JPS5937078B2 - アンドロスト−１，４−ジエン−３，１７−ジオンの醗酵製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明ハアンドロストー１．４−ジエン−３゜１７−ジ
オンの醗酵製造方法に関し、さらに詳しくは、固定化増
殖生菌体を用いてステロール類を選択的にアンドロスト
−１，４−ジエン−３゜１７−ジオン（以下”ＡＤＤ’
”と略称する）に変換する方法に関する。

ＡＤＤは卵胞ホルモンや黄体ホルモンなどの女性ホルモ
ンの重要な中間体であり、婦人科疾患の治療薬や経口避
妊薬（ピル）等の原料として有用な公知の化合物であり
、従来からステロール類の醗酵生産法によって製造され
ている。

例えば、特公昭４６−１７９５１号公報及び特公昭５０
−１１９９８号公報には、ミコバクテリウム属、アース
ロバフタ−属又はノカルディア属に属する微生物を、キ
レート剤や、ニッケル、コバルト等の阻害剤の共存下で
、ステロールを含む培地中で培養することによりＡＤＤ
を製造する方法が開示されており、また、特開昭５５−
１０号公報、特開昭５５−１３８３９４号公報、米国特
許第３６８４６５７号明細書及び米国特許第３７５９７
９１号明細書には、ミコバクテリウム属に橘する微生物
を親株とした、アントロスタン系化合物の分解酵素を欠
失する突然変異株を用いて、ステロールを含む培地中で
培養することによりＡＤＤを製造する方法が記載されて
いる。

しかし、これらの従来提案されている方法はいずれも、
微生物菌体を栄養培地中で遊離分散させた状態で増殖培
養するものであるため、培養終了時に微生物菌体と目的
生成物とを別々に培地から分離しなければならず、その
上分離した菌体はそのまま廃棄し、次の培養のためには
新たに微生物菌体を前培養した後醗酵生産に使用しなけ
ればならないという煩雑な操作を行なう必要がある。

しかも、かかる従来の醗酵生産法では、ＡＤＤに加えて
アンドロスト−４−エン−３，１７−ジオン（以下”４
−ＡＤ”という）が多量に副生ずるため、目的とするＡ
ＤＤの収率が悪く、しかも、培養に要する時間が前培養
時間を含めて２４０時間乃至２５０時間と長い等の重大
な欠点があった。

本発明者らは上記の如き欠点のないＡＤＤの効果的な製
造方法につき鋭意研究を重ねた結果、使用すべき微生物
菌体を天然または合成高分子ゲルに増殖可能な状態で包
括固定化し、ステロール類を基質として、該ゲルに包括
固定化された該微生物菌体を増殖培養すると、４−ＡＤ
が殆んど副生せずＡＤＤが選択的（又は優先的）に生成
し、ＡＤＤが好収率で得られ、しかも包括固定化された
微生物菌体は前培養することなく何回も繰返して使用す
ることができることが見い出され、本発明を完成するに
至った。

しかして、本発明によれば、ステロール類を基質として
、高分子固体担体に包括固定化されたステロール類の側
鎖分解能を有する微生物菌体を、栄養培地中で培養し、
該ステロールをアンドロスト−１，４−ジエン−３，１
７−ジオン（八ＤＤ）に選択的に変換せしめることを特
徴とするアンドロスト−１，４−ジエン−３，１７−ジ
オン（ＡＤＤ）の製造方法が提供される。

