JPS5933228A - 抗腫瘍活性物質ｃｄ−０１とその製法およびその製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はスタフィロコッカス属に属する細菌の一体から
得られる抗腫瘍活性を有する加熱変性デオキシリボ核酸
ＣＤ−０１に関する。

スタフィロコッカス属に属する細菌の宿主介在性の抗腫
瘍活性物質については、細胞壁構築成分等が研究されて
いるが、これらのもののうち、抗腫瘍活性の筒いものけ
副作用も強く、副作用の弱いものは必ずしも抗腫瘍活性
が高くないという欠点がみられる。

先に本発明者らは結核菌から得られる抗腫瘍活性物質に
ついて柿々検討した結果、結核菌を破砕して得られる無
ａｉｌｌ胞抽出液から分離された加熱変性デオキシリボ
核酸が宿主介在性の強力な抗Ｉｌ！ｌ！瘍活性を有し、
かつ毒１生および抗原性が極めて低いことを初めて見い
出し、特許（特願昭５６−２３６６９）を出願した。

さらに、本発明者らはスタフィロコッカス属に属する細
菌の菌体抽出物についても新規な抗腫瘍活性物質を見い
出すべく、結核菌の経験に基づいて抗腫瘍活性物質の検
索を鋭意性なった結果、スタフィロコッカス属の細菌か
ら結核菌の場合に用いたと同様の方法で調製した加熱変
性デオキシリボ核酸も高い抗ｊ匝瘍活性を示し、かつ毒
性が極めて低く、発熱性や抗原性がほとんどないことを
確認し、本発明物質を加熱度１クユデオキシリボ核酸Ｃ
Ｄ−０１と部名して、本発明を完１戊するに至った。

以下、本発明物質を単に加熱変性デオキシリボ核酸、変
性デオキシリボ核酸、デオキシリボ核酸あるいは本物質
と称することが多い。本発明によって得られるデオキシ
リボ核酸は結核菌由来の該物質と同様に宿主介在性の強
い抗１岨瘍活性を有し、その作用はこれまでに知られて
いる！ＩＪｈ物細胞由来のデオキシリボ核酸等の腫瘍細
胞への直接障害作用に基づく抗腫瘍作用（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ　　ν１９．９９７゜１９６５、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　２７．２３４２．１９６７゜Ｐｒｏｃ
ｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａ
ｃａｄｅｍｙ　ｏｆＳｃｉｅｎｃｅ　６１．２０７．１
９６８）　　に比べｉｄるかに強力である。

本発明物質とその製造法およびその宿主介在性の強力な
抗１腫瘍活性は本発明者らによって初めて明らかにされ
たものである。

すなわち本発明は、加熱変性によって抗腫Ｊα活性を有
せしめてなる加熱変性チオキシリボ核酸ＣＤ−０１及び
その塩に関し、更に詳細には、スタフィロコツカス属細
菌より得られる抗腫瘍活性を有する加熱変性デオキシリ
ボ核酸Ｃ１１−０３に関し、そして、その製法及び抗腫
瘍剤に関するものである。

さらに本発明はスタフィロコッカス属細菌破砕物を遠心
分離して得られる核酸画分を加熱することを特徴とする
抗腫瘍活性を有する加熱変性デオキシリボ核酸ＣＤ−０
１の製造法に関するものである。

さらに本発明は核酸画分の分離法として無細胞抽出液に
核煎占Ｃ果剤を加え、得られる沈澱の可溶画分から分離
することを特徴とする抗腫瘍活性を有する加熱変性デオ
キシリボ核［ＣＤ−０１の製造法に関するものである。

さらに本発明は核酸画分の分離法として無細胞抽出液に
核酸凝集剤を加え、得られる沈澱を水または塩類溶液に
対して透析した後加熱し、その上清から分離すること全
特徴とする抗腫瘍活性を有する加熱変性デオキシリボ核
酸ＣＤ−０１の製造法に関するものである。

さらに本発明は、デオキシリポ核１０　Ｊｉ’物をホ・
）８０〜１２０℃に加熱して、抗腫瘍性を治せし５ぬる
ことを特徴とする抗腫瘍活ｉ件を有する加熱変性デオキ
シリボ核酸ＣＤ−０１の製造法である。

さらに本発明は、加熱変性によって抗腫１μ活性ケ有せ
しめてなる加熱変性デオキシリボ核酸ＣＤ−０１を有効
成分とする抗）匣瘍剤である。

本発明に用いられる微生物は、スタフィロコッカス属に
属する細菌であるが、好適なもσ）とし−Ｃロコッカス
アフアーメンタンス（Ｓｔ　ａｐｈｙ　ｔｏｃｏｃｃｕ
ｓａｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）　ＮＣＴＣ−７４９５株な
ど力；挙げられる。

