JPS5929652A - スパガリンまたはその誘導体の精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般式 （式中Ｒは水素原子、ヒドロキシル基、炭素数１ないし
１０個の脂肪族アシルオキシ基を、ｎは４または６の整
数を示す。） で表わされるスパガリン（Ｓｐｅｒｇｕａｊｉｎ）　”
！、　タハ、その誘導体の酸塩の精製法に関し、より詳
しくは、スパガリンまたはその誘導体の酸塩を、充填剤
としてカルボキシル基をもつ不溶性担体を用いるカラム
クロマトグラフィーで精製するにあたり、溶離液として
無機塩を含有する含水親水性溶媒を用いることを特徴と
する、一般式（Ｉ）で表わされるスパガリンまたはその
誘導体ノ酸塩の精製法に関する。

一般式（Ｉ）の化合物においてＲがヒドロキシル基、ｎ
が４の物質は、スパガリンと称され、立体配置が（１１
日、１５Ｓ）のものは悔涙らによって微生物の培養Ｆ液
より塩酸塩として単離された化合物で、非毒性の制癌剤
として期待されている（Ｊ、ＡｎｔｉｂｉｏＬｉｃｓ　
３４　：　Ｉ　６１９−１６２７　）。

捷た、Ｃ］　ＩＨ，１５Ｓ　）’−’スパガリンを除く
一般式（Ｔ）ノ化合物ノ酸塩モ（Ｉ　］（−）、　１５
８）　−、＜パガリンと同様の制癌作用を有する新規物
質である（特厚Ｅｌ”５６−６９３４０号および特願昭
５６−１５９５０３号参照）。

従来、一般式（Ｉ）のスパガリンの酸塩の精製は、例え
ば粗製品を、充填剤としてＣＭ−セフアゾ■ ノクス　のナトリウム塩を用いるカラムクロマトグラフ
ィーにおいて、溶離液として塩化ナトリウムを含む水を
用いて溶出し、スパガリンの酸塩を含むフラクションを
減圧で濃縮乾固し、ついで乾固品を少量のメタノールに
溶かして不溶の塩化ナトリウムをＰ別し、Ｆ液をセフア
ゾ■ ソクス　Ｔｊ（−２０にかけ、メタノールで溶出して残
存する塩化ナトリウムを除去し、スパガリンの酸塩を含
むフラクションを減圧乾固することにより行われていた
（特開昭５７−４８９５７号公報参照）。

しかしながら、従来の精製法即ちＣＭ−セフ■ アデノクス　に吸着させたスパガリンの溶離液として塩
化ナトリウムを含む水を使用する方法では高純度のスパ
ガリンの酸塩を得ることはできなかった。

丑だ、スパガリンを除く一般式（Ｉ）の化合物の酸塩を
上記の方法により精製してもスパガリンと同様に高純度
のものを得ることはできなかった。

一般的に優れた薬理作用を有しているといえども、純度
の不良な化合物は医薬品にはなり得ない。医薬品として
開発するためには、純度の低い目的物を精製して高純度
にする必要があり、このことは極めて重要なことである
。

そこで本発明者らは高純度のスパガリンまたはその誘導
体の酸塩を得るための精製法を開発するために、１ず上
記精製法では高純度のものを得ることができない原因に
ついて種々検討をおこなった。その結果、その原因は、
一般式（Ｉｌのスパガリンまたはその誘導体の酸塩は、
水中において次式で示す分子内可逆反応により徐々に分
解して、 Ｈ２ＮＣＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＨＣＨ２ＣＯＮＨＣＨＣＯ
ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ２１１１ ＮＨＲ０Ｈ ｆｉ＋ （２） （式中Ｒは前記に同じである。） 一般式（印のω−グアニジノ脂肪酸アミドの酸塩と一般
式（ｍ）のＮ（：４−（３−アミノプロピル）アミノブ
チル］　−２，２−ジヒドロキシエタンアミドの酸塩に
なるため、１だ、（１１←ｌ、　１５Ｓ）−スパガリン
酸塩は細菌の培養Ｐ液から分離するため、一般式（２）
の化合物の酸塩および一般式（ｍ）の化合物の酸塩の他
に多くの不純物を含んでいるためであることが判明した
。

以上の知見をもとに本発明者らはスパガリンまたはその
誘導体の酸塩の精製法について鋭意検討した結果、充填
剤としてカルボキシル基をもつ不溶性担体を用いたカラ
ムクロマトグラフ５− イーで精製するにあたり、溶離液として無機塩を含有す
る含水親水性有機溶媒を用いることにより、高純度のス
パガリンまたはその誘導体の酸塩が得られることを発見
し、本発明を完成するに至った。