本発明の方法において基質として用いられる「ステロー
ル類」とは下記式 。

式中、Ｒは炭素原子数Ｃ８〜Ｃ１ｏ個の鎖状炭化水素基
を表わし、Ｂ環及び／又はＣ環は二重結合を有していて
もよい、 で示される基本骨格構造を有するステロイドを総称する
ものであり、例えば、コレステロール、スチグマステロ
ール、α−１β−もしくはγ−シトステロール、カンペ
ステロール、エルゴステロール、ブラシツカステロール
、フコステロール、ラノステロール、アグノステロール
等によって代表されるステロール：それのＣ−３工ステ
ル誘導体、例えばコレステリルオレエート、コレステリ
ルパルミテート、コレステリルサルフェート、コレステ
リルアセテート、コレステリルヘミスクシネート、コレ
ステリルベンゾエート、コレステリルホスフェート等：
Ｃ−３エーテル誘導体、例えばポＩＪ 、ｔキシエチレ
ンコレステリルエーテル、ポリオキシエチレンラノリン
アルコールエーテル、等：或いはこれらの酸化誘導体、
例えばコール酸、リトコール酸、デオキシコール酸、４
−コレステノー３−オン、■、４−コレスタジェンー３
−オン、４．２２−コレスフジエン−３−オン、１９−
ヒドロキシコレステロール等が包含され、これらはそれ
ぞれ単独で又は２種もしくはそれ以上組合わせ用いるこ
とができる。

これらステロール類は必ずしも純粋に単離された形で用
いる必要はなく、例えば、羊毛脂、ラノリン、ラノリン
の加水分解生成物（ウールアルコール）、魚油やイカ油
からのアルカリ洗浄油、植物油の脱臭スカム脱スラッジ
、トール油、等のステロール含有天然物及び加工物もま
た基質として使用することができる。

一方、かかるステロール類の変換のために使用される微
生物菌体は、ステロール類のＣ−１７側鎖〔上記式（Ｉ
）における基Ｒ〕を分解する能力を有するものであり、
かかる側鎖分解能力を有するものであれば、その分類学
上の位置に拘束されることなく、広範囲の微生物菌体か
ら選ぶことができる。

ステロールの側鎖分解能を有する微生物菌体としては多
数のものが知られており〔例えばＡｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ
、Ｃｈｅｍ−＊４２，４１１（１９７８） 、Ｊ。

Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、８７ ＊ １３８７（１
９６５）、Ａｇｒｉｃ。

Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅｍ、３３．１６４４（１９６９）等
参照〕、そのような能力が未知の菌体であっても、例え
ば次の如きスクリーニング法によって容易に検定するこ
とができる。

供試菌体の生育に適合した栄養培地中に、ステロール（
例えばコレステロール）を０．１〜０．５％の濃度にな
るように加え且つ供試菌体を接種して、１〜８日間３０
℃で試験管培養し培養終了後培養液をそれと等体積の酢
酸エチルで抽出し、抽出物を薄層クロマトグラフィーに
より（展開溶媒クロロホルム）展開した後、ヨウド発色
により基質ステロールの消費とそれに伴う生成物スポッ
トを確認することにより、供試菌体が側鎖分解能で大ま
かに側鎖分解能を持つ菌体を選別する。

更にこれと同一条件下で大量培養行い、生成物を確認す
ることによってステロール類の側鎖分解能を有する微生
物菌体の検定が完了する。

そのようなステロール類の側鎖分解能を有する微生物菌
体として具体的には、アースロバフタ−属、ノカルディ
ア属、ミコバクテリウム属、バチルス属、シュードモナ
ス属、コリネバクテリウム属、フザリウム属、ブレビバ
クテリウム属、プロタミノバクタ−属、ミクロバクテリ
ウム属、セラティア属、アゾトバクタ−属及びアルカリ
土類金属に属するものが挙げられ、特に下記に例示する
ものが好適な例として記載することができる。

