酸への有用なポリペプチドの融合をさせ
るＰＧＫ発現系に基づいた分子を含んでいる。ＰＧＫに
基づいた発現系において、発現はグルコースの利用度に
よって調節され得る。従って、このキットは、全部又は
一部分であっても何等かのポリペプチドのコード配列が
どのよ５な条件の下でも発現されるように、あらゆる可
能性のある発現をカバーするものである。
表１に、このキットにおけるプラスオドの名称とそれら
の基本的特徴を挙げる。
表　　１ ｐ＝ベクターは、転写刺激により発現する。
ｆｌ−ベクターは、コードン間の接合で融合タンパク質
を産生ずる。
ｆ２−ベクターは、ＰＧＫ読み取り枠＋１において接合
で融合タンパク質を産生ずる。
ｆ３−ベクターは、ＰＧＫ読み取り枠＋２において接合
で融合タンパク質を産生する。
実施例１ 酵母のＴＲＰｌ遺伝子の５′領域に基づいた多数の酵母
の発現ベクターを作った。９ＭＡ１０３と呼ばれる酵母
の発現プラスオドを作るための概要を第３図ａと第３図
ｂＫ示す。部分的制限エンドヌクレアーゼ部位の地図と
配列についての情報が示されており、詳しい説明はＴｓ
ｃｈｕｍｐｅｒとＣａｒｂｏｎによるＧｅｎｅ　１０１
５７（１９８０）、ＨａｒｔｌｅｙとＤｏｎｅｌｓｏａ
　ＫよるＮａｔｕｒｅ　２８７８６０（１９８０）　、
　　５ｕｔｃ目ｆｆｅ　ＫよるＣ、８．Ｈ。
Ｓ、Ｑ、Ｂ、す７９（１９７９）に記載されている。Ｔ
４リガーゼとＢａｍ　ＨＩリッカーの使用は、Ｍａｎｉ
ａｔｉ＠ほか（１９７８）Ｃｅｌｌ　１５６８７に従っ
たものであり、ポリアクリルアミドゲルからの制限断片
の精製はＭａｘａｍとＧｉ　１ｂｅｒｔ　（１９８０）
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｇｎｚ、　６５４９９　Ｋよっ
たものである。大腸菌の形質転換は、　Ｃａｍｅｒｏｎ
はカＰ、Ｎ、Ａ、８．（１９７５）７２３４１６　Ｋ記
載の方法によった。
ＴＲＰＩ遺伝子の５′端にあるＥｃｏＲｌ−Ａｌｕｌ断
片の１末端を定めるＡｌｕＩ部位は、ＡＴＧ開始コード
／からヌクレオチド８イ一分だけ上流鯛に位置している
。
従って、このＡｌｕ１部位に挿入されたどんな配列であ
っても、ＴＲＰｌプロモータから効率よく転写されなけ
ればならない。もし５この配列も５′端に近いＡＴＱ開
始コード／を含んでいるとしたら、効率的な転写を期待
することＫもなろう。そのため。
ＥｃｏＲＩ−Ａｌｕ断片（９３ｂｐ）　４Ｌ　　７９６
７　りＩＪ　ルア　ミドゲルで分離した後、ＹＲｐ　７
のＥｃｏＲＩとＡＩＬＩＩＫよる分解によって産生され
た他の制限断片からＭ製した。次にこの断片をＥｃｏＲ
Ｉで切断されたｐＢＲ３２２につなげ、その後ＢａｍＨ
Ｉリンカ−１より多くのりガーゼ、スペルミジ／（＠ｐ
ｅｒｍｉｄｉａｅ　）を反応物ニ添加した。２０℃で６
時間培養した後、このＤへ人を７エノール抽出し、エタ
ノール沈殿させ１次にＢａｍＨＩで分解してリンカ−を
開裂させた。その後。
１３ｄｍＨＩをフェノール抽出により除去し１分子の混
合物を結びつけ、大腸菌のＡＫＥＣ２８を形質転換する
ために使用した。（ＡＫＥＣ２８＝　Ｋ、１２　　ｔｒ
ｐｃ１１１７１ｅｕＢ６　　Ｔｈｙ　　ｈｓｄｒ−ｂｓ
ｄｍ−）　　入１ｕＩ末端に付層シタＢａｍＨＩ　ＩＪ
　ｙ　カーを持ツタＹＲｐ７カらノ９３　ｂｐＥｃｏＲ
Ｉ−Ａｌｕｌ断片により置き換えられたｐＢＲ３２２の
小さなｇｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を有するプラスミド
を含む形質転換物コロニーは、テトラサイクリ／感受性
、１４５ｋｂ　　ＴＲＰｔ：ＡｋＳ１断片をグ。−ブと
して用いた１グル／スタイ／（Ｑｒｕｎｓｔｅｉｎ）と
ポグネス（Ｈｏｇｎｅｓｓ　）　”交雑（（１９７５）
Ｐ、へ、Ａ、Ｓ、　７２３９６１）における陽性信号、
その次にグラスミドＤＮＡの詳しい制限分析な基に１６
］定した。このようＫして作られたプラスミドが、第３
１３ｂのｐ　ＭＡ　１　ｇ　１である。その次に、　ｐ
ＭＡＩＱｌを唯一のＥｃｏＲ１部位で切断し、２μ：　
ＬＥＵ　２　ｙ′裂／選択基本巣位と混合し、連結し、
ア／ビ／す／抵抗性とロイン／・プロトドｏフイ（ｐｒ
