JPS5940439B2 - 発酵法によるｌ−ヒスチジンの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は発酵法によるし一ヒスチジンの製造法に関する
。

さらに詳しくは、２−フルオロヒスチジンの生育阻害に
対して抵抗性を有する微生物変異株を栄養培地に培養し
て培養液中にＬ−ヒスチジンを蓄積せしめる発酵法によ
るし一ヒスチジンの製造法に関する。

その目的とするところは、食品・医薬品その他に広い用
途を有するし一ヒスチジンの新たな工業的製法を提供す
ることにある。

従来、発酵法によるＬ−ヒスチジンの製造方法としては
、種々の方法が知られているが、このうちアナログ抵抗
性株を用いる方法としては、ブレビバクテリウム属、コ
リネバクテリウム属、アルスロバクタ−属、ミクロバク
テリウム属、ノカルディア属、バチルス属、もしくはア
ゾトバクタ−属の各属のＬ−ヒスチジンアナログ（すな
わち２−チアゾールアラニンおよび１，２．４−４リア
ゾール−３−アラニン）抵抗性株を使用する方法（特公
昭４８−１８８２９、特開昭４９−４１５９２）及びそ
の改良法（特開昭４９−１００２９１、特開昭５０−４
９４９０、特開昭５０−４９４９１．特開昭５０−６９
２９２、特開昭５Ｏ−７０５９１）、大腸菌の２−チア
ゾールアラニン抵抗性株（特開昭５５−１６５７９８）
を用いる方法、その他セラチア属の２−メチルヒスチジ
ン抵抗性株を用いる方法が知られている。

優れたヒスチジンの製法は常に求められており、Ｌ−ヒ
スチジン生産菌について研究を行なった結果、これ迄Ｌ
−ヒスチジン生産菌の性質としては全く知られていなか
った２−フルオロヒスチジン抵抗性の性質を付与した変
異株が培養液中に著量のＬ−ヒスチジンを蓄積すること
を見出し本発明を完成するに至った。

本発明の２−フルオロヒスチジン抵抗性の変異株は公知
のアナログ抵抗性変異株の取得法によって得ることがで
きる。

例えばヒスチジン生産性菌を種々の薬剤処理あるいはＸ
線、γ線、Ｃｏ照射等の処理をすることによってさらに
は遺伝子組換の方法によって得られる。

本発明の変異株は例えばコ１１ネバクテリウム・グルタ
ミクルムＴＣＣ１３７６１、ブレビバクテリウム属細菌
ＡＴＣＣ１４９０２等のヒスチジン生産菌から誘導でき
る。

また、２−フルオロヒスチジン抵抗性の性質に加えて、
他の薬剤（例えば、２−チアゾールアラニン、１，２．
４−トリアゾール−３−アラニン、３−アミノ−１，２
，４−）リアゾール等のヒスチジンアナログ、その他プ
リンアナログ、ピリミジンアナログ、サルファ剤、金儲
アミノ酸のアナログ、グルタミンアナログ、グリシンア
ナログ等）に対する抵抗性を有する変異株あるいは各種
の栄養要求性（例えば、各種アミノ酸、ビタミン、核酸
塩基の要求性）を有する変異株を用いることによってさ
らに高収率でヒスチジンを生産することが期待できる。

このような変異株を得る具体的な操作例を以下に説明す
る。

操作例 コリネバクテリウム・グルタミクムの野生株ＡＴＣＣ１
３７６１をイースト・ブイヨン寒天培地上で１６時間培
養し、遠沈洗滌後１０３ｃｅｌｌｓ／ｄの細胞濃度にな
るように０．１ Ｍ トリス−マレイン酸緩衝液に懸濁
し、これに３００μｉ／ｍｌの濃度になるようにＮ−メ
チル−Ｎ′−二トローＮ−二トロソグアニジンを添加し
て室温で３０分間放置する。

この洗滌細胞を１０７ｃｅｌｌｓ ／シャーレ宛下記の
組成の２−フルオロヒスチジン１００μｇ／ｍｌを含む
寒天培地に接種して３０℃で３日間培養する。

発現する２−フルオロヒスチジン抵抗性のコロニー３０
個を釣菌してＬ−ヒスチジン生産試験を行い培養液中に
１■／ｍ１以上のＬ−ヒスチジンを蓄積する株をＬ−ヒ
スチジン生産菌として保存する。

これらのＬ−ヒスチジン生産菌のうち最も生産量の高か
った変異株をＣ３−９と命名した。

寒天培地の組成ニ ゲルコース１０ｇ、（ＮＨ４）２Ｓ０４１ｇ。

ＫＨ２ＰＯ４０，５ｇ、に２ＨＰ０，０．５ｇ、ＫＣｌ
０．２ 、！ｌｉ’、 ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，２ｇ
。