下記に例示する微生物菌体はいずれも公的保存機関に保
存されており、第三者が自由に分譲を受けることができ
るものである。

下記の例示においてカッコ内がその寄託番号であ゛り各
略号は次の意味を有する： ＡＴＣＣ：アメリカン・タイプ・カルチュア・コン
レクション（アメリカ合衆国） ＩＦＯ：財団法人醗酵研究所（大阪） Ｎ■：ナガオ・インステイチュート（東京）ＩＡＭ：東
京大学応用微生物研究所（東京）（１）アースロバフタ
−属 アースロバフタ−・シンプレックス（ＡＴＣＣ６９４６
） （２）ノカルディア属 ノカルディア・コラリーナ（ＩＦＯ３３３８）ノカルデ
ィア・エリスロホツス（ＮＩ９１１０）１（３） ミ
コバクテリウム属 ミコバクテリウム・フレイ（ＩＦＯ３１５８）ミコバク
テリウム・フォーライトラム（ＡＴＣＣ６８４２） ミコバクテリウム・デイエルンホッフエリ（ＡＴＣＣ−
１９３４０） （４）バチルス属 バチルス・スファ工＋）’ｙ ス（ＩＦＯ３３４１）（
５）シュードモナス属 シュードモナス・プチダ（ＩＦＯ３７３８）（６）コリ
ネバクテリウム属 コリネバクテリウム・エクイ（ＩＡＭ１０３８）（７）
フザリウム属 フザリウム・オキシスポルム（ＩＦＯ５９４２）（８）
ブレビバクテリウム属 ブレビバクテリウム・リポリチクム（ＩＡＭ１３９８） （９）プロタミノバクタ−属 プロタミノバクタ−・アルボフラブス（ＩＦＯ３７０７
） （１０） セラティア属 セラディア・マルセツセンス（ＩＦＯ３０４６）ａυ
ミクロバクテリウム属 ミクロバクテリウム・ラクチクム（ＩＡＭ１６４０） ０２） ストレプトミセス属 ストレプトミセス・コエリカラー（ＩＦＯ３１７６） ０３）アゾトバクタ−属 アゾトバクタ−・ビネランデイＤＡＭ１０７８２０４）
アルカリ土類金属 アルカリゲネス・ファエカリシス（ＩＡＭ１０１５） 本発明の方法で使用される微生物菌体は上記の例示の種
に限定されるものではなく、またこれらの菌体を親株と
して、放射線や紫外線、あるいはニトロソグアニジン誘
導体等の変異誘起剤などで処理して得られる突然変異株
を用いることも可能である。

本発明に従えば、上記微生物菌体は増殖可能な状態で高
分子固体担体に包括固定化して使用される。

しかして、この包括固定化に用いる固体担体は、微生物
菌体が該担体表面及び／又は該担体内で増殖することが
可能で、ステロール類の側鎖の分解に関与する一連の酵
素反応に実質的に悪影響を与えず、好ましくはＡＤＤの
製造過程で崩壊しない程度の機械的強度をもつ天然又は
合成の高分子物質が適している。

そのような高分子物質きしては、例えば、アルギン酸、
コラーゲン、Ｋ−カラギーナン、セルロース、寒天、セ
ロファン、コロジオンなどの天然高分子物質や、ポリア
クリルアミド、ポリスチレン、ポリブタジェン、ポリウ
レタン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリ
コールなどの合成高分子物質を挙げることができる。

中でも、Ｋ−カラギーナン、アルギン酸、ポリウレタン
、ポリエチレングリコールが特に適している。

かかる高分子物質への前記微生物菌体の包括固定化は、
包括固定化後の微生物菌体が実質的に死滅することなく
増殖可能な状態に保持され且つステロール類の側鎖分解
に関与する一連の酵素群に悪影響を与えない限り、一般
に緩和な条件下に、それ自体公知の任意の方法によって
行なうことができる。

例えば、菌体を懸濁した上記天然高分子体（例えば、ア
ルギン酸ナトリウム、Ｋ−カラギーナン、寒天等）の４
０〜５０℃の水溶液を、０℃〜室温に放置するかもしく
はカルシウムイオン、カリウムイオン、アルミニウムイ
オン、鉄イオン等の金属イオンを適当な濃度で含む冷却
水溶液に滴下することによりゲル化し、そのゲル内に供
試菌体を固定化する方法〔Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌ 、
Ｂｉ ｏｃｕｇ ＋１９．３８７（１９７７）、Ｅｕｒ
、Ｊ、Ａｐｐｌ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ８ 、２４１ （１９７９）］、
菌体を懸濁した合成高分子の水溶液に近紫外線や紫外線
、Ｘ線を短時間（１〜５分）照射することにより固定化
する方法ＣＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ ６否−９１７９（
１９７６） 、 Ｅｕｒ、Ｊ 、 Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ。