ｏｔｏｔｒｏｐｈＹ　）で選んた大腸＠　ＡＫＥＣ２８
を形質転換するために使用した。全てのこの表視型の形
質転換物には、第４図にｐＭＡ　１０３として示す同じ
地図又は他の配電にある２μ：ＬＥＵ２基本単位を持つ
分子を含んでいた。９ＭＡ１０３にある発現部位は、　
ＢａｍＨＩ　テア’ｌ　、　　１０”／、Ｌｇ　ｆ）　
＃５１＆　”’ＱｌｔＨｔｔを形質転換する。
同様にしてＴＲＰＩ：ＡＲ８１：ＡＳＳ基本単位をｐＭ
Ａ・１０１のｇｃｏＲＩ部位に挿入して９ＭＡ１１３を
作ったが、この場合には選択はアンピンリン抵抗性とト
リブトファン・グロトトロフィによるものであった。ｐ
ＭＡ１１３０部分的地図は、第５図に示されている。Ｉ
）ＭＡ１１３の場合、酵母の形質転換の頻度は１０４／
＾ｇである。
実施例２ １．４５ｋｂ　　ＢｃｏＲＩ　　ＴＲＰ　１断片の範囲
な越えた酵母ゲノムの領域は、全部のＴＲＰＩ　　５’
調節領域を利用するためにクローン化した。
１．４５ｋｂ　　ＥｃｏＲＩ　：　ＴＲＰ　１断片の限
界’ｋ　Ｍｌ　、ｔ　タＤへＡ配列は、ＴＲＰＩグロモ
ータがらの発現を最大にするために必要である。１．４
５ｋｂ　　ＥｅｏＲ１断片に重なるＨｉｎｄ　　ＩＩＩ
断片を単離したが、それには全てのＴＲＰ　　５’調節
領域（第２図に黒い部分で示す）を含んでいる。このＨ
ｉｎｄ　　ＩＩＩ断片の大きさを調べるため、サザン（
５ｏｕｔｂｅｒｎ　）交雑で１．４５ｋｂ　　ｊ；ｃｏ
Ｒ１断片（第２図）からのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ　　Ｉ
ＩＩ断片断片ノ一方をグローブとして使用して、Ｈｌｎ
ｄ　　１１１で切断された酵母のＤＮＡを完全なものＫ
した。オートラジオグラフィで、１本の約２．０ｋｂの
バンドを見ることができた。次ｆＣ，Ｈｉｎｄ　　ＩＩ
Ｉで分解さされた全部の酵母ＤＮＡを１９６アガロース
ゲル中に分散させ、そして１５〜２．５ｋｂの大きさの
範囲にある全てのＤＮＡなタパク（Ｔａｂａｋ）と７　
ラヘル（Ｆｌａｖｅｌｌ　）Ｋよる方法（ＮＡＲ５２３
２１（１９７８））　Ｋより精製し、Ｈａｎｄ　　ＩＩ
Ｉで分解されたｐＴＲ２６２な用いて結びつけた（Ｒｏ
ｂｅｒｔｓほか（１９８０）Ｇｅｎｅ　１２１２３　）
　ッ次Ｋ　７００個のテトラサイクリ／抵抗性のコロニ
ーは、　ＭＩ＆された１、４５ｋｂ　　ＥｃａＫＩ　：
　ＴＲＰ　１断片をグローブとして使用して、″グルン
スタイン（Ｑｒｕｎｓｔｅｉｎ）−ホグネス（Ｈｏｇｎ
ｅｓｓ　）”操作によりスクリー二／グした。１個のコ
ロニーだけがこのグローブとの交雑を示し、プラスミド
ＤへＡはこのクローンから作った。このグラスミドは、
　１．４５ｋｂ　　ＥｃｏＲＩ　　ＴＲＰ　ｌ断片から
のＢｃｏＲＩ　−Ｈ７−７１ｄ　　Ｉ　Ｉ　ｌ断片の小
さい方と特異的に交雑する２２ｋｂ　　Ｈｉｎｄ　　Ｉ
ＩＩ断片を含んでいる。−１０３（ＡＴＧにある人が＋
１である）の位置にあるＥｃｏＲＩ部位から上ｔＩｔａ
の領域のヌクレオチド配列は、標準的なＭ１３／ジデオ
キシ配りＵ決定法（Ｓａｎｇｅｒほか（１９７７）Ｐ、
Ｎ、Ａ、８．７４６４６３　）により決定した。その配
列を第６図に示す。この図で。
１６９から２７５までのヌクレオチド配列は、チュンパ
−（Ｔｓｃｈｕ＋ｎｐｅｒ）とカーボン（Ｃａｒｂｏｎ
）　（Ｑｅｎｅｌｏ　１５７（１９８０）　）に従って
いる。潜在的に１賛な特徴なもっているところにはアン
ダーライ／がひかれている。新規な配列のデータには、
上に−が引かれていない全ての配列を含む。全てのＴＲ
Ｐ１５′調節領域を含むＩ）ＭＡ１０３の誘導体を作る
ために、１組の構成体を第７図に概略で示すように作っ
た。
（この図で、太線は酵母から得られたＤＮＡを示す）　
　２．２ｋｂ　　Ｈｉｎｄ　　ＩＩＩ断片は、タパク（
Ｔａｂａｋ）と’　ラヘｋ　（Ｆｌａｖｅｌｌ　）の方
法（（１９７８）ＮＡ）ｔ　５２３２１）Ｋより精製し
、　ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄ　　Ｉ１１部位へ挿入し、
プラスミドｐＭＡ３３を作った。ｐ　ＭＡ　３３かもの
