JPS5840470B2 - ザルコシン酸化酵素の製造法 - Google Patents
ザルコシン酸化酵素の製造法Info
- Publication number
- JPS5840470B2 JPS5840470B2 JP52094432A JP9443277A JPS5840470B2 JP S5840470 B2 JPS5840470 B2 JP S5840470B2 JP 52094432 A JP52094432 A JP 52094432A JP 9443277 A JP9443277 A JP 9443277A JP S5840470 B2 JPS5840470 B2 JP S5840470B2
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- Japan
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- enzyme
- sarcosine oxidase
- sarcosine
- producing
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は栄養培地にアルスロバクタ−
（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ）属に属する細菌を培養
して、ザルコシン酸化酵素（以下ＳＯと略する）を製造
する方法に関するものである。
して、ザルコシン酸化酵素（以下ＳＯと略する）を製造
する方法に関するものである。
ＳＯはザルコシンなグリシン、ホルムアルデヒドおよび
過酸化水素に転換する酵素で、自然界、特に動物臓器中
に存在することが古くより知られている。
過酸化水素に転換する酵素で、自然界、特に動物臓器中
に存在することが古くより知られている。
この酵素はクレアチニンあるいはコリン代謝系に関与し
ており、特に前者の代諸系の他の酵素即ちクレアチニン
アミドヒドロラーゼおよびクレアチンアミジノヒドロラ
ーゼと共役反応せしめて、ホルムアルデヒドあるいは過
酸化水素を生成せしめ、それらを公知方法で定量するこ
とにより、フレアニンあるいはクレアチンを簡便かつ特
異的に定量することが可能となるため従来の非特異的な
化学的定量法に代わるものとして臨床診断分野での有用
性が極めて高まっている。
ており、特に前者の代諸系の他の酵素即ちクレアチニン
アミドヒドロラーゼおよびクレアチンアミジノヒドロラ
ーゼと共役反応せしめて、ホルムアルデヒドあるいは過
酸化水素を生成せしめ、それらを公知方法で定量するこ
とにより、フレアニンあるいはクレアチンを簡便かつ特
異的に定量することが可能となるため従来の非特異的な
化学的定量法に代わるものとして臨床診断分野での有用
性が極めて高まっている。
多くの微生物がザルコシンを代謝することが出来るカ、
ザルコシンをグリシン、ホルムアルデヒドおよび過酸化
水素に転換するＳＯの酵素系については、現在まで、コ
リネバクテリウム （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属についてのみ報
告がなされているにすぎない（昭和５２年度日本農芸化
学会講演要旨集８６頁）。
ザルコシンをグリシン、ホルムアルデヒドおよび過酸化
水素に転換するＳＯの酵素系については、現在まで、コ
リネバクテリウム （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属についてのみ報
告がなされているにすぎない（昭和５２年度日本農芸化
学会講演要旨集８６頁）。
そこで本発明者等はＳＯ生産能を有する微生物を広く検
索し、その菌株の中から、アルスロバクタ−属に属する
細菌が強力な、ＳＯ活性を有することを認め、車両を液
体培養し、その培養物から抽出、精製することにより、
効率よく、高純度かつ極めて安定なＳＯを製造する方法
を確立したのである。
索し、その菌株の中から、アルスロバクタ−属に属する
細菌が強力な、ＳＯ活性を有することを認め、車両を液
体培養し、その培養物から抽出、精製することにより、
効率よく、高純度かつ極めて安定なＳＯを製造する方法
を確立したのである。