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ６，２０７（１９７９）］あ
るいは両末端にインシアナート基をもつ合成高分子体と
菌体懸濁液を混合するだけで菌体を高分子ゲル内に固定
化する方法ＣＥＬＩ ｒ 、Ｊ 、Ａｐｐｌ 、Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ 。

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、 ８ 、１４３（１９７９）
］等が掲げられ、これらの方法によればステロールの側
鎖分解反応に関与する一連の酵素群は何等悪影響を受け
ない。

（ここに記載した例はほんの１例である。

）微生物菌体の担体への固定化量は臨界的ではなく、使
用する高分子物質の種類や微生物菌体の種類等に応じて
広範に変えることができるが、菌体、の漏出、酵素活性
、担体の機械的強度等を考慮し、一般に、−白金耳の菌
体を接種した１００ｒＩｌｌの前培養液（２０〜５０時
間培養したもの）の２ｍｌ中に含まれる菌体量（その量
は微生物菌体によって異なるが大体１×１０２〜Ｉ Ｘ
１０”個程度である）に対して、２５０ｍ’ｉｆ 〜
２０ 、！ｉ’、好マシくは１ｇ〜３ｇの高分子物質を
用いるのが有利である。

微生物菌体を包括固定化した固体担体は、一般にピース
伏、タブレット状、立方体状、フィルム状等の形状に成
型した後使用に供される。

その貯蔵保存は通常、生理食塩水、リン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ６〜８．１〜５０ｍＭ）あるいは無菌水に浸し
て、５℃〜３０℃で保存したりまたは凍結して保存する
。

上記の如く調製された固定化微生物菌体の培養に使用さ
れる栄養培地は、使用する微生物菌体に合わせて調製す
ることができるが、一般に、放線菌では酵母エキス（０
４％）、マルトエキス（１％）、ｐＨ７，０なる培地が
、カビ類ではマルトエキス（２％）、ペプトン（０，１
％）、ｐＨ７，０なる培地が、酵母類ではマルトエキス
（０，３％）、酵母エキス（０，３％）、ｐＨ７，０な
る培地が、更にバクテリアでは、肉エキス（１％）、ペ
プトン（１係）、食塩（０，５係）、ｐＨ７，０なる培
地がしばしば用いられる。

基質として使用されるステロール類は一般に水に不溶乃
至難溶性のものが多く、従って、培地には、界面活性剤
、例えばポリオキシエチレンソルビクントリオレート、
ポリオキシエチレンソルビクンモノラウレート、ポリオ
キシエチレンモノステアレート、ポリオキシエチレンモ
ノパルミテート、ドデシルエーテルスルホン酸ナトリウ
ム、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド等を適量
、通常０．０１〜０．２重量％の濃度で添加するが、或
いはグリセリド含有物質、例えば大豆レシチン、綿実油
等を好ましくは０．２〜５重量の濃度で加えるのが有利
である。

殊に、後者のグリセリド含有物質の添加はＡＤＤの収量
を増大させるのに有効であり、好適である。

また、ステロール等の培地への溶解性を高めるため、菌
体の倍加やステロールの側鎖分解能に悪影響を及ぼさな
い範囲で水混和性有機溶媒、例えばジメチルホルムアミ
ド、ジメチルスルホキシド、アセトン、メチルアルコー
ル、エチルアルコール、ｎ−フロビルアルコール、イソ
プロピルアルコール、エチレンクリコール、フロピレン
クリコール、グリセリン等を用いてもよい。