小さなＥｃｏＦＬＩ断片を精製し、次Ｋｌ）ＭＡＩＯＩ
の唯一の＆ｏＲＩ部位に挿入した（＠３図す参照）。Ｔ
Ｉ’ＬＰ５′領域の合構成を確実にするためにこの断片
の配置を調べた。得られたグラスミドは％　ｐ　ＭＡ　
３５と呼ばれる。その後、９ＭＡ３５をＥｃｏＲｌで部
分的に切断し、２μ：ＬＥＵ２基本単位を挿入した。−
１０３におけるＥｃｏＲ１部位ではなく、ｐＢＲ３２２
のＥｃｏＲ１部位において２μ：ＬＥＵ２断片が存在し
て（・るので、組み換え分子なスクリーニングした。こ
のような分子は、　　９ＭＡ３６である（第７図）。
実施例３ 酵母のＰＱＫ遺伝子の５′領域に基づいた多数の酵母の
発現ベクターを作った。
酵母のＰＧＫ遺伝子は、酵母−大腸菌ベクターであるｐ
ＭＡ３　（第１図）Ｋある２、９５ｋｂ　　Ｈｉｎｄ　
　ｌ　Ｉ　１断片上に存在している。この分子の部分的
制限地図を第８図ａｌｃ示す。ＰＧＫ　Ｈｉｎｄ　　Ｉ
ＩＩ断片ハ。
酵母のポリ−Ａ　　ＲＮＡから作った３″Ｐでラベルさ
れたｃＤＮＡを使って、λ７６２　（Ｍｕｒｒａｙほか
（１９７７）Ｍｏｌｃｃ、ｇｅｎ、Ｑｅｎｅｔ　　１５
０５３　）に挿入されたＨｉｎｄＩＩＩ断片の集団から
単離した。この断片は、ヒツツｖ　ｙ　（Ｈｉｔｚｅｍ
ａｎ）ほか（（１９８０）　Ｊ　ＢＣ，２５５１２０７
３）によって説明されたプラスミドｐＢＩ　Ｋあり、そ
して交雑の選択翻訳実験（Ｒｉｃｃｉａｒｄｉほか（１
９７９）Ｐ、Ｎ、Ａ、８．７６４９２７　）における”
３．ｌｋｂ”断片に供ている。この断片は、８ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥでの純粋なＰＱＫと同じ移動度を持つタンパク實
を符号化して表わされている。１．９５　ｋ　ｂ断片の
制限地図を、＠８図ｂ［示す。
酵母ＰＧＫの残基２７０〜４００のアミノ酸配列を第９
図ａに示す。この配列は、手作業の及び自動化されたエ
ドマン（Ｅｄｍａｎ　）分解法により決定されたもので
ある。このアミノ酸配列により、　２．９５ｋｂＨｉｎ
ｄ　　ＩＩＩ断片上にある制限部位とタンパク質配列に
ある２個又は３個のアばノ酸のグループとを引き合わせ
ることができる。第９図すは、関連ある制限部位を示す
ものであり、このような部位は第９図ａのアミノ酸配列
上に印がつけられている。
制限地図にある４つの部位の位置とタンパク實の配列は
一致しているので、１．９５ｋｂ　　Ｈｉｎｄ　　Ｉ　
Ｉ　Ｉ断片上の部位に関する遺伝子の位置を決めること
ができる。ＰＱＫの分子量が４０Ｋｄ　（４１５アミノ
酸残基）であり、また大きなイノトロン・かないとすれ
ば、コード配列の５′と３′端の位置を予想することも
できる。コード配列の大きさは、直線状だとすれば、第
８図すのように表わされ、開始コード／ｋｔ　ｇｃｏＲ
ｌ　部位の左へ約９００ヌクレオチドのところ。
また終止コードンは右へ約３００ヌクレオチドのところ
にある。
ＰＱＫ転写物の５′端の位置は、Ｓ１保絵方法（Ｂｅｒ
ｋと５ｈａｒｐ（１９７８））’、Ｎ、Ａ、Ｓ、　７５
１２７４　）により確認した。コード配列（第８図ｂ）
の５′端に及ぶ１．２ｋｂ　　Ｈａｅ　　Ｉ　Ｉ　Ｉ断
片をアガロース・ゲルで［ｋｌし、全酵母ＤＮＡと交雑
させた。交雑物を穐々の濃度の８１ヌクレアーゼで処理
し、その恢得られた物ｋ　１．９５ｋｂ　　Ｈｉｎｄ　
　Ｉ　Ｉ　１断片をプローブとして使用し、サザ／（５
ｏｕｔｈｅｒｎ　）交雑法によりｘ、ｓ９６アガロース
・ゲル罠かけて分析した。第１Ｏ凶は、１つの保躾され
た断片の大ささは６８０ｂＰであることを示している。
この図で、それぞれのレー／におけるＳｌの濃度は、ａ
）２５単位、ｂ）５０率位、Ｃ）　１００単位である。
レーンｄ）は、未処理の１，２ｋｂ　　ＨａｅＩＩＩ断
片を持っている。これまでの地図によるデータを基にす
ると、ＰＧＫ転写物の５′端は、２．９５ｋｂＨｉｎｄ
　　ＩＩＩ断片の上にあるＥＣｏＲｌ部位の左肯約９６
０　ｂｐのところにあるようである。このことは。
開始コード／の位１ｉ１ｉＫ関する我々の予想とよく−
致しており、もし転写物の５′端とＢｇｌ　　ＩＩ部位
の関にイントロンがあるとすれば、それらは非常に小さ