微生物の培養方法や１狗体の破砕方法は、通常の方法に
従ってよい。たとえばスタフィロコッカスアウレウスの
場合はノ１−トインフユージョン培１也を用いて３０℃
程度の温度で１６〜２０時間通気あるいは静置培養する
ことにより良好な培養物が得られ、これを遠心分離また
は濾過して菌体を得ることか出来る。得られた菌体を水
、好ましくは過当な緩衝液と充分混合し、氷冷しながら
ダイノミル（Ｄｙｎｏ　Ｍｉｌｌ　）あるいはフレンチ
（Ｆｒｅｎｃｈ　）プレスなどにより菌体を破砕して破
砕菌体懸濁液を得る。この懸濁液を遠心して無細胞抽出
液を得るが、このときの遠心分離の条件は、未破砕菌体
。

部分的に破砕された菌体、細胞壁画分等を沈滞として除
去出来る通常の遠心力で良く、たとえば５．０００ｘｇ
、１０分間以上遠心してその上清を取得する。

本発明における無細胞抽出液とは、破砕菌体懸濁液から
遠心分離により、未破砕菌体、部分的に破砕された菌体
、細胞壁画分等を出来るだけ除いた両分のことである。

無細胞抽出液から核酸画分を得るには、無細胞抽出液を
直接有機溶剤処理して核酸画分を得る方法（例えばマー
マー（Ｍａｒｍｕｒ）法やフェノール法等、以下直接有
＋＊溶剤法と称する）と無細胞抽出液に核酸凝集剤を加
えて核酸画分を含む沈澱を得る方法が適用可能である。

１げ接有機溶剤法は小祉規侯（通常１１以下）の本発明
物質を得るのに適した方法であり、得られる核酸画分（
以下ＣＤ核酸画分と称する）に１、通常抗原性を有する
多糖や蛋白等の不純物を含崩するので密度勾配遠心法等
により不純物を出来る／どけ除去した後書られる稍裏デ
オキシリボ核順画分を加熱処理して本発明物質を侍るか
、あるいはＣＤ核酸画分をまず加熱処理した後遠心法や
沈澱法叫によって不純物を除去して本発明物質をイＩＩ
る。

Ｃ−Ｄ核酸画分や精製デオキシリボ核酸画分の加熱処理
条件は、後述の調製法と共通するので、後に詳しく述べ
る。

本発明における加熱の目的は本発明物質の分子量分布を
調節し、２本鎖構造を１本鎖構造にかえるとともに不純
物の除去効率を高め、〜製剤化を容易にし、片時の溶解
性を高め、抗腫瘍活性が高く、かつ、毒性、副作用の低
い本発明物質を得ることである。

無料１泡抽出液に核岐凝集剤を加えて核酸画分を沈澱さ
せる方法は、核酸画分を濃縮出来るので大ｉｌｔ規模の
本発明物質を得るのに適した方法である。

この方法において用いられる核酸凝集剤は通常の核酸；
疑集剤のいずれも使用可能であるが、後の工程で１＋１
いた凝ｌｂ剤を簡便に除去出来るという意味で、低分子
・ｇ（東剤が好ましい。その好適な例としては、塩化カ
ルシウム、塩化マンガン、塩化マグネシウム、硫ｊ抜ア
ルミニウム等の多価金属陽イオンあるいはストレプトマ
イシン、カナマイシン等の水溶性塩基性抗生物質または
その塩等が挙げられる。核酸凝１技剤の使用量はその種
類により適宜選択出来るが、たとえば多価金属陽イオン
では０．１〜１０％、好互しくは０．１〜３％、抗生物
質では０．（月〜ｌ　０％、好ましくは０．１〜１％を
抽出液に対して使用するのが適当である。

操作としては無細胞抽出液に核酸凝集剤を加え、生成し
た沈澱を遠心あるいは渥過等の方法にょシ分離して核酸
画分を含む懸濁液を得る。この懸濁液より核酸凝集剤を
除くには透析が適当である。

その際に使用する水性溶媒は、核酸凝集剤の除去効率を
高めるために適当なイオン強度を有する、ｐＨが中性附
近の緩衝液が好ゴトシい。／ことえば好適なものとして
は０．１〜］ＭＮａＣυ含有リン酸Ｉ慢衝液、　　０．
１〜］　ＭＫＣｆｆ　り、７−　ン目＆緩衝液、０．１
〜ＩＭＮａＣＱ含有炭酸す）　ｌ）ラム緩衝（イ飢　０
．１〜］ＭＮａＣ，［！含有トリス塩酸緩衝液等が挙け
られる。

核酸画分を含む懸濁液を含塩ぼり両液に対して透析した
後便すればさらに水に対して透析して塩類を除く。透析
済みの核酸画分を含む懸濁液を以下ＣＮ−１画分と称す
る。ＣＮ−１画分を寿る操作ｌは、全て冷却下で行ない
、核酸画分の不必要な分ｊｌ献変性を防止する。冷却温
度は０ないし１０℃が好ましい。

ＣＮ−１１６分から本発明物質を４Ｕるには２つの方法
が可能である。１つの方法ｉｄ：、ＣＮ−１画分から核
酸画分を分離した後、得られた核酸両分を加熱して本発
明物質を得る方法であり、もち一つの方法はＣＮ−１画
分を加熱処理した後本発明物質を分離する方法である。

