JPS59112953A - ペプチド化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は造血に対して抑制作用を有する新規なペヲチド
およびそれらの製造に関する。

最も効果的な癌治療法の多くは細胞毒薬物を使用してお
り、これは有糸分裂期間中およびＳ−期において癌細胞
を攻撃する。細胞分裂を受ける正常な組繊細胞は通常同
時に影響を受けるがしかしかかる細胞の大部分は休止し
ており従って攻撃を受は易いわけではない。しかしなが
ら、かかる細胞毒薬物は増殖中の組繊細胞を攻撃するの
みならず、骨髄中の大部分の通常は休止した造血幹細胞
が細胞分裂周期（サイクル）に入る引金を引き、従って
それらを攻撃に感じ易くする傾向がある。

骨髄細胞は多能性幹細胞に由来しこれは成熟して形態学
的に区別される細胞、すなわち巨大球、赤血球、顆粒球
およびリンパ球の複合相集団を形成する。多能性幹細胞
の約１０％のみが常時細胞分裂中である。成熟の初期相
においては増殖中の幹細胞のそれぞれは個々の形態学的
に異なる形態に「連合」シ、結果として前記４種の成熟
した細胞型の１種となる。細胞が増殖するとそれらはそ
れ以上の増殖の力を徐々に喪失しそして成熟した細胞例
えば赤血球または顆粒球はもはや分裂し得ない。その結
果として、成熟した細胞は連続的に死んでいるので、ま
だ成熟してない細胞そして％忙多能性幹細胞の増殖能力
が維持されることが必須要件である。

今や、休止幹細胞が分裂周期に入るのを選択的に阻止し
うるある種のベツチドを見出した。

これらにブチドは骨髄抽出物中に微量に見出される天然
に存在する顆粒球形成抑制因子と類似であると信じられ
る。

それゆえ、本発明によれば、一般式Ｉ （Ｉ） （式中、ＲＩＶｉグリシンまたはＤ−アラニンの残基で
あり、そして他のすべてのアミノ酸残基はＬ−形であり
、Ｘｌおよびｘ２は同一または相異なりてＯＨまたはＮ
ｌ２であシそしてｎは０または１である９を有する化合
物およびその生理学的に受容しつる塩が提供される。

本発明のベゾチドの生理学的に受容しうる塩には塩酸塩
、臭化水素酸塩、硫酸塩等のような酸付加塩ならひにア
ルカリ金属塩例えばす）　ＩＪウムまたはカリウム塩、
アルカリ土類金属塩例えばカルシウム塩、ま几はアミン
塩のような塩基との塩が包含される。

Ｎ−末端から第２番目の位置にあるアミノ酸残基が臨界
的であると思われる。何故ならば天然に存在する顆粒球
形成抑制因子とみなされてきたペプチドすなわちビｏ　
Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＬｙｓＯＨが不活性
であることが判明したからである。入手しうる天然の顆
粒球形成因子の量が微量なので、その天然物質の構造は
決定されていない。これは結晶形態または完全に純粋な
形態ではまだ得られておらずそしてこのことが天然源か
ら得られる物質のみを用いて達成されうるか否かは判っ
ていない。対照的に、本発明のペプチドは薬学的用途に
適する結晶形でそして天然起原の夾雑性ペプチドおよび
蛋白質を伴うことなく比較的大量に得られうる。

本発明の好ましい化合物をあげれば次のとおりである。

（ｔ）Ｉ、−ヒログルタミルーＬ−グルタミル−Ｌ−ア
スパルチル−Ｌ−システイニル−Ｉ、−ＩＪリジン（２
）Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−アスパル
チル−Ｌ−システイニル−クリシル−Ｌ−リジン、 （３）Ｌ−ヒログルタミルーＩ、−クルタミニルーＬ−
アスパルチル−Ｌ−システイニル−Ｌ　＋　ＩＪリジン （４）Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−アス
ノぐルチル−Ｌ−システイニル−Ｄ−アラニル−Ｌ−リ
ジンおよび （ｓ）Ｌ−ヒログルタミルーＬ−グルタミル−Ｌ−アス
パルチル−し−システイニル−Ｌ　＋　ＩＪ　シンアミ
ド。