いということを示唆するものである。ＰＱＫ遺伝子の５
”ｇ節”領域は１便利な制限部位を殆ど含まない領域に
あり、そのため配列計画の作製を比較的困難にしている
。この問題を解決するため。
一般的にも役に立つであろう方法を採用した。プラスミ
ドｐＭＡ３−ＰＧＫ　１に８ａｌ　　Ｉ　（＠　８　Ｖ
　）　ｖ用イて分解し１次にエクソヌクレアーゼＢＡＬ
３１を用いて分解して各端部から約ｓｏｏ　ｂｐを散り
除いた。
このことにより２つの小さな５ａｌｌ断片が失われ。
ＰＧＫ配列と９８Ｒ３２２にある５ａｌｌｓ位Ｋｋｆｆ
６最も左の５ａｌ１部位から始まりそしてＰＧＫの開始
コードンとｐＢＲ３２２のヌクレオチド１１５０付近で
それぞれ終る幾つもの欠損部ができた。これらの欠損さ
れた分子は％Ｂａｍ　Ｈｌ　リンカ−が分子で５０倍過
剰に存在する中で連結し、その後ＡＫＥＣ２８をＬＥＵ
＋、人ｒｎｐＲＫ形質転換するために使用した。
１）ＭＡ２２Ｊ１欠損シリーズと呼ばれるこれらの分子
の一般的構造を第１１図に示す。７０−のこれらの欠損
分子は、ＰＧＫ遺伝子の５′領域を含むＥｃｏＲｌ−８
２ｍ　Ｈｌ断片の長さをｆＩＡ１１定することにより分
析した。それらの平均的長さは１．５ｋｂであるが、５
００ヌクレオチドを含む大きさである。１１ｉＥって、
この集団は、ＰＧＫ遺伝子の５′領域の配列分析のため
に有用な多くの分子を提供する。このような２つの欠損
部であるＣと冑を第８区ｂ［示す。これらの分子からの
小さなＥｃｏＲｌ　−Ｂａｍ　Ｈ１断片を精製し、　Ｍ
１３ｍｌ）７０１でクローン化し、それぞれの場合Ｂａ
ｍ　８１部位から始まりｇｃｏｆｔ１部位に向って伸び
るよ５にジデオ＊　シ（ｄｉｄｅｏｘｙ　）　鎖末端法
（Ｓａｎｇｅｒほか（１９７７））”、Ｎ、Ａ、８．７
４５４６３　）により配列化させた。開始コード／から
上Ｒ，餉の２２６ヌクレオチドト１１に初の７コードン
のヌクレオチド配列を第１２図に示す。（この図で、長
四角は転与物の５′端に近い位置を表す）・　この配列
は、４つの他の欠損部を重なっている端点と配列化させ
ることＫより確認した（データは図示せず）。
ｐＭＡ２２ａ欠損シリーズは、中に発現ベクターに基づ
いた多くの潜在的ＰＱＫを含む分子の集団から成ってい
る。それぞれ異った大きさの小さなＥｃｏＲＩ−Ｂａｍ
　ＨＩ断片を持っており、従ってそれぞれ異った量“の
ＰＧＫ　　５’領域を持っている。それらは全て、遺伝
子が挿入され、そして発現される唯一のＢａｍ　ＨＩ部
位を持っている。第１３図は、印のついた種々の欠損端
点の位置を有する−２２６から＋６２４までのＰＧＫ遺
伝子の配列を示す。欠損４点の番ｇ（第１３図）は、ア
ミノ酸３２と３３のコード／の間の欠損端点を有するｐ
ＭＡ２２ａ欠損である例えはプラスミドｐＭＡ２７９の
ような欠損を持ったプラスミドの名前を保持している。
この位置に配列ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧのＢａｍ　　Ｈｌ
す／カーを挿入した。各欠損端点には、−１位１１１４
Ｃ挿入されたＬｌｇｌＩＩりンカーＣＡＡＡＡＧＡＴＣ
ＴＴＴＴＧｔ有するｐ　ＭＡ　３０１という例外はある
が、同じＢａｍ　　Ｈｌす／カーがある。このＢｇｌ　
　ＩＩリッカーは、開始ＡＴＧの周りの領域のＡ量を増
やすために使用した。
明らかに％プラスミドｐＭＡ　２７ｇと９ＭＡ３０１は
。
それらの発現部位に挿入された例等かのコード配列との
転写融合物を作り、従って表１における９ＭＡ２００Ｐ
型となる。それに対し、他のものは全て転写融合物と翻
訳融合物の両者を作るのである（即ち、融合タンバク實
ができる）。９ＭＡ２３０は＋１（読み取り枠）融合ベ
クターであり、９ＭＡ２８３は内枠（＋３）融合ベクタ
ーである。分子は、表ＩＫおけるｐＭＡ２００ｆ１％ｆ
２及びｆ３型である。
実施例４ 酵母のＰＱＫ遺伝子からの５′と３′領域の両方から成
る９ＭＡ３０１３と呼ばれるＰＧＫ罠基づく発枳ベクタ
ーを作った。
ＰＧＫの３′領域のヌクレオチド配列は標準的方法で決
定した。これを第１４区に示す。第１５図は、ｐ　ＭＡ
　３０１３を作るための截ｌ！を示す。７ラスミドルＭ
