JPS5936102A - シアル酸又はシアル酸含有物質の分離・精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、特異的吸着体及びそれを用いるシアル酸又は
シアル酸含有物質の分離・精製法に関する。

動物のホルモン及び神経伝達物質と考えられている 次式（■）： で示されるセロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン喜
以下［５−ＨＴＪという。）は牛脳ガングリオシド類の
ミセル構造、ガングリオシド類を含むりぎシーム、フェ
ツイン特のシアル酸含有物質と結合することが知られて
いる（Ｊ。

Ｎｅｕｒｏｃｈｅ・ｍ・、、２６．１１９３（１９７６
））。また、５−ＨＴとサル脳ガングリオシド類との間
に、特異的な相互作用があることも知られている。

従来、シアル階含有タンパク質のアフィニティークロマ
トグラフィーによる精製には、高価なアメリカ産カブト
ガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ　ｐｏｌｙｐｈ−ｅｍｕｓ　）の
レクチン又は小麦胚芽凝集素（以下「ＷＧＡ」という。

）等を用いねばならず、その利用範囲が非常に制限され
ている。特に、ＷＧＡはＮ−アセチルグルコサミンとも
結合するという欠点もある。また、最近、インド産カブ
トガニ（Ｃａｒｃｉｎｏｓｃｏｒｐｉｕｓ　　ｒｏｔｕ
ｎｄａｃａｕｄａ　）　　のレクチンを不溶化してシア
ル酸含有物質を吸着させている報告（Ａｎａ　Ｉ　、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、。

１１５．１３０（１９８１））もあるが、他のレクチン
と同様の問題点を有している。これらの問題点を解決す
るために、５−ＨＴを固定化してシアル酸含有物質を特
異的に吸着し、精製する方法Ｌ　Ｃａｒｂｏｈｙｄ、Ｒ
ｅｓ、、１０３（２）　、２１３　（１９８２）〕が開
発されたが、セロトニンは動物ホルモンとしての活性を
有するが、不安定で酸化され易い。従って、クレアチン
酸との複合体としてでなければ直ちに分解してしまい、
遊離の状態では入手困難であり、クレアチン酸を除失し
てから使用されているが、不安定なため調製が難しく、
工業的には不適である。

本発明者らは、前述の問題点を解消するため鋭意研究を
重ねた結果、 次式（■）： で示される５−ヒドロキシインドール酢酸又は次式（■
）： で示される５−ヒドロキシトリプトファンが固定化され
た不溶性高分子を得ることに成功し、更に、これらを吸
着体として用いることにより、前述の問題点を解消でき
ることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、 （式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ水素原子又はア
シル基を表わし＋Ｒ４は水酸基、アシルオキシ基、アミ
ノ基又はアシルアミノ基を表わす。） で示される５−ヒドロキシインドール誘導体残基を有す
ることを特徴とする不溶性高分子、並びにそれを用いる
ことを特徴とするシアル酸又はシアル酸含有物質の分離
・精製法である。

以下、本発明を更に詳細に説明する。

本発明に用いる５−ヒドロキシインドール酢酸及び５−
ヒドロキシトリプトファンは、５−）ＩＴと同様に５−
ヒドロキシインドール骨格を有するが、５−ＨＴに比し
著しく安定であり、遊離体が容易、かつ、安価に人手し
得るという長所を有する。更に、５−ヒドロキシトリプ
トファンは、担体と結合し得る官能基として、カルボキ
シル基と７ミノ基とを有するので、アミノ基又はヒドラ
ジノ基を有する担体とも、ホルミル基又はカルボキシル
基を有する担体とも結合させることができ、適用範囲が
広いという長所をも有する。また、両者のＮ−アセチル
ノイラミン酸（以下「ＮＡＮＡＪという。）との親和力
を紫外線吸収法（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、劫、６２８（
１９４６））により測定したところ、５−ＨＴとＮＡＮ
Ａとの親和定数（Ｋａ）が４．２Ｘ１０　Ｍ−であるの
に対し、５−とドロキシインドール酢酸では１．９Ｘ１
０’Ｍ−１，５−ヒドロキシトリプトファンでは１．５
Ｘ１０　Ｍ　　であった。

本発明の５−ヒドロキシインドール誘導体が固定化され
た不溶性高分子（以下［固定化５−ＨＩＪという。）の
うち、前記式（ＩＶ）又はＭで示される５−ヒドロキシ
インドール誘導体残基（以−上ｌ−５−）（Ｉ残基」と
いう。）を有するものは以下のようにして得ることがで
きる。