前者の方法においては、ます、ＣＮ−１画分すな有物濃
度と水性溶媒のｐＨや塩譲度等を調節した後、節心分離
−または、ｐ過等の方法によりＣＮ−１画分からデオキ
シリポ核ｉソを含む可溶画分を分離する。

この可溶画分から沈澱法あるいはカラムクロマト法ある
いは電気泳動法さらに要すればリボヌクレアーゼ処理法
等の方法によりデオキシリボ核酸画分を分離して、加熱
処理すれば本発明物質が得られる。ＣＮ−１画分から可
溶画分を分離する際の好適なＣＮ−１画分の濃度は１〜
１５ｍｆ／ｍｆｉである。

水性溶媒のｐＨは中性附近が好ましく、通常酸あるいは
塩基、あるいは緩衝液でｐＨ５から８の範囲に調節する
。水性溶媒のイオン強度は、遠心分離等の際の沈澱の除
去効率に影響を与え、通常０．１以上が好ましく、要す
れば食塩あるいは塩化カリウム等を加えてイオン強度を
調節しても良い。

このようにＡ節したＣＮ−１画分を通常２０，０００ｘ
２で５分間以上遠心分離すると、核酸画分を含む清澄な
可溶画分がその上清として得られる。この上清からスト
レプトマイシンあるいは塩化マンガンあるいはセチルト
リメチルアンモニウムプロミド等を用いる沈澱法あるい
はセファローズ等を用いるカラムクロマト法あるいは塩
化ビニル−酢酸ビニル共重合体等を用いる電気泳動法等
によりデオキシリボ核酸画分を分離することが出来る。

以上の操作は全て０〜１０℃で行うのが好−ましい。

このようにして得られたデオキシリボ核酸画分をさらに
リボヌクレアーゼ処理後加熱処理するかあるいは加熱処
理後リボヌクレアーセ処理すれば精製された本発明物質
が得られるが、加熱条件は後者の方法と共通するので後
に詳述する。

後者の方法では、まずＣＮ−１画分を加熱するが、この
加熱操作は核酸画分の適切な変性ケ行なうことおよび不
純物を変性させ以後の本発明物質の分離操作を容易にす
ることを目的とする。加熱条件は後に示すように本発明
物質の抗ｊＩＩＩＬ編活性にも密接に関連しており、適
切な条件範囲が存在する。

加熱の要因としては、加熱時の溶質の濃度、水性溶媒の
種類とｐＨ，イオン強度、加熱温度、加熱口、５゛間が
挙げらｎ、適切な条件範囲は次のとおりである。

溶質の濃度は１〜１５ｍｆ／ｍρが適切でめる。

水・曲溶媒が水あるい（は食塩前の含塩水（イオン強要
が０．１〜０．５）の場合は８０℃ないし１２０℃で５
分間ないし１２０分間、　水性溶媒が緩衝液の場合は緩
衝液のｐＴＩによって大きく影響され、中性附近のｐＨ
では加熱温度は高く、加熱時間も長くし、酸性あるいは
アルカリ性では、加熱温度は低く、加熱時間も短くする
のが好ましい。

例えば水性溶媒が強酸性あるいは強アルカリ性の場合は
、加熱温度を８０〜１２０℃に限定するものではなく、
室温付近でも充分である。また、水性溶媒がアルカリ性
の場合はｐＨ，加熱温度および時間を適宜選択すれば本
発明物質からリボ核ばを除去しうる点で有利な場合もあ
る。

以上のごとく、逸切な加熱条件を選ぶことにより後に示
すように本発明の目的とする抗１腫瘍活性が高く、かつ
抗原１生の低い加熱変性デオキシリボ核酸を含む懸濁液
を得ることが出来る。

ここに示した加熱条件は本発明物質調製法の重要な要因
であり、本明細書で示したいずれの調製法にも適用可能
である。

このようにしてＣＮ−１画分を加熱した佼冷却し、遠心
またはｐ過等の方法により沈渣を除けば、本発明物質を
含む清澄な溶液をイ４］′る。この溶液から本発明物質
を分離するのは容易であり、通常の方法によって可能で
ある。その適切な例としては、核酸凝集剤による沈鹸法
、有機溶媒による分画法カラムクロマト法あるいは電気
泳動法等とりボヌクレアーゼ処理法との組み合わせが挙
げられる。

これらの方法によって得られた本発明物質は、そのまま
製剤の原体として使用するか、あるいは凍結乾燥して乾
燥粉末にすることも可能である。

本発明物質中のデオキシリボ核酸の分子量は約３万から
１００万の間に分布し、グアニン、シトシン（ＧＣ）含
量は約３５％である。本発明物質の転移温度Ｔｍは、明
確な値を示さずさらに、ヒドロキシアパタイトのカラム
クロマトグラフィーにより分析すると本発明物質が変性
された１本鎖のデオキシリボ核酸であることを意味する
。

本明細書に示した方法によって得られる物質のなかには
、加熱変性デオキシリボ核酸以外に、微ｉ１）のリボ核
１タ、蛋白、糖等を含むものもあるが、いずれも混入物
と言える程度であり、要すればこれらはさらにＭ１２し
て除くことが出来る。