Ａ３−ＰＧＫはＢｇｌ　　ＩＩと）’ｓｔ　　１を用い
て切断し、ＰＧＫ遺伝子（第１５図に波線で示す）の３
′端を含む断片はタバク（’ｌ’ａｂａｋ）とフライ＃
　（Ｆｌａｖｅｌｌ）の方法（ＮＡＲ５２３２１（１９
７８）　’）　Ｋより精製した。
この後この断片をＢｇｌ　　ＩＩとｐｇｔ　　１で切断
された９ＭＡ３０１と連結し、混合物は大腸菌株ＡＫＥ
Ｃ２８をア／ピシリ／耐性とロイシン、プロトトロフイ
に形質転換するために使用した。できたクローンは、３
つの山ｎｄ　　ＩＩＩ部位を持ったプラスミドを得るた
めスクリーニングした。このようなグラスミドは、　　
９ＭＡ３０１３である。ｐ　ＭＡ　３０１３は、ＰＱＫ
の５′と３′領域に隣接した唯一のＢｇｌ　　１１発境
部位を持っている。
実施例５ 上述の攬々の酵母の発現ベクターを、ヒトのα型インタ
ーフェロンを異種で、潜在的に有用なコード配列として
使用し″′Ｃ試験した。この配列は。
ワーウイツク（Ｗａｒｗｉｃｋ）大学のパーク（Ｄ、Ｃ
。
Ｂｕｒｋｅ）教授によって最初に作られたプラスミドＮ
　５１（８０酵導体であるＢａｍ　Ｈｌ断片に含まれて
いる。インターフェロンの信号配列にあるアミノ酸８１
５に対応する位置にあるＡ　Ｔ　Ｇ　ｆ）　恢Ｋ　Ｂａ
’ｍ　Ｈ１が配置されるように修勤した。このＨａｍ　
　Ｈ１断片のヌクレオチド配列を第１６図に示す。Ｂａ
ｍ　Ｈ１断片はそれ自身の翻訳開始コード／を持ってい
るので、転写融合の構成物において使用することができ
、また融合タンパク質を産生ずることになるベクターに
おいても使用することができる。この断片を株々の分子
の発現部位に挿入した。この分子の一般的構成を第１７
図に示す。次に、できた分子を酵母の―株ＭＤ４０−４
Ｃ（ＭＤ４０−４（シーｃｌ　ｕｒａ　２ｔｒｐｌ　　
１ｅｕ２−３　１ｅｕ２−１１２　　ｈｌｓ３−１１　
　ｈ＋５３−１５）へ碑準的な形質転換法で移入した（
　Ｈｉｎｎｅｎほか（１９７ｇ）Ｐ、Ｎ、Ａ、８．７５
１９１９　）。酵母中に産生されたインターフェロンの
一度は、セムリキ・フオレスト・ウィルス（ｓＦｖ）を
誘発剤として用いたウィルス）ｔＮＡ減少検定法におい
て、牛（ＥＢＴｒ）の細１ｉヲｆ　用Ｌ　テロ１１１足
しり（ＡｔｈｅｒｔｏｎとＢｕｒｋｅ　（１９７５）Ｊ
、Ｑｅｎ、Ｖｉｒｏｌ　　２９１９７　）　ｏ表２は、
樵々の組み換え分子を含む酵母細胞中に産生されたイン
ター表　　　　　２ ９ＭＡ１０３　　７ＲＰＩ　　　　　　　−６００ＰＭ
Ａ　３６　　　ＴＲＰＩ（伸長）　　　−１，７Ｘ１０
４ｐＭＡ２７８　　　ＰＧＫ（Δ２７８）　　　−２，
ＯＸ１０４ＰＭＡ３０１　　　ＰＧＫ（Δ３０１）　　
　−１，５Ｘ　１０’１）Ｍ４３０１３　　ＰＧＫ（Δ
３０１）　　ＰＧＫ　　　１、ＯＸ　１０？ｐＭＡ２３
０　　　ＰＧＫ（Δ２３０）　　　−１，５Ｘ　１０７
ｐ１０７ｐ対照）−−＜５０（検出できず）としである
。
使用される発現ベクターが依存する系に、かなりの範囲
の発現能力があることがわかる。ｊｌＡのレベルは、融
合タンパク質ベクターｐＭＡ２３０　、転写ベクターｐ
ＭＡ・３０１とｐＭＡ　３０１３について得られ、それ
らでは全細胞り／ノクク質の２３１６もがイノターフェ
ロ／タンパク質として存在している（第１８図）。この
図はクーマシ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　）で染めた８ＤＳ
−ＰＡＧＥによるタンパク質の展開図であり、図におい
てそれぞれ一次のようなものを含む。
（ａ）　９ＭＡ２３０を含むＭＤ４０−４ｃからの全タ
ンパク質。
（ｂ）　９ＭＡ２３０　／インターフェロンを含むＭＤ
４ｇ−４ｃからの全タンパク質。
（ｃ）　ＮＫ２カラムでの部分的精製後のｐＭＡ２３０
／インターフェロンを含むＭＤ４０−４Ｃからのタンパ
ク質。分子量のマーカの位置を図に示す。矢印は、ＰＧ
Ｋ−インターフェロ／融合タンパク質の位置を表す。
プラスミドを産生ずる全てのインターフェロンは、発現
プラスミドにより与えられる表視型との全個体群におけ
る細胞の割合によって測定した場合、少くとも４０代は
安定して保たれる。
実施例６ 酵母中のＰＱＫはグルコースによって１誘発”される。
