JPS59208465A - Ｄｎａおよびｒｎａにおける突然変異の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＤＮＡに招ける突然変異の検出は各種分野において重要
である。かかる一つの分野に、発生源的に決定した疾病
の診断があり、かかる疾病の保有者を確認することであ
る。化ヨーロッパにおいては発生源的に決定した欠除に
よって生ずる疾病は全ての生きて出産した者の１襲にり
かんすることがある。幾つかの地中海沿岸国では、人口
の２０％がサラセミアと組合さった発生源的欠除を有す
ると言われる。

遺伝分析の従来の方法は、ＤＮＡ分離および制限消化、
ゲル電気泳動詔よびイー・サザン博士の方法による］）
ＨＡブロッティング、お交雑化および洗浄、＃よびオー
トラジオグラフィを含む。

全体で３〜１０日を要し、放射性プローブを交雑化のた
め使用している。かかる方法は、アカデミツク・プレス
によって１９８１年に発行されたピー・エフ・アール・
リトルのジェネック・エンジニアリング第１巻、第６１
頁〜第６２（７） 頁の論文の首題である。

かかる方法はＤＮＡが関心のある区域において正確に配
列されていようといまいと使用できる。

しかしそれらは大きな欠点を有する；これらが制限酵素
分割位置に存在するとき点突然変異を検出するのに有効
なだけであり、従って同じ酵素に対する他の近接分割位
置がないときにのみ有効である；それらはＩ）ＮＡ分離
、制限、ゲル電気泳動およびサザンブロツテイングの長
たらしい予備工程を必要とする；そしてそれらは一般に
放射性ラベルの使用を必要とする。これらの欠点は、こ
れらの方法による臨床的研究室での遺伝的スクリーニン
グの開発を阻害して来た。

所望の区域におけるＤＮＡ配列が知られているとき、こ
れらの欠点の幾つかは克服できる。ビー・ジエイ・コン
ナー等は（Ｐｒｏｏ、Ｎ１１ｔｌ、Ａａａｄ。

Ｓ０１．米国、第８０巻１９８３年１月号、第２７８頁
〜第２８２頁に）制限酵素分割位置で突然変異があるべ
きことを必要としない方法を発表している。放射性的に
ラベル付けした１９−塩基オリゴヌクレオチドプローブ
が、可能な突然変異を含むＩＩＮＡの区域と交雑を生ぜ
しめる。交雑条件は、突然変異が存在するかしないかに
よってプローブが交雑するようにまたはしないように注
意深く選択する。しかしプローブの長さおよび交雑条件
は正確をうることは困難であり、成功するには厳密な要
件を必要とする。上述した長々とした予備工程は、放射
性ラベル付きプローブでも同様に使用される。

本発明の方法は一般的に所望の区域において核酸配列の
知識を必要とする。しかし制限酵素分割位置で突然変異
があることを必要さしない。

（制限位置内での突然変異の場合、正確な核酸配列を必
要とすることなく、簡単な末端充足実験から、含まれる
塩基変化を推論することができる。）この方法は明瞭な
結果を与えることができる。好ましい形において、従来
の方法の特長である長々とした予備工程を必要とせず、
放射性ラベルの使用を必要としない。

従って本発明は、特定塩基から一方向に延び（９） る核酸鎖の部分に対し相補性である線状プローブを提供
することによって標的核酸鎖における特定ヌクレオチド
塩基の突然変異を検出する方法を提供し、この方法は、 （ａｌ標的にプローブを交雑させて核酸雑種を形成させ
、これによってプローブの一末端を特定塩基に実質的に
隣接する核酸鎖に交雑するようにし、 （ｂｌプローブ延伸に適切な条件の下雑種をヌクレオチ
ド誘導体と混合して、標的中の特定塩基が検出すべき突
然変異であるときまたはないとき１このみプローブの末
端にヌクレオチド誘導体を接合させるようにし、上記ヌ
クレオチド誘導体を担持するプローブが特定条件下耐消
化性であり、 （０）上記特定条件下雑種を消化させ、これによってそ
の二本鎖部分を、末端がそれに接合した上記ヌクレオチ
ド誘導体を有しなければプローブの上記末端で始まる漸
進的消化をさせ、（ｄｌもはや核酸鎖に交雑されないプ
ローブの部（１０） 分を除去し、 （−１消化後残っているプローブの存在または不存在を
標的中の特定ヌクレオチド塩基の突然変異を検出するた
めに使用 することからなる。

この方法の最も重要なのは工程（ｂｌであり、これは特
殊な性質を有するヌクレオチド誘導体の使用を含む。こ
のヌクレオチド誘導体がプローブの末端に接合すると、
このときプローブは特定条件下で耐消化性である。一つ
の形において、標的中の特定塩基が正常であるとき、即
ち考えられる突然変異がないときにのみプローブへの接
合を生ぜしめる条件下にヌクレオチド誘導体を雑種と混
合する。別の形では、（異なる）ヌクレオチド誘導体を
、標的中の特定塩基が考えられる突然変異であるときに
のみプロブの末端にそれを接合させる条件下に雑種と混
合する。

これを達成するのに種々の方法が可能である、この三つ
をＡ、ＢおよびＣで示す、これらの中入およびＢが好ま
しい。

（Ｉ　１　） Ａ、プローブを、工程（，１において一端が特定塩基に
直接隣接する核酸鎖に交雑するようになるように提供す
る。このときプローブ延伸に適切な条件の下ヌチド誘導
体を雑種と混合してプローブが特定塩基に対し相補性で
あるときプローブの末端にヌクレオチド誘導体を接合さ
せるように工程（ｂｌを行なうことができる。

Ｂ、プローブを、工程（、ｌにおいて、特定塩基から数
塩基離れて一末端が核酸鎖に交雑するようになるように
提供する。このとき、特定塩基に対し相補性であるとき
、ヌクレオチド誘導体を含むプローブの一末端に接合さ
せるように、プローブ延伸に適切な条件の下、１Ｍ以上
の他の異なるヌクレオチドと共に、ヌクレオチド誘導体
を雑種と混合して工程（ｂｌを行なうことができる。

工程（ｂｌで、１．２および３個のヌクレオチドを使用
する場合の本発明の具体例を示すことは理解を助けるこ
とができる。

Ａ、プローブは、工程（，１において、試験すべき特定
塩基に直接隣接する塩基に対向するその末端塩基で核酸
鎖（標的）に交雑されるようになる。−例として、＊印
が点突然変異を表わすような配列を有する標的を考える
。

