JPS5946494B2 - 抗腫瘍剤及びその製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は乳酸連鎖球菌から抽出、分画して得る抗腫瘍剤
及びその製法に関する。

近年菌体成分の抗腫瘍性が注目されているが、成分それ
自体が敗血症、産褥熱、狸紅熱、丹毒、等の病原菌や腐
敗菌の菌体そのものであったり、菌体抽出成分とはいえ
結核菌、プルセラ症菌、腐敗菌、溶血性連鎖球菌等の有
害菌の菌体成分のため毒性が強いことなどにより腫瘍の
治療上まだ満足すべきものがない。

本発明者らは毒性の低い抗腫瘍性物質の検索に当り古く
から食品として利用されている乳製品例えばヨーグルト
、ケフィール、酸乳、乳酒、各種チーズ等酪農乳食品に
利用されている乳酸醗酵菌に着目し、その生物活性に関
する研究材料としてまた細菌として最初に純粋分離され
たという歴史的背景があり、乳製品原料としての獣乳中
に最も普遍的に存在し、チーズスターターとしての乳酪
菌として最も重要な菌種で且つ非病原性菌である点に配
慮を置いて、乳酸連鎖球菌を選び、とくにストレプトコ
ッカス・ラクチスを代表菌種としてその培養菌体の抽出
物に関してその生物活性を検討したところ、当該菌の超
音波破砕物をホルムアミド酸アルコール及びアセトン処
理して抽出物たる多糖体含有画分が他の細菌とくにダラ
ム陰性菌の内毒素としてのリポ多糖体、肺炎球菌の型特
異性多糖体等に比べはるかに低毒性であり、しかも少量
投与により優れた抗腫瘍作用を示すことを見出した。

以下本発明の詳細な説明する。先ず本発明の説明の都合
上本願抗腫瘍剤の製法について述べる。

即ら本発明製法ではストレプトコッカス・ラクチスに代
表される乳酸連鎖球菌を該閑の発育し得る培地例えば固
体培地、液体培地等で培養後常法により集菌する。

この培養においてとくに多量の菌体を得る場合には液体
攪拌培養が望ましく、培養温度は通常２５〜３７°Ｃの
範囲であり、この内とくに高温部で良く生育する。

また培養時間は１〜２日以内で行なわれるが通常１８時
間培養で足りる。

次に上記の如くして得られた乳酸連鎖球菌の菌体を破砕
し、破砕物を遠沈、濾過等により沈渣を得るが、この工
程に於ては先ず菌体を破砕する前に蒸留水、生理食塩水
または燐酸緩衝液等にて洗浄する。

前記菌体の破砕は蒸留水による菌懸濁液を用い凍結融解
法、ホモジナイザー法、酵素溶解法或いは超音波破砕法
等によるが抽出目的物の生物活性維持と以後の処理手段
を考慮すれば超音波破砕法が望ましい。

得られた菌体破砕物懸濁液は約１０，０００×ｇ１時間
の遠沈分離或いは濾過等を行ない粗細抱締を主成分とし
て高分子物質が沈渣として分画分離されるものである。

得られた沈渣にはホルムアミドを加えて加熱し、その後
冷却せしめる。

この工程に於て熱水抽出法を採らずホルムアミド抽出に
よるのはアルカリ処理によって積極的に中性多糖類など
結合″の強い糖類を抽出せんとする意図による。

またホルムアミド添加量は通常前記沈渣の１０倍容量で
行なう。

かくして得られたホルムアミド処理菌体液に更に酸アル
コールを添加して、のち遠沈に付されて上滑液を得る。

この工程は前記菌体の細胞壁の基礎構造物たるペプチド
グリカン及び菌体内高分子蛋白を分離除去するためのも
のである。

而して添加される酸アルコールは上記目的に沿う性質の
ものを十分量適用する必要があり、例えばエタノール＝
２Ｎ塩酸＝９５：５（容量）の酸アルコールを前記ホル
ムアミド添加沈渣の２．５倍容量で添加すればよい。

またこの工程における遠沈は１０．０００Ｘ、９．３０
分間で所望上清液を得る事ができる。

次に前記上滑液をアセトン処理して沈殿物を得る。

前記アセトンの用量は前記上清液に対して約４倍容量で
あり、沈殿物の分離は例えば遠沈法によればよい。

分離された沈殿物は十分に洗浄され本発明薬剤とされる
。

かくして得られた沈殿物は前記乳酸連鎖球菌における細
胞壁特殊構造の主要構成分である含多糖体組成物であり
、分析の結果、当該組成物は炭水化物及び蛋白質の他に
少量の有機リン酸、ＤＮＡそしてＲＮＡを含むことが明
らかである。