本発明をさらに詳細に説明すると、本発明の原料である
一般式（Ｉｌのスパガリンまたはその誘導体の酸塩にお
いて、Ｒは水素原子、ヒドロキシル基、ホルミルオキシ
基、アセチルオキシ基、プロピオニルオキシ基、ｎ−ブ
タノイルオキシ基、イソブタノイルオキシ基、およびオ
クタノイルオキシ基のような炭素数１ないし１０個の脂
肪族アシルオキシ基であり、ｎは４″！、たは６の整数
である。

酸塩における酸としては、無機酸、有機酸のいずれでも
よく、無機酸としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン
酸、ホウ酸などがあげられ、有機酸としては、酢酸、プ
ロピオン酸のヨウナ低級脂肪酸、コハク酸、フマル酸、
マレイン酸、酒石酸、クエン酸のような多塩基性酸、ベ
ンゼ６− ンスルホン酸、トルエンスルホン酸、メクンスルボン酸
、エタンスルホン酸のようなスルホン酸などがあげられ
る。

代表的な具体例としては、スパガリン、１５−０−ポル
ミルスパガリン、１５−Ｏ−アセチルスパガリン、１５
−０−フロピオニルスハカリン、１５−０−ブタノイル
スパガリン、１５−０−オクタノイルスパガリン、１５
−デオキシスパガリンおよびＮ−（４−（３−アミノプ
ロピル）アミノブチル］−２−（９−グアニジノノナン
アミド）−２−ヒドロキシエタンアミドなどの塩酸塩、
硫酸塩などがあげられる。

本発明の精製は、一般式（Ｉｌのスパガリンまたはその
誘導体の酸塩の粗製品をカルボキシル基をもつ不溶性担
体な充填したカラムにかけ、溶離剤として無機塩を含有
する含水親水性有機溶媒で溶出し、目的物を含むフラク
ションを集めることによって行われる。

一般式（Ｉ）の化合物の酸塩の粗製品としては、特に制
限はないが、スパガリンの場合は培養沖■ 液について、既知法によりＩＴ（Ｃ−５０のカラムクロ
マトグラフィーを行って得られる、あるいは、従来法で
の水のみを溶媒とするＣＭ−セファデックスカラムクロ
マトグラフィーにより単離されるもの等が用いられ、ス
パガリン誘導体の場合は、反応混合物を減圧下で濃縮し
て得られるもの等が用いられる。

粗製品の純度としては特に制限はないが３０−９５％が
好ましい。

カルボキシル基をもつ不溶性担体としては、■ 特に制限はないが、ＣＭ−セファデックス、カルボキシ
メチルセルロースなどが好ましい。

溶離液に含まれる無機塩としては、特に制限はないが、
ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属の塩化物、臭
化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などがあげられ、塩化
ナトリウム、塩化カリウムなどが好ましい。

溶離液として用いる親水性有機溶媒としては、沸点が１
２０Ｃ以下、好１しくは９０Ｃ以下の水と混合する有機
溶媒であれば特に制限はないが、メタノーノペエタノー
ル、ｎ−プロパツール、イソプロパツールなどの低級ア
ルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケト
ン類、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどの環状エー
テル類などがあげられ、メタノール、エタノールなどが
好ましい。

親水性有機溶媒の含水率としては、含有される無機塩の
種類と量により異なるが、１０ないし９０％であり、特
に３０〜６０％が好ましい。

溶出の方法としては、溶離液中の無機塩の濃度を連続的
に変化させるグラジェント法、はじめに無機塩が低濃度
の溶離液を流して大部分の不純物を溶出させ、つぎに高
濃度の溶離液を流して目的物を溶出させるステップワイ
ズ法、あるいは一定濃度の無機塩を含む溶離液で行う方
法などがあり、どの方法で行ってもよいが、操作がしや
すく、かつ高純度の目的物を得やすいステップワイズ法
が好ましい。

溶離液中の無機塩の濃度としては、溶媒に溶ける範囲内
であれば特に制限はないが、グラジ９− ヱント法では０から１モル濃度程度まで変化させるのが
好１しく、ステップワイズ法では、はじめに０．２ない
し０．５モル濃度の溶離液を流し、つぎに０．７ないし
１．５モル濃度の溶離液を流すのが好ましい。