さらに、培地には必要に応じて、ニッケル、コバルトナ
どの金属の塩の如きステロイド骨格の分解に関与する酵
素の阻害剤や、α、α′−ジピリジル、０−フエナント
ロン等のキレート化剤を添加してもよい。

かかる阻害剤やキレート化剤は通常０．１ｍＭ〜１ｍＭ
の範囲の濃度となる量で使用するのが好ましい。

上記の培地に基質として配合するステロール類の量は臨
界的ではなく広範に変えつるが、ステロールの培地への
溶解度や転化率等を考慮して、通常０．０１〜４重量％
、好ましくは０．１〜２重量％の濃度となるような量で
培地に配合するのが適当である。

以上述べたステロール類を含む培地中での固定化画体の
培養はそれ自体公知の方法で行なうことができる。

例えば、培養温度は通常２０〜５０℃、好ましくは２０
〜３０℃とすることができ、また、培地のｐＨは通常５
〜９の範囲、好ましくは６〜７の範囲に調整することが
できる。

培養法としては、坂ロフラスコを用いた振盪培養、ジャ
ーファーメンタ−を用いた通気攪拌培養等が容易に実施
されるが、特に固定化増殖菌体を使用することから、栄
養培地を連続的に供給する通気攪拌連続培養法が最も実
用的である。

通気を必要とすることから培養器は種型流通式培養器を
用いるのが適当である。

以上述べた如き条件下に培養は約５０時間〜１２０時間
行なうことができる。

これによってＡＤＤが大体２０〜４０％程度の収率で得
られる。

培養終了後の培養液からの生成したＡＤＤの回収及び精
製はそれ自体公知の方法で行なうことができる。

例えば、回分式の培養器を用いた場合はまず、濾過によ
って固定化菌体ゲルを培養液から分離し、固定化菌体ゲ
ルは再びステロール類を含有する新しい培地にインキュ
ベートし、繰り返して用いることが可能となる。

一方、培養液はｐＨ６０に調整した後、それと同体積の
ジクロルメタンで抽出した後、無水硫酸す） ＩＪウム
で乾燥し、溶媒を除去する。

白色の結晶が得られ、これをメチルアルコール、エチル
アルコールあるいはアセトンに溶解させる。

難溶結晶は基質ステロールであり、これを濾過して再び
反応に供する。

一方、母液を除去し、塩化メチレンを展開溶媒にカラム
クロマトグラフィーによりＡＤＤ及び４−ＡＤを分離す
る。

こうして得られたＡＤＤ及び４−ＡＤはそれ自体純度の
高いものであるが、更にｎ−へブタンを用いて再結晶す
ることにより純粋なものを得ることができる。

連続培養を行う際は流出した培地液を、ｐＨ６，０に調
整した後全く同様の操作を行うだけでよい０ 以上ノこ述べた本発明の方法によれば、従来法とは異な
り、アンドロスト−１，４−ジエン−３゜１７−ジオン
（八ＤＤ）が選択的に好収率で得られるのみならず、以
下に述べる如き利点も得られる。

け）本発明の方法に従って用いられる固定化微生物菌体
は、栄養培地中でインチューベーションを継続させるた
め、担体ゲル表面及び／又はゲル内の微生物生菌層を更
新することができ、従って固定化微生物菌体の触媒活性
を更に長期間保持することが可能となる。

（２）固定化菌体を調整するに際して、微生物生菌体量
は担体１ｇに対して０．１−２０■湿潤菌体と少量を用
いるだけでよく、微生物生菌体の大量培養が不要である
。

このことは、アンドロストー１，４−ジエンー３，１７
−ジオン（ＡＤＤ）の製造に際して要する菌体コストを
下げることが可能となるだけでなく、製造に要する時間
を大幅に短縮しく従来の醗酵法の約１／２）経済的にも
操作上でも有利なものである。