上式の化合物は明らかに薬量依存性である複雑な活性の
型を示す傾向がある。特に、化合物（１）は比較的低い
薬量レベルでマウスに注射された場合骨髄造血系の選択
的抑制、すなわち形態学的に識別しうる細胞および、連
合した幹細胞の抑制を示すが、多能性幹細胞に由来する
他の細胞直系は影響を受けない。細胞外液体中１０−７
Ｍ濃度では成熟細胞中最大である末梢顆粒球の著明な減
少がある。１０−５Ｍ１回の注射後、主要効果は連合し
た幹細胞に現われると思われる。より多量例えば１０−
５Ｍを連続６日間注射後では、連合した幹細胞の祖集団
がまだ強く減少されるがしかしまた多能性幹細胞および
赤血球産生も減少される。１０−５Ｍで３週間では、リ
ンパ球の産生を含む全造血系の強い刺激が観察される。

わずかに効力のレベルは相異−するが、化合物（２）〜
（５）によっても同様の結果が示される。

他の組織の細胞そして特に非骨髄造血組織に関連する腫
瘍細胞には何ら抑制効果がないことに留意するべきであ
る。従ってこれらは骨髄造血系を選択的に保護する。し
かしながら、これらペプチドは骨髄造血系に関連する筋
細胞、例えば骨髄性白血病細胞に保護作用を及はし、そ
してかかる癌の治療には選択的に使用できない。

これらペプチドは有意な毒性をもたない。その上、観察
されたすべての血液学的作用は可逆的でありそしてその
ペプチドを注射された動物の他の器官においては何ら肉
眼的変化は観察されなかった。

前記のように、造血そして特に顆粒球形成の抑制は休止
細胞が細胞分裂に入りそして細胞毒抗癌薬物例えばチト
シンアラビノシドによる攻撃を受は易くなるのを阻止す
る傾向がある。

化合物（１）のような本発明のペプチドで処置後には、
骨髄造血細胞への抑制効果は単に可逆的であるのみなら
ず、実際かかる細胞の産生が一時的に異常に増大し、従
って正常細胞祖集団が非常に速かに修復され、そして事
実、一時的に過度になることに注目した。

細胞毒薬物を使用する治療法における前記保護機能に加
え、本発明によるペプチドは例えば骨髄性白血病におけ
る骨髄造血系に関連した癌細胞の増殖を停止させるのに
も使用されうる。

これらにプチドは造血を変更するのが望ましいあらゆる
臨床的症状に使用されうる。ある場合には、本発明によ
るペプチドはまた骨髄造血系が活性不充分である場合に
これを刺激するために比較的多量に使用するとともでき
る。

これらペプチドはリンパ造成のような関連する非骨髄性
細胞にもある種の影響を及ぼすことが判明したので、こ
れらは他の器官における細胞増殖の選択的修正にも使用
されうる。

一般に、細胞毒薬物に対して保護作用を働かせるために
、本発明のはツチドは大患者に１日について体重７０〜
当９１〜１０Ｗｇ例えば４〜５■の範囲で注射によシ投
与されうる。注入または同様の手段により投与される場
合、薬量は体重７０ｊ［ｆｌＣ）き６日取上Ｋｔ）７ｔ
［３０〜５００４、例えば約１００ｗ９でありうる。原
則的に社患者の細胞外液体中にベツテド沃度約１０−９
Ｍ〜１０″′４Ｍを生ずるのが望ましい。

一般に、チトシンアラビノシドのような細胞毒薬物との
組み合せ療法では細胞毒薬物がなお存在する一方で骨髄
造血系が保護されることを確保するためには注意深いタ
イミングを必要とする。

本発明のさらにもう一つの特徴によれば、薬学的担体ま
たは体形剤と一緒の前記定義された式（１）の化合物ま
たはその生理学的に相容性である塩の少くとも１種を活
性成分として包含する薬学的組成物が提供される０本発
明による組成物は、例えば経口、鼻内、非経口または直
腸からの投与に適する形態で提供されりる。

ここで使用される「薬学的」なる用語には本発明の獣医
学的適用も包含される。

本発明による化合物は錠剤、被覆錠、鼻スプレー、溶液
、乳剤、粉剤、カプセルまたは徐放性形態物のような慣
用の薬理学的投与形態で提供されうる。これら形態物の
調製には慣用の薬学的何形剤ならびに通常の製造法が用
いられうる。錠剤は、例えば１種またはそれ以上の活性
成分を既知の何形剤例えば炭酸カルシウム、燐酸カルシ
ウムまたは乳糖のような希釈剤、コーンスターチまたは
アルギニン酸のような崩壊剤、殿粉または七うチンのよ
うな結合剤、ステアリン酸マグネシウムまたはメルクの
ような潤滑剤および／まｆｃはカルボキシポリメチレン
、カルボキシメチルセルロース、酢酸フタル酸セルロー
スまたはポリ酢酸ビニルのような抑制された放出のため
の薬剤と混合することにより製造されうる。

