JPS5929236B2 - 固定化細胞膜結合酵素を製造する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生化学的反応において有効に触媒として作用す
る固定化細胞膜結合酵素の製造法に関するものである。

近年、酵素を触媒として用いて生化学反応の反応に利用
する技術が開発されたのに伴い、酵素源としての微生物
菌体を固定化して用いる方法も色色試みられるようにな
っている。

微生物菌体そのものを酵素源として用いる方法は、菌体
力・ら繁雑な操作を経て酵素を抽出する必要がなく、又
、酵素の安定性も比較的高〜・こと力・ら、実用的には
精製酵素を用いる方法よりも便利な面がある。

し力・しながら、所望の酵素の種類によっては、酵素が
細胞膜と緊密に結合していて、培養し、集菌しただけの
状態では活性が外に現われないものが多い。

活性を発現させる為に、菌体を有機溶媒と接触させたり
、凍結乾燥したり、鉱酸と接触させたり、界面活性剤と
接触させることが行なわれており、このような方法は遊
離菌体の場合には、非常に有効であることが多い。

一方、菌体を固定化させる場合に、一般に固定化によく
利用させる方法であるアクリルアミドのゲルを用いた包
括固定法を採用すると、前述のような方法で固定化前に
活性を発現させた菌体を用いた場合、固定化の過程で酵
素の活性が失なわれることが多い。

本発明は前記したような、固定化菌体の製造法における
欠点を排除し、有効に触媒として作用する固定化細胞膜
結合酵素の製造法を提供することを目的とする。

本発明者等は鋭意研究の結果、所望する酵素が細胞膜と
結合して内在する菌体な活性を発現させずにアクリルア
ミドのゲルで包括固定した後、該固定化菌体な凍結乾燥
せしめることによって活性化させることにより、菌体の
有する所望４素活性がほぼ完全に発現した固定化菌体を
得ることができることを見い出した。

本発明は、上述の研究結果に基いて達成されたものであ
る。

以下に本発明の内容を詳述する。本発明においてはまず
所望の目的酵素について特にその活性の高い酵素を細胞
膜と結合した状態で内在しているバクテリアを選択する
ように留意すべきである。

バクテリアの細胞膜と結合した酵素には種々あり、どの
ような酵素が細胞膜と結合しているかはバクテリアによ
って異なるが、一般にエネルギーを必要とする合成反応
系の酵素が多（・。

これらは菌体の培養が終了した時点では活性が表われな
いような酵素である。

本発明は主として上記したような酵素を含有するバクテ
リアを対象とするものである。

筐たバクテリアｌ択に際しては、目的とする酵素反応に
対する活性が高いものである一方、その他の反応、例え
ば基質又は生成物の分解反応に対する活性の低い菌体を
選択することが必要である。

例えばＮＡＤ及びＡＴＰを基質としてＮＡＤＰを生成す
るＮＡＤキナーゼが所望の場合には、ＮＡＤサナーゼの
活性が高く、ＮＡＤ、ＡＴＰ 。

及びＮＡＤＰ分解酵素の活性の低いバクテリアを選択す
る。

同様に２分子のＡＤＰより１分子のＡＴＰと１分子のＡ
ＭＰを生成するアデニレート・キナーゼが所望の場合は
アデニレート・キナーゼ活性が高い反面、ＡＤＰ及びＡ
ＴＰの分解活性の低いバクテリアを選択する。

又、単一の酵素ではなくて、複合酵素系が所望の場合で
あっても、目的とする一連の酵素群又は一連の酵素系の
一部が細胞膜と結合した形で存在するならば本発明の対
象となる。

前述のようにして選択したバクテリアは、培養して菌体
を集菌し、必要に応じて洗滌したのち、該菌体中の酵素
の安定なｐＨに調整した緩衝液に懸濁させる。

刀・＜シて得られた菌体懸濁液はアクリルアミドモノマ
一尺ヒＮ−Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド等の架橋
剤、更に適当な重合促進剤を混合し、アクリルアミドを
重合させて菌体をゲル中に固定する。

所望する酵素活偏を発現させる為に前述のようにして調
製したアクリルアミドゲル固定化菌体を凍結乾燥する。

凍結乾燥に際しては、アクリルアミドゲル固定化菌体を
−２０〜−８０℃で凍結させ真空度約１０−４ｍｍＨｓ
’付近で最終品温３０〜４０℃となるまで真空乾燥を行
なうのが好ましい。

本発明によって製造された固定化細胞膜結合酵素は適当
な緩衝液に懸濁することにより容易に復水し、各種の生
化学反応に有用であって、反応はバンチ式で行ってもよ
いが、カラムに充填して連続反応を行なう場合特に有利
である。