即チ、アカロース、セルロース、キチン、マンナン、ポ
リアクリルアミド系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂
等の水酸基を有する不溶性高分子を、既知の方法（有機
合成化学、第３８巻、１２８〜１３８頁（１９８０年）
〕に従い、エピクロルヒドリン、エビブロムヒドリン等
のエビハロヒドリン蓼又は、エチレングリコールジグリ
シジルエーテル、１．３−プロパンジオールジグリシジ
ルエーテル、１．４−ブタンジオールジグリシジルエー
テル、１．５−ベンタンジオールジグリシジルエーテル
、１，６−ヘキサンシオールジグリシジルエーテル等の
ビスオキシラン化合物；で処理することにより得られる
エポキシ活性化不溶性高、分子を濃アンモニア水で処理
してアミノ化するか、又は、特願昭５７−１２２８３５
号記載の方法に従い、ヒドラジン水化物、ヒドラジン水
化物塩、ヒドラジン硫酸塩等のヒドラジン類；又はシュ
ウ酸ジヒドラジド、マロン酸ジヒドラジド、コハク酸ジ
ヒドラジド、グルタル酸ジヒドラジド、アジピン酸ジヒ
ドラジド、ピメリン酸ジヒドラジド、スペリン醜ジヒド
ラジド、アゼライン酸ジヒドラジド、セバシン酸ジヒド
ラジド等の炭素数２〜１２の直鎖状飽和ジカルボン酸ジ
ヒドラジド寥マレイン酸ジヒドラジド、７マル酸ジヒド
ラジド等の不飽和ジカルボン酸ジヒドラジド蓼及び７タ
ル酸ジヒドラジド、テレフタル酸ジヒドラジド等の芳香
族ジカルボン酸ジモドラジド等のジヒドラジド化合物で
処理することによりヒドラジノ化する。この時、エポキ
シ化の時間又はジヒドラジド化合物の種類等を適宜選択
することによって、基剤とリガンドとを結びつける腕（
スペーサー）の長さを調節することができる。とのよう
にして得たアミノ化担体又はヒドラジノ化担体に、カル
ボジイミド化合物の存在下において、５−ヒドロキシイ
ンドール酢酸又は５−ヒドロキシトリプトファンを、−
３〜８、好ましくは、−１４〜６の条件下で、室温で５
０〜５００時間、好ましくは、１００〜３００時間反応
させることにより目的とする固定化５−）（Ｉを得るこ
とができる。溶媒としては、一般には、水が用いられて
、必要に応じて、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の塩
を、好ましくは、０．１〜２モル濃度、更に好ましくは
、０．３〜１モル濃度にあるように添加してもよい。カ
ルボジイミド化合物としては、１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（以
下「ＥＤＣＪという。）、１−シクロヘキシル−３−（
２−モルホリノエチル）カルボジイミド・メソ−ｐ−）
ルエンスルホン酸塩、ジシクロへキシルカルボジイミド
等が単独で又は二種以上の混合物として用いられる。こ
のようにして得た固定化５−ＨＩは、未反応の（５−ヒ
ドロキシインドール誘導体が固定化されていない）アミ
ン基又はヒドラジ７基を無水酢酸等でアシル化して不活
性化することが好ましい。

また、前記（ＶＩ）又は（■）で示される５−ＨＩ残基
を有する不溶性高分子は以下のようにして得ることがで
きる。

即ち、前述のアミノ化担体又はヒドラジノ化担体を、無
水コハク酸で処理し、スクシニル化担体とした後、前記
カルボジイミド化合物の存在下において、５−ヒドロキ
シトリプトファンと反応させることにより目的とする固
定化５−ＨＩを得ることができる。また、アミノ化担体
又はヒドラジノ化担体を、水素化シアノホウ素ナトリウ
ムの存在下において、グリオキサール、プロパンジアー
ル、ブタンジアール、グルタルアルデヒド（ペンタンジ
アール）、デカンジアール等のジアルデヒド化合物で処
理して、ホルミル化担体とした後、水素化シアノホウ素
ナトリウムの存在下において、５−とドロ、キシトリプ
トファンと反応させても、目的とする固定化５−ＨＩを
得ることができる。