錠剤は所望の場合は数層からなることもできる。被覆さ
れた錠剤は錠剤と同様の方法で得られた芯（コア）を錠
剤の被覆に通常使用される薬剤例えばポリビニルピロリ
ドンまたは七ランク、アラビアゴム、タルク、二酸化チ
タンまたは糖で被覆することにより製造されうる。徐放
性となすかまたは禁忌を回避するために、芯も数層から
構成してもよい。錠剤被覆はまた徐放性となすために数
層からなることができ、その場合錠剤用の前記何形剤が
使用されうる。

注射溶液は例えば防腐剤例えばｐ−ヒドロキシベンゾエ
ートまたは安定剤例えばＥＤＴＡの添加によるような慣
用の方法によシ製造されうる。

次にこの溶液を注射用バイアルまたはアンプル中に充填
する。

鼻スプレーも同様に水溶液中で製剤化されそしてエーロ
ゾル推進薬と共にまたは手動による圧縮手段を備えたス
プレー容器中に包装されうる。１種または数種の活性成
分を含有するカプセルは、例えば活性成分を乳糖または
ソルビトールのような不活性担体と混合しそしてこの混
合物をセラチンカプセル中に充填することにより製造さ
れうる。

適当な生薬は、例えば活性成分または活性成分の組合せ
物を天然脂肪またはポリエチレングリコールまたはそれ
らの誘導体のようなこの目的に期待された慣用の担体と
混合することにょジ製造されうる。

本発明の化合物を含有する薬量単位は式（１）のペプチ
ドを１〜１０ｙ例えば４〜５■の量で含有するのが好ま
しい。

本発明のさらにもう一つの特徴によれば前記に定義され
た薬学的組成物の有効量を患者に投与することからなる
造血の抑制法が提供される。

しかしながらこの新規ペプチドのもう一つの主要な用途
は免疫学的検定技術の次めの物質の製造にある。ペプチ
ドは抗体産生性動物（例えばウサギ、モルモットまたは
ヤギ）に注射する次めにアルブミン、ボリンン（ｐｏｌ
ｙｓ　ｉｎｅ　）またはポリプロリンのような適当な高
分子担体に共有結合されうる。この高分子担体を使用す
る周知の吸収技術を用いることにより高特異性抗血清が
得られる。ズプチド分子中に放射能（３Ｈ１１４Ｃ１１
８０，１５Ｎ）を導入することにより放射線免疫検定が
容易に企画でき、そして血清（血漿）、尿および脳背髄
液のような異なる生物学的液体中のペプチドの測定に使
用されうる。

本発明のペプチドは任意の好都合な方法で合成されうる
。一般に、存在する反応性の基（アミン、チオールおよ
び／またはカルボキシル）は全合成期間中にわたって保
護され、そして従って最終工程は式（１）の保護された
誘導体の保護基除去であろう。通常、すべての−〇〇〇
Ｈ基、すべての−ＮＨ２基、ピログルタミル残基の−Ｎ
Ｈ基およびシステイニル残基の一〇Ｈ基が保護されよう
。

従って保護され友化合物は式■ （ＩＩ） （式中、１：１２およびＲ６はアミン保護基または水素
原子であり、Ｒ３、Ｒ４およびＲ７はＮＨ２、保護され
たアミンまたはカルボキシル保護基またはＯＨでありそ
してＲ５はチオール保護基である〕を有しうる。

アミノ酸の保護基については広い選択が知られておりそ
してＢ、５ｑｈｒｏｅａｅｒおよびＫ　、Ｌｕｅｂｋｅ
両氏らのｒ　Ｔｈｅ　ＰｅｐｔｉｄｅｓＪ第１および２
巻（アカデミツクプレス１？６５および１９６６年発行
）、Ｇ、Ｒ，Ｐｅｔｔｉｔ氏の「５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　
Ｐｅｐｔｌｅｓ　Ｊ第１〜４巻（Ｖａｎ　Ｎｏ５ｔｒａ
ｎｄ　１９７０．１９７１．１９７５および１９７６年
発行）、Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙ１氏のｒＭｅｔｈｏｄｅ
ｎｄｅｒ　Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅｍｉｅ、　
５ｙｎｔｈｅｓｅ　ｖｏｎ　Ｐｅｐｔｉ−ａｅｎ　Ｊ第
１５巻（ゲオルグφチー７１９７４年発行）およびｒ　
Ａｍ１ｎｏ　Ａｃ１ｄｓ、　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ａｎｄ
　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　Ｊ第４〜８巻（英国化学会１９７
２．１９７４．１９７５および１９７６年発行）に例示
される。