次に実施例１において精製して得られたＣＤ　−Ａ１に
ついて理化学的性質を調べ、その結果を示す。なお、実
施例２で得られたＣＤ−Ａ２の精製品についても同様の
理化学的性質を示している。

本物質、加熱変性デオキシリボ核酸ＣＤ−Ａｌの理化学
的性質（Ｎａ塩による）： （１）元素分析（％）　　：　Ｃ：２７．１３〜３２．
４１　　Ｈ：４．２４〜５．８１　　Ｎ：１１．１９〜
１３４８Ｐ：６．９３〜８．１５　　Ｎａ：３．１８〜
４．９８（２）分子量＝３万〜１００万 分子量分布図は第１図に示す通り。

（３）　　融　点：明（ｆ（Ｎな融点を示さない。

（４）紫外線吸収スペクトル：第２図に示す通り。

（５）赤外線吸収スペクトル：第３図に示す通り。

（６）溶剤に対する溶解性：水に可溶、エタノール。

メタノール、エーテル、アセトンに不溶。

（７）呈色反応 、へ）オル／ノール反応：　ＳＴＳ法により分画したＲ
ＮＡ画分に対して陰性。

Ｂ）ジフェニルアミン反応：ＳＴＳ法により分画したＤ
ＮＡ画分に対して陽性。

Ｃ）ニンヒドリン反応：本物質＋　（ｌ　Ｉｔｆｊ　／
　ｍ、（！の濃度で１婁１生。

Ｄ）アンスロン反応：本物質１０　＋ｎＳｉ’　／　ｍ
、Ｑの濃度で陰性。

（８）塩基性、酸性、中性の区別二本物質の水溶液のｐ
Ｈは６．５〜′ｌ、５である。

（９）物質の色二白色粉末 （１０）特　性：加熱処理によって可溶性を付与すると
ともに、高い抗腫瘍活性を有せしめ、かつ毒性および抗
原性が極めて低くなっている。

（１１）　　塩基組成（％）ニゲアニン：１８．１　　
アデニン：：う４１シトシン＝１７２　アミン：３０６ （方法は化学分析による） ０り　酵素処理二本＊質をデオキシリボヌクレアーゼ（
（ＤＮａｓｅ　ｌ）で処理すると抗腫瘍性が・テくなる
が、リボヌクレアーゼＴ２（ＲＮａｓｅＴ２）の処理て
は抗ｊ匝瘍１生は変化しない。

（１３）　　ヒドロキシアパタイトのカラムクロマトグ
ラフィーにより分析すると１本鎖構造である。

０４）転移温度（Ｔｍ）　　：測定された融解曲線から
は明確な転移温度Ｔｍは求められない。

本発明物質が示す抗１１１ｉ瘍活性の本体が、加熱炭１
隼デオキシリボ核酸であることは、本発明物質をデオキ
シリボ核酸分解酵素（ＤＮａｓｅ′Ｉ）で処理すると抗
ｊ腫瘍活性がなくなること、本発明物質をリボ核酸分解
酵素（ＲＮ　ａｓｅ　’Ｌ　）で処理Ｉ−ても抗腫瘍活
性が変化しないことから明らかである。

本発明物質を抗ハΦ瘍剤として用いる場合は、注射剤の
型で用いるのが好ましい。本発明物質は、単独であるい
は通常用いられる添加剤、賦型剤を加えて液剤、あるい
は同時溶解型の凍結乾燥製剤として適用可能である。

また本発明物質は水中油滴型あるいは油中水滴型ノエマ
ルジョンとしても適用可能である。

本発明物質の使用量、投与経路は適宜選択されるが使用
量は体重ｋｇあだシ０．０１ないし１００ｍｆが好壕し
く、投与経路は皮肉、皮下、静脈内、腹腔内投与や腫瘍
内投与が行なわれる。さらに本物質は経口投与も可能で
ある。

本発明物質はモルモット−守マウスの種々の＋ｍ瘍系に
対して高い抗）腫瘍作用を示す。例えばマウスの同系１
匣膓であるＴＭＣ力ルチノーマに対し−Ｃ＋発明物質は
生理食塩’ａｌに溶ｐｌＩ　Ｌ、た型で１匝瘍卸１廁と
接触させた後、！ｌｆｂ物体内に移植することによる腫
瘍の生着抑制（サブレッショ／活性）あるいｔｔ　＃ｄ
＋物体内に生着した１厘ノ帽ｌ＋１１識内に投与するこ
とによる抗ｉ１Ｗ、　腐活性（リグレッション活性）に
おいて原料である菌体と同等か、あるいはそれよりも商
い抗ｊ庫ノ爵活性を示１７だ。徒だ、モルモットの同系
ハ１１１瘍であるライン１０に対しては、油中水滴型の
本発明物質の腫瘍内投与により、本発明′物質は、原発
腫瘍の増殖抑制だけでなく、所属リンパ節への１匣膓の
転移も抑制した。