すなわち本発明はアルスロバクタ−属に属し、ザルコシ
ン酸化酵素生産能を有する微生物を栄養培地に培養し、
培養物よりザルコシン酸化酵素を採取することを特徴と
するザルコシン酸化酵素の製造法である。
ン酸化酵素生産能を有する微生物を栄養培地に培養し、
培養物よりザルコシン酸化酵素を採取することを特徴と
するザルコシン酸化酵素の製造法である。
本発明で使用される菌株としては、アルスロバクタ−属
に属する菌株が使用されるが、代表的な菌株としてはア
ルスロバクタ−・ウレアファシェンス■ＦＯ１２１４０
が使用される。
に属する菌株が使用されるが、代表的な菌株としてはア
ルスロバクタ−・ウレアファシェンス■ＦＯ１２１４０
が使用される。
なお上記菌株のＩＦＯ番号は財団法人発酵研究所（Ｉｎ
５ｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
。
５ｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
。
０ｓａｋａ１Ｊａｐａｎ）の保存菌であることを示して
いる。
いる。
車両は栄養培地、好ましくは酵素生産能を高めるために
コリンを添加した培地で液体培養することにより、ＳＯ
を菌体中に生産蓄積するので、公知の方法で抽出、精製
、乾燥することにより、酵素粉末を得ることが出来る。
コリンを添加した培地で液体培養することにより、ＳＯ
を菌体中に生産蓄積するので、公知の方法で抽出、精製
、乾燥することにより、酵素粉末を得ることが出来る。
さらに具体的に説明すると、車両を適当な栄養培地、例
えば適当な糖質、窒素源、無機塩類と酵素生産能を高め
るためにコリンおよび有機促進物質を含む培地で培養し
、ＳＯを菌体中に蓄積せしめるのであるが、ここで糖質
にはグルコース、シュクロースなどの単糖類、三糖類が
使用出来る。
えば適当な糖質、窒素源、無機塩類と酵素生産能を高め
るためにコリンおよび有機促進物質を含む培地で培養し
、ＳＯを菌体中に蓄積せしめるのであるが、ここで糖質
にはグルコース、シュクロースなどの単糖類、三糖類が
使用出来る。
窒素源には、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーン
スチープリカーなどの有機窒素源が有効である。
スチープリカーなどの有機窒素源が有効である。
無機塩類としては、リン酸アンモニウム、リン酸２カリ
ウム、硫酸マグネシウムなどが用いられる。
ウム、硫酸マグネシウムなどが用いられる。
有機促進物質として、酵母エキスやペプトン、肉エキス
、コーンスチープリカーなどが良い。
、コーンスチープリカーなどが良い。
培地のｐＨは中性付近とし、通気攪拌などの好気的培養
を３０℃前後で１〜２日間行なう。
を３０℃前後で１〜２日間行なう。
上記の方法で得られたＳＯを含む菌体を濾過または遠心
分離によって分別し、適当な緩衝液に懸濁後、磨砕また
は超音波処理で酵素を抽出する。
分離によって分別し、適当な緩衝液に懸濁後、磨砕また
は超音波処理で酵素を抽出する。
その抽出液から不溶物を濾過または遠心分離によって分
別して後、得られる濾液または上清液から、硫酸アンモ
ニウム塩析あるいはアセトン、アルコール等を用いる溶
媒沈澱などの公知の方法で酵素標品を得る。
別して後、得られる濾液または上清液から、硫酸アンモ
ニウム塩析あるいはアセトン、アルコール等を用いる溶
媒沈澱などの公知の方法で酵素標品を得る。
さらに高度に精製された酵素標品を得るには、イオン交
換を応用した吸着溶出法およびゲル濾過法などを用いれ
ばよい。
換を応用した吸着溶出法およびゲル濾過法などを用いれ
ばよい。
本発明で得られる酵素は図面に示す如く、中性付近に最
適のｐＨ値を有しく第１図参照）、最適温度は３５℃付
近である（第２図参照）。
適のｐＨ値を有しく第１図参照）、最適温度は３５℃付
近である（第２図参照）。
ｐＨ安定性に関しては、ｐＨ６，０から９．０までの範
囲で安定で（第３図参照）、熱安定性に関しては３０℃
まではほぼ安定であるが、それ以上になると次第にその
活性を失う（第４図参照）。
囲で安定で（第３図参照）、熱安定性に関しては３０℃
まではほぼ安定であるが、それ以上になると次第にその