従って、例えば使用されうるアミン保護基にはカルボベ
ンゾキシ（以下「ｚ」としても表示される）、トリチル
、第３ブトキシカルボニル（以下ｒＢｏｃＪとしても表
示される）およびアシル基例えばアセチル基またはホル
ミル基が包含される。

例えば使用されうるカルボキシル保護基にはベンジル（
以下ｒＢｚｊとしても表示される）、ｐ−二トロベンジ
ルまたは第５ブチル基のような容易に解裂されるエステ
ル基が包含される。

チオール保護基にはｐ−メトキシベンジルおよびスルホ
エチル基が包含される。

例えば前記参考文献中に詳説されるように広範囲の他の
かかる基が存在し、そして前記方法におけるすべてのか
かる基の使用は本発明の範囲内に該当することＩｒ１ｕ
Ｒされよう。

カルボキシル保護基は常法例えば適当なエステル化試薬
例えばベンジルまたはｐ−ニトロベンジルアルコールの
ようなアルコールと酸例えばｐ−トルエンスルホン酸の
存在下に反応させることにより導入されうる。

アミン保護基は常法例えばカルボベンゾキシクロライド
またはピバロイルクロライドのような適当な酸ノルライ
ド、または無水酢酸のような酸無水物と反応させること
により導入されうる。

・　チオール保護基はｐ−メトキシベンジルクロライド
またはスルホエチルブロマイドのような適当なＳ−エー
テル化剤との反応により導入されうる。

アミンまたはカルボキシル保護基の除去には広範囲の操
作がある。従って例えばアミン保脆基はアシドリンス、
水素添加分解、希水酸化アンモニウムでの処理、ナ）　
ＩＪウムでの処理、ナトリウムアミドでの処理、ヒドラ
ジンでの処理、または例えばロイシンアミノペプチダー
ゼを用いる酵素的加水分解により除去されうる。興味あ
る方法にはまた例えば氷酢酸中における無水臭化水素で
の処理、トリフルオロ酢酸での処理、液体弗化水素での
処理および接触水素添加も包含される。

従ってカルボベンゾキシおよび第６ブトキシカルボニル
基は、例えば好都合には氷酢酸の存在下に無水臭化水素
を使用してか、またはトリフルオロ酢酸を使用して除去
されうる。アシル基は例えば酸による慣用の加水分解ま
たは前記した酵素的加水分解により除去されうる。

カルボキシル保護基の除去は、例えばけん化、アシドリ
シス、水素添加分解または酵素的加水分解により遂行さ
れうる。従って、例えばけん化は好都合には水、アルコ
ールおよび／またはアセトンの存在下にアルカリ金属水
酸化物を用いて遂行されうる。アシドリシスは例えば無
水臭化水素まｆｃはトリフルオロ酢酸を使用することに
より遂行できそして水素添加分解は例えば接触水素添加
例えば炭素上のパラジウム好都合には木炭上の１０チパ
ラジウムを使用すること忙より遂行されうる。酵素的加
水分解は例えばロイシンアミノペプチダーゼを使用する
ことにより遂行されうる。従って例えばべ／ジルおよび
ｐ−ニトロベンジル基は水素添加分解により除去できそ
して第３ブチル基は例えば酸分解により除去できる。

アミン、ヒドロキシルおよびカルボキシル保護基は例え
ばアシドリシス、アルカリ加水分解、水素添加分解、ナ
トリウムまたはナトリウムアミドでの処理、ま几は酵素
的加水分解により同時に除去されうる。かかる方法には
好都合には氷酢酸の存在下における臭化水床処理および
好都合には溶解乾燥塩化水素を含有するアルコールでの
処理が包含される。

ｐ−メトキシベンジル基のようなチオール保護基は好都
合にはメルカプトエタノール、システィンまたはメチオ
ニンのような捕集剤の存在下に低温例えば０℃で弗化水
床を用いて除去されうる。この方法はアミン、カルボキ
シルおよびチオール保農基を同時に除去しうる。