Ｆ ｅ Ｓｏ ・７ＨＯＯ，１ｊｊ 、 Ｍｎ ＳＯ
４・２ ７Ｈ２０５０”２Ｓ’、 ＣａＣｌ２ ２０ｍ？、
ビオチン３０μ９１ルチン１０■、２−フルオロヒスチ
ジン０．１ｇおよび寒天２０ｇを１１中に含む（ＰＨ７
，２）。

同様にしてブレビバクテリウム・５ｐｌ ＡＴＣＣ１４９０２から２−フルオロヒスチジン抵抗性
を有する変異株ＡＢ ３９を取得した。

これらの菌は微生物工業技術研究所にそれぞれコリネバ
クテリウム・グルタミクムＣ３−９微工研菌寄第６２２
９号及びブレビバクテリウム・３ｐ、Ｂ−３９、微工研
菌寄第６２２８号として寄託されている。

本発明に使用する培地組成としては使用菌株の利用しう
る炭素源、無機物その他の必要な栄養素を程良く含有す
るものであれば合成培地、天然培地のいずれも使用でき
る。

すなわち炭素源としてはグルコース、フラクトースソル
ビトール、グリセロール、蔗糖、澱粉、澱粉加水分解物
、糖蜜、果汁などの各種炭水化物、酢酸、フマール酸、
乳酸、グルコン酸、コノ・り酸などの有機酸、さらにエ
タノール、メタノールなどのアルコール類も使用できる
。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム
等の各種無機酸のアンモニウム塩、尿素、アミン類、そ
の地金窒素化合物、ならびにベフトン、肉エキス、酵母
エキス、コーン・スチープ・リカー、カゼイン加水分解
物、大豆粕酸加水分解物、各種発酵菌体およびその消化
物などが使用できる。

さらに無機物としては、リン酸第−カリウム、リン酸第
二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、
塩化ナトリウム、儲酸第−鉄、硫酸マンガン、炭酸カル
シウムなどを使用する。

勿論、本発明に使用する微生物が生育のために特定の栄
養素を必要とする場合には、その栄養素を適当量培地中
に存在させなければならないが、これらの物質は窒素源
として例示した天然物に含まれて添加される場合がある
。

培養は振盪培養あるいは深部通気攪拌培養などの好気的
条件下で行なう。

培養は通常２０〜４０℃の範囲で、ｐＨ３〜９で１〜５
日行われる。

培養終了後培養液よりＬ−ヒスチジンを採取するには公
知のイオン交換樹脂法などの方法が用いられる。

以下に実施例を示す。

実施例 １一 種菌としては、コリネバクテリウム・グルタミクムＣ３
−９を用いる。

この変異株を、グルコース４０Ｓ１ポリペプトン２０ｇ
、ＫＨ２ＰＯ４１，５、！ｉｆ’、に２ＨＰＯ４０，５
ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，５ｇ、ビオチン５．０μ
Ｉ、尿素３ｇ、酵母エキス５ｙをｉｚ当りに含むｐ Ｈ
７，２の種培地４０ｍ１を含む３００罰容三角フラスコ
に接種して３０°Ｃで２４時間振盪培養した。

この種培養液１ｍｌ宛を２０ｍ１の下記の組成の発酵培
地を含む３００ｍ１容三角フラスコに接種して、３０℃
で３日間振盪培養したときのし一ヒスチジンの生成量は
３．２７１１Ｉｉ／ｍｌであった。

対照として同様に培養した野生株ＡＴＣＣ１３７６１の
培養液中のＬ−ヒスチジンの量は０．１〜／ｍｌ以下で
あった。

用いた発酵培地の組成は次のとおり。

廃糖蜜（グルコース換算）７０ｇ、肉エキス５ｇ、（Ｎ
Ｈ４）２ＳＯ４４０ｇ。

ＫＨ２ＰＯ４１，５ｇ、に２ＨＰＯ４０，５ｇ。

ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，！ｌ、尿素３ｇ。

ＣａＣＯ３３０ｇを１１当りに含む（ｐＨ７，４）。

実施例 ２ 種菌としてブレビバクテリウムｓｐ、Ｂ−３９を用いる
他は実施例１と同様に実施した結果培養液中に４−２”
？／ｍｌのし一ヒスチジンが蓄積した。

対照として培養した野生株ＡＴＣＣ１４９０２の培養液
中のし一ヒスチジンの含量は０．１ ｍ９／ｒｎｌ以下
であった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
   に属し、２−フルオロヒスチジンの生育阻害に対して抵
   抗性を有する微生物変異株を栄養培地に培養して培養液
   中にＬ−ヒスチジンを蓄積せしめ、該培養液中からし一
   ヒスチジンを採取することを特徴とする発酵法によるし
   一ヒスチジンの製造法。