びらに本発明物質は、生理食塩液に溶解して１１里瘍組
織とは異る場所に投与することによってもＩＭＣ力ルチ
ノーマに対して抗腫瘍作用を示した。

本発明物質の急性毒性はマウスに対する静脈内投与によ
る体亜ｋｇアたりの５０％致死量ＬＤ５０イ直が５００
ｍ５Ｆ以上であることから、極めて低い。

また本発明物質の抗原性についても、モルモットギー試
験によって、本発明物質が極めて安全であることが判明
した。

その信奉発明物質の発熱性，疼痛性，起炎性。

肉芽形成性等も原料菌体に比較し、極めて低く、通常の
医薬としての適用には問題にならない程度であることが
、種々の試験により判明した。

各種の腫瘍細胞に対する本発明物質の細胞増殖抑制作用
を調べたところ、本発明物質は、１１とんど細胞増殖抑
制作用を示さなかった。このこと７！Ｊ）ら本発明物質
は宿主の免疫反応を介して抗腫瘍作用を示すと考えられ
るので本発明物質の免疫学的活性を種々検討した。その
結果、本発明物質はマウスのキラーＴ細胞増強効果、お
よびマクロファージ活性化作用の他にナチュラルキラー
細胞活性増強作用を示した。

以上の種々の知見から本発明物質は抗腫瘍剤として極め
て有用なものと考えら扛る。

以下に本発明物質の製造法を実施例により、丑だ、本発
明物質の抗腫瘍剤としてＶ）有用性を試験例により示す
。

実施例１　ストンブトマイシンを用いて得られる懸濁液
の可溶画分から本発明物質の１Ｑ造牛心臓浸出液　　５
００ｍＩｌ ペプトン　　　　　ＩＯｆｉ’ ＮａＣＱ　　　　　　　　５ｆ 水を加えて１ρにし、ｐＨ　７．　２に調節する。

Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ，　　Ｆ
ＤＡ２０９株を上記組成の培地で３０℃、２０時間培養
し、培養液を遠心分離処理して得た湿菌体ｌｌ　Ｏ　ｆ
を４　０　ｍ．Ｑの１０ｍＭリン酸緩衝液（　ｐＨ　７
．　０　）　　に懸濁した後、水冷下ダイノミルで破砕
し、２０，０００ｘｆで２０分間遠心分離して上清の無
細胞抽出液を得た。この抽出液にストレプトマイシン ０、３％になるように添加し、充分攪拌した後、４℃で
一晩装置し、生成した沈澱を遠心分離により果め、０．
５　Ｍ　ＮａＣＱ含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，
０）に懸濁した。　この懸濁液をセロハンチー−プに詰
めて同じ緩衝液に対して透析し、続いて蒸留水に対して
透析して核酸画分を含む懸濁液９４ｍρ　（以下この懸
濁液をＣＮ−１と称する）を得た。この懸濁液の固形物
濃度は１６．７ｍｆ／ｍＱであり、湿菌体あたり３．９
％の収率であった。

次にＣＮ−１全計にＮａＣ４を終濃度が０．９％になる
ように加えて攪拌し、加熱変性処理（１００℃、６０分
）した後、２０，０００　ｘ？、２０分間遠心分離して
上清を得た。この上清にＮａＣｌ１を最終濃度が０．４
Ｍになるように加えて溶解した後、セチルトリメチルア
ンモニウムプロミド（以下このものをＣＴＡＢと称す。

東京化成金社製）を最終濃度が０．２％（Ｗ／Ｖ）にな
るように加えて充分攪拌し、室温に３０分間静置した。

生成した沈澱を遠心分離により集め、１ＭＮａｃρ液５
９ｍρ　に溶解した後、等量のクロロホルム−イソアミ
ルアルコール（２４：　１）の混液を加えて振盪、遠心
分離して水層部分を得た。この操作をさらに２回くり返
した後、得られた水層に３倍相の９９．５％エタノール
を加えて攪拌し、・Ｉ　Ｃで一晩静置した。生成した沈
澱を遠心分離により′果め、蒸留水３０ｍＱ、に溶解し
た後、蒸留水に対して透析し、積装核酸溶液を得た。こ
の溶液をｌ　Ｎ　Ｎａ０Ｉ−１で中＋１１後、凍結乾燥
して乾燥標品２：Ｎｍｆを（４＋た。本市７０　＋ｒ＋
７４二０．０５　Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）　　１０
　ｍＱに溶卵ｒした後、同緩衝液２ｍＲに溶解したりボ
ヌクレアーゼＴ２　　（三共会社製）２００Ｕを添加し
、：う７℃で２２時間反応させた。反応液に等；仕のク
ロロホルム−イソアミルアルコール（２４：ｌ）の混液
を加えて振盪後、遠心分離して水層部分をイ４Ｉた。