（３）用いる微生物菌体により異なるがその大部分の固
定化増殖菌体は担体ゲル表面に近い個所で局在し密集化
するため高い触媒能をもったものを調製することができ
る。

たとえば、水に難溶な疎水性の高いステロール類は、相
体内部への拡散速度が非常に小さいが、担体の表面に生
菌体が局在するために、基質ステロールは容易に相体表
面の生菌体と接触することができ、効率よく変換反応を
進めることができる。

更に、増殖している菌体が表面に密集しているため、ス
テロール類の側沢分解反応のような複雑な逐次反応にお
いても、副生物が少なく、最終生成物であるＡＤＤへ非
常に効率よく変換される。

（４）上記のようにステロール類の変換に関与する生菌
体は担体表面あるいは菌体によっては担体内部に局在し
ているため、従来の醗酵法のように培地中に遊離分散し
ない。

従って、変換反応の終了時に相体を流過するだけで生成
物を含む培地から菌体を分離することが可能であり、特
にＡＤＤのような水に難溶な生成物が含まれている培地
では遠心分離をすることによって菌体を除去する方法が
とれないため固定化増殖菌体を用いる本発明の方法は操
作的にも非常に有利なものである。

更に、分離回収された固定化菌体は再びステロール類を
含む新しい培地にインキュベートすることにより、繰り
返して使用することが出来るためこの点においても経済
的に有利である。

以下実施例により本発明をさらに説明する。

実施例−１ 酵母エキス（１重量％）、肉エキス（１重量％）及びペ
プトン（１重量％）を含む培地をｐＨ７，０に調整し、
１２０℃で２０分間滅菌処理を行った。

この培地にアースロバフタ−・シンプレックス（ＡＴＣ
Ｃ６９４６）を−白金耳接種し、３０℃にて１４０回／
分の振盪下で２４時間培養した。

一方、Ｋ−カラギーナン４ｇを１００ｍ１の生理食塩水
中に５０℃に加温して溶解し、この溶液２５ｍ１に、上
記で用意した生菌体を含む前培養液２ｍｌを加えて充分
混合した後、注射筒につめ、冷却した２係塩化カリウム
溶液に滴下し、ビーズ状（７）Ｋ−カラギーナンゲルに
固定化させた。

このゲルを滅菌水で充分洗浄後、酵母エキス（１重量％
）、肉エキス（１重量％）、ペプトン（１重量％）及び
大豆レシチン（２，５重量％）からなる培地（ｐＨ７，
０）１００ｄに力Ｕえて、３０℃にて１４０回／分の振
盪下で２４時間インキュベーションを行い、その後、基
質として３００７９（０，３重量％）のコレステロール
を添加した。

同条件で８時間インキュベーションを行った後に、阻害
剤としてα、α′−ジピリジル１５．６■（０，０１６
重量係）を添加し、再び同条件下で７２時間インキュベ
ーションした。

反応終了後、無菌状態でゲルを沖過し、培地をジクロル
メタン（５０ｍｌ）で２回抽出し、この反応液をＴＬＣ
−スキャナーで定量したところ１゜４−アンドロスタジ
エン−３，１７−ジオン（ＡＤ、Ｄ）が３６係の収率で
得られた。

実施例−２ 実施例−１において調製した固定化菌体ゲルを再びコレ
ステロールを含む新しい培地に加えて、実施例−１と全
く同様の操作を行い、固定化菌体ゲルを繰り返し使用し
たところ、ＡＤＤ収率は低下せず、この間における菌体
のゲルからの漏れも見られなかった。

その結果を下記表−１に示す。実施例−３ 実施例−１と同様の操作で前培養を行い、この前培養液
２ｍｌを、２係のアルギン酸ナトリウム水溶液５０ｒｆ
Ｌｌに加えて混合し、地射筒から、５０ｍＭの塩化カル
シウムの冷却した水溶液中に滴下して、ビーズ状のアル
ギン酸カルシウム固定化菌体を調整した。