選択的脱保＠（保護基除去）の方法の一つは、例えば好
都合には触媒として例えば炭素上のノ々ラジウムを使用
しそして好都合には溶媒例えば水、メタノール、ジオキ
サン、酢酸ま几は第３ブタノールの存在下における接触
水素添加である。この方法は例えばカルボベンゾキシ基
を除去するが、しかし第５ブトキシカルボニルまたはア
シル基を元のままに残す。

一般に、式（【）の化合物の保護された誘導体はペプチ
ド合成に適する技術により製造されうる。適当に保護さ
れたりジン銹導体を適当に保護されたシスティン銹導体
、まｆｃはｎ＝１である場合は化合物ＮＨ２ＲＩ　Ｃｏ
ｏ！（と反応させることによシＣ−末端で出発しうる。

リジン誘導体は遊離のα−アミノ基を有し、そして一方
他の反応体は遊離であるかまたは活性化されたカルボキ
シル基のいずれかおよび保護されたアミン基を有しよう
。カップリングし友後、中間体を例えばクロマトグラフ
ィーにより精製し、そして次に選択的にＮ−保護基除去
してさらに他のアミノ酸残基の付加を許容せしめる。必
要なアミノ酸順列が完成されるまでこの操作を継続する
。

Ｎ−保護基除去は通常穏和なアシドリシスにより遂行さ
れよう。過剰の酸は通常例えばトリエチルアミンのよう
な塩基を使用することにより次のカップリング工程前に
中和される。

あるいはまた、Ｎ−末端で出発しそして好ましくは活性
化されたカルボキシル基を有する適当に保護されたグル
タミン酸′！たはピログルタミン酸誘導体をグルタミン
酸またはグルタミンの適当に保護された誘導体と反応さ
せることも可能である。カンプリングさせ素抜、生成物
を例えばクロマトグラフィーにより精製し、そして末端
α−カルボキシル基を保護基除去（脱保護）シそして所
望の場合は次のカップリング工程に先立ち活性化させう
る。この工程順序を所望のペプチドが完成するまで反復
する。

例えば使用されうるカルボン酸活性化物質には混合無水
物、アジドまたは活性化エステル例、ｔＪｆｐ−ニトロ
フェニルエステル、２，４．５−　トリクロロフェニル
エステル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル
マタはＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルが包含
される。

一般に好都合には適当な溶媒系例えばテトラヒドロフラ
ン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、メチレンクロ
ライドまたはこれら溶媒の混合物中低温例えば−２０℃
ないし周囲温度でカップリング反応を遂行するのが好都
合である。

遊離のアミノ基およびカルボキシル基のカップリングは
、例えばジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を
使用して遂行されうる。例えば使用されうる他のカップ
リング剤Ｊｄ　Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ
−１，２−ジヒドロキノリンである。

合成を同相樹脂支持体上で実施するのがより好都合であ
りうる。クロロメチル化されたポリスチレン（１％ジビ
ニルベンセンと交さ結合）が支持体の一つの有用なタイ
プである。この場合合成は１ｊ−保許され７ｔ　ＩＪレ
ジン支持体に結合させることによりＣ−末端で出発しよ
う。Ｘ２がＮＨ２である場合ベンズヒドリルアミン基を
担持する樹脂支持体を使用するのが好ましい。これらを
はじめにリジンカルボキシル基に結合させそして例えば
ＨＦを用いて最後に解裂させると所望のアミドが生ずる
。

以下に説明のために例を掲げる。溶媒は商業上の物質を
再蒸留しそして下記方法すなわちジメチルホルムアミド
（ＤＭＦ）　Ｆｉモレキュラーシーブ４Ａ上、ジクロロ
メタン（ＤＣＭ）はＣａＣ４２上、トリエチルアミ７　
（ＴＥＡ）はＮａ／Ｐｂ合金（Ｂａｋｅｒ）上そしてト
リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）はモレキュラーシーブ４Ａ上
で保存する。

