JPS5881791A - Ｓ−ノルニコチンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は培養法によるＳ−ノルニコチンの製造法に関す
る。

Ｓ−ノルニコチンは、Ｓ−ニコチンナトトドもに葉たば
こ中に含有されるアルカロイドの１種で、その含有量は
葉たばこの種類によって異なるが、通常栽培種葉たばこ
中には０．１〜２．５重量％、野生種葉たばこ中には３
〜４重量重量％台有されている。

周知のようにＳ−ニコチンは、たばこの喫煙による満足
感を賦与する上で極めて重要な因子とされているが、最
近の研究によれば、Ｓ−ノルニコチンもＳ−ニコチンと
同様たばこの喫味満足感の賦与に有効であり、かつ、Ｓ
−ノルニコチンを少量種々のたばこ原料に添加すること
によシ、たばこ煙の悪癖を抑え喫味をまろやかにするな
どの品質改良効果を有することが判明している。しかも
、Ｓ−ノルニコチンの生理作用はＳ−ニコチンに比して
弱いので、近年開発が進められている人工たばこあるい
は脱ニコチン処理を施した再生たばこ等に対する喫煙満
足感の賦与および香喫味改良の観点から８−ノルニコチ
ンの利用は極めて有効であると考えられる。さらに、Ｓ
−ノルニコチンと種々の糖類との加熱縮合物は、すぐれ
たたばこの香喫味改良剤となることが知られておシ（特
公和４−６６３９号）、Ｓ−ノルニコチンの用途は今後
拡大することが期待される。

従−来、ノルニコチンの製造方法としては、次の２方法
が考えられる。すなわち、第１の方法は葉たばこを栽培
し収穫した葉たばこから８−ノルニコチンを抽出精製す
る方法であり、第２の方法はミオスミンを化学的に合成
し、これを還元することによりノルニコチンを得る方法
である。

第１の方法によれば、Ｓ−ノルニコチンを直接抽出しう
る利点があるが、葉たばこ中のＳ−ノルニコチン含量は
極めて少量であるためＳ−ノルニコチン含量の比較的高
い葉たばこの野生種にコチアナ・グルチノーサ゛等）を
栽培するとしても、野生種の収量は栽培種にくらべ畑の
面積当シー程度の収量であり、また野生種のア０ ルカロイドはＳ−ノルニコチンやＳ−ニコチンなどの混
合物であるため、抽出、分離、精製の工程が複雑となる
。第２の方法ではラセミノルニコチンが製造され、これ
を光学分３割することは知られていないのでＳ型のノル
ニコチンのみを得ることは現状では不可能である。

本発明者等は、上記の方法によることなく、培養法によ
って８−ノルニコチンを製造する方法について鋭意研究
を重ねた結果、Ｓ−ニコチンを分解してＳ−ノルニコチ
ンを生成する菌株を見出し、本発明をなすにいたった。

すなわち、本、発明Ｈｓ−ニコチンを加えた培地にペリ
キ。

ラリア　フィラメントーザに属するニコチン分解菌を接
種培養して得られる培養物から８−ノルニコチンを抽出
採取する方法である。

Ｓ−ニコチンを分解してＳ−ノルニコチンを生成する菌
としては、現在までに不完全菌であるカニングハメラ　
エキニ＆ラーｇＱｍｎｉｎｇｈａｒｎｅ１１ａｅｅｈｉ
ｎｕｌａｔａ）が報告されている（Ａｐｐｌｉｅｄ　ａ
ｎｄ＆ｖｉｒｏｍｍｔａｌ　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
、　３８．８３６（１９７９））０しかし、この菌によ
るＳ−ノルニコチン生成量拡極めて低く、分析機器を用
いて検出できる程度にすぎない〇 しかるに、本発明者等が見出したＳ−ニコチン分解菌は
、効率よくＳ−ニコチンから８−ノルニコチンを生成し
、極めて実用性に富むものである。

本菌株は、１９７８年に日本専売公社岡山試験場圃場で
分離されたベリキュラリア　フィラメントーザ（Ｐｅ１
ｌｉｃｕｌａｒｉａ　ｆｉｌｇｎｅｎｔｏｓａ）　Ｊ　
Ｔ　８−２０８（以下、本園株ともいう）で、工業技術
院微生物工業技術′研究所に受託番号第５９５５号とし
て寄託されている公知の菌で、従来タバコ腰折病菌とし
て知られているもっである。その菌学的性質は中村壽夫
著、煙草植物病学Ｐ、７８〜８１、（１９５５年）側音
書店発行に述べられている通りである。