以上のようにして得られた固定化５−　ＨＩは、洗浄後
、適当に緩衝化することにより、チログロブリン、ゴナ
ドトロピン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、下垂体黄体
化ホルモン（１）　Ｌ　Ｉ−１）、エリスロボエチン（
ＥＰＯ）等のシアロクルコホルモン、及びセルロプラス
ミン、フェツイン、フィブリノーゲン、α１−グリフプ
ロティン、ハプトグロブリン、α２−マクログロブリン
、トランスフェリン、オロソムフイド等の血中タンパク
質の分離・精製冨これらの化合物をプロテアーゼ等を用
いてシアル酸を含む糖鎖が外れないように分解して生ず
る各種シアーロペプチドとシアル酸を含まないペプチド
との分離寥シアロペブチド間におけるシアル酔含有喰の
差による相互分Ｎ６　＋コロミン酸、シアリルラクトー
ス等のシアル酸含有多糖、オリゴ糖及びシアル酸そのも
のの分離・精製Ｉ細胞中のシアル酸を含む細胞器官及び
細胞断片の分離・精製；細胞表面におけるシアル酸含有
喰の差による血球及び培養細胞等の分離・精製を等に広
く利用できる。

固定化５−　ＨＩに吸着したシアル酸又はシアル酸含有
物質を溶離するには、一般には、１μＭ〜４Ｍの濃度範
囲のサリチル酸、サリチル酢塩、（Ｎ　Ｉ（＋　）　２
ＣＯ３、ＮＨ４１１ＣＯ３を含有する水溶液又緩衝液が
用いられる。

本発明によれば、容易、かつ、安価に高いリガンド濃度
を有する固定化５−ＨＩを得ることができ、更に、これ
を用いることにより、シアル酸又はシアル酸含有物質を
効率よく分離・精製することができる。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は、本発明の範囲を何隻制限するものでは
ない。

実施例１ アガロースとしてファルマシア社製のセファロースＣＬ
６Ｂを用いた。グラスフィルター上で水でよく洗浄後、
吸引濾過したアガロース３０りをフラスコに入れ、水４
５ｄ、２ＭＮａＯＨ水溶液１９．５−及びエピクロルヒ
ドリン４．５−を順次加えた。懸濁液を４Ｏｒのインキ
ュベーター中で３時間振盪後、グラスフィルター上で水
で充分に洗浄してエポキシ活性化アガロースを得た。こ
のエポキシ活性化アガロースに導入されたエポキシ基の
量をＮ　ａ　２　Ｓ　２０３を用いる中和滴定法により
測定したところ、層重１１１１ｊ’当たり、６７．２μ
ｍｏｌｅのエポキシ基が導入されていた。

このエポキシ活性化アガロースに８０％ヒドラジン水化
物水溶液３０Ｌ／を加え、４０Ｃのインキュベーター中
で２時間振盪した。反応後、グラスフィルター上で水で
充分に洗浄してヒドラジノ化アガロースを得た。

（１）で得たヒドラジノ化アガロース９ｙを０．５ＭＮ
ａＣ１水溶液ｉｓｙに懸濁した後、５−ヒドロキシイン
ドール酢酸１００■とＥＤＣｏ、３Ｆを加え、…を５に
調整し、室温で１４０時間反応させた。次いで、水で充
分に洗浄した後、無水酢酸を加えて、ＯＣで３０分間、
更に室温で３０分間処理して、未反応の（５−ヒドロキ
シインドール酢酸が固定化されていない）ヒドラジ７基
をアセチル化した。反応後、充分に洗浄して目的とする
固定化５−ヒドロキシインドール酢酸を得た。この固定
化５−ヒドロキシインドール酢酸に固定化された５−ヒ
ドロキシインドール酢酸の級を紫外部吸収測定法により
測定したところ、層重１１ｙ当たり５１．６μｍｏｌｅ
の５−ヒドロキシインドール酢酸が固定化されているこ
とが判明した。

（２）で得た吸着体ＩＰ（湿重量）をミニカラム（９″
′ｇφＸ１０％）（生化学工業■製、セパコールミニカ
ラム（商品名）〕に充填し、水洗後、１　ｔｔ　ｍｏｌ
ｅＳＯＮＡＮ　Ａ水溶液（ｐＨ３，６）を過剰量を流し
た後、水洗し、次いで１０　ｍＭ　（ＮＨ４）２ＣＯ３
水溶液（＋）Ｈ９，１）で溶出した。溶出液中のＮＡＮ
Ａをレゾルシン法により測定したところ、湿重量ＩＰ当
たり４３．４μｍｏｌｅのＮＡＮＡが吸着されていたこ
とが判明した。