＊ ０．、　ＡＧＡＧＣＴＡＴＯＧＡＴＣ、、、または＊ ０．、ＡＧＡＧＴＴＡＴＧＧＡＴＣ、、。

プローブは　− ＡＴＡＣＣＴＡＧ　、　、　。

３′ 配列を含有する。

工程＋ａ＋において、二つは次の如く交雑されるように
なる： ＊ 、　、、　ＡＧＡＧＣＴＡＴＧ（ＩＡＴＣ＠自・ＡＴＡ
ＣＣＴＡＧ　＠−・ ３′ または ＊ 、　、　、　ＡＧＡＧＴ〒ＡＴＧＧＡＴＣ、−・ＡＴＡ
ＣＣ〒ＡＵｅ書・ ３′ この好ましい例において、グアノシン（Ｃ１の誘（１３
） 導体を他のヌクレオチドを用いずに工程（ｂ）で使用し
、一つの場合に詔いてしかし他の場合ではなく導入する
： ＊ 、、　、ＡＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＴＣ、、。

ＧＡ〒ＡＣＣＴＡＧ ３′ または ＊ ＡＧＡＧＴＴＡＴＧＧＡＴＣ・１・ ＡＴＡＣＣＴＡＧ ３′ Ｂ、プローブは試験される特定塩基から数塩基離れた３
′末端を有する標的に工程体）で交雑されるようになる
。Ａにおけると同様の標的配列を用いて、配列 ＣＣＴＡＧ　、　、　。

３′ を含有するグローブを考えることができる。工程（ａｌ
において、ニ一つは ＊ 、　、　、　ＡＣＩＡＧｃＴＡＴＧＧＡＴｃ・・−ＣＣ
ＴＡＧ、　、　。

（１４） または ＊ 、　、　、　ＡＧＡＧＴＴＡＴＧＧＡ’ｌ’Ｃ、畢嘩Ｃ
ＣＴＡＧ−・・ ３′ のように交雑されるようになる。

この例において、グアノシン（Ｇｌの誘導体は、工程（
ｂｌにおいてｄＡＴＰおよびｄＴＴＰと共に使用されて
次のものを与える。

＊ 、　、　、　ＡＧＡＧＣ〒ＡＴＧＧＡ’［’Ｃ・・拳Ｇ
ＡＴＡＣＣＴＡＧ　　−・・ ３′ または ＊ ０．　、　ＡＧＡＧＴＴＡＴＧＧＡ’ｌ’Ｃ、、。

ＡＡＴＡＣＣＴＡＧ　、　＠・ ３′ ヌクレオチド誘導体を一つの他のヌクレオチドとの混合
物の形で使用する場合の比較位置を推論することは容易
である。しかしながらこの例１こおいては、ヌクレオチ
ド誘導体は標的中の特定塩基に対向する位置にのみ導入
されること（１５） が必要である。

Ｃ，プローブは、工程（、ｌにおいて、−末端が（Ａに
おける如く）特定塩基に直接隣接するか、或いは（Ｂに
おける如く）特定塩基から数塩基離れた核酸鎖に交雑さ
れるようになるように提供する。このとき工程（ｂｌは （ｂＨｉｌグローブ伸長のため適切な条件の下雑種と場
合によっては一つまたは二つの他の異なるヌクレオチド
と共に連鎖停止ヌクレオチド化合物を混合し、連鎖停止
ヌクレオチド化合物が特定塩基に対し相補性であるとき
プローブの末端にそれを接合させるようにする。

（ｂｌ（ｉｉ１グローブ延伸のため適切な条件の下形成
される雑種を１種以上のヌクレオチド誘導体と混合し、
連鎖停止ヌクレオチド化合物が既に存在しないときプロ
ーブの末端にそれを接合させるようにし、１種以上のヌ
クレオチド誘導体を担持するプローブは特定条件下耐消
化性である。

上記Ａの例の工程（，１で形成された同じ標的／プルー
ブ雑種を考えることができる。連鎖停止グアノシン化合
物（０１を工程（ｂＨｌｌで使用し、他の場合でなく、
一つの場合において導入される：＊ 、　、、ＡＧＡ（Ｉｃ：ＴＡＴＧＧＡＴＣ、、。

ＧＡＴＡＣＣＴＡＧ　　ａ　、。

３′ または ＊ 、　、　、　ＡＧＡＧＴＴＡＴ（３ＧＡＴＣ＠Φ−ＡＴ
ＡＣＣＴＡＧ・・・ ３′ 次に工程（ｂｌ（Ｉｌｌを、他の場合でなく一つの場合
において導入される全４種ヌクレオチド誘導体（人、旦
、王、Ｔ）を用いて行なう。

＊ ０．、ＡＧＡＱＣＴｉＴＧＧＡＴＣ＋、。

（）ＡＴＡＣＣ’ｌ’ＡＯ・・・ ３′ または ＊ 、　、　、　Ａ（ｉＡＧＴＴＡＴＧＧＡＴｃ　、　、１
−・・Ｔ　ＣＴ　ＣＡ　Ａ’［’ＡＣＣ’ｌ’ＡＧ　、
、　。

明らかに工程（ｂＨＩｌｌは入単独を用い、または旦と
共にそして場合により二と共に用いて用うこ（１７） とができた。連鎖停止ヌクレオチド化合物として好適な
のは、ジデオキシ型クレオチドであり、またそれらの３
′末端（或いは５′末端）にそれ以上のヌクレオチドの
付加をしない他の数種のヌクレオチド化合物もある。し
かしながらそれらは選択した個々の条件下消化からグロ
ーブを保護しない。

制限切断の位置が突然変異の位置に直接隣接していない
とき制限断片としてプローブを作ることが好都合である
ことがあり、一つまたは二つのヌクレオチド型を伸長制
限するた省略できる。

標的およびプルーブは両方共ＤＮＡであることができる
。或いは何れかか両者がＲＮＡであることができる。

この方法の工程（８１でのプローブの存在または不存在
を測定するため、一般にプ四−ブは例えば放射性同位元
素でまたは酵素における部分をとる基、または螢光ある
いは化学発反応をとる基でラベル付けする。

／ＩＩ （１８） 本発明方法において、標的は不動態化してもよく、溶液
の形にしてもよい。不動態化したものを使用するのが好
ましい、何故ならば交雑されないプローブの除去を容易
にし、工程（ａｌで再交雑する相補性標的鎖の危険を減
するからである。しかしながら、ある場合には溶液の形
での標的の使用が好ましい。