本発明に於て前記沈殿物をそのまま有効成分として利用
する事ができるが、これに更に増量剤、安定剤などの常
用の成分を適宜加えて用いる様にしてもよい。

また本発明抗腫瘍剤の形態は特に制限がすく、例えば前
記沈殿物を凍結乾燥して粉末とし或いはカプセル剤、懸
濁液、顆粒又は錠剤などの形態として用いることができ
る。

更に本発明抗腫瘍剤の投与方法も任意であり、例えば経
口投与、腹腔内投与、血管内投与などの方法を適宜用い
ることができる。

本発明で用いる乳酸連鎖球菌としては抗腫瘍作用を発揮
しうるものであればよく、たとえばストレプトコッカス
・ラクチスＢＫ−０４５株などを挙げることができる。

この菌株は、本発明者らによって市販牛乳より分離され
たものであり、主要な菌学的性質は以下に示す通りであ
る。

ストレプトコッカス・ラクチスＢＫ−０４６株ａ）形態
的性質 （１）形 連鎖状球菌 大きさ ０．６〜１．０μ （２）運動性 なし く３）ダラム染色 十 ｂ）培養的性質 （１）発育条件 通気嫌気性 （２）発育温度 ４５℃＋ （３）ゼラチンの液化 − （４） リドマスミルクの還元 十（５）糖類の
発酵 マンノース ＋ マンニット ＋ マルトース ＋ ザリチン ＋ ショ糖 −デンプン − グルコース ＋ イヌリン − Ｃ）生理的性質 （１）オキシダーゼテスト − （２）カタラーゼテスト − （３）０−Ｆテスト Ｆ （４）食塩（６，５係） 生育せず （５） ｐｉ−１（９，６） 生育せず（
６）６０℃、３０分の加熱 生育せず （７） グルコースから乳酸の生成率 ９２％（８）
乳酸の旋光性 Ｄ＋ 以上の菌学的性質をもとにして、バージ−のマニュアル
・オブ・デイタミネイティブ・バクテリオロジ−（Ｂｅ
ｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉ−
ｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｇｙ）第７版および
第８版ならびに「乳酸菌の研究」（北原覚雄著）により
検索した結果、ストレプトコッカス・ラクチスに該当す
ることが認められた。

なお、この菌株はストレプトコッカス・ラクチスＢＫ−
０４５株（微工研菌寄第４５９１号）として工業技術院
微生物工業技術研究所に保管されている。

本発明抗腫瘍剤の特色を列記すれば次の通りである。

（１）本則は後記実例に明らかな如く、日本産ドンリウ
ユラットを用いての実験に於て静脈内投与で１１ｎＩ？
／ｋｇ×１０日、腹腔内及び経口投与で２５η／ｋｙＸ
１０日と極めて少量の投与による顕著な抗腫瘍効果が
認められており、ヒトの腫瘍に対しても少量投与で同様
の効果を有することが示唆される。

とくに本則は現在認められている他の各種抗腫瘍剤にお
ける本則と同様の実験結果と比べてみるに（癌と化学療
法第２巻、第４号、第６０５頁、昭和５０年）、ラット
の尾静脈投与で腹水肝癌ＡＨ−４ＩＣに反応しているも
のは本則の他に見当らず、従って本則の特異的抗腫瘍性
には犬なる期待が持たれる。

（２）本則のラットを用いた実験においてＬＤ５ｏカ静
脈内投与で４５０ｍＩ？／ｋｇ１腹腔内投与≧４ｇ／ｋ
ｇ、経口投与≧２０ｇ／ｋｇと極めて高く、また実験的
には見るべき副作用もないなど、その安全性は極めて高
い。

（３）尚本則の効果と同量に関連して本則のラット尾静
脈内投与有効量である１〜／ｋｇＸ１０回は此種含多糖
体成分の抗腫瘍剤中では極めて少量であり、しかも前記
急性毒性値から想像されうる安全量のはるかに低量であ
る事も本則の大きな特徴である。