実施例２ シアログリコペブチドの分離・精製 実施例１（２）で得た吸着体１ｙ（湿重量）を実施例１
（３）と同様のミニカラムに充填し、水洗後、ブタ甲状
腺のチログロブリンをプロテアーゼで分解して得たグリ
コペプチド混合物２．５　ｗＵｉの水溶液を流した後、
水洗し、素通り画分として、シアル酸の検出されないグ
リコペプチド（マンノースに換算して約２６０μりの糖
を含む）を得た。次いで、１０ｍＭＮＨ４ＨＣＯ３水溶
液で溶出したところ、初めにシアル酸含有暇の少ないシ
アログリコペプチド（マンノースに換算して３７０μｍ
の糖及びシアル酸１００μ７　を含む）が得られ、次い
でシアル酸含有級の多いシアログリコベプチド（マンノ
ースに換算して４９０μ）の糖及びシアル酸１５０μノ
を含む）が得られた。

実施例３ ビニル系クロマト基剤［Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　　ＨＷ　
６５（商品名））１０ｙを水１５＋１！４！に懸濁した
後、２ＭＮａＯＨ水溶液６．５　ｍｌ及びエピクロルヒ
ドリン２、３　ｍｌを順次加えた。懸濁液を４０Ｃのイ
ンキュベーター中で３時間振盪後、グラスフィルター上
で水で充分に洗浄してエポキシ活性化基剤を得た。これ
に、アジピン酸ジヒドラジド１．２Ｆ　Ｉ　Ｏ，Ｉ　Ｍ
　Ｎａ２ＣＯ３水溶液８ｍｌに懸濁しタモノを加え、４
０Ｃで一夜反応させた。途中、…を９に調整した。反応
後、グラスフィルター上で水で充分に洗浄してヒドラジ
ノ化基剤を得た。

（１）で得たヒドラジノ化基剤を０．５　Ｍ　ＮａＣ１
水溶液に懸濁した後、５−ヒドロキシインドール酢酸３
００■とＥＤＣ１１！を加え、…を５に調整し、室温で
３００時間反応させた。次いで、水で充分に洗浄した後
、無水酢酸を加えて、ＯＣで３０分間、更に室温で３０
分間処理して、未反応のヒドラジノ基をアセチル化した
。反応後、充分に洗浄して目的とする固定化５′−ヒド
ロキシインドール酢酸を得た。

（２）で得たビニル系吸着体１０ｙ（湿重量）をカラム
（１３へφ×８０％）〔生化学工業■製、プラクティ・
カラム（商品名）〕に充填し、７エライン及びノイラミ
ニダーゼ（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ由来を生化学工
業側部）処理したフェツインの混合物１０■の水溶液を
流した後、水洗し、素通り画分として、約半吸のタンパ
ク質を得た。

このタンパク質はアシアロ７エツインであることが、シ
アル酸の測定結果から判明した。次いで、ｔ　ｏ　ｍＭ
ＮＨ，ＨＣＯ３水溶液で溶出して、更に、約半歌の７エ
ツインを得た。

実施例４ （１）　　固定化５−ヒドロキシトリプトファンの調製
−一一−１−一一一、−ｍ−− 顆粒状セルロース系ゲル濾過剤〔セルロファインＧＣ７
００（商品名）〕のヒドラジノ化体１２りを０．５　Ｍ
　ＮａＣ１水溶液１８ｍに懸濁した後、無水コハク酸０
．９６ｊ’を加え、…を４に調整し、室温で２時間振盪
攪拌した。水洗後、ｏ、１ＭＮａＯＨ水溶液１８ｔｎｌ
を加え、室温で３０分間放置して、スクシニル化担体を
得た。このスクシニル化担体５ｙ（層重１りに、５−ヒ
ドロキシ）　！Ｊ　７’　）　７７ンｌＱＱｍｐを水１
３−に溶解した４０を加えた後、ＮａＣ１Ｏ，３８Ｆト
ＥＤＣ０，１７ｙを加えてよく攪拌し、…を５に調整し
て室温で２００時間反応させた後、充分に洗浄して目的
とする固定化５−ヒドロキシトリプトファンを得た。

