JPS5879996A - プラスミドｐＡＣ１およびその取得方法 - Google Patents

プラスミドｐＡＣ１およびその取得方法

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JPS5879996A
JPS5879996A JP57183039A JP18303982A JPS5879996A JP S5879996 A JPS5879996 A JP S5879996A JP 57183039 A JP57183039 A JP 57183039A JP 18303982 A JP18303982 A JP 18303982A JP S5879996 A JPS5879996 A JP S5879996A
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plasmid
cilasmid
acremonium
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JP57183039A
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カ−ル・エツサ−
ヴアルタ−・ミヌ−ト
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Hoechst AG
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Hoechst AG
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P37/00—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はシラスミドＩ）ＡＯ１、アクレモニウム・クリ
ソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇ’ａ
ｎｕｍ　）ＡｒＯａ１４５５３からそれを得るだめの方
法、訃よびβ−ラクタム抗生物質の生合成を促進Ｊ−る
ハイブリッドベクター金製造するだめのその１更用に関
する。
抗生物質を生盛するかびの菌株に遺伝子工学的な方法を
適用することは最近ますます重要になってきた。このこ
とは抗生物質の午成においてよＦ）　４）い生産性を示
すような遺伝子的に変更されたかびの菌株を得ることを
目的としている。
しかしながら相互に関連性を有しない微生物に対してし
ばしば認めらｉするように、遺伝子的に改善されるべき
ホスト細胞から直ちに１往び除去されないようなプラス
ミドが得られる場合にのみ、この目的は遺伝子工学的方
法を用いて首尾よく燵成することができる。
種々のアクレモニウムのある利！の１株は七フ゛アロス
ポリンを製造するために１史用さノ］、るということが
開示されている。しかしながらアクレモニウムの種類に
おいてまたは他の密接に関連したかびの菌株においてま
だシラスミドを発見することができなかったので、現在
１でセファロスホ＋）ンの生成を増大せしめるような菌
株を得るために遺伝子工学的方法を使用することができ
なかった。
今や意外にもアクレモニウム・クリソゲナムＡＴＯＯ１
４５５３の菌株にプラスミドが存在し、そのプラスミド
は外形の長さが約６．７μｍであり、そして分子サイズ
が約２［１９キロベース（ｋｂ　）であることが見い出
された。このプラスミドにはＰＡＯ１という名称が与え
られた。
プラスミドｐＡｏ　１１ｄアガロースゲル上での制限酵
素エンドヌクレアーゼを用いる解裂により特徴づけるこ
とができる。この方法により特定のフラグメントの数お
よびサイズを決定することができる。たとえば制限エン
ドヌクレアーゼＢｇ１１１Ｖｉこのプラスミドを５．１
０．４．７５．４．３０゜５．５０．２．１５およびｔ
　０５　ｋｂのサイズを有する６個の７ラグメントに解
裂する。
これとは対照的に制限エンドヌクレアーゼ１ａｏＲＩハ
ブラスミドｐＡｏ　ｉをａｌ、４．７．４．４．２．６
およびｔ　３　ｋｋ＋のサイズを有する５個のフラグメ
ントに分割する。
　５− 他方制限エンドヌクレアーゼＨｐａ　ｌはプラスミ　　
ド　を　５．６１　、　４．６０、　５．５０、　２，
７２、　１３５、　１．２５、Ｑ、８２．０．７４およ
びＱ、６１ｋｂのサイズを有する９個のフラグメントに