次に本発明の詳細な説明する。

まず、オートクレーブ等を用いて第１表の組成のＭＹ培
地を常法によシ加熱加圧滅菌する。

第　　１　　表　　　　　ＭＹ培地 マルト・エキス　　　３ｆ イースト・エキス　　３ｔ ペプトン　　　　　　５ｔ グルコース　　　　１０Ｆ 精製水　　１１ ＨＬｓ 第１表の培地組成はカビ、酵母保存用ＭＹ培地として公
知である◎ 次に、外径１８−試験管内のジャガイモ・グルコース寒
天培地（以下ＰＤＡ培地という。）に、あらかじめ２０
〜３０℃、５〜１０日間、望ましくは１週間培養した本
菌株の試験管１本分の菌体を、３２容の三角フラスコ中
に第１表の培地１ｊを加え滅菌したものに無菌的に接種
し、温度２０〜３０℃で好気的に振盪培養する０３〜５
日間、望ましくは４日間培養を行い、菌体がほぼ最大量
になつた時に、あらかじめ濾過滅菌したＳ−ニコチン水
溶液（塩酸でｐＨＦｈ、ｓに調整）を約０．１重量％以
下の濃度になるように添加し、培養を継続する。Ｓ−ニ
コチン濃度が培地の０，１重量嘩以上になると、萌の生
育が阻害されるので望ましくない。培養期間はＳ−ニコ
チン添加後７〜２０日間の範囲がよい。７日未満ではＳ
−ノルニコチンの生成量が不充分であり、また２０日以
上培養を継続してもＳ−ノルニコチン生成量の増加はわ
ずかである。この培養操作によつて、基質としての８−
ニコチンの約１０９１をｓ−ノルニコチンに変換させる
ことができる。

又、本菌株によるＳ−ニコチンからＳ−ノルニコチンの
変換は常法によシジャーフアーメンター中で、通気攪拌
によっても行うことができる。

次いでこの培養液中に生成したＳ−ノルニコチンを抽出
する。すなわち、培養終了後の液に炭酸カリ・ラム、苛
性ノーになどのアルカリを加えてｐＨを約１０以上に調
整した後、有機溶媒を加えて抽出する。この有機溶媒層
にｐＨ３以下の塩酸水浴液を加えてさらに抽出しＳ−ノ
ルニコチン２塩酸水溶液を得る。抽出用有機溶媒として
はエーテルまたはクロロホルムなどを便用することがで
きる。また抽出に先立って培養終了後の液を減圧濃縮し
たのち溶媒抽出を行うことにより、使用する有機溶媒等
を節約できる。この塩酸水溶液をエバポレーター等を用
いて減圧濃縮する。しかしこの方法ではＳ−ノルニコチ
ンと共に８−ニコチン本抽出される０従ってＳ−ノルニ
コチンと残存Ｓ−ニコチンとの分離は薄層クロマトグラ
フィー、高速液体クロマトグラフィー又は蒸留などの常
法によって行う０本発明によるＳ−ノルニコチンの製造
法は培養法であるため、操作を常温常圧下で実施するこ
とができ、葉たばこより抽出する方法に比し高収率で簡
易に製造することができる利点がある。

次に本発明を実施例によって説明する。

実施例Ｌ オートクレーブを用いて１２１℃で加圧加熱滅菌した第
１表の組成のＭＹ培地５Ｊを入れた三角フラスコに、前
もって試験管５本の滅菌済みＰＤＡＭ面培地に２８℃で
７日間培養しておいた本菌株を滅菌水を１０−ずつ添加
して試験管からかきとって加え混合し、これを滅菌済み
３ノ容三角フラスコ５個にＩＪ−ずつ無菌的に分注し、
２８℃で４日間振盪培養した。ついで塩酸でｐＨを５．
５に調節した滅菌済み１ｏｐｓ−ニコチン水溶液をそれ
ぞれＳ−ニコチンとして０．５ｔずつになるように加え
同様の条件で１４日間培養を行なった。この培養済み液
全量５Ｊ−の中の８−ノルニコチン平均濃度はｏ、ｏ　
ｓ　ｓ！ｌｖ／＋ｄ（基質Ｓ−ニコチンの１２％（モル
比）に相当）であワた。この培養済みの溶液５Ｊ−をガ
ーゼで濾過して菌体を除いたのち１０重量弔の炭酸カリ
ウム水溶液を用いてｐＨ１０に調節し、全量的２１のク
ロロホルムを用いて３回に分けて抽出し、クロロホルム
を合せたものを０．５規定の塩酸水溶液７００ｄで抽出
した。この塩酸水溶液を東京理化学製エバポレーターを
用いて減圧濃縮し、メルク社製シリカゲル６０の薄層プ
レート（厚さ５■）に展開剤としてクロロホルム：メタ
ノール：５８１％アンモニア水の混合比が６ｇ　：ｌＯ
：１の溶液を用いて上昇法で展開させ、展開終了後、風
乾させたものの片すみに、０．２％イサチン（５％酢酸
水に溶解させたもの）をスプレーびんを用いてスプレー
させたのち、１１０℃で１５分間加熱し、青色に発色し
た位置と同じＲｆ値の部分をかきとって、１規定の塩酸
水溶液５〇−で抽出し、エバボレー！−で減圧濃縮を行
い、Ｓ−ノルニコチン２塩酸塩ｏ、３７ｓｒ（ｓ−ニコ
チンの１１−（モル比）に相当〕を得た。