（２）細胞分化因子の分離・精製 （１）で得た固定化５−ヒドロキシトリプトファン５Ｆ
（層重軟）をカラム（１３瓢φＸ４０％）〔生化学工業
■製、プラクティ・カラム（商品名）〕に充填し、細胞
分化因子を含有するヒト尿を透析、ゲル濾過等で尿素、
塩類及び単糖、オリゴ糖、その他の低分子化合物を除失
し、濃縮したもの５＊ｌ（々ンパク質濃度１０ｑ／ｍ／
）を流して、水洗後、１０ｍＭＩＪン酸緩衝液（ｐＩ（
７）を流して、アルブミン等の夾雑タンパク質の一部を
溶出除去した。次いで、１０〜１００ｍＭサリチル酸ナ
トリウムを含む０．１　Ｍリン酸緩衝液で溶出すること
により、タンパク質当たりの比活性を約５倍上昇させる
ことができた。

実施例５ （１）　　固定化５−ヒドロキシインドール酢酸（７）
＃ｉｌ顆粒状セルロース系ゲルｐ過剤〔セルロファイン
Ｇ　Ｃ１５ｍ　（商品名））１０ｙを水１５ｍに懸濁し
た後、２　Ｍ　ＮａＯＨ７ｍｌ　及びエピクロルヒドリ
ン２．５−を順次加えた。懸濁液を４０ｃツインキユベ
ーター中で４時間振盪後、グラスフィルター上で水で充
分に洗浄してエポキシ活性化基剤を得た。これに、アジ
ピン酸ジヒドラジド１．２ｙを０．１　Ｍ　Ｎ　ａ　２
　ＣＯ３水溶液ｆ３ｔｔｔｌニ懸濁したものを加え、声
を９に調整し、４０ｃで一夜反応させた。反応後、グラ
スフィルター上で水で充分に洗浄してヒドラジノ化基剤
を得た。

これを０．５　Ｍ　ＮａＣ］水溶液に懸濁した後、５−
ヒドロキシインドール酢酸３００〜とＥＤｃｌりを加え
、…を５に調整し、室温で２００時間反応させた。次い
で、水で充分に洗浄した後、無水酢酸を加えて、ＯＣで
３０分間、更に室温で３０分間処理して、未反応のヒド
ラジノ基をアセチル化した。反応後、充分に洗浄して目
的とする固定化５−ヒドロキシインドール酢酸を得た。

（２）　　ヒト赤血球の分離・精製 （１）で得た固定化５−ヒドロキシインドール酢酸１り
（層重蔽）を、ノイラミニダーゼ処理したヒト０型赤血
球及び未処理ヒ）０型赤血球の等量混合懸濁液（ＰＢＳ
中計４％含有）２＊ｌに加え、室温に１０分間置く。こ
の間、数回軽く振盪して吸着を促進した。次いで、３３
０〜３５０メツシユ（３０〜３５μｍ）のナイロン又は
ポリエチレンメツシュで濾過し、ＰＨ１で洗浄すると、
血球の一部が濾過され、一部は吸着剤に結合していた。

血球が吸着されている吸着剤（赤色）を１０ｍＭサリチ
ル酸ナトリウムを含む１０Ｍ　ＮＨ４ＨＣＯ３水溶液（
岨８．５）で洗浄したところ、血球が脱離した。それぞ
れの血球についてビーナツツレクチンによる凝集性を調
べたところ、吸着されない血球は凝集せず、吸着後脱離
した血球は凝集した。以上のことから細胞表面にシアル
酸を有する細胞と有さない細胞と力（本発明の吸着体に
より分離できることが判明した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （式中、Ｒ，Ｒ及び几はそれぞれ水素原子又はアシル基
   を表わし、几は水酸基、アシルオキシ基、アミ７基又は
   アシルアミノ基を表わす。） で示される５−ヒドロキシインドール誘導体残基を有す
   ることを特徴とする不溶性高分子。 ２　次式： （式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ水素原子又はア
   シル基を表わし、　Ｒ４は水酸基、アシルオキシ基、ア
   ミノ基又はアシルアミノ基を表わす。） で示される５−ヒドロキシインドール誘導体残基を有す
   る不溶性高分子を、吸着体として用いることを特徴とす
   るシアル酸又はシアル酸含有物質の分離・精製法。