従って、この調節系の１繊に必要な構造が例えば９ＭＡ
２３０にある１５００ヌクレオチドＰＧＫ断片上に存在
しているがどうかを確認することは興味深いことであっ
たし、もしそうであればヒトのα型インターフェロンは
グルコースによっテ調節され得る。
Ｂａｍ　ＨＩ部位に挿入されたα型インターフェロンの
配列を有する９ＭＡ２３０を含む酵母菌株ＭＤ４０−４
ｄは、Ｒ素源として酢酸塩に富む培地において。
２Ｘ１０１ｆｌ胞／ｍ＆の濃度になるまで１２代増殖さ
せた。これらの細胞は、新鮮な培地な言む２つのフラス
コに分けて接種材料として使用した。１つのフラスコに
は縦木源としてグルコースを含み、もう１つの方には酢
酸塩を含んでいた。従って。
酢酸塩／酢酸塩、酢酸塩／グルコース、グルコース／グ
ルコースという接種材料／培地の３状態があった。これ
らの培地のアリコートな穐々の間隔で取り出し、抽出物
を＃４製し、インターフェロ／濃度を検定した。これら
の検定の結果を第１９１ＮＫ示す。この図において、・
はグルコース／グルコース、Ｏは酢酸塩／酢酸塩、Δは
酢酸塩／グルコーｘｖ表−ｒ。＠１９図のデータは、グ
ルコース／グルコース培地には比較的高ａ１１ｃのイノ
ターフェロ／を含み、これに対して酢酸４／酢酸塩培地
には実験中を通して低濃度のインターフェロンしか含ん
でいないことを示している。酢酸Ｉｌ＆／グルコース培
地は、細胞をグルコース弔地圧移した後（時間０．第１
９図）、インターフェロ／濃度が増加することを表して
いる。このインターフェロンの誘発は、約８時間以上に
わたって起きた。そして、グルコースで増殖した細胞に
より産生されたインター７エロ／の濃度は、酢酸塩で増
殖した細胞より２０〜３０倍高い。
これらの結果は、インターフェロン濃度の炭素源による
調節は、ＰＱＫ遺伝子の５′調節領域によって仲立ちさ
れるということを強く示唆しているのであるが、酢酸塩
又はグルコースで増殖した細　、胞Ｋｋけるプラスミド
の安定性には差異がないということを証明することが重
要である。従って、第１９図に表わされている実験の闇
、種々の点で城った酵母細胞のアリコートから、全ＤＮ
Ａを調製した。ＤＮ’ＡはＥｃｏＲＩを用いて分解し、
断片は１９６アガロース・ゲルで分離した。その後分離
したバントヲニトロセルロースにプロット（ｂｌｏｔ）
し、そして３２Ｐ−ＹＲＰ７と交俸させた。このグロー
ブのｐＢＩ’Ｌ３２２部分は、酵母のＤＮＡ調製−にお
けるプラスミドの濃度を測定するのに役立ち、これに対
して１．４５ｋｂ断片の配列は、ＤＮＡ量の調節、輸送
効率、交雑効率を証明するために使用した。このすｆ　
ｙ　（５ｏｕｔｈｅｒｎ　）プロット分析に加えて、ア
リコートにおけるＬｅｕ＋細胞の割合は、ロイノンを含
む培地とロイシンな含まない培地でのコロニー数を比較
することＫより測定した。全ての場合で。
サザン交雑のグラフは同一であり、９９９６以上の細胞
がＬｅｕ＋であって（データは図示せず）、酢酸塩又は
グルコースでの増殖は、グラスミドのコピー数又は安定
性に何等の影曽を与えないことを示している。
【図面の簡単な説明】
第１図は１本発明の発現ベクターの構造において前駆体
として使用される２つの酵母の複製ベクターの部分的制
限エンドヌクレアーゼの図である。 それらは９ＭＡ３及び９ＭＡ９１と表示されている。 第２図は、ＴＲＰＩ遺伝子のＥｃｏＲ１断片ノ３断片ノ
ウ１示す部分的制限エンドヌクレアーゼの地図である。 第３図は、＃母の発現ベクターｐＭＡｔ０３の構造を示
す模式図である。 第４図は、酵母の発現ベクターｐＭＡ１０３の部分的制
限エンドヌクレアーゼの地図である。 第５図は、＃母の発現ベクター１）ＭＡ１１３の部分的
制限エンドヌクレアーゼの地図である。 第６図は、ＴＲ１５’調節領域の配タリを示すヌクレオ
チド１夕１ｊの図である。 第７図は、酵母の発現プラスミドｐＭＡ３６の構造を示
す模式図である。 第８図ａは、＃母のＰＧＫ遺伝子の位置を示すプラスミ
ドｐＭＡ３−　Ｐ　ＱＫの部分的制限エンドヌクレアー
ゼの地図である。 第８図すは、　９ＭＡ３−ＰＱＫの２．９５　ｋ　ｂ　