実施例乞 第１表の野培地７Ｊ−を調製し丸菱理化装置研究所製の
１０１容ＭＤ５００型発酵槽に入れオートクレーブで１
２１℃、１５分間加圧加熱滅菌した０前もって試験管７
．本の滅菌済みＰＤＡ斜面培地に本菌株を接種し、２５
℃、７日間培養後、各試験管に滅菌水を１０１１ｔずつ
添加して菌体をかきとシこの全量を滅菌済み発酵槽中の
培地に添加して２５℃、３日間攪拌通気培養した。攪拌
用プロペラの回転数は３００ｒｐｍ、通気量はｏ、　ｓ
　ＶＶＭとした。この培地に滅醒済みＳ−ニコチンを３
．５ｆ添加し、同一条件下で７日間培養を続けた。この
培養終了後のＳ−ノルニコチン量は０．４１５Ｆ（基質
Ｓ−ニコチンの１３％（−１ニル比）に相当〕であった
。この培養済みの溶液７１をヌッチェを用い東洋ν紙屋
１のν紙で濾過して菌体を除去また。エバポレーターを
用い約１１になるまで減圧濃縮を行ったのち１０％炭酸
カリウム水溶液でｐＨ１０に調節しエーテル３Ｊ−で３
回に分けて抽出し、さらにこれを０．５規定の塩酸水溶
液ＩＪ−で抽出した。エバポレーターを用い塩酸水溶液
を約１０ｗｔに濃縮したものを、米国ウォーターズ社製
の高速液体クロマトグラ書でマイクロポンダパック０１
８カラム、溶媒としてメタノールと０．０５モル重炭酸
アンモニウム水溶液の１：１混合物を１分間に２−の流
速で流して、Ｓ−ノルニコチン相当部分のピーク部分の
溶媒を０．５規定の塩酸水溶液に捕集し、減圧濃縮して
約２０ｍとした。この濃縮液は再度２Ｎ苛性ソーダでｐ
Ｈ１１に調製後、クロロホルム３０−とＯ，Ｓ規定の塩
酸水溶液１〇−で抽出し、減圧濃縮を行い、Ｓ−ノルニ
コチン２塩酸塩ｏ、　ｓ　ｓ　ｔ　（基質Ｓ−ニコチン
の１１５−（モル比）に相当〕を得た。

Ｓ−ノルニコチンは反応性に富み、不安定な物質である
ため、Ｓ−ノルニコチン２塩酸塩の形で保存し、使用す
る直前にアルカリ性溶媒を用−てＳ−ノルニコチンとし
て使用に供する。

なお本発明においてＳ−ノルニコチンの定量法は次の方
法によった。すなわち、培養液に等量のメタノールを加
えて遠心分離器を用いて毎分８，０００回転で菌体と沈
澱物を除いた上澄を、ウォーターズ社製の高速液体クロ
マトグラフ、マイクロボシダバックＣ１８カラム、溶媒
としてメタノールと０．０５モルの重炭酸アンモニウム
水溶液１：１、検出器として波長２５４■に調整した分
光光変針を用いて、チャートのピー゛り面積から８−ノ
ルニコチンの量を求めた。

出願人　日本専売公社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　８−ニコチンを加えた培地にペリキュラリア　フ
   ィラメントーザに属するニコチン分解菌を接塊培養して
   得られる培養物からＳ−ノルニコチンを抽出採取するこ
   とを特徴とするＳ−ノルニコチンの製造法０ ２、　ニコチン分解菌がベリキュラリア　フィラメント
   ーザＪＴＳ−２０８菌株である特許請求の範囲第１項記
   載のＳ−ノルニコチンの製造法０