このゲルを滅菌水で充分洗浄した後、実施例−１と同様
の操作でこのゲルをインキュベーションしたところ、Ａ
ＤＤが２５％の収率で得られた。

実施例−４ トルエンジイソシアネート２モルを平均分子量が約２０
００−３０００のポリエチレンオキシド１モルと混合し
、８０℃で約３時間反応させ、両末端に各１つのインシ
アネート基を有し、主鎖にポリエチレンオキシドを有す
る平均分子量が約２５００〜３５００のポリウレタンを
調整した。

一方、実施例−１と同様の操作でアースロバフタ−・シ
ンプレックス（ＡＴＣＣ６９４６）を前培養し、この前
培養液２ｍｌに上記の様にして調整したポリウレタンＩ
ｇを加えて充分混合し、菌体をゲル内に固定化した後、
４℃で約１時間放置し、ゲルを充分硬化させ、得た固定
化物を３Ｘ３Ｘ３ｍｍの立方体に切断した。

こうして調整した固定化ゲル菌体を実施例−１と全く同
様の方法でコレステロールを含む培地でインキュベーシ
ョンしたところ、ＡＤＤが３０係の収率で得られた。

実施例−５ 実施例−１と同様の操作でアースロバフタ−・シンプレ
ックス（ＡＴＣＣ６９４６）を前培養を行い、この前培
養液２ｍｌにアクリルアミド１ｇおよびＮＮ’〜メチレ
ンビスアクリルアミド５０■を溶解した。

次いでこの液にＮＮＮ’Ｎ’−テトラメチレンジアミン
５重量％水溶液１ｍｌおよび過硫酸カリウム２，５重量
多水溶液１ｒＩＬｌを加えた後、窒素ガス雰囲気下で０
℃に５分間、さらに室温下に１時間放置し、菌体の固定
化物を得た。

この固定化物を２ Ｘ ２ Ｘ ２ｍｍの立方体に切断
して用いた他は実施例−１と全く同様の操作でコレステ
ロールを含む培地でインキュベーションを行ったところ
、ＡＤＤが２０％の収率で得られた。

実施例６〜１７ 各種微生物菌体の培養に適した培地中で実施例−１の如
く培養した前培養液２ｍｌを用いて、実施例−１で示し
た方法でに一カラギーナン固定化菌体ゲルを得た。

これを下記表−２に示す培地組成をもった培地ニインキ
ユベーションして、コレステロールカラＡＤＤへの変換
を試みた。

その結果を下記表−３に示す。

ただし、各地中の大豆レシチン濃度はいずれも２．５重
量係とし、αα′αジーリジル濃度は０．０１６重量％
である。

また、基質コレステロール濃度は０．３％である。

ｐＨはいずれも７．０である。

実施例 １８〜２３ 基質としてコレステロールのかわりに下記表−４に示し
たステロール類を用いた他は、実施例１と全く同様の操
作を行い、Ｋ−カラギーナン固定化増殖菌アースロバフ
タ・シンプレックス（ＡＴＣＣ６９４６）を用いて、イ
ンキュベーションを行った。

その結果を下記表−４に示す。実施例 ２４ 平均分子量約２０００のマレイン化ポリブタジェン１０
０ｇを、３０ｇの２−ヒドロキシエチルメタアクリレー
トと共にトルエン中で反応してマレイン化ポリブタジェ
ンのモノエステル誘導体を得た。

これにベンゾインエチルエーテルを１．５ｇ加えた液状
のマレイン化ポリブタジェン（以下ＰＢＭ−２０００と
略す）を得た。

実施例１と同様の操作でアースロバフタ−・シンプレッ
クス（ＡＴＣＣ６９４６）を前培養し、この前培養液２
ｒｎｉ！を上記の様にして合成したＰＢＭ−２０００の
樹脂１ｇを溶解したベンゼン溶液３Ｍ中に加え、界面活
性剤であるＴｗｅｅｎ −８５（０，２％）共存下で充
分混合した後に４×４−に枠組みされた透明なポリエス
テルフィルム状に流し込み同フィルムで上下を被った後
、３００−３６０ｎｍの近紫外線を３分間照射した。