解裂する。
対照的に制限エンドヌクレアーゼＨ１ｎａ　ｍ、Ｓａｄ
　ｌおよびＫｐｎ　ｌの作用による解裂はまだ認められ
ていない。
アクレモニウム・クリソゲナムＡＴＯＯ１４５５３の培
養液からのプラスミドＩＩＩＡＯ１の単離は複雑である
。なぜならば主として核ＤＮＡ（ｎＤＮＡ）およびミト
コンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ　）　（後者は同様の密
度および外形の長さを有する）もまた細胞中に存在し、
それからプラスミドシム０１を注意深く分離しなければ
ならないからである。しかしながらアクレモニウム・ク
リソゲナムＡＴＯＯ１４５５３の原形質溶解質または機
械的に解裂せしめられた菌糸体から得られた＠ＤＮＡを
セシウムクロリ　６− ド遠心法により予精製し、プラスミドＤＮＡおよびミト
コンドリアＤＮＡを含む環状ＤＮＡをたとえばヒドロキ
シアパタイトのクロマトグラフィーによりそれから分離
し、そして最後にプラスミドＤＮＡを数回、好捷しくは
３回の順次的なセシウムクロリド遠心法により単離し且
つＮ製した場合には、シラスミドｐＡｏ　１の精製に関
する問題は解決できることが明らかになった。液体窒素
中で凍結乾燥したのちに機械的に解裂せしめられた原形
質または菌糸体は出発物質として役立つ。
以下の本文においては本発明の好゛Ｉ［７い態様がさら
に詳細に説明される。
総ＤＮＡの遊離は表面活性剤たとえばナトリウムドデシ
ルスルフェート（８，ＤＢ）および蛋白質分解酵素たと
えばプロテイナーゼにとともにインキュベーションする
ことにより達成され、それハエタノールを用いる沈殿生
成およびセシウムクロリド勾配遠心法により他の細胞成
分から分離される。特定の塩濃度を使用するヒドロキシ
アパタイトのクロマトグラフィーにより総ＤＮＡは最初
にｔｐ！ｊ異的に結合せしめられ（従って残留不純物物
にＲ）ＩＡおよび炭水化物が除去される）、つぎに低分
子量の環状ＤＮＡ　（ｍｔ−およびｐｌ−ＤＮＡ　）が
特異的に高山されるが、他方核ＤＮＡはカラムに結合さ
れた塘−まである。構造および外形の長さに関して極め
て類似しているミトコンドリアＤＮＡのプラスミドＤＮ
Ａからの分１１Ｈ：ｊ、少数回のセシウムクロリド勾配
（グラジェント）中のプレ・ぞラティブ超遠心段階によ
り密度のわずかな違いを利用して行なわれる。製品の純
度は制限分析および電子顕微鏡影像により調べられる。
プラスミドｐＡｏ　１はアクレモニウム種に導入するこ
とができるハイブリッドベクターを形成するのに特に適
している。このことは現在までに知られているプラスミ
ドはすべて比較的少数のホスト細胞においてのみ確立で
きることが明らかになっているからである。ハイブリッ
ドベクターが密接に関連しているホスト細胞に導入され
る場合には常にうまくクローン化する絶好の機会が存在
する。従ってこの情況においてはセファロスポリン生成
醒株間の関係が極めて良好な基礎を提供する。
ハイブリッドベクターを製造するためには、すでにエシ
ェリヒア・コリ（Ｅｓｃｌ＋８ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
）プラスミドに対して使用されており、そしてまたスト
レプトきセーテス（８ｔｒｅｐｔｏｍｙａ＠ｔｅａ　）
にも適用されている（Ｍ、Ｂｉｂｂ、　Ｊ、０．８ｃｈ
ｏｔｔｅｌおよびｓ、Ｎ、０ｏｈｅｎ氏ら著［Ｎａｔｕ
ｒｅ　Ｊ第２８４巻第５２６〜５３１頁（１９８０年）
およびＯ，Ｊ、ＴｈＯｍｐ１５Ｏｎ　。
Ｊ、Ｍ、Ｗａｒｄおよびり、Ａ、Ｈｏｐｗｏｏｄ氏ら著
［ＮＩＬｔｕｒ６　Ｊ　９− 第２８６巻第５２５〜５２７頁（１９８０年）〕のと同
様の遺伝子工学的方法が適用される。
これらの既知の方法により、上記の制限エンドヌクレア
ーゼを用いて得られたプラスミドｐＡｏ　１のいくつか
の解裂位置に、抗生物質抵抗性を有する遺伝子を挿入す
ることができるばかりでなく、また抗生物質の生成を増
大せしめる遺伝子を挿入することもできる。このように
して得られたハイブリッドプラスミドは現在までに行わ
れたすべての観察により、まさに初期のプラスミドと同
様にアクレモニウム細胞中で生存可能であり且つ再生可
能である。
本発明をさらによく理解せしめるために以下に実施例を
あけて説明する。
実施例 プラスミドＤＮＡを単離するための出発菌株は菌株ア′