本発明において重要なのは、工程（ｂ）で使用するヌク
レオチド誘導体であり、工程（ｃ）で使用する消化条件
である。好ましい実施態様によれば、工ｉ　（ｂｌにお
けるヌクレオチド誘導体としてチオヌクレチドを使用し
、ラベル付プ四−ブの３′末端への接合を生ぜしめる。

そして工程（ｃｌにおいて、デオキシヌクレオシド−５
′−モノホスフェートを放出し、３′末端からのみ二本
鎖核酸鎖を消化するＥ　、ａｏｌｉからの酵素　エキソ
ヌクレアーゼ頂を用いて消化を行なう。この酵素は消化
を行なうときリン原子が硫黄に結合しているときホスホ
エステル結合を低下した効率でのみ分解する。従ってそ
の３′末端でチオヌクレオチドで− （１９Ｊ 末端停止された鎖はエキソヌクレアーゼ■による劣化に
対し抵抗性である。

従って上記ＡおよびＢの実施態様において、星−ヌクレ
オチドを工程（ｂｌで使用する。そのヌクレオチドが標
的の特定塩基に対して相補性であるとき、プローブの３
′末端に接合し、形成される雑種はエキソヌクレアーゼ
■で工程（Ｏ］で耐消化性である。−万千オヌクレオチ
ドが特定塩基に対１．川補性でないとき、プローブの３
′末端に接合せず、！４種は工程１０１で消化される。

調査すべき核酸（標的）が一本鎖でないときには、それ
を一本錦にし？ｊければならない。これはＤＮＡの熱変
性の如き通常の手段によって行なうことができる。一本
鎖標的鎖は例えばニトロセルロース上に不動態化するの
が好ましい。

コノ予備処理はニトロセルロースフィルター上に精製し
たＤＮＡをスポットし、８０℃でベーキングして一本鎖
標的を固定するか、或いはできルナラニトロセルロース
フィルター上で４Ｔ’Ｊ　胞ヲ直接処理することによっ
て行なうことができる。

標的を制限消化、ゲル電気泳動およびサザンブｐツテイ
ングすることは有利ではあるが必ずしも必要ではない。

線状プローブは一本鎖または二本鎖ＤＮＡであってよく
、二本鎖であるときには使用時にそれを一本鎖の形に変
える。鎖の一末端が、調査下にある特定塩基を含まず、
それから一方向に延びる標的の一部に対して相補性であ
ることが必要である。かかる線状プローブを合成もしく
は得るための方法は当業者に知られており、ここには説
明しない。プローブは標的に対する強力交雑を確実にす
るため鎖長中に少なくとも１０個のヌクレオチドがある
べきであり、所望なだけ長くあるとよい。プローブが長
ければ長い程、それらはプローブ分子１個についてラベ
ルの世を大にすることができるので有利であることがで
き、交雑化の特異仕度を高くできるので有利である。

グローブをラベル付けするため使用するラベルの種類に
は厳密な規制はなく、ラベルは工程（２１） （０１で行なわれる消化を妨害してはならない。放射性
ラベルが好都合なことがしばしばある。臨床研究室では
一般に非放射性ラベル、例えば酵素または化学発光また
は螢光材料が好ましい、かかる場合直接ラベル付けが可
能であり、或いはビオチンの如き受容体分子でラベル付
けする。

二つのポリヌクチオチド配列、その一つが標的に対し交
雑し、他がラベルを担持するものを有するグローブを計
画するのが有利であることがある。もしラベル配列が工
程（、）で標的に交雑されるようにならなかとき、それ
はラベル付けされた塩基が工程（司で消化を受けるか受
けないかは問題でない。例えばエキソヌクレアーゼ■が
工程（６）における消化のため使用される酵素であると
き、標的配列に工程（、）で交雑されるようにならない
プルーブ配列の一部にのみ１ｓＳ　−チオヌクレオチド
をラベルとして使用できる。同様にビオチンまたは蛋白
質の如きラベル群は予想通り工程（Ｏ）で消化を阻止す
ることができる。

プループが二本鎖であると、両鏡が標的のそ（２２） れらの相補性鎖に交雑する。従って二本鎖プローブのラ
ベル付けには注意を払わなければならない。プローブ発
生には三つの選択がある＝１１１線状一本鎮の均一にラ
ベル付されたまたは末端ラベル付けされたプローブ。こ
れはオリゴヌクレオチドを合成することによって作るこ
とができる。或いはラベル付きＲＮＡプローブはファー
ジ５Ｐ１３　ＲＮＡポリメラーゼおよび適当な鋳型を使
用して作ることができる。

（１１）調査下、特定塩基に隣接してその末端で交雑す
る鏡上でのみラベル付けされる線状二本鎖プローブ。か
かるプローブはＭ１３クローンから作ることができ、均
一にラベル付けできる。

或いはそれらは、ラベル強度が適切であることが見出さ
れたとき一つの鎖にのみにおいて末端ラベル付けできる
。或いはそれらはＴ　４　ＤＮＡポリメラーゼを用いて
ラベル付けできる。

（ｌｉＤＷＪ＠においてラベル付けされた二本鎖プロー
ブ。かかるプローブは最も都合良く作ることができるが
、奪釈の問題を生ぜしめる。一つの（２３） 鎖の一つの末端、例えば３′末端を調査下特定塩基に隣
接する標的にアニール［７、他の鎖の３′末端が別の塩
基に隣接する標的の幾つかの他の区域でアニールする。

このｆｍの塩基は調査下にある特定塩基およびその期待
される突然変異体の両者とは異なるべきであるのが好ま
しい。この他の塩基が特定塩基またはその突然変異体と
同じであるとき、この方法は有用な情報を尚与えること
がで、〜るｌ、かし定性的でなくむしろ定量的な情報を
与えることができる。

ラベル付きプローブは必要ならば一本鎖の形に先ず変え
る、次いで標的と交雑させて雑種を形成する。洗浄によ
って過剰にラベル付けされたプローブを除去した後、雑
種は、プローブ延伸に適切な条件下、例えば重合条件下
、場合によっては一つまたは二つの他の異なるヌクレオ
チドの存在下に、ヌクレオチド誘導体で上記具体例Ａお
よびＢにおける反応を受けさせる（或いは具体例Ｃにお
いては連鎖停止ヌクレオチド化合物を用いる）。交軸化
、洗浄、および重合条件は従来の条件でよい。