更に、本発明によって製造された固定化細胞膜＃イ＼ｈ
鰺■１Ｌｔ 古ケ裡ム １ ナー十ト１ｔＦ、 Ｖ
ｔ、 ／’、 σ）ｆり１ノ式ゼトゲパ恵く、長期間活
性を保持し、又、取り扱いにも便利である。

以上述べたよ５に本発明ゆ酵素を細胞膜に結合した状態
でアクリルアミドのゲルに固定化し、力・つ凍結乾燥す
ることによって高い活性を持った固定化細胞膜結合酵素
を提供できるので、酵素反応を利用する分野に寄与する
ところが多大である。

以下実施例を例示して本発明を具体的に説明する。

〔実施例 １．〕 ＮＡＤキナーゼ活性を有するプロテウス・ブルガリス（
ＩＦＯ３８５０）をグリース２％、酵母エキス０．５％
、Ｃ３ＬＩ％、リン酸第１カリウム１係、リン酸第２カ
リウム１％、硫酸マグネシウム０．０５％を含むｐＨ７
，５の借地で３０℃、８時間通気培養して得られた菌体
を、集菌後、水で洗滌した。

得られた菌体２４０２を、４００−の水に懸濁したのち
、８０２のアクリルアミドモノマーと８２のＮ−Ｎ’−
メチレンビスアクリルアミドを加え１０℃以下に冷却し
、これに５％ジメチルアミンプロピオニトリルと５％過
硫酸アンモニウムを各各２〇−添加し、１時間１０℃以
下に放置した。

力・〈シて得られた固定化アクリルアミドポリマー菌体
を１０〜１００メツシユの大きさのゲルに成型後、犬亜
真空■製真空凍結乾巣機ＶＦＩ）１２００ＦＭＳ−Ｂ型
を用いてアクリルアミド固定化菌体を凍結温度−４０℃
、真空度１０”−’ ｍｍＨｆで最終品温３０℃となる
まで凍結乾燥し、アクリルアミド固定化細胞膜結合ＮＡ
Ｄキナーゼ１５１を得た。

このものの活性を５ｍＭ ＮＡＤ、５ｍＭ ＡＴＰ。

１００？？７Ｍフン化ナトリウム、１０ｉＶ塩化マグネ
シワム、１０ｍＭアジ化ナトリウム、１０ｍＭ塩化亜鉛
を含有する５０ｍＭ９ン酸緩衝液（ｐＨ７，５）中で測
定したところ２０ ｕｎｉ ｔ／ｒ乾燥ゲルであった。

（ｌｕｎｉｔは１時間当り１μｍｏｌｅのＮＡＤＰを生
成する活性）一方凍結乾燥処理を行なわない固定化菌体
ではＮＡＤキナーゼ活性は全く見られな力・つた。

又、本発明によって得られた凍結乾燥処理アクリルアミ
ド固定化細胞膜結合ＮＡＤキナーゼの保存中の活性変化
を調べたところ、４℃以下では９０日間活性の低下は見
られず、３０℃においても９０日後にはじめの活性の８
９％を示した。

〔実ｌ咥【１ｅ２リ ２．〕 アデニレート・キナーゼ活性を有するブレビバクテリウ
ム・アンモニアゲネス（ＩＦＯ１２０７２）をグルコー
ス２％、酵母エキス３％、リン酸第１カリウム０．１％
、リン酸第２カリウム０．１％、塩化カルシウム０．０
１％を含むｐＨ７，５の培地で３０℃、８時間培養し、
菌体を得た。

得られた菌体を実施例１と同様の方法でアクリルアミド
のゲルに固定化、成型した後、凍結乾燥してアクリ、ル
アミド固定化アデニレート・キナーゼ１５ｆを得た。

このものの活性を５ｍＭ ＡＤＰ、２ｍＭ塩化マグネシ
ウム、１００？？２Ｍ塩化カリウムを含有する７０ｍＭ
） ！Ｊエタノールアミン緩衝液中で測定したところ
、１３．８ ｕｎｉ ｔ／ｆ乾燥ゲルであった。

一方凍結乾燥処理を行なわない固定化菌体ではアデニレ
ート・キナーゼ活性は全く見られなかった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 所望の酵素が細胞膜に結合した状態で菌体内に内在
   し、力・つ培養し集菌した段階で酵素活性を発現しない
   バクテリアの菌体をアクリルアミドのゲルに包括固定し
   た後、凍結乾燥することによって活性化することを特徴
   とする固定化細胞膜結合酵素を製造する方法。