（４）本発明の製剤はその高い薬効と安全性の故に経口
投与が可能である。

したがって被投与者に投与抵抗感がないことが期待され
る。

次に本発明を実施例により詳しく説明する。

実施例 １ 乳酸連鎖球菌ストレプトコッカス・ラクチス株（微工研
菌寄第４５９１号）をイーストペプトングルコース培地
を用い培養温度約３２°Ｃで１８時間培養後、培養菌体
を常法により集菌し、得られた菌体を蒸留水にて洗浄し
て後閑体１５０ｇを蒸留水に懸濁し、５００ｍ１コンビ
ルビーカ一ヲ用い総量５００ｍ１の菌懸濁液とした。

この様にして得た菌懸濁液を超音波発生装置（トミー精
工、ＵＲ−２００Ｐ）を用い氷水中にて２０にＨｚ、
’２００Ｗ１時間超音波破砕を行なった。

この菌体破砕液を遠心分離（１０，０００Ｘ、９１１時
間）し、粗細胸壁を主成分とする高分子物質を沈渣とし
て分画した。

この様にして得られた沈渣１００ｇにホルムアミド１
ｋｇを加え油浴中にて１７０℃、２０分間加熱処理して
冷却後、２．５倍容量の酸アルコール（エタノール：２
Ｎ塩酸−９５：５（溶量））を添加して細胞壁の基礎構
造物のペプチドグリセリン及び細胞内高分子蛋白を遠心
分離（ｉｏ、ｏｏ。

Ｘ、９，３０分間）により除去し、上清液を得た。

かくして得られた上清液区分に４倍容量のアセトンを加
えて細胞壁特殊構造物の主成分である多糖類含有の組成
物を沈殿、分離せしめた。

この沈殿物を蒸留水及びエーテルにて各２回洗浄し、凍
結乾燥させて炎天白色の粉末を得た。

この粉末は水難溶性であり、２係水溶液で中性（ｐＨ７
，０）、稀薄なアルカリ液にはやや可溶性であり且つエ
タノール、アセトン、エーテル等の有機溶媒には不溶で
その主要成分組成は粉末１００■中炭化水素２４．４１
Ｎ？係、蛋白質３ｓ、３ｒｎ９％、有機リン酸０．３■
係、ＤＮＡ０．１■係、ＲＮＡ４．ＩＴｕ？係であった
。

実施例 ２ 実施例１により得た多糖類含有組成物たる本則を用いて
、３系の腹水肝癌に就き抗腫瘍効果の検討を行なった。

日本産ドンリュウラット雌（体重約１２０ｇ）を１群６
頭として各ラットの尾静脈より１０７個の腹水肝癌（Ａ
Ｈ４１Ｃ，ＡＨ４４、ＡＨ６６）を移植し、３日後より
本則を連続１０日間にわたり、尾静脈内投与（３系３群
に１〜／に９Ｘ日他の３系３群に５〜／ｋｇ／日）、腹
腔内投与（３系３群に５■／ｋｙ／凪他の３系３群に２
５〜／ｋｙ／日）及び経口投与（３系３群に５■／に９
Ｘ日、他の３系３群に２５〜／に９Ｘ日）の用法用量に
より投与し、前記腹水肝癌移植後６０日間にわたる延命
効果によって無投与対照群と比較しつつその抗腫瘍効果
を検討した。

抗腫瘍効果の判定は１群６頭のラットの合計生存日数を
もって延命効果を見た（癌と化学療法第２巻、第４号、
第６０５頁、昭和５０年）。

なお判定基準は１群６頭のラットの合計生存日数が５０
日以下を−、５１〜２００日を士、２００日以上を十と
定めた。

水剤の抗腫瘍効果実験の結果は第１表に示す如く尾静脈
内投与では１■／ｋｙＸ１０日、腹腔内投与及び経口投
与では２５ ｍ９／ｋｇｘ １０日で強い抗腫瘍効果が
認められた。

尚無投与対照群のラットは腹水肝癌投与後１週間前後で
金側死亡した。

参考例 本発明薬剤のラット急性毒性ＬＤ、。

は１週間観察で尾静脈内投与４５０■／ユ、腹腔内投与
〉６００〜／ゆ、経口投与＞２０ｇ／ｋｙであった。

また最小致死量（ＭＬＤ）はラット１０頭を用いた尾静
脈内投与で〉４００■／ｋｙであった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 乳酸連鎖球菌の細胞壁骨格に付着の特殊構造物を構
   成する含多糖体組成物を有効成分とする抗腫瘍剤。 ２ 乳酸連鎖球菌の破砕物から粗細抱締画分を得、これ
   をホルムアミド処理し、更に酸アルコール処理して析出
   沈殿部を除去し、得られた上清部をアセトン処理して沈
   殿物を得ることを特徴とする抗腫瘍剤の製法。