例　　１ Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−アスパルチ
ル−Ｌ−システイニル−Ｌ　−＋）　シン〔化合物（１
）〕 （ａ）　　ｔ　−Ｂｏａ　−（ｓ　−ｐ−メトキシベン
ジル）−Ｌ−システイニル−（ε−ベンジルオキシカル
ボニル）　−Ｌ　−ＩＪリジンンジルエステル（１） ６−ベンジルオキジカルボニル−リジンベンジルエステ
ル塩酸塩（４０６η）をＤＭＦ　３　ｄ中に溶解させそ
して遊離のＴＥＡがｐＨ指示紙の湿つ次紙片で蒸気相中
に検出されうるまでＴＩｎＡを添加する。この溶液中に
ＤＭＦ　５−中に溶解した１−Ｂｏｃ　−（Ｓ　−Ｔ）
−ノドキシベンジル）−Ｌ−７ステインＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステル（４９１＋＋ｖ）を添加する。

溶液をわずかにアルカリ性に保持するために適当な間隔
でＴＥＡを少しずつ添加する。この混合物を室温で一夜
放置しそしてニンヒドリン反応が陰性であるか検査した
のち、ＤＭＦで平衡化されそして標準反応体〔例えば例
においてはｔ　−Ｂｃｃ　−（γ−ベンジル）　−Ｌ　
−ｆルタミン酸−ｐ−ニトロフェニルエステルおよびｐ
−ニトロフェノール〕で検定されたセファテックス（Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ）ＬＨ−２０の２．５×７５ｍカラムに
直接適用する。カラム流れは重力による流れによシ保持
しそして流出液は約１０−の７ラクシヨンに集める前に
２８０ｎｍで監視する。各フラクションのｔ’ｌｃによ
り生成物を同定し、代表的フラクションを集めそして真
空下に蒸発させる。油状生成物の収量〜７ｏｏ＋ｖ（１
ｏ。

％〕、ｔｌｃ　（クロロホルム／アセトン（９：１））
中同質、Ｒｆ＝　０．６４゜ （ｂ）　　ｔ−Ｂｏｃ　−（β−ベンジル）−Ｌ−アス
パルチル−（８−ｐ−メトキシベンジル）−Ｌ−システ
イニル−（ε−ベンジルオキシカルボニル）　−Ｌ　−
１）　シンベンジルエステル（ＩＩ） 保護されたジはプチド（１）７００ｒＩｋｉを無水ＤＣ
Ｍ２Ｓｆｎｔ中に溶解させそして無水ＴＦＡ　２５−を
添加する。６０分後、酸および溶媒を真空下に除去する
。残留物をＤＣＭ中に溶解させそして再び蒸発させる。

’Ｉ’ＥＡでわずかにアルカリ性となしたＤＭＦ（３ｍ
、ｌ中の残留物の溶液にＤＭＦ　３　ｄ中のｔ　−’Ｂ
ｏａ　−（β−ベンジル）−Ｌ−アスパラギン酸ｐ−ニ
トロフェニルエステル（４Ｂ８１１Ｆ）（７）溶液を加
える。アルカリ度を頻繁に検査しそして少量のＴＥＡの
添加により保持する。ニンヒドリン反応が陰性（約２時
間後）になった後反応混合物をセファデックスＬＨ−２
０カラム（２，５Ｘ７５ｃｍ）に適用しそして前記のよ
うにして精製する。真空下に蒸発させた後の結晶性生成
物の収量〜９００■（１００チ）、ｔｌｃ　（クロロホ
ルム／アセトン（９：１））上置質、Ｒｆ＝　（］、　
７０゜（ｃ）　　ｔ　−Ｂｏｃ　−（γ−ベンジル）−
Ｌ−グルタミル−（β−ベンジル）−Ｌ−アスパルチル
−（Ｓ−ｐ−メトキシベンジル）−Ｌ−７ステイニルー
（ε−ベンジルオキシカルボニル）　−Ｌ　−’）　）
ンベンジルエステル＠）保護されたトリペプチド誘導体
１１９００ｖを前記のようにしてＴＦＡで保護基除去し
、ＤＭ７３ｄ中に溶解しそしてＴＥＡを用いて弱アルカ
リ性となす。この溶液中にｔ　−Ｂｏａ　−（γ−ベン
ジル〕−Ｌ−ｆルタミンＲｐ−ニトロフェニルエステル
（ＤＭＦ　３−中）　５　［］　４ｊ９を加える。約２
時間牛後にニンヒドリン反応が陰性となりそしてこの混
合物をセファデックスＬＨ−２０のカラムに適用して前
記のように精製する。反応混合物中の成分の分離および
ｔｌｃによるその監視は前記と同様にして実施されうる
。適切なフラクション（この場合園９〜１５）を集め、
蒸発させそして乾燥する。淡帯黄色油状物の収量〜１１
４０Ｗ（１００チ）、ｔＩＣ（クロロホルム／アセトン
（９：１）、）上同質、Ｒｆ＝　０．５３゜ （ｄ）ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ピログルタミル
−（γ−ベンジル、１−Ｌ−グルタミル−（β−ベンジ
ル〕−Ｌ−アスパルチル−（Ｓ−ｐ−メトキシベンジル
）−Ｌ−７ステイニルー（ａ’−ヘンシル−オキシカル
ボニル）−Ｌ−リジンベンジルエステル＆）テトラペプ
チド誘導体１１１１１４０■をＩについて前記したと同
様にしてＤＣＭ中ＴＦＡを用いて保護基除去しそしてＤ
ＭＦ　３−中に溶解させる。この溶液をＴＥＡで弱アル
カリ性となしそしてベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ピ
ログルタミン酸ｐ−ニトロフェニルエステル４２３■ヲ
ＤＭＦ３ｄ中の溶液として加える。反応混合物のアルカ
リ度を反復して検査して必要ならばＴＥＡの添加により
元に戻しておかねばならない。約６時間抜ニンヒドリン
試験が陰性となりそしてペンタペプチド銹導体■を前記
と同様にして精製しうる。