精製時の温度は、一般式（Ｉｌのスパガリンまたはその
誘導体の酸塩が熱に不安定なため、室温以下で行うのが
好ましく、特に１０Ｃ以下で行うのが好ましい。

一般式（Ｉ）で表わされるスパガリンまたはその誘導体
の酸塩の単離は公知の方法によって行われる。例えば、
本発明のカラムクロマトグラフィーを行った後、目的物
を含むフラクションを４０Ｃ以下で乾固まで濃縮するか
、または溶出液中の有機溶媒を減圧濃縮し、残った水溶
液を凍結乾燥する。つぎに得られた目的物と無機塩の混
合物にメタノールを加えて塩を炉別し、炉■ 液をさらにセファデックス　ＬＨ−２０を充填したカラ
ムにかけ、メタノールで溶出し、目的物を含むフラクシ
ョンを減圧濃縮する。さらに残＝１０− 渣を少量の水に溶かし、これを凍結乾燥することによっ
て単離することができる。

以上述べたごとく、溶離液として含水親水性有機溶媒を
用いることにより、従来の水を溶媒として用いる方法に
比べて不純物の分離状態を著しく改善することができる
。

また、カラムクロマトグラフィーの後、目的物を含むフ
ラクションを減圧濃縮または凍結乾燥して溶媒を除去す
るにあたり、従来の水のみを溶媒として用いる場合に比
べて含水親水性有機溶媒を用いる場合は、濃縮がはるか
に低温、かつ短時間で行うことができるため、水溶液中
で不安定な一般式（Ｉ）のスパガリンまたはその誘導体
の酸塩の分解を抑えることができる。したがって、本発
明により従来法に比べ、より高純度の目的物をより高収
率で得られるようになった。

なお本発明の原料である粗製品スパガリンは特開昭５７
−４８９５７号に従って製造した。さらにスパガリンを
除く本発明の原料である一般式（Ｉ）で表わされる化合
物は、特願昭５６−６９３４０号および特願昭５６−１
５９５０３号に従って合成した。すなわち、一般式和の
ω−グアニジノ脂肪酸アミド誘導体の酸塩と一般式％式
％ の酸塩とを酸触媒の存在下に反応させることにより製造
した。

一般式但のω−グアニジノ脂肪酸アミドのうち、Ｒが水
素および水酸基である化合物は既知である。Ｒが脂肪族
アシルオキシ基である化合物は、Ｒが水酸基である対応
する化合物をアシル化することにより得ることができる
。

式（ｍ）の化合物は既知である。

つぎに実施例により本発明を具体的に説明する。なお、
原料および精製品などの純度は、逆相高速液体クロマト
グラフィーにおいて、ピークの面積比から算出した。ま
た本実施例においては次の略号を使用する。

■ ＣＭ−セファデックス：ＣＭ−セファデック■ スＣ−２５（ナトリウム型〕 １（ＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー実施例１゜ ■ ＣＭ−セファデックスを予め０．３Ｍになるように塩化
ナトリウムを６０％含水メタノール（Ｖ／Ｖ）に溶かし
た溶液で膨潤させ、その２００ｍ１をカラムに充填し調
製する。培養Ｐ液より通常の方法で分離、精製された純
度９２１％のスノくガリン塩酸塩２．０１を６０％含水
メタノール（ｖ／ｖ）　２０　ｍｌに溶解し、この溶液
を上で調製したカラムに注入する。ついで、上に述べた
と同じ組成の塩化ナトリウムの含水メタノール溶液２．
１４を流して不純物を溶出し、１．０　Ｍになるように
塩化ナトリウムを６０％含水メタノール（ｖ／ｖ）に溶
かした溶液６００　ｍ、ｌを流してスパガリンを含む溶
出部分を分取する。

この溶出液を減圧濃縮してメタノールを留去し残留液を
凍結乾燥する。ついで、凍結乾燥物にメタノールを加え
、不溶物を炉別後Ｐ液を室温で減圧濃縮する。

１３− ■ さらにメタノールで膨潤させたセアデックスＬＨ−２０
，２００ｒｎｌＪよりなるカラムを調製する。

このカラムに上の濃縮残渣を少量のメタノールに溶かし
た溶液を注入する。ついで、メタノールで溶出し、目的
物を含む溶出部分を分取し、減圧濃縮してメタノールを
留去する。残留固体を少量の水に溶かし、凍結乾燥する
ことにより純度９８１係の精製スパガリン塩酸塩１．６
７ｇ−（収率８３．５％）を得た。