Ｈｉ　ｎｄ１１１断片の地図である。 第９図ａは、酵母のＰＧＫの２７０〜４００残基の配列
を示すアミノ酸配列の図である。 第９Ｆｆ４ｂは、　　１．ｇ５ｋｂ　　Ｈ７ｎｄ　　Ｉ
ＩＩ断片断片０８労１第９図ａと第９図すにより，ＰＱ
Ｋアミノ酸配列配列限部位との比較ができる。 第１０図ハ、ＰＱＫｊ−ド配列の５′端に及ぶＨａｅＩ
ＩＩ断片の８Ｉ　　ＲＮＡ保繰の結果を示す図である。 第１１図は，　ｐＭＡ２’１ｍの欠損列の一般的構造を
示す部分的制限エンドヌクレアーゼの地図である。 第１２図は，ＰＧＫ遺伝子の５′領域の配列を不すヌク
レオチド配列の図である。 第１３図は，印をつけた多くの欠損端を持ったー２２６
から＋６２４までのＰＱＫ遺伝子の配列を示すヌクレオ
チド配列の図である。 第１４図は，Ｅｃｏ８４部位から停止コードンを越えて
ヌクレオチド１４０までのＰＱＫの３′端における配列
を示すヌクレオチド配列の図である。 第１５図は，ｆ＃母の発現グラスミドｐ　ＭＡ　３　０
１３の構造な示す模式図である。□。 第１６図は，修飾されたＢａｍＨｌヒトのα型イ／ター
フエロン遺伝子断片の配列を示すヌクレオチド配列の図
である。 １１１７図）！、一般的なインターフェロン酵母の発現
プラスミドを示す部分的！ｆｆ１Ｊｄ工／ドヌクレアー
ゼの地図である。 第１８図は，　ｐＭＡ２３０でつくられたイ／ター７エ
ロン融合タ／バク質の産生な示す（矢印で表示）クー−
ｖ　シ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　）染め（ｒ）ＳＤ８−Ｐ
ｋＧＦ，ゲルの図である。 第１９図は，インターフェロ／の発現のグルコース調節
を示す図である。 ＴＲＰｌ　　Ｍ　８　　　（１・４５にｂ）Ｔ４　リ〃
−ぜ ＥＣ０ＬＩ　ｆｆＰ、’ｔｋ墳 ＡＭＰＲＴＥＴ”　ｔｒ＋　Ｊｚ　’Ｉ　ｆｆｉ　ＬＰ
ＭＡ　１０３　　　　　ＦＩ　Ｇ、　３（ｂ）ｙｉ見Ｉ
Ｐ４１［Ｂ〔■エエ）二１憬」二ΣＲ１ （、ＩＨＩ（ｐＥＩＨＪ’ｌ）　　　　　トＩＧ、５Ｃ
ＡＴＡＣτ＾τＡＴ　　ＡＴＡＴＡＡＴＡＴＡ　　ＧＡ
ＡＧＣＡＴＴＴＡ　　ＡＴＡＧＡＡＣＡＧＣＡＴＣＧＴ
ＡＡＴＡＴ　　ＡＴＧＴＧＴＡＧＴｒ０ ＴＣＣＡＧＴＴＡＴＧ　ＡＣＧＣＣＡＧＡＴＧ　ＧＣＭ
：ＴＡＧＴＧＧ　ＡＡＧＡＴＡＴＴＣＴ　ＴｒＴＡＴＴ
ＧＡＡＡ　ＡＡＴＡ［、ＣＴＧＴＣ２０ ト１ｂ、ｂ ＦＩＧ、　８ ０シ！−一一一力 ＦＩＧ　　９ ０１ イア０　　　　３８０ ＩＩＧＧＧＤＴＡＴＶＡＫＫＹＧＶＴＤＫＩＩＨ３ ９８３− ＦＩＧ、　＋２ ２２６ ＡＧＣＣＴＧＣＴＣＴ　ＣＡＣＡＣＡＴＣＴｒ　ＴＣＴ
ＴＣＴＭＣＣＡＡＧＣＧＧＴＧＴｒ　ＴＡＧＴｒＴＡＧ
ＴＡ１７６ ＧＡＡＣＣＴＣＧＴＧ　ＡＡＡＣ肩＾Ｃ＾Ｔ貫ＡＣ八Ｔ
八へＡへ＾Ｔ患Ｃ買（社）＾Ｔ緑訂匹虹１２６ 撃匹Ｃ店Ａ品込正ＥＴ　ＴＧＴＣ面ＣＴ品買ＣＧＴＡＧ
τ苗Ｔ饅Ｇ貫！−ＨＩ ＷｍＷａｍＱＩＣＷｕａｔｃａｘｙｗｖｃｒｔｅａα＋
Ｃｔｗ　ｃａｒ　ｃｔｃ　ｃｅ　ｃａａ２！６ ｅｅｌ　ｏｃｖ　ｖａｒ　ｃａｔ　ｃａｃ　ａｒｔ　ｃ
ｔｃ　ｃｖａ　ｃｈｃ　ａａａ　ｒｒｃ　ｔａｃ　ｕゴ
ＱＩＣ’ｌｃ　ｔａｃ　ＩＪｃ２Ｉ 龜Ａπｍ　ｅｃ　ｔ＾！ａηＭ１嚇Ｇ騙ＡＡＩ？＾Ｃ城
Ｃ密就冨υ品ｓ：。 ６！６ ＋ｖ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
ＦＩＧ、＋６１；０ ツ ９二Ｏ □□−Ｉ關 ＦＩＧ、　１７ ＦＩＧ、　１９゜ 拵１頁の続き 優先権主張　０１９８２年３月２３日■イギリス（ＧＢ
）■８２０８４２２ ＠１９８２年６月１６日０イギリス （ＧＢ）［有］８２１７４９６ 発　明　者　スーザン・メアリ・キングズマン 英国オックスフォードシャ・イ ズリツブ・ミドルストリート・ ダレイストーンズ（番地なし） じ出　願　人　スーザン・メアリ・キングズマン 英国オックスフォードシャ・イ ズリツブ・ミドルストリート・ ダレイストーンズ（番地なし） ［絖ネ市＋ｌ−’ｒ吋 昭和５７４’ｊ’１１月−ＬＨ 特許庁長官　　若　杉　相　人　　殿 １、事件の表示 昭和５７年特許噛第１４７４９９号 ３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 ４、代理人 住　所　東京都新宿区西新宿ｌＮ−１８４１″ｆ＋置　