クレモニウムクリソゲナムＡＴＯＯ１４５５３１０− である。この菌株の菌糸体をつぎの組成を有する完全液
体培地中で約４８時間振盪することにより培養する。
蔗　　糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６．
Ｏｐデキストリ／（白）　　　　　　　　　　　　ｉｓ
、ｏｐＮａＯＩＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　α５ｐｘ２ａｐｏ４　　　　　　　　　　　　　　
　　　　［１５９ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，５ｐ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０１０１ｊｌ 肉抽出物（ディノコ社製）　　　　　　　　　　ｔｏ　
　ｊＩ酵母抽出物（ディフコ社製）２．０　　ノ寒天（
サーバ社製）　　　　　　　　２０　　Ｆ蒸　　留　　
水　　　　　　　　　　　　全量１０００−となすこの
培地は１２１℃で２０分間前もって滅菌しておく。この
場合にｐＨの設寓は７．０〜Ｚ２である。
Ｕ　、　５ｔａｈ１氏ら（［Ｍｏ１ｅｏ、（）ｅｎ、Ｇ
ｏｎｅｔ、　Ｊ第１７８巻第６３９頁およびそれ以降（
１９８０年）〕により記載された方法で、４８時間後に
菌糸体をガーゼに通して収穫し、セし−Ｃ液体窒素下で
破壊する。
つぎの操作のために約６０Ｐの菌糸体を使用する。
しかしながら酵累を使用して細胞の破壊を行うこともて
きる。このためには培養液から分離した菌糸体を蒸貿水
で２回洗浄し、２−メルカプトエタノールは５重量％を
含有する等張性で中性の浴液に懸濁し、そして３０℃で
３０分間靜直置法インキュベートする。その稜繭糸体を
等張性且つ中性の溶成で洗浄する。つぎに等張性且つ中
性の溶液中で穏和に振盪しながら３０℃の温度で約６時
間この繭糸体にサイトファージ醇素Ｌ１１２〜／−およ
びジモラーゼ２■／ｐａｌを作用せしめる。つぎに濾過
（グラスウールフィルター）により原形質を菌糸体の残
留部分から分離し、そして等張性浴液中で５分間遠心分
離することにより２回洗浄する。
つぎにヌクレアーセ阻害剤とし−Ｃのエチレンジアミン
テトラアセテートを最終濃度６０　ｍＭ−まで上記の原
形質懸濁物に加える。その仮線ＤＮＡを遊離せしめるた
めに最初にナトリウムドデシルスルフェートを最終一度
１ｔｓまで、そしてプロテイナーゼＫ（メルク社製）を
最終濃度０．０２重量％まで加え、つぎにその混合物を
６７℃で３０分間放置し、最後に７０℃で１５分間イン
キュベートする。粗製の溶解質を遠心分Ｍ（４℃で且つ
ＩＱＯＯＯＸ）で１０分間）することにより澄明にし、
つぎに５０ｍＭ）リスヒドロキシメチルアミンメタンお
よび２０ｍＭエチレンジアミンテトラアセテートからな
る緩衝液に対して１５時間透析する。２倍容量のエタノ
ールを添加することにより１ｍ　ＤＮＡを沈殿させ、−
２０℃で１５時間放置したのち遠心分離しく一２０℃で
且つろ７３００１３− Ｘノで８分間）、そして１．７００の密度に調節された
セシウムクロリド浴液中の等密度勾配遠心法〔ツルパル
ロータＴＶ　８６５　（５ｏｒｖａｌｌ　ｒｏｔｏｒ　
’ｒｖ８６５）中１５℃で且つ４５，０００　ｒｐｍで
２１時時間上り予ｒＩ製する。ＤＮＡ帝はイスコ（工（
１００）分別器を使用して得られる。
プラスミドＤＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡからなる
環状ＤＮＡを総ＤＮＡから分離する／こめに、その混合
物を５０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン、２
（］ｍＭエチレンジアミンデトラアセテートおよび２４
０ｍＭ燐酸二水素ナトリウムからなるｐＨ６，７の緩衝
液に対して透析する。コルマン氏ら（Ｏｏ１ｍａｎ氏ら
著「Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｌｏａｈｅｍ、　Ｊ　　第９１巻第
６０６頁およびそれ以降（１９７８年）〕により記載さ
れた方法でその透析物をヒドロキシアノぞタイトのクロ
マトグラフィーに付す。この方法で最初にヒドロキシア
パタイト２９を含む１４− 刀ラムに；ａ　ＤＮＡを結合せしめ、つぎに緩衝液で環
状ＤＮＡ　（ｆ−洗浄除去するが、他方核ＤＮＡはアパ