本方法により精製されたスパガリンのＨＰ　Ｌ　Ｃのク
ロマトグラムを第１図に、又、本実施例で用いた原料を
従来法により再度精製したスパガリンのＨＰＬＣのクロ
マトグラムを第２図に示した。この図から明らかなよう
に従来法による場合はかなりの不純物の存在が認められ
るのに対し、本発明方法による場合は不純物が消失およ
び大巾に減少している。従って、本発明方法によると不
純物のほとんどないスパガリンを得ることができる。

＝１４− 実施例２ ■ ＣＭ−セファデックス　を予め０．３Ｍになるように塩
化ナトリウムを５０％含水エタノール（ｖ／ｖ　）に溶
かした溶液で膨潤させ、その１．、ｅ３をカラムに充填
し調製する。

純度９１．８％のスパガリン塩酸塩１４８ψを上に述べ
たと同じ組成の塩化ナトリウム含水エタノール溶液１．
５０　ｍｌに溶解し、上で調製したカラムに注入する。

ついで、上に述べたと同じ組成の塩化ナトリウム含水エ
タノール溶液５．６．８を流して含捷れる不純物を溶出
させ、つぎに］、ＯＭになるように塩化ナトリウムを５
０％含水エタノール（Ｖ／Ｖ　）に溶かした溶液１．７
沼を流して目的物を含む溶出部分を分取する。

以下実施例１と同様に処理することにより、純度９８．
０％の精製スパガリン塩酸塩１０．９ｐ（収率７３，６
％）を得た。

実施例３゜ （Ｖ／Ｖ　）で膨潤させ、この１００ｍ１をカラムに充
填し調製する。

純度９４９％のスパガリン塩酸塩１．０１を上に述べた
と同じ含水メタノール１０ｍ１に溶解し、カラムに注入
する。６０％含水メタノールＣｖ／ｖ　）５００　ｍｌ
と０．８　Ｍになるように塩化ナトリウムを６０％含水
メタノール（ｖ／ｖ　）に溶がした溶液５００ｍ１を用
い、連続的に塩化す）　ＩＪウムの濃度を上昇させるグ
ラジェント法により溶出を行い、目的物を含む溶出部分
を分取する。

以下実施例１と同様に処理することにより、純度９８．
０％の精製スパガリン塩酸塩０．７０ＰＣ収率７００％
）を得た。

実施例４゜ ■ ＣＭ−セファデックス　を０．３Ｍになるように塩化ナ
トリウムを６０％含水メタノール（Ｖ／Ｖ）に溶かした
溶液で膨潤させ、この２０ｍ１ｌをカラムに充填し調製
する。

３−アセトキシ−７−グアニジノへブタンアミド塩酸塩
０．３１％とＮ−（４−（３−アミノプロピル）アミノ
ブチル］　−２，２−ジヒドロキシエタンアミド２塩酸
塩０．３２？を縮合させて得られる１５−０−アセチル
スパガリン塩酸塩を含有する反応混合物０．７５ｙ−（
目的物の含有量０．２１．Ｐ）を、上に述べたと同じ組
成の塩化す）　ＩＪウム含水メタノール溶液２　ｍｌｌ
に溶解し、これを上で調製したカラムに注入する。つい
で、上に述べたと同じ組成の塩化ナトリウム含水メタノ
ール溶液により溶出を行い、目的物を含む溶出部分を分
取する。

以下実施例１と同様に処理することにより、純度９８．
７％の精製１５−０−アセチルスパガリン塩酸塩０．１
５９−（収率７５．０％〕を得た。

】５−０−プロピオニルスパガリン粗、製品の精製も同
様に実施することができる。

実施例５゜ ７−グアニジノへブタン酸アミド塩酸塩２．２０１とＮ
−ｒ：４−（３−アミノプロピル〕アミノブチル〕−２
，２−ジヒドロキシエタンアミド・２塩酸塩２．９０５
１−を縮合させて得られる１５−デオキシスパガリン塩
酸塩を含有する反応混合物６．１０ＰＣ目的物の含有量
２．７５ｆｉ’）をＣＭ−セフアゾ１７− ■ ツクスフ　００　ｍｌよりなるカラムを用いて実施例１
と同様な方法でカラムクロマトグラフィーおよび後処理
を行うことにより、純度９８．０％の精製１５−デオキ
シスパガリン塩酸塩１．８０Ｐ（回収率６５．５％）を
得た。