しかしながら使用するポリメラーゼ酵素は下記二つの要
件を満さなければならない。

（＋１酵素は非常に忠実でなければならない、即ちこれ
らのヌクレオチドが標的配列中の塩基に相補性であると
きプローブ配列の末端に一つ以上のヌクレオチドの付加
を行なわなければならない、しかしそれらがそうでない
ときには、非常に少ない頻度でのみ付加を行なうか全く
行なわれない。

（Ｉｌ＋酵素はエキソヌクレアーゼ活性を有していては
いけない、即ちプローブ配列の末端からヌクレオチドを
除去する傾向があってはならない。

これらの要件に合致する一つの酵素は、適当に精製され
た牛胸腺ＤＮＡポリメラーゼである。

他のものは、望ましからぬエキソヌクレアーゼ活性を除
くため変性された原核ＤＮＡポリメラーゼの中に、また
は特に真核ＤＮＡポリメラーゼの中に容易に見出すこと
ができる。通常プ四−ブがＩ）ＮＡまたはＲＮＡのもの
であるかどうかには係（２５） りなく同じ酵素を用いるべきである。

ヌクレオチド誘導体も下記二つの要件を満さなければな
らない。

（１）上記具体例ＡおよびＢにおいて、それが特定ヌク
レオチド環基に対し相補性であるとき、およびそうある
ときにのみラベル付きプローブの所望末端にそれは接合
しなければならない。

従って特定ヌクレオチドがアデニンであるとき、チミジ
ンまたはウリジンの誘導体が好適である、しかしアデノ
シン、シチジンまたはグアノシンの誘導体は好適でない
。（具体例Ｃにおいては、標的配列の特定塩基での突然
変異を検出する仕事は、ヌクレオチド誘導体によらずに
、連鎖停止ヌクレオチド化合物によって行なう）。

（１１）ラベル付きプローブの末端で接合するとき、保
護されていない雑種を滴下するのに有効な条件下、形成
される雑種を消化から保護しなければならない。

ヌクレオチド誘導体は、原則的に、ホスホジエステル結
合中に含まれるようになるホスフェ（２６） −ト基中、または塩基中または糠中で変性されたヌクレ
オチドであることができる。多くのかかる変性ヌクレオ
チドは文献中に記載されている。ヌクレオチド誘導体は
、工程（０）で使用すべきであるエキソヌクレアーゼ酵
素との関係において選択する必要がある。

上述した如く、或状況の下で好適なヌクレオチド誘導体
は、α−リン原子に結合した酸素原子が硫黄で置換され
ているもの、例えばα−８−デオキシチミジントリホス
フェート（α−８ｄＴＴＰ　）　、またはα−８−デオ
キシアデノシントリホスフェート（α−８ｄＡＴＰ　）
である。

それ自体ラベル付けされているヌクレオチド誘導体を使
用することができる。充に高いラベル密度がヌクレオチ
ド誘導体中に導入しうるとき、予めラベル付けされてい
なくて、ヌクレオチド誘導体のそれに結合させること書
こよりラベル付けされるようになるプローブを使用する
ことができる。この方法は標的の予備精製を行なったと
き特に有用である。非特定ラベル導入は（２７） パリンドローム区域を有する複雑な標的で生ずることが
ある。

工程（司において、形成される雑種は、（１）ヌクレオ
チド誘導体で一末端で保護されているラベル付きプロー
ブに影響を与えず、（１１）ラベル付きプローブが、標
的が不動態化されているニトロセルロースまたは他の媒
体からそれを除去するよう保護されていない雑種を漸進
的に消化する 条件の下で消化を受けさせる。

従ってエキソヌクレアーゼ酵素は、３’、［から漸進的
に二本鎖ＤＮＡ、またはＤＮＡ　／　ＲＮＡ雑種、また
は二本鎖ＲＮＡを侵害するものである；（或いは酵素は
５′末端から漸進的に侵害する酵素を使用できる）；そ
して工程（ｂｌで使用するヌクレオチド誘導体で阻止さ
れるものである。

上述した如く、消化のため使用しつる酵素はエキソヌク
レアーゼ■である。この酵素ハＲＮＡ鎖のみの３′末端
から漸進的にＤＮＡ　／　ＲＮＡ雑種をまたは３′末端
のみから二本鎖ＤＮＡを侵害する。

５′末端から漸進的に二本鎖ＤＮＡまたはＤＮＡ　／Ｒ
ＮＡ雑種を消化するエキソヌクレアーゼ酵素を使用する
と、工程（ｂｌにおいて、ラベル付きプローブの５′末
端でヌクレオチド誘導体を結合することが必要である。

消化が鎖に沿って漸進的に進行する場合、不動態化され
た標的からラベル付きプ四−ブのラベルの殆んどまたは
全部を除去するのに充分な長さ継続しなければならない
。この要因は、標的配列に相補性であり、従って標的に
交雑されるようになるラベル付きプローブの最大長さに
限界を与える。

本発明方法を不動態化されておらず溶液の形で標的配列
を用いて行なうとき、工程（ａｌは、標的材料を（それ
を一本鎖の形で存在させる必要があるときは変性して）
プローブ材料と混合し、次いで交雑を行なう条件を保つ
ことを含む。余分な酵素を、存在する一本鎖プローブま
たは標的配列を消化させるが、二本鎖配列を消化させる
ことなく、工程（ｃ）で含有させることができる。

（２９） ＲＮＡプローブを使用するときこの目的のためＲＮアー
ゼ酵素を利用できる。次いでプローブの非交雑部分を除
去することは工程（ｄｌにおける簡単な事である、何故
ならそれらは工程（Ｃ１で単一ヌクレオチドに破壊され
ているからである。

全ての場合番こおいて、工程（ｄｌにおけるプローブの
非交雑部分を除去した後、標的になお結合したラベルを
測定する。これは従来の方法で行なうことができ、ラベ
ルの種類によって決る。

所望によって測定を助けるためラベルを標的から溶離し
てもよい。

図面を参照すると、第１図〜第３図は実施例１に関する
反応工程であり、それぞれ標的製造、プローブ製造、お
よび交雑化および試験を示し、第４図は実施例１で得ら
れた結果を示すオートラジオグラフの表示であり、第５
図〜第７図は実施例２に関する反応工程をであり、それ
ぞれ標的製造、プローブ製造、詔よび交雑化および試験
を示し、第８図は実施例２で得られた結果を示すオート
ラジオグラフの表示である。