活性を失う（第４図参照）。
本酵素の活性は、ザルコシンに作用せしめ、生じる過酸
化水素を測定することにより、測定出来る。
化水素を測定することにより、測定出来る。
即ち生成する過酸化水素をＯ−アミノフェノールの存在
下でペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）で分解し、同時にＯ−
アミノフェノールを定量的に酸化せしめ、生成する色素
量を４８０ｎｍで比色定量することによりＳＯの酵素力
価を求める。
下でペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）で分解し、同時にＯ−
アミノフェノールを定量的に酸化せしめ、生成する色素
量を４８０ｎｍで比色定量することによりＳＯの酵素力
価を求める。
酵素反応液の組成および反応条件は以下の通りである。
（１） 反応液の組成
３７℃、１５分間反応する。
反応停止はＩＮ塩酸０．５ｒｒｌＥ添加で行ない、生成
した色素を４８０ｎｍで比色定量する。
した色素を４８０ｎｍで比色定量する。
（３） 酵素力価
酵素力価の表示は１分間に１μモルのザルコシンを分解
する酵素量を１単位とする。
する酵素量を１単位とする。
次に本発明を実施例を用いて説明する。
実施例 １
塩化コリン１％、ペプトン０．２％、酵母エキス０．１
％、硫酸マグネシウム（７水塩）０．１％、Ｋ２ＨＰＯ
４０，１％、ｐＨ７，２からなる培地を５０”宛５００
ｍｌ容坂ロコルベン１０本に分注し、１２０℃、１５
分間加熱殺菌後、アルスロバクタ−・ウレアファシェン
スＩＦＯ１２１４０を接種し、３０℃で４０時間、振盪
培養した。
％、硫酸マグネシウム（７水塩）０．１％、Ｋ２ＨＰＯ
４０，１％、ｐＨ７，２からなる培地を５０”宛５００
ｍｌ容坂ロコルベン１０本に分注し、１２０℃、１５
分間加熱殺菌後、アルスロバクタ−・ウレアファシェン
スＩＦＯ１２１４０を接種し、３０℃で４０時間、振盪
培養した。
培養終了後、各コルベンより培養液を集め、遠心分離で
菌体を分別し、湿菌体１５Ｐを得た。
菌体を分別し、湿菌体１５Ｐを得た。
これを７５ｍ１の０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０
）に懸濁後、超音波処理にてＳＯを抽出し、遠心分離に
よって不溶物の除去を行ない、得られた上澄液に７０％
飽和硫酸アンモニウムを加え、ＳＯを沈澱せしめた。
）に懸濁後、超音波処理にてＳＯを抽出し、遠心分離に
よって不溶物の除去を行ない、得られた上澄液に７０％
飽和硫酸アンモニウムを加え、ＳＯを沈澱せしめた。
塩析物を遠心分離で集め、２０ｍ１の０．０２Ｍリン酸
緩衝酸（ｐＨ７，０）に溶解し、０．００２Ｍリン酸緩
衝液で緩衝化したセファデックスＧ２５を充填したカラ
ム（径４．５（Ｘ、長さ６０ｃＩｒＬ）に通じ脱塩を行
ない、活性区分を集めた。
緩衝酸（ｐＨ７，０）に溶解し、０．００２Ｍリン酸緩
衝液で緩衝化したセファデックスＧ２５を充填したカラ
ム（径４．５（Ｘ、長さ６０ｃＩｒＬ）に通じ脱塩を行
ない、活性区分を集めた。
得られた脱塩酵素液を凍結乾燥した結果、０．１３単位
／■のＳＯ粉末０５グを得た。
／■のＳＯ粉末０５グを得た。
実施例 ２
実施例１と同様の操作で得られた脱塩酵素液を次いで予
め０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化した
ＤＥＡＥ−セルロースカラム（径４（１；７７２、長さ
３０ｃｍ）に通して、ＳＯを吸着させ、同緩衝液で洗浄
した後、同緩衝液と０．５Ｍの食塩を溶解した同緩衝液
とで濃度勾配を作り、除々に食塩濃度を上げなからＳＯ
を溶出させた。
め０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化した
ＤＥＡＥ−セルロースカラム（径４（１；７７２、長さ
３０ｃｍ）に通して、ＳＯを吸着させ、同緩衝液で洗浄
した後、同緩衝液と０．５Ｍの食塩を溶解した同緩衝液
とで濃度勾配を作り、除々に食塩濃度を上げなからＳＯ
を溶出させた。
溶出されたＳＯ活性区分を集め、７０％飽和硫酸アンモ
ニウムによる塩析濃縮後、０．０２Ｍ！Ｊン酸緩衝液で