淡帯黄色油状物の収量〜１２３０Ｗｗｉ、　ｔｌｃ　（
クロロホルム／アセトン（９：１））上同質、Ｒｆ＝Ｑ
、４４（ティリング）。

（θ）　　Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−
７スパルチルーＬ−システイニル−Ｌ−リジン 保護されたはンタスプチド誘導体Ｎ５０岬を捕集剤とし
てメチオニン５００■を添加して０℃で液体弗化水素５
０ｄ中に溶解させそして１時間放置する。次に弗化水素
を真空下に０℃で蒸発乾固させそして残留物を酢酸エチ
ルと攪拌する。

酢酸エチル洗液を傾瀉しそして捨てる。残留する物質を
希酢酸中に溶解させそして凍結乾燥する。

凍結乾燥した物質（２〜）をＣ１Ｂ−カラム（１０簡Ｘ
１０ｃＩｎ）を用い、溶液Ａ（Ｑ、１％水性トリフルオ
ロ酢酸）および溶液Ｂ（アセトニトリル中の０．１％ト
リフルオロ酢酸〕を使用し溶液Ｂの０．１０％を６０分
間にわたって添加する匂配溶離法を用いて毎分２．８−
の流量で逆相ＨＰＬＣすることにより精製しうる。Ｑ　
１４　ｎｍでの紫外線吸収またはビリジンジスルフイツ
ド試薬（ＳＨ基に対する）を用いて検出を遂行する。

同じ操作が前記化合物（２）〜（５）の調製に用いられ
うる。これらの合成法はスキームの形態で以下に掲げそ
して生成物の特性を第１表゛に示す。

下記略語が用いられる。

Ｂｏａ　＝第３ブトキシカルボニル ＢＺ−ベンジル Ｚ＝ベンジルオキシカルボニル（カルボベンゾキシ〕ｐ
ＭＢ　＝　ｐ−メトキシベンジル Ｓｕ　＝　Ｎ−ヒドロキシスクシニミルｐＮＰ　＝　ｐ
−ニトロフェニル 第　　１ 化合物（υ ｒ）　　ＴＬＣ（シリカゲル） 溶媒 Ｈ）アミノ酸分析 Ａｌａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　−Ａｓｐ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１．００Ｇｌｕ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１．９８（）ｌｙ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　−Ｃｙｓ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　’０．９８Ｌｙｓ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１．０４Ｉｌｌ）　ＨＰＬＣ ０１８５μｍ　１２５Ｘ４ｍｓ＋ ＤＣ’ｆ：　２１４闘　　　　　　　　　　　　　ＲＴ
　１５．７流１ｔ：ＩＷＩｖｍ 溶液Ａ：５ｍＭ燐酸 溶＃Ｂ：　８０％　５ｍＭ燐酸／２０％Ｃ’Ｈ３ＣＮ時
間　溶液Ｂ％ ０ ８２０ ３０　　１００ Ｒｆ＝０．１９　　　　Ｒｆ＝０．１５　　　　Ｒｆ＝
０．２２　　　　Ｒｆ＝Ｑ、１５Ｒｆ＝０．Ｄ８　　　
　Ｒｆ＝０．０８　　　　Ｒｆ＝０．０８　　　　Ｒｆ
＝０．１４−　　　　　　　　　−　　　　　　　　１
．０１　　　　　　　　−１．００　　　　　　　１．
００　　　　　　　１．００　　　　　　　１．０Ｃ１
１，９１１，８７１，９４１，８７ ０，９８−−− ０，９００，９００，８９０，８８ １、υ９　　　　　　　０．９８　　　　　　　１．０
９　　　　　　　　’１．００ＲＴｉ６．７　　　　　
ＲＴ　　ａ８　　　　　ＲＴ　　１ａ３　　　　　ＲＴ
　　１０．０毒物学的試験 本発明の物質の毒性作用について （１）骨髄細胞の懸濁培養物として２４時間まで、そし
て （２）寒天培養物による幹細胞毒性につき７日間試験し
た。