この操作をさらにくり返した後、水層の金融を、あらか
じめ０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム液で洗浄した径２．
５　ｃｍ、長さ９０ｃｍのセファデックスＧ−１００（
Ｐｈａｒｍａｃｊａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社
製）カラムに負荷し、内液で溶出した佼、最初に溶出す
る両分としてデオキシリボ核酸を含む両分を得だ。この
画分を水に対して透析した後、ＮａＯＨで中和佐、凍結
乾燥して本発明物質５０３ｍＳ’を得た。以下このもの
をＣＤ−Ａｌと称す。

ＣＤ−Ａｌのチオキシリボ核酸の含量（純度）は５％過
塩素酸で加水分解した後、ジフェニルアミン法（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｆ２４　：Ｈ５，
１９５６）によシ定量しだ時９８．５％であった。

実施例２　マーマー法による本発明物質の製造：５ｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＦＤＡ２０９
Ｐ株を実施例１の培地で同様の培養条件によって得た湿
菌体２６０７を７倍量の１０　ｍＭ　ＩＪン酸緩衝液に
懸濁した後水冷下ダイノミルで破砕し、２０，０００ｘ
ｌｉ’ｆ２０分間遠心して無細胞抽出液を得た。この抽
出液からマーマー（Ｍａｒｍｕｒ、　　Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　Ｍｏ１ｅ　−ｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　３
．２０８．１９６１）法により粗デオキシリボ核酸画分
を得た。この両分を０．９％食塩液に対して透析した後
、１００℃、６０分加熱した。

冷却後蒸留水に対して透析、中和後凍結乾燥して得た標
品６８ｍｆに対し、実施例１と同様のスケールでリボヌ
クレアーゼＴ、処理を行ない、精製し、本発明物質４５
．３ｍｒを得た。以下このものをＣＤ−Ａ２と称す。Ｃ
Ｄ−Ａ２のデオキシリボ核酸含量は実施例１と同様の方
法で分析すると９８．＋ｉ％で；ｂつた。

実施例 ＣＤ−Ａｌ、１０＋ｎｆ　ｆ　］　（ｌ　ｍｕ、のＰＢ
Ｓマイナス液（条研化学社製）に溶解し、ニュクリポア
ーＮｏ　２０　（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ社製）を用いて無
菌濾過しまた。

得られたＦ液を１．５　ｒｒＪずつバイアル瓶に無繭的
に分注して本発明物質の液剤を得た。

実施例４　凍結乾燥製剤 ＣＤ−Ａｌ、１０ｍ１を１．０　＋ｎ［の注射用蒸留水
に溶解し、次に５００ｍ！ｉ′のマニトールを加えて溶
フリイした後、ニュークリボアーＮｏ２０　　を用いて
無菌濾過しだ。得られたｐ液を１．　Ｆｑ　ｍρずつ無
菌的にバイアル瓶に分注した後、凍結乾燥して本発明物
質の凍結乾燥製剤を得た。

実施例５　エマルジョン剤 ＣＤ−Ａｌ、４ｍＶを０．５ｎＪの生理食塩液に溶卵１
し、次にドラケオール６−　ｖＲ（Ｄｒａｋｅｏ＋　６
−ＶＲ。

Ｐｅｎ５ｉｌｖａｎｉａ　Ｒｅｔｉｎｉｎｇ　Ｃｏｍｐ
ａｎｙ製）とアラシー／Ｉ／Ａ　（Ａｒｌａｃｅｌ　Ａ
、　Ａｔ１ａｓ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉ
ｅｓ吸）の８．５：１．５の混液０．５ｍρを加えて連
結注射針を用いて油中水型のエマルジョンを得た。

試験例１　　マウスＩＭＣ力ルチノーマに対する抗腫瘍
作用 本発明物質のマウスＩＭＣカルチノーマに対する抗腫瘍
性を調べた。

試験系は次のとおりである。

ＣＤＦ、　　雌性マウスの皮肉に５×１０５個のＩＭＣ
力ルチノーマ細胞を移植し、移植後１日目から隔日に計
６回、実施例３の方法で調製した製剤を１回あたり０．
１ｍＱずつ、腫瘍内に投与した。移植後３５日目に１ｌ
ｉａ瘍を摘出し、その重量を測定した結果は第１表のと
おりであった。

第１表　マウスＩｔ＼ＩＣ力ルチノーマに対する抗１１
１１！−瘍作用 後述の検定を含めて平均腫瘍電歇および治疹例数の出現
頻度の有意差検定にはスチーーデントのｔ検定法とフィ
ッシャーの検定法をそれぞれ用いた。

Ｔ／Ｃは対照群の平均腫瘍車量に対する投与群の平均ｊ
腫瘍東量のパーセント比である。Ｂ　ＣＧはＢＣＧワク
チン（日本ピーシ−ジー会社製）を用いた。対照として
は生理食塩液を用いた。

試験例２　　ストン４フ２ ヘパトーマに対する抗腫瘍作用 本発明物質のストン４フ２ １０ヘパ］・−マに対する抗腫瘍作用を調べた。

ＩＸ］．０６個のライン（ｌｉｎｅ）１０ヘノクトーマ
腫瘍細胞をストレイン（　５ｔｒａｉｎ　）　２モルモ
ットの皮肉に移植し、移植後７日目に実施例３に示した
方法で調製した製剤ｏ．ｌｒｎρを）匝瘍内に投与した
。