（３０） 下記実施例１および２は本発明を示す。実施例１および
２の説明はそれぞれ第１図〜第４図および第５図〜第８
図と関連させて読むべきである。

実施例　１ 目的： １、不動態化された標的に交雑されたプローブを消化す
るためＥ、ｏｏｌｉエキソヌクレアーゼ■の能力を立証
すること。

２、導入されたチオヌクレオチドを導入することによっ
てエキソヌクレアーゼ■の阻止を立証すること。

方法： 標的製造（第１図） １、下記条件下で、制限エキソヌクレアーゼＣ１，■で
消化してプラスミドｐＡ’ｒ１５３の試料を線状化した
。

トリス［１、ｐＨ７，４１０ｎＭ Ｍｇ　Ｃ１＊　　　　　　　　　　　　Ｉ　Ｑ　ｍＭＮ
ａＣｌ　　　　　　　　　　　　５　Ｑ　ｍＭ（３「 牛血清アルブミン（ＢＳＡ）　　　　　　１００μ２／
−２、線状二本鎖ＤＮＡを２分間１００℃で加熱して一
本鎖の形に変えた。

３、変性線状、ＡＴ　１５３溶液の１μ、９（ＤＮＡの
１０ｎｆヲ含有）を、ニトロセルロース膜（シュライト
ヘル・アンド・シュルタイプＢＡ１３５）の一枚の上に
グリッド格子模様の形で対の形に点滴した。膜シートは
、各区分が１対の点を含有するように同じ１．５２区分
に切りとれるようにした。

点を含むシートを空気乾燥し、真空中で８０℃で２時間
ベーキングした。

プラスミド、ＡＴ　１５３のＢＢｎ＋Ｈ１位置をとりま
く配列は、プ四−ブが交雑されることが期待される区域
であった。

プローブ製造（第２図） １、プラスミドｐＡＴ　１５３を、ｌＱｍＭのトリス１
（ＣＩ　ＰＨ７，４，５Ｑ　ｍＭのＮａＣ１、ｌＱｍＭ
のＭｙＣｌｌＩ。

１ｍＭのジメチオスレイトール、１００μ２／−のＢＳ
Ａ中で制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで消化した。

２、消化された分子の両末端は、Ｅ！、ｃｏｌｉ　ＤＮ
ＡポリメラーゼＩのフレナラ断片の存在下デオキシグア
ノシンヌクレオチドを導入する凹んだ３′末端を有する
ことが予期された。伸長反応は、工程１からのＢＢｍ旧
消化混合物１００μ象に、５０μＣ１の（α−”Ｐ）　
ｄＧＴＰ　（３ＱＱ　Ｑ　Ｃ１／ｍｍｏｌ　）およびフ
レナラポリメラーゼ１０単位を加えて続けた。この量は
線状プラスミドｐＡＴ　１５３を４μ？含有していた。

伸長反応は１５分間２０℃で培養した。非ラベル付きｄ
ＧＴＰを最終濃度１００μＶまで加えた。そして反応を
２０℃で更に５分間続けて、伸長完了を確実にした。次
いで混合物を１０分間６５℃で加熱してフレナラポリメ
ラーゼを失活させた。

３、ラベル付きＤＮＡ調剤を、工程２からの混合物に制
限エンドヌクレアーゼＨｑｅ　ｌ［の２０単位を加え、
３０分間３７℃で培養してこの酵素で消化した。この工
程は与えられたプローブ分子の５′末端が標的に完全ア
ニーリングすることによってその３′末端の伸長を阻害
できる機会を減（３３） 少した。反応は緩衝したフェノールとクロロホルムの１
＝１混合物１００μ℃で抽出して停止した。

次の方法で非導入放射能を除去した。

１００、ｕＩｌの４Ｍ酢酸アンモニウム（、Ｈ４，５）
および４００μ氾のエタノールを水性相に加えた。

混合物を１０分間−７０℃に冷却し、２分間３７℃に温
め、室温で１０分間マイクロ遠心分離中で回転させた。

非導入ヌクレオチドは上澄液中に残った。ペレットを、
Ｈ４，５の６６６１１１Ｍの酢酸アンモニウムを含有す
る６６％エタノールで２回洗浄し、１００１ｉｆｔの１
０ｍＭ）リスＨＣＩ　（ｐＨ７，５）、１ｍ１ＪのＢＤ
ＴＡ中に再溶解した。

４、工程３からのグローブ調剤を２分間１００℃で加熱
して変性した。混合物中の一本鎖ラベル付きＤＮＡ断片
は、標的のＢａｍＨ１位置の何れの側の区域に対しても
相補性であった。

１、変性標的ＤＮＡの点９６対を担持するニトロセルロ
ース膜シートを、 （３４） ３０−の６×標準ク工ン酸ナトリウム食塩水５×デンハ
ーツ溶液 １００μｆ／−のイーストｔＲＮＡ ０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ　）中で２時
間６５℃でゆっくりと振とうした。

１×標準ク工ン酸ナトリウム食塩水（ＳＳＣ）＝０．１
５ＭのＮａＣ１ ０，０１５Ｍのクエン酸Ｎａ３ 、Ｈ７，０ １Ｘ７’７ハーツ溶液−０，０２％　（Ｗ／Ｖ　）　Ｂ
ＳＡｏ、０２％（Ｗ／Ｖ　）フイコル ０．０２％（Ｗ／Ｖ　’）ポリビニルピロリドン 次に新しく沸とうしたグローブ混合物１０μ２（これは
約４００１のＤＮＡおよび１０ｄｐｍ）８１１ｐを含有
していた）を加え、混合物を１６時間６５℃でゆっくり
と振とうした。次に放射性混合物を捨て、ニトロセルロ
ース膜を、６×ｓｓｃ、５Ｘデンハーツ溶液、０．１％
ＳＤＳの５０−で３０分間６５℃でゆっくりと振とうし
た。

（３５） 次に膜を室温で次の溶液中で３０分間洗浄した：　２　
Ｘ　ＳＳＣで２回、Ｑ、　Ｉ　Ｘ　ＳＳｃで一回。膜を
４℃で２　Ｘ　ＳＳＣ中で保存した。スポット対を含有
する膜の１．５ｍ１区域を使用前にＰＨ７，８の５０ｍ
Ｍ　）リスＨＣＩで洗った。