タイトに結合されたま１である。
ミトコンドリアＤＮＡの除去およびこのようなプラスミ
ドＤＭＡの精製ｔ」、Ｌ　７００の密度に調節されたセ
シウムクロリド溶液中でその濃度勾配を利用した等密度
遠心法（ツルパルロータＴＶ８６５申１５℃且つ３２’
、ＯＯＯｒｐｍで４４時間）を順次的に３回行うことに
より行われる。
特訂出１＋Ｕ人　　へキストーアクチェンケゼルシャフ
ト１５− ９０５−

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １）アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉ
    ｕｍｃｈｒｙａｏｇｅｎｕｍ　）　ＡＴＯＯ１４５５３
    から得ることができ、外形の長さが約６．７μｍであり
    、そして分子サイズが約２０９キロベース（ｈｂ　）で
    あるプラスミドｐＡＯ１゜ ２）制限エンドヌクレアーゼＢ、Ｉ　Ｔｉによりサイズ
    ５．１０．４．７５．４．３０、ろ、５０．２．１５お
    よびｔＯＳｋｌ）を有する６個のフラグメントに分割さ
    れている特許請求の範囲第１項記載のプラスミド。 ３）制限エンドヌクレアーゼＢａａ　ＲＩによりサイズ
    ａ１．４．７．４．４．２．６、およびｔ　３　ｋｂを
    有する５個の７ラグメントに分割されている特許請求の
    範囲第１項記載のプラスミド。 ４）制限エンドヌクレアーゼＨｐａ　ｌによりサイズ５
    ．６１．４．３０．５．５０．２．７２．１．３５．１
    ．２５．１１８２、［１１，７４および［］、６１ｋｋ
    ｌをイコする９個ノフラグメントに分割されている特許
    請求の範囲第１項記載のプラスミド。 ５）アクレモニウム・クリソゲナムＡＴＯＯＩ　４５５
    ３の原形質溶解質または機械的に〃ｒ裂せしめられた耐
    糸体から得られた総ＤＭＡをセシウムクロリド遠心法に
    より予′ｔＰ！Ｓし、プラスミドＤＮＡおよＯ−ミトコ
    ンドリアＤＮＡからなる塊状ＤＮＡをり「ｔマドグラフ
    ィーによりそれから分離し、そして最後に数回の順次的
    なセシウムクロリド遠心法によりシラスミドＤＮＡを単
    離し且つ精製することからなる、シラスミドｐＡｏ　１
    を取得する方法。 ６）環状ＤＮＡがヒドロキシアパタイトのクロマトグラ
    フィーにより核Ｉ）Ｎムから分離除去される、％許請求
    の範囲第５項記載の方法。 ７）特許請求の範囲第１項記載のシラスミドを制限エン
    ドヌクし・アーセにより解裂し、そしてβ−ラクタム抗
    生物質の生合成を促進する遺伝子をその肩裂置位に挿入
    することからなる、ハイブリッドベクターの製造法。
JP57183039A 1981-10-21 1982-10-20 プラスミドｐＡＣ１およびその取得方法 Pending JPS5879996A (ja)

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DE31416918 1981-10-21

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Publication Number Publication Date
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ID=6144526

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JP (1) JPS5879996A (ja)
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DE (1) DE3141691A1 (ja)
DK (1) DK466282A (ja)
ES (1) ES516639A0 (ja)
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AU8960982A (en) 1983-04-28
EP0077557A2 (de) 1983-04-27
ZA827664B (en) 1983-08-31
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