緩衝化したセファデックスＧ−２００を通して分子篩を
行ない、最終的に得られるセファデックスＧ２００の分
子篩液は、次いで凍結乾燥して１５■のＳＯ標品を得た
。
ニウムによる塩析濃縮後、０．０２Ｍ！Ｊン酸緩衝液で
緩衝化したセファデックスＧ−２００を通して分子篩を
行ない、最終的に得られるセファデックスＧ２００の分
子篩液は、次いで凍結乾燥して１５■のＳＯ標品を得た
。
このものの比活性は１．６単位／１ｒｌＩ？であり、抽
出液からの収率は３７％であった。
出液からの収率は３７％であった。
第１図は本発明により得られる酵素のｐＨ活性曲線を示
す。 第２図は本発明により得られる酵素の温度活性曲線を示
す。 第３図は本発明により得られる酵素のｐＨ安定曲線を示
す。 第４図は本発明により得られる酵素の熱安定曲線を示す
。
す。 第２図は本発明により得られる酵素の温度活性曲線を示
す。 第３図は本発明により得られる酵素のｐＨ安定曲線を示
す。 第４図は本発明により得られる酵素の熱安定曲線を示す
。
Claims (1)
- １ アルスロバクタ−属に属し、ザルコシン酸化酵素生
産能を有する微生物を栄養培地に培養し、培養物よりザ
ルコシン酸化酵素を採取することを特徴とするザルコシ
ン酸化酵素の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP52094432A JPS5840470B2 (ja) | 1977-08-05 | 1977-08-05 | ザルコシン酸化酵素の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP52094432A JPS5840470B2 (ja) | 1977-08-05 | 1977-08-05 | ザルコシン酸化酵素の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5428893A JPS5428893A (en) | 1979-03-03 |
| JPS5840470B2 true JPS5840470B2 (ja) | 1983-09-06 |
Family
ID=14110071
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP52094432A Expired JPS5840470B2 (ja) | 1977-08-05 | 1977-08-05 | ザルコシン酸化酵素の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5840470B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5881133U (ja) * | 1981-11-30 | 1983-06-01 | 三菱農機株式会社 | 移動農機のブレ−キ装置 |
| JPS603176U (ja) * | 1983-06-21 | 1985-01-11 | 株式会社クボタ | 乗用田植機の走行用操作構造 |
| JPS61146128U (ja) * | 1985-02-28 | 1986-09-09 |
-
1977
- 1977-08-05 JP JP52094432A patent/JPS5840470B2/ja not_active Expired
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5881133U (ja) * | 1981-11-30 | 1983-06-01 | 三菱農機株式会社 | 移動農機のブレ−キ装置 |
| JPS603176U (ja) * | 1983-06-21 | 1985-01-11 | 株式会社クボタ | 乗用田植機の走行用操作構造 |
| JPS61146128U (ja) * | 1985-02-28 | 1986-09-09 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5428893A (en) | 1979-03-03 |
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