０３３４３５）１２１■　　（新イｄヒル）５、補止命
令の日付　　　　昭和　　４１　　　月　　日ら、績正
により増加°４°る発明の数

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、＃母の選択マーカ、酵母の複製源それに発現が制限
    部位に挿入されたポリペプチドのコード配列から得られ
    るように唯一の制限部位に関係して位置している酵母の
    プロモータから成る酵母の発現ベクター。 ２　酵母のプロモータが酵母の解糖系酵素のコードとな
    る遺伝子のゴ領域の少くとも一部分から成る特許請求の
    範囲第１項記載の酵母の発現ベクター。 ３、−酵母のプロモータが酵母のＰＧＫ遺伝子の５′領
    域の少くとも一部分から成る特許請求の範囲第２ａ記載
    の酵母の発現ベクター。 ４、ＰｑＫ遺伝子のｄ領域の少くとも一部分が唯一の制
    限部位の上ＩＩＬ＠に位置しＣおり、そしてＰＱＫ遺伝
    子の３′領域の少くとも一部分が唯一の制限部位の下流
    側に位置している特許請求の範囲第３項記載の酵母の発
    現ベクター。 ５、形質転換された酵母の栄養培地にある発酵性炭素源
    の濃度を変えることにより発現の調節がなされる特許請
    求の範囲第１項から第４項のいずれか１項に記載の酵母
    の発現ベクター。 ６、発酵性炭素源がグルコースである特許請求の範囲＃
    １５項記載の酵母の発現ベクター。 ７、酵母のプロモータがＴＩ’ＬＰ　１遺伝子の５′領
    域の少くとも一部分から成る特許請求の範囲第１項記載
    の酵母の発現ベクター。 ８、＃母の発現ベクターには酵母のプラスミド２μ複製
    源の少くとも一部分とＩＪＵ　２酵母の選択マーカの少
    くとも一部分を含む特許請求の範囲第１項から第７項の
    いずれか１項に記載の酵母の発現ベクター。 ９、　酵母の発現ベクターには自己ｌＩ製製列列少くと
    も一部分と自己複製配列安定化配列の少くとも一部分を
    含む特Ｉｆｆ請求の範囲第１項から第７項のいずれか１
    項に記載の酵母の発現ベクター。 １０、　　酵母の発現ベクターにはポリペプチドのコー
    ドとなる遺伝子の少くとも一部分を含む４’ｌ情求の範
    囲第１項から第９項のいずれが１項に記載の酵母の発現
    ベクター。 １１、＃母の発現ベクターにはヒトのα型インターフェ
    ロンのコードとなる遺伝子の少くとも一部分を含む特許
    請求の範囲第１項から第１Ｏ項のいずれか１項に記載の
    酵母の発現ベクター。 １２、　　上記ポリペプチドのコードとなる遺伝子を含
    む特許請求の範囲第１項から第１１項の（・ずれか１３
    Ｊｋ記載の酵母の発現ベクターによって形質転換された
    酵母の宿主有機体にあるポリペプチドを発現させること
    から成るポリペプチドの主意方法。 １３、　　特許請求の範囲第１項から４１２項のいずれ
    か１ｆｊＫｆｆｉ鎮の酵母の発現ベクターによって形質
    転換された酵母。 １４、　　％許錆求の範囲第１項から第１１項のいずれ
    か１項に記載の酵母の発現ベクターによって形質転換さ
    れたサツカロミセス・セレビシェ（８ａｃｃｈａｒｏｍ
    ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）。 １５、　　％許祠求の範囲第１項から第９項の（・ずれ
    が１項に記載の２つ以上の酵母の発現ベクターから成る
    ｌキットの酵母の発現ベクター。 １６、　　それぞれのベクターがＴＲＰＩ　：　ＡＲ８
    １：Ａ８Ｓ又はＩＪＵ２；・２μ複製源選択マーカと複
    製系及びＴＲＰｌ又はＰＧＫ　　５領域の酵母プロモー
    タのどちらかの少（とも一部分のいずれかを持つ４つ以
    上の酵母の発現ベクターから成る１キツトの酵母の発現
    ベクター。
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