移植後８０日目に生存例数、治癒例数、所属リンパ節へ
の転移の有無を調べた。対照としては生理食塩を用いて
同様に調製したものを用いた。

結果は第２表に示した。

第２表　ストレイン２モルモットノライン１０ヘパトー
マに対する抗腫瘍作用 ＊：ｐ（０．０１ 試験例３　核酸分解酵素処理物の抗腫瘍作用：本発明物
質を核酸分解酵素で処理することにより本発明物質の抗
腫瘍活性の本体を調べた。

試験法は次のとおりである。

ＣＤ−Ａｌをデオキシリボ核酸分解酵素ＤＮａｓｅ　１
（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）で処理した後得
られた分解物をクロロホルム処理してＤＮａｓｅ　ｌを
除き、次にセファデックスＧ　１　０　（　Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅ　−ｍｉｃａｌｓ製）カラ
ムにより脱塩，凍結乾燥して、本発明物質の核酸分解酵
素処理物を得た。得られた処理物の抗腫瘍活性を試験例
１と同様に試験し、第３表に示す結果を得た。

第３表　マウスＩＭＣ力ルチノーマに対する核酸分解酵
素処理物の抗腫瘍作用 ＊＊　：　ｐ（０，ｆ）５　　　＊　：　ｐ＜０．０１
Ｔ／Ｃは対照群の平均腫瘍重量に対する投与群の平均腫
瘍重量のパーセント比である。

対照としては生理食塩液を用い、ＢＣＧはＢＣＧワクチ
ンを用いた。

試験例４　ナチュラルキラー（ＮＫ）　　細胞の活性増
強作用： 本発明物質のＮＫＫ細胞対する活性増強作用を調べた。

試験法は次のとおりである。

生理食塩液、ＣＤ−Ａｔ又はＣＤ−Ａ２の生理食塩酸溶
解液（１ｍＳ’／ｒ＋Ｊ）を８週令のＣ５□ＢＬ／６系
雌性マウスに一四あたり０．３　ｍｎｎ腹腔膜投与てそ
の４８時間後に腹腔浸出細胞を採取した。採取液中の細
胞数を１０％牛脂児血清添加ＲＰＭ　１１６４０培地で
２×ｌＯ個／ｍυに調整した後プラスチックシャーレに
移して３７℃、５％炭酸ガス大気下で９０分間インキー
ベートシ、シャーレＶＣ付７１性細胞、非付着性の細胞
を得た。谷々の細胞５×１０５個と５１ｃｒで標識した
マウス白面病細胞ＹＡＣ−１，１×１０　個を３７℃、
　５％炭酸ガス大気下で１０％牛脂児而清添加ＲＰＭＩ
　］　Ｃ６０培地を用いて４時間培養した。その培養上
清に遊離された５＋　Ｃｒの放射能をオートガンマ−カ
ウンター（Ｐａｃｋａｒｄ製）で測定し、腹腔浸出［８
ＪＩｉＷのＹＡＣ−１細胞に対する細胞障害作用を調べ
た。

第４表　Ｎ　Ｋ細胞の活性増強作用 試験例５　細胞増殖直接阻害作用 本発明物質のＹＡＣ−１マウス白血病細胞とＦＭ３ＡＭ
ウス乳癌細胞の細胞増殖に対するＩＭ接接置害作用調べ
た。

試験系は次のとおシである。

８．４Ｘ１０’個のＹＡＣ−１細胞と１５．４Ｘ１０’
個のＦＭ３ＡＭ胞をそれぞれ１０％牛脂児血清添加ＲＰ
Ｍ１１６４０培地に浮遊せしめ、３７℃、５％炭酸ガス
大気下で２４時間培養後ＣＤ−Ａｌを１ｒｒｌＦ／ｍβ
の最終＃度に加え、同じ条件下でさらに培養を継続した
。培養開始後２４時間目毎にトリパン　′ブルー染色に
より生細胞数を測定した。結果は第５表に示した。

／ 試験例６　急性毒性 １群１０匹の５週令ｄｄＹ系雄性マウス（平均体重２３
１）にＣＤ−Ａｌを生理食塩液に高角イして体重］　ｋ
ｇあたり５００＋ｎｆ／を静脈内投与した。本発明物質
は投与後１週間の観察期間中、体重増加の抑制を示さず
、死亡例もなかった。この結果から本発明物質の静脈内
投与における５０％致死用量Ｌ　Ｄ　ｓｏは５００ｍｆ
／ｋｇ以上と考エラレル。