２、膜の洗浄した区域を、断面積２．８−の平底筒状試
験管中に置いた。牛胸腺ＤＮＡポリメラーゼ触媒した伸
長反応を、３７．５単位の牛胸腺ＤＮＡポリメラーゼ−
α（ファルマシアＰ−Ｌバイオケミカルスより入手）を
含有する ３　００　μＲ，の５ＱｍＭ）リスＨＣＩ　（ＰＨ７，
８）Ｉ　Ｑ　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｆＣｌ　ｍ １ｍＭ　　ジチオスレイトール ５００μｙ／、ｚ　　ＢＳＡ 中で行なった。ヌクレオチドは使用しうる時１００μｙ
の最終濃度で存在させた。反応は２時間３７℃で保温し
た。

ｄＡＴＰはファルマシアＰ−ＬバイオケミカフＬ／Ｘよ
り入手した。α−８ｄＡＴＰはＡ異性体およびＢ異性体
の混合物であり、アメルシャムで作った。

ポリメラーゼ伸長反応に続いて、ＢａｍＨＩ発生３′末
端に３２Ｐ−デオキシグアノシンヌクレオチドを付加し
て始めにラベル付けしたプローブ分子が、反応がｄＡＴ
Ｐまたはα−８ｄＡＴＰを含有したとき一つのｒＡＪ残
基によって伸長されたことが予期られた。ポリメラーゼ
反応は１００　ｍＭの最終濃度に５　Ｍ　Ｎａｌを加え
て停止した。（牛胸腺ＤＮＡポリメラーゼは高塩濃度で
阻止される）。

３、適用しうるとき２００単位のエキソヌクレアーゼ■
を加え、反応混合物を２時間３７℃で保温した。膜区域
を別々に３０−の２　Ｘ　ＳＳＣで洗い、乾燥し、−７
０℃で増強スクリーンを有するＸ線フィルムに曝露した
。

オートラジオグラフィに続いて、液体シンチレーション
カウンターで結合３２Ｐについて評価した。

結果 第４図は下記条件の下に得られた４個の代表的な点の対
のオートラジオグラフの表示である。

１、工程（２）でＤＮＡポリメラーゼ＋ｄＡＴＰを使用
しく３７） だ。工程（３）でエキソヌクレアーゼ使用せず。

２、工程（２）でポリメラーゼなしにｄＡＴＰを使用し
た。１ｉＴ３１でエキソヌクレアーゼ■を使用した。

３、工程（２）でＤＮＡポリメラーゼ＋η−８ｄＡＴＰ
を使用した。工程（３１でエキソヌクレアーゼを使用し
た。

４、工程（２）でＤＮＡポリメラーゼ＋ｄＡＴＰを使用
した。工程（３１でエキソヌクレアーゼを使用した。

結果は明らかに、 １、エキソヌクレアーゼ■は、導入したチオアデノシン
ヌクレオチドの不存在下に末端ラベルを除去した、 ２、チオ−アデノシンヌクレオチドの導入はエキソヌク
レアーゼ■によってラベルの除去を阻止した ことを示している。

液体シンチレーションカウンティングは、ｄＡＴＰの存
在下における伸長およびエキソヌクレアーゼ団での消化
の後０であったのに比し、α＋　５ｄＡＴＰの存在下に
牛胸腺ＤＮＡポリメラーゼ−（３８） α−触媒した伸長およびエキソヌクレアーゼ■での消化
の後に、対照点に対し交雑したラベルの１４％が保持さ
れたことを示した。

実施例　２ 目的： １、不動態化された標的から５′末端ラベル付けされた
プローブのエキソヌクレアーゼ■触媒除去を証すること
。

２、野生型配列から突然変異体の明白な識別を明らかに
すること。

原理ニ プラスミドｐＡＴ　１５３は位ｆｌｉｔ　６４８から位
置２３５３　ｂｐ　（ＥｏｏＲＩ位置から数えた番号）
までプラスミドｐＢＲ３２２のセグメントを欠如する。

ＰＡＴ　１５３中の位置１６４９での塩基対はＡ−Ｔで
ある。ｐＢＲ３２２中での位置１６４９でのそれはＧ−
Ｃである。従って位［１６４８でその３′末端を有する
プローブはアニールして、Ａｌｊ　１５３およびｐＢＲ
３２２になり、突然変異の点に隣接する。

（３９） 方法： 標的製造（第５図） １下記条件の下プラスミドＰＡＴ　１５３および、ＢＲ
３２２の試料を制限エンドヌクレアーゼＢａｍ旧で別々
に消化した。

ｌ　Ｑ　ｍＭのトリスＨＣ１、ＰＨ７，８１Ｑ　ｍＭの
ＭｐＣ１２ ５Ｑ　ＬＩＩＭのＮａ　Ｃ１ １００ｔｔｆ　／　ｍｔのＢ５Ａ ２、線状化したプラスミドを２分間１００℃に加熱し、
それらの鎖を分離し、次いで水浴に入れた。

一３変性した線状プラスミド溶液の０５μ！（５゜ｎｒ
金含有を、ニトロセルロース膜（シュライヘル・アンド
・シュルタイプＢＡ８５）上で格子パターンに対の形で
点滴した。膜を同じ１．　Ｏｃｔ１区域に切断できるよ
うにし、その各々にＰＡＴ１５３スポットの一対および
、ｒ３Ｒ３２２スｉツトの一対を含有させた。各１１ｃ
Ｉｎ平方をスポットを区別し、ｐＡ’［’　１５３およ
びｐＢＲ３２２スポツトの別々の液体シンチレーション
カウンティングするため切断をするためマークした。ス
ポットを含有するシートを空気乾燥し、８０℃で２時間
真空中でベーキングした。

５′から３′の方向で見て位置１６２９から１６４８ま
でのｐＡ’Ｉ’　１５３およびｐＢＲ３２２の一本鎖と
同じ配列を有するオリゴデオキシヌクレオチドを合成し
た。溶液ホスホ−トリエステル法を使用した。このオリ
ゴヌクレオチドは拡散点に隣接したその３′末端と両プ
ラスミドに交雑することが予期された。

２０−ヌクレオチドプローブを、標準条件でＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼおよび（γ−ｊ！Ｐ）ＡＴＰを用い
てその５′末端で８２ｐでラベル付けした。反応混合物
は１００　ｒｌＦのオリゴデオキシヌクレオチドおよび
１００μＣ１の（γ−３２Ｐ）ＡＴＰを含有していた。

導入されなかったラベルは、酢酸アンモニウムおよびエ
タノール添加に続いて、混合物を１６（４１） 時間−２０℃で、そして１５分間−７０℃で冷却したこ
とを除いて実施例１に記載した方法でオリゴヌクレオチ
ドを選択沈澱させて除去した。