化合物ＩＦｉ動物１匹当り９．１　ｍｙまでの薬量でマ
ウスへの１回注射および複数回注射ならびに連続注入に
よっても試験した。観察時間は１９日間までで全部で動
物２７３匹を使用した。全器官の顕微鏡検査により剖検
を行った。

これら薬理学的研究に使用された方法はＯ，Ｄ。

Ｌａｅｒｕｍおよびダブリ”−ＰａｕｋｏＶｉｔｓ両氏
により［Ｅｘｐ、Ｈｓｍａｔｏｌ。」第１２巻（１９８
４年）に詳細に記載されている。

１０−５Ｍまでのどの薬量でも毒性または動物の死亡の
何の徴候も観察されなかった。多量では白血球増加症を
誘発する。白血球減少症は薬量の多い動物のいずれにお
いても観察されなかった。

生物学的試験 ＬａｅｒｕｍおよびＰａｕｋｏｖｉｔｓ両氏によりｒ′
Ｅ２ｘｐ　。

Ｈｅｍａｔｏｌ、　Ｊ第１２巻（１９８４年〕に記載さ
れるようにして骨髄細胞の寒天コロニー法（ＣＦＵｏ）
および生体内実験が行われた。

これら物質は生体外で抑制効果を示した（第Ｂ表〕。化
合物（１）のみが生体内試験されそしてこれは可逆的な
抑制作用を示した。

第■表

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）一般式Ｉ （υ （式中、Ｒ１はグリシンまたはＤ−アラニンの残基であ
   り、そして他のすべてのアミノ酸残基はＬ−形でろシ、
   ＸｌおよびＸ２は同一または相異なシてＯＨまたはＮＨ
   ２であシそしてｎは０または１であるンを有する化合物
   およびその生理学的に受容しうる塩。 ２）Ｌ−ヒログルタミルーＬ−１’ルタミニルーＬ−ア
   スパルチル−Ｌ−システイニル−Ｌ−リジン、Ｌ−ピロ
   グルタミル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−７スバルチルーＬ−
   システイニル−グリシル−Ｌ−リジン、Ｌ−ピログルタ
   ミル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−システ
   イニル−Ｌ　−ＩＪ　）ン、Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−
   ”ルタミルーＬ−アスパルチルーＬ−システイニル−Ｄ
   −アラニル−Ｌ　＋＋　リシンおよびＬ−ピログルタミ
   ル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−アスパルチル−し−システイ
   ニル−Ｌ−リジンアミドから選ばれたものである前記特
   許請求の範囲第１項記載の化合物。 ３）結晶形をした前記特許請求の範囲いずれかの項に記
   紀の化合物。 ４〕　前記化合物の保護された誘導体を脱保護すること
   からなる前記特許請求の範囲第１項記載の化合物の製法
   。 ５）前記保護された化合物が式Ｕ （式中、Ｒ２およびＲ６はアミン保護基または水素原子
   であり１．Ｒ５、Ｒ４およびＲ７はＮｌ２、保護された
   アミノまたはカルボキシル保護基またはＯＨであｐそし
   てＲ５はチオール保護基である）を有することからなる
   前記特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６）前記保護基が酸加水分解、水素添加分解、アンモノ
   リンスま九は酵素的加水分解により除去されることから
   なる前記特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７）前記特許請求の範囲第５項に定義された一般式■を
   有する化合物。 ８）薬学的担体または付形剤と共に前記特許請求の範囲
   第１項記載の化合物を包含する薬学的組成物。 ９）前記特許請求の範囲第１項記載の化合物の有効量を
   ヒトまたは動物患者に投与することからなる該患者の骨
   髄造血系の抑制法。