試験例７　抗原性 生理食塩液に溶解したＣＤ−Ａｌを１群６匹のハートレ
ー系雌性モルモット　（平均休止３４０　？）に１匹あ
たシ１ｍグずつ、週３回合計６回皮内投与して感作した
。最終感作臼から２週間経過援ＣＩ）−ＡＩを生理食塩
液に溶解して体重ｋｇあたり１０ｍＬ？あるいは２ｍｆ
を静脈内投与した。チャレンジ前後のモルモットの行動
観察により本発明物質の抗原性を調べたところ本発明物
質はＡｆ＋記投再投与量全くアナフィラキシ−ショック
を誘発しなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明物質のセファローズＣＬ−６Ｂカラノ・
クロマトによる溶出図を、第２図は同物質の紫外線吸収
スペクトルを、第３図は同物質の赤外線吸収スペクトル
を示す。 特許出願人　三井東圧化学株式会社 第　１１２］ （］ ０　　　　　　　　　　　１０　　　　　　　　　　２
０　　　　　　　　　　　ＪθＳ氏腋管敷　（本）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、加熱変性によって抗腫瘍活性を有せしめてなり、下
   記の理化学的性質（Ｎａ塩による）を示す加熱変性デオ
   キシリボ核酸ＣＤ−０１及びその塩。 （１）元素分析（％）　　：　Ｃ：２７．１３〜３２．
   ４１　　　Ｈ：４．２４〜５．８１　　Ｎ：１１．１９
   〜１３．４．８Ｐ：６．９３〜８．１５　　Ｎａ：３．
   １８〜４．９８（２）分子量：３万〜１００万 分子量分布図は第１図に示す通り。 （３）融゛　点：明確な融点を示さない。 （４）紫外線吸収スペクトル：第２図に示す通り。 （５）赤外線吸収スペクトル：第３図に示す通り。 （６）溶剤に対する溶解性：水に可溶、エタノール。 メタノール、エーテル、アセトンに不溶。 （７）呈色反応 Ａ）オルシノール反応：　ＳＴＳ法により分画したＲＮ
   Ａ画分に対して陰性。 Ｂ）ジフェニルアミン反応：　ＳＴＳ法により分画した
   り、ＮＡ画分に対して陽性。 Ｃ）ニンヒドリン反応二本物質１ｆ】ｌＬｆ／ｍＱの濃
   度で陰性。 Ｄ）アンスロン反応：本物’ｆｌ　］　Ｏ１ｒｆｌ／　
   ｍＦ、の濃度で陰性。 （８）塩基性、酸性、中性の区別二本物質の水溶液のｐ
   Ｈは６．５〜７．５である。 （９）物質の色：白色粉末 （１０）　　特性：加熱処理によって可溶性を付与する
   とともに、高い抗腫瘍活性を有せしめ、かつ重性および
   抗原性が極めて低くなっている。 ０１）　　塩基組成（％）ニゲアニン：　１８．１　　
   アデニン：：う４１シトシン：１７．２　　チミン：３
   ０６（方法は化学分析による） ０功　酵素処理二本物質をデオキシリボヌクレアーゼｆ
   　（ＤＮａｓｅｉ）で処理すると抗腫瘍性がなくなるが
   、リボヌクレアーゼＴ　２　（ＲＮ　ａ　ｓ　ｅ　Ｔ２
   　）の処理では抗腫瘍性は変化しない。 （１３）　　ヒドロキシアパタイトのカラムクロマトグ
   ラフィーにより分析すると１本鎖構造である。 ０・１）転移温度（Ｔｍ　）　：測定された融解曲線か
   らは明確な転移温度Ｔｍは求められない。 ２、スタフィロコッカス属菌より得られたものである特
   許請求の範囲第１項記載の加熱変性デオキシリボ核酸Ｃ
   Ｄ−０１゜ ３　スタフィロコッカス属細菌破砕物を遠心分離して得
   られる無＋ｉＪＩ胞抽出液から得られる核酸画分を加熱
   変性することを特徴とする抗腫瘍活性を有する加熱変性
   デオキシリボ核酸ＣＤ−０１の製造法。 ４、核酸画分の分シ１＃法として無細胞抽出液を有機溶
   剤処理して分離することを特徴とする特許請求の範囲第
   ３項記載の製造法。 ５、核酸画分の分離法として無細胞抽出液に核酸凝集剤
   を加え、得られる沈澱を水まだは塩類溶液に対して透析
   した後、その可溶画分から分離することを特徴とする特
   許請求の範囲第３項記載の製造法。 ６、スタフィロコッカス属細菌破砕物を遠心分離（，２
   て得られる無細胞抽出液に核酸凝集剤を加え、倚らｇる
   沈澱を水なたは塩類溶液に対して透析した後加熱変性し
   てその上清から分離することを特徴とする抗腫瘍活性を
   有する加熱変性デオキシリボ核酸ＣＤ−０１の製造法。 ７　デオキシリボ核酸含有物を約８０°〜１２０℃に加
   熱して抗腫１ｇ性を有せしめることを特許とする抗腫瘍
   活性を有する加熱変性デオキシリポｊ亥酸ＣＤ−０１の
   製造法。 ８、加熱変性によって抗腫瘍活性を有せしめてなる加熱
   変性デオキシリボ核酸ＣＤ−０１を有効成分とする抗腫
   瘍剤。 ９、加熱変性デオキシリボ核酸ＣＤ−０１がスタフィロ
   コッカス属菌より得られたものである特許請求の範囲第
   ８項記載の抗腫瘍剤。