実施例６゜ ３−ヒドロキシ−７−グアニジノへブタンアミド塩酸塩
０．２４．７とＮ−［４−（３−アミノプロピル）アミ
ノブチル］　−２，２−ジヒドロキシエタンアミド２塩
酸塩０１２９１を縮合させて得られる１１（至）−スパ
ガリン塩酸塩を含有する反応混合物０．６０Ｐ（目的物
の含有量０．２１５’）をＣＭ−七〇 ファデックス　１００ｍ１よりなるカラムを用いて実施
例１と同様な方法でカラムクロマトグラフィーおよび後
処理を行うことにより、純度９８５％の精製１１（至）
−スパガリン０．１４？（回収率６７％）を得た。

参考例１１５−デオキシスパガリン（Ｎ−（４−（３−
アミノプロピル）アミノブチ ル、ｌ−２−（４−グアニジノプタンア１８− ミド）−２−ヒドロキシエタンアミド）の合成 ４−グアニジツブクンアミド塩酸塩３６ｏｍ９（２ミリ
モル〕、Ｎ−（４−（３−アミノプロピル）アミノブチ
ル、１−２．２−ジヒドロキシエタンアミド塩酸塩７０
１ｍｇ（２，４ミリモル）、グルタル酸２６４７＋１＆
（２ミリモル）と水０．３６　ｒｎｌを混合し、６０ｒ
で１日反応させ、１５−デオキシスパガリンを含有する
反応混合物を得た。

参考例２．１５−０−アセチルスパガリンの合成（Ｓ）
−７−グアニジノ−３−ヒドロキシヘプタンアミド塩酸
塩８１３ｍ９にピリジン７　ｍｌおよび無水酢酸７　ｍ
ｌ、を加え、室温で１夜攪拌した。反応後氷水１００ｍ
１を加え、減圧濃縮し、濃縮液をＣＭ−セファデックス
Ｃ−２５（Ｎａ型）の塔（４５０ｍｌ、径２．５　Ｃｒ
ｎ）にかけ、食塩濃度０．１６〜０．２モルの溶出部を
集め、減圧濃縮乾固した。得られた残渣をメタノール抽
出し、この抽出液をメタノールで膨潤したセフ７デｙ　
クスＬＨ−２０（ｒ）塔（１，５，、ｅ。

径５．６　ｃｍ　）にかけ、メタノールで展開し、脱塩
した。有効画分を集め、減圧乾固して、白色粉末の（Ｓ
）−７−グアニジノ−３−アセトキシへブタンアミドの
塩酸塩７５３ｍｇ（収率７８８％）を得た。

このものの重メタノール中で測定したプロトンＮＭＲ（
ＴＭＳをスタンダードにし、６０　ＭＨｚ　）　（以下
単にＮＭＲ，という。）で１．４〜１．９　（ＣＨ２Ｘ
　３　）、２．００　（Ｃ０ＣＨ２）、２．４９　（Ｃ
Ｊ−７２）、３．１．８　（ＮＣＨ２）５．１．９（Ｃ
Ｈ）に特徴的なシグナルを示した。

この（８１−７−グアニジノ−３−アセトキシヘプクン
アミド塩酸塩３５４　ｍ９、Ｎ−［４，−（３−−アミ
ノプロピル）アミノブチル］　−２，２−ジヒドロキシ
エタンアミド塩酸塩４２９■およびグルタル酸３３３ｍ
ｇを加え、これを水０．５　ｍｌに溶解し、６０Ｃで１
夜反応させ、１５−０−アセチルスパガリンを含有した
反応混合物を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法によって精製されたスパガリン塩
酸塩のＨＰ　Ｌ　Ｃのクロマトグラムである。 第２図は従来法によって精製されたスパガリ（■））、
（２）はスパガリンである。 特許出願人　日本化薬株式会社 ＝２１＝

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式 （式中Ｒは水素原子、ヒドロキシル基、炭素数１ないし
   １０個の脂肪族アシルオキシ基を、ｎは４′！！：たは
   ６の整数を示す。）で表わされるスパガリンまたはその
   誘導体の酸塩を、充填剤としてカルボキシル基をもつ不
   溶性担体な用いるカラムクロマトグラフィーで精製する
   にあたり、溶離液として無機塩を含有する含水親水性有
   機溶媒を用いることを特徴とする、一般式（Ｉ）で表わ
   されるスパガリンまたはその誘導体の酸塩の精製法。