用いたラベルの約１６％が導入された。

変性した標的ＤＮＡの２４組のスポットを含有する膜シ
ートを、６０℃で２時間１５−の６×ＳＳＣ，５Ｘデン
ハーツ溶液、１００μｆ／−のイース）　ｔＲＮＡ、０
．１％のＳＤＳ中でゆるやかに振とうした。約５ｎｆの
ＤＮＡおよび１０’　ｄｐｍ　（２）　”Ｐ　ヲ含有し
た１０μＬの３３Ｐラベル付はプ四−ブ混合物を加え、
混合物を６０℃で１６時間ゆるやかに振とうした。

膜を３０分間６０℃で、５０−の６　Ｘ　ＳＳＣ。

５×デンハーツ溶液、０．１％ＳＤＳ中で洗い、次いで
室温で３０分間１００−の２ＸＳＳＣ中で２回洗い、次
いで室温で３０分間５ｏ−の５９ｍＭトリス−ＨＣｌ、
ＰＨ７，８で一回洗った。シートから四角の膜を切りと
り、直ちに使用した、或いは２×ＳＳＣ中で４℃で保存
し、使用前に５　Ｑ　ｍＭ（４２） トリスｐＨ７，８で再洗してから使用した。

２、牛胸腺ＤＮＡポリメラーゼーα反応を、断面積２．
８−の平底筒状ポリプ四ピレン試験管中３０μｍ容量中
で行なった。反応緩衝液は下記の通りであった。

５０ｍＭ）リス−ＨＣＩ　ＰＨ７，８ １Ｑ　ｍ　Ｍ　　Ｍ　ｙＣ１ｚ ｌｍＭ　　ジチオスレイトール ５００μｆ／ｍｌ　　ＢＳＡ 米国メリーランド州、ベセスダのザ・ユニフォームド・
サービセス・ユニバーシティ・−Ａ−”ｊ・ザ・ヘルス
・サイエンスのニー・エム・ホルムス博士によって提供
された牛胸腺ＤＮＡポリメラーゼーα画分Ｃを４３単位
／−の最終濃度で使用した。用いうる時には、ヌクレオ
チドを１００μＭの濃度で使用した。α−８ｃｌＴＴＰ
ストツクはＡ異性体詔よびＢ異性体のほぼ同割合を含有
していた。α−８ｄＣＴＰはＡ異性体を９０％より多く
含有していた。両ストックはアメルシャムで作った。

（４３） 反応は３７℃でオツシレイテイングシェーカーで２時間
１６０半振動／分で振とうした。ポリメラーゼ反応は反
応混合物の吸引によって停止させ、膜はそれぞれ３０−
の５０ｍＭ）リス−ＨＣ１、ＰＨ７，８中で洗浄した。

３、エキソヌクレアーゼ■反応は、ポリメラーゼ反応に
使用した試験管と同じ試験管中で３００バ容叶で行なっ
た。反応混合物は、５ＱｍＭのトリス−ＨＣｌ、ＰＨ７
，８，７５ｍ？ｊのＮａＣ１、ｌＱｍＭの）Ｊ７Ｃ１，
，１ｍＭのジチオスレイトール、５００μｍ／−のＢ８
Ａ　、および２６４単位／−のエキソヌクレアーゼｍ（
ファルマシアＰ−Ｌバイオケミカルス製）を含有してい
た。

反応は３７℃でオツシレイテイングシェーカーで３０分
間１６０半振動／分でゑとうした。

四角の膜を次いで３０−の２ＸＳＳＣで洗い、空気乾燥
し、−７０℃で増強スクリーンを有するＸ線フィルムに
対し曝露した。オートラジオグラフィに続いて、四角の
膜を、ＰＡ’ｌ’１５３およびＰＢＲ３２２スポツトに
結合した　Ｐの別々の測定のため切断した。