こうして、ＰＢＭ−２０００なる樹脂に固定化されたア
ースバクター・シンプレックスのフィルム状ゲルヲ得た
。

これを５×５−に切断して無菌水で洗浄後実施例１と同
様の方法でコレステロールを含む培地に加えてインキュ
ーベーションを行ったところ１５％の収率でＡＤＤが５
％の収率で４−ＡＤが得られた。

実施例 ２５ 寒天２００■を１０７７Ｚｌの蒸留水に加え煮沸溶解し
たのち、５０℃にまで冷却する。

溶液が５０°Ｃになった時点で、実施例１と全く同様の
方法でアースロバフタ−・シンプレックス（ＡＴＣＣ６
９４６）の前培養を行った培養液１ａを加え充分混合し
た後、無菌状態を保ったまま室温で２０時間放置した。

こうして得られたゲルを３Ｘ３Ｘ３關の立方体に切断し
、これをグルタルアルデヒド（１％水溶液）に１０分間
浸し次いでヘキサメチレンジアミン（１％水溶液）に５
分間浸した後、無菌水で洗浄した。

こうして得られたゲルを用いて実施例１と同様の方法で
コレステロールを含む培地にインキュベーションを行っ
たところ３０％の収率でＡＤＤが４％の収率で４−ＡＤ
が得られた。

比較例 酵母エキス（１重量％）、肉エキス（１重量％）及びペ
プトン（１重量％）含む培地をｐＨ７，０に調整し、１
２０℃で２０分間滅菌処理を行った。

この培地にアースロバフタ−・シンプレックス（ＡＴＣ
Ｃ６９４６）を−白金耳接種し、３０℃にて１４０回／
分の振盪下で２４時間培養した。

この培養液２ａを、酵母エキス（１重量％）、肉エキス
（１重量％）、ペプトン（１重量％）及び大豆レシチン
（２，５重量％）からなる培地（ｐＨ７，０）１００ｒ
ＩＬｌに加えて、３０℃にて１４０回／分の振盪下で２
４時間インキュベーションを行い、その後、基質として
３００７Ｑ（０，３重量％）のコレステロールを添加し
た。

同条件で８時間インキュベーションを行った後に、阻害
剤としてαα′αジーリジル１５．６即（０，０１６重
量％）を添加し、再び同条件下で７２時間インキュベー
ションした。

反応終了後、培地をジク頃しメタン（５０ｍ７）で２回
抽出し、この反応液をＴＣＬ−スキャナーで定量したと
ころ１，４−アンドロスタジエン−３，１７−ジオン（
ＡＤＤ）の収率は２９％であった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ステロール類を基質として、高分子固体担体に包括
   固定化されたステロール類の側鎖分解能を有する微生物
   菌体を、栄養培地中で培養し、該ステロールをアンドロ
   スト−１，４−ジエン−３゜１７−ジオンに選択的に変
   換せしめることを特徴とするアンドロスト−１，４−ジ
   エン−３，１７−ジオンの製造方法。 ２ 該微生物菌体が、アースロバフタ−属、ノカルディ
   ア属、ミコバクテリウム属、バチルス属、シュードモナ
   ス属、コリネバクテリウム属、フザリウム属、ブレビバ
   クテリウム属、プロタミノバクタ−属、ミクロバクテリ
   ウム属、セラティア属、アゾトバクタ−属又はアルカリ
   土類金属に鶏する菌種である特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ３ 該ステロール類が、ステロール、そのＣ−３工ステ
   ル誘導体、そのＣ−３工−テル誘導体又はこれらの酸化
   誘導体である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ 該固体担体が天然又は合成の高分子物質である特許
   請求の範囲第１項記載の方法。