結果 第８図は、下記条件下得られたスポットの九つの代表的
な組のオートラジオグラフを示す。

それぞれの場合において、スポットの左手の対はＰＡＴ
　１５３から誘導され、右手の対はｐ　Ｂ　Ｒ３２２か
ら誘導される。

１、工程（２］でポリメラーゼ使用せず。工程（３）で
エキソヌクレアーゼ使用せず。

２、工程（２）でポリメラーゼ使用せず。工程（３）で
エキソヌクレアーゼ使用。

３、工程（２）でＤＮＡポリメラーゼ＋ｄＴＴＰおよび
ｄＣＴＰ使用。工程（３）でエキソヌクレアーゼ使用せ
ず。

４、工程（２１でＤＮＡポリメラーゼ＋ｄＴＴＰおよび
ｄＣ〒Ｐ使用。工程（３）でエキソヌクレアーゼｍ使用
。

〔第７図の（ｄ）〕。

５、工程（２）でＤＮＡポリメラーゼ＋α−８ｄＴＴＰ
使用。工程（３１でエキソヌクレアーゼｍ使用。〔第７
図の１ａ））。

（４５） ６、工程（２）でＤＮＡポリメラーゼ＋ｄＴＴＰ使用。

工程（３）でエキソヌクレアーゼｍ使用。

７、工程（２１でＴ）ＮＡポリメラーゼ＋α−８ｄＣＴ
Ｐ使用。工程（３）でエキソヌクレアーゼｍ使用。〔第
７図の（ｂｌ）。

８、工程（２）でＤＮＡポリメラーゼ＋ｄＣＴＰ使用。

工程（３）でエキソヌクレアーゼｍ使用。

９、工程＋２１でＤＮＡポリメラーゼ＋α−８ｄ’ｌ’
ＴＰおよびα−８ｄ　ＣＴＰ使用。工程（３）でエキソ
ヌクレアーゼｍ使用。〔第７図の（０１〕。

結果は明らかに次のことを示した。

１、エキソヌクレアーゼ■は、比較的短時間で中程度の
酵素濃度で５′末端ラベル付き２０−ヌクレオチドプロ
ーブを効率的に除去する。

２、プローブは、チオヌクレオチドの牛胸腺ＤＮＡポリ
メラーゼ触媒導入によりエキソヌクレアーゼ■から保護
できる。

３、この方法は拡散配列の第一塩基のみを使用してそれ
らの異なる配列に基いた。ＡＴ　１５３および、ＥＲ３
２２を明確に区別した。

（４６） 液体シンチレーションカウンティングは、対照ｐＡＴ　
１５３スポツトに交雑した　Ｐラベルの約４４％がσ−
８ｄＴＴＰの存在下伸長の結果として保護され、対照Ｐ
ＢＲ３２２スポットに交雑したラベルの約２８％がα−
８ｄＣＴＰの存在下伸長の結果として保護されたことを
示した。何れかのスポット対に交雑したＩｍｐラベルの
５％未満が非相補性チオヌクレオチドの存在によって保
護された。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第３図は実施例１に関する反応工程であり、そ
れぞれ標的製造、プローブ製造および交雑化および試験
を示し、第４図は実施例１で得られた結果を示すオート
ラジオグツの表示であり、第５図〜第７図は実施例２に
関する反応工程であり、それぞれ標的製造、プローブ製
造ｔよび交雑化および試験を示し、第８図は実施例２で
得られた結果を示すオートラジオグラフの表示である。 Ｆｔａ、７ Ｆｔａ、２ Ｆｔａ、４ Ｆｔａ、８ ダ　　　　６　　　７　　　　δ　　　　νＦｔａ、５ ｒ＼　　　　　ｒ＼　　　　　　　　　　−＼−Ｃｓ　
　　　　　１．Ｊ”’ｘコ 手続補正書 昭和ｔり年陣？９０ 許庁毛官若杉和夫　殿 １鷹え鐵 正をする者 １件との関係　　で１已′ｌＴよ乃陶／；雫−所−鰺噌
１ 理人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　特定塩基から一方向に延びる核酸鎖の一部を相補
   する線状プローブを提供することによって標的核酸鎖に
   おける特定ヌクレオチド塩基の突然変異を検出する方法
   であって、 Ｔ−１標的にプローブを交雑させて核酸雑種を形成せし
   め、これによってプルーブの一端を特定塩基に実質的に
   隣接する核酸鎖に対して交雑するようにし、 （ｂｌプローブ伸長に適切な条件の下、ヌクレオチド誘
   導体を雑種と混合し、標的中の特定塩基が検出すべき突
   然変異であるときまたはないときにのみプローブの一端
   にヌクレオチド誘導体を接合させ、上記ヌクレオチド誘
   導体を担持するプローブが特定条件下耐消化性とし、（
   Ｃ１上記特定条件下雑種を消化させ、これによってその
   二本鎖部分を、末端がそれに接合した（　　２　） 上記ヌクレオチド誘導体を有しなければプローブの上記
   末端で開始させて漸進的に消化させ、 （ｄ１核酸鎖に対しもはや交雑されないプローブの部分
   を除去し、 （ｅ］標的中の特定ヌクレオチド塩基の突然変異を検出
   するために消化後残ったプローブの存在または不存在を
   使用する ことを特徴とする方法。 ２、　プローブを、工程（ａｌにおいて一末端が特定塩
   基に直接隣接している核酸鎖に交雑されるようになるよ
   うに与える特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、　工程（ｂｌが、 （ｂｌプローブ伸長に適切な条件の下ヌクレオチド誘導
   体を雑種と混合し、グローブが特定塩基に対して相補性
   であるときヌクレオチド誘導体をプ四−ブの一末端に接
   合させ、上記ヌクレオチド誘導体を担持するプローブが
   特定条件下耐消化性であることからなる特許請求の範囲
   第２（３） 項記載の方法。 ４、　工程（ｂｌが、 （ｂＨ１１プローブ伸長に適切な条件の下達鎖停止ヌク
   レオチド化合物と雑種とを混合し、プローブが特定塩基
   に対し相補性であるときプローブの末端にそれを接合さ
   せ、 （ｂＨｉｉｌプローブ伸長に適切な条件の下１種以上の
   ヌクレオチド誘導体を形成される雑種と混合し、連鎖停
   止ヌクレオチド化合物が既に存在しないときグローブの
   末端にそれらを接合させ、上記１種以上のヌクレオチド
   誘導体を提持するプループが特定条件下で耐消化性であ
   ることからなる特許請求の範囲第２項記載の方法。 ５、工程（，１において、−末端が特定塩基から数塩基
   離れた核酸鎖に交雑されるようになるようにプローブを
   与える特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、　工程（ｂｌが、 （ｂ）プローブ伸長に適切な条件の下、１つまたは二つ
   の異なるヌクレオチドと共にヌクレオチド誘導体を雑種
   と混合し、それが特定塩基に対し相補性であるときヌク
   レオチド誘導体を含むプローブの末端にそれらを接合せ
   しめ、上記ヌクレオチド誘導体を担持するグローブが特
   定条件下耐消化性であることからなる特許請求の範囲第
   ５項記載の方法。 ７、　工程（ｂｌが、 （ｂｌ・（１１プローブ伸長に適切な条件の下、一つま
   たは二つの他県なるヌクレオチドと共に連鎖停止ヌクレ
   オチド化合物を雑種と混合し、連鎖停止ヌクレオチド化
   合物が特定塩基に対し相補性であるときそれを含み、プ
   四−ブの末端にそれらを接合せしめるようにし、 （ｂｌ　（ＩＩ　＋プローブ伸長に適切な条件の下、一
   つ以上のヌクレオチド誘導体を形成された雑種と混合し
   、連鎖停止ヌクレオチド化合物が既に存在しないときプ
   ローブの末端にそれらを接合せしめるようにし、上記一
   つ以上のヌクレオチド誘導体を担持するプローブが特定
   条件下耐消化性である特許請求の範囲第５項記載の方法
   。 （５） ８、標的がＤＮＡまたはＲＩＩＩＡのものである特許請
   求の範囲第１項〜第７項の何れか一つに記載の方法。 ９、　プローブがラベル付けされている特許請求の範囲
   第１項〜第８項記載の方法。 １０、プローブがＤＮＡまたはＲＮＡのものである特許
   請求の範囲第１項〜第９項の何れか一つに記載の方法。 １１、工程（ｂｌで使用するヌクレオチド誘導体がチオ
   ヌクレオチドである特許請求の範囲第１項〜第１０項の
   何れか一つに記載の方法。 １２、工程（０）で、３′末端からのみ二本鎖核酸鎖を
   消化するエクソヌクレアーゼ酵素を使用する特許請求の
   範囲第１項〜第１１項の何れか一つに記載の方法。 １３、プローブ伸長を重合条件下半胸腺ＤＮＡポリメラ
   ーゼを使用して達成する特許請求の範囲第１項〜第１３
   項の何れか一つに記載の方法。 １４、標的を不動態化した形で使用する特許請求の範囲
   第１項〜第１３項の何れか一つに記載の（６） 方法。