JPS59501905A - 動物組織の修復 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 動物組織の修復 発明の背景 １、発明の分野 この発明は、動物、特にヒトの組織、特に繊維芽細胞の修復を促進する組成物に 関する。この発明はざらに、上記組成物を局所的又は全身的に投与することによ る傷の治療方法に関する。

２、７−　の− 外傷、やけど、糖尿病性潰瘍、褥槍潰瘍、及び他の外傷の部位において迅速に細 胞増殖を促進する必要かある。

動物細胞の迅速な増殖を促進する多数の「増殖因子」が知られている。これらの 増殖因子は、皮膚性増殖因子（ＥＧＦ）、）ランスフォーミング増殖因子（↑Ｇ Ｆ）及び神経増殖因子（ＮＧＦ）を包含する。しかじなから、この発明の以前に は、これらのいずれの増殖因子にも、傷の治癒を加速する薬理的に許容できる薬 剤として見出されたものはなかった。

イタシュリン（ホルモン）の細胞分裂活性は、プロスタグランジンＦ、（ホルモ ンそのものというわけではないが、類似の性質を有しており、ｍ管性の平滑筋の 収縮を引き起こす）の存在によって何倍にも増加することトー１コールド・スプ リング・／Ｘ−バー研究所ニューヨーク、ｐｐ４０３−４２４参照）。同様なイ ンシュリンの活性化が繊維芽細胞増殖因子によって起きることがビー・ニス・ル ドランドらによってＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

ＳｃｉユニＵ、ＳユＡ、７１：２８００−２８０４　（１９７４）に記載されて い条。

また、それがＥＧＦによって引き起こされることがアール・ダプリュ・ホリーら によ−）　テＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、υ、Ｓ、Ａ、　７１：２Ｈ８−２９１１（１９７４）に記載されてい る。

さらに、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７ ８：１２７９−１２８３　（１９７９）にシー・ディー・スタイルズらによって 発表された［反応性−進行Ｊ　（ｃａｍｐｅｔａｎｃｅ−ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏ ｎ）理論においては、血小板誘導増殖因子又はＩａｍ芽細脳細胞増殖因子インシ ュリン様の増殖因子であるソマトメジンＡ及びＣのようなインシュリン族のもの と組み合わさって、細胞増殖について陽性の効果を示すことが示されている。

戸」王ｕｅ　Ｇ凹１月り上記１１びユアールーパサーガ編、スプリンガーファー ラーク出版、ニューヨーク（１！３８１）に記載されているように、多くの新規 なペプチド増殖因子が単離され、特徴づけられている。しかしながら、それらの 物質の生体内での活性はほとんど研究されていない、多くの場合、利用できるペ プチドの量が少量であるので、生体内での研究が制限されてきた。ペプチド増殖 因子の潜在的な適用の重要な領域は、外傷の治癒である０重症のやけど、外傷、 糖尿病性及び褥槍潰瘍等の治療において迅速な傷の治癒が必要であるにもかかわ らず、現在のところ、薬剤によって傷の治癒を加速する実際的な方法は存在しな い。上述のＴｉ５ｓｕｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓの１２３ページには、 ＥＧＦがこの領域において有用であるかもこの発明は、動物の細胞、特にヒトの ｍ維芽細胞の増殖を促進するための組成物を提供する。この組成物は、その活性 成分としてベータ型トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β）及び活性化剤 を含む。活性化剤は、表皮増殖因子（ＥＧＦ）及びアルファ型トランスフォーミ ング増殖因子（ＴＧＦ−α）から成る群より選ばれる少なくとも１つである。

ＴＧＦ−βと活性化剤は、好ましくは等モル量存在し、活性成分は細胞増殖（組 織修復）を促進するのに少なくとも十分な量存在する。

もう１つの具体例として、この発明の活性化されたＴＧＦ−β組成物は、他の（ 第２の）増殖因子と混合されてその活性グ向上されることもできる。

組成物は、局所的に塗布するのに適当な、例えば生理食塩水や、精製コラーゲン 懸濁液のような、いずれの坦体とでも製剤化することができる。組成物はまた、 全身的な投与に適したいずれの坦体とでも製剤化することができる。

この発明の組成物の局所的投与は、やけど、外傷及び他の傷の部位に組成物を直 接塗布することによって行なわれる。多くの場合、周期的又は継続的な投与が好 ましいであろう。なぜなら、活性成分は、増殖が促進されている細胞によって生 理的に利用されるからである。

さらに、この発明の組成物は、治療すべき傷の性質及び部位に応じて、注射、経 腸的、又は経皮的パ、ツチによって全身的に投与することもできる。

の詳細な； 「トランスフォーミング増殖因子Ｊ　（ＴＧＦ）という語は、トランスフオーム されていない指標細胞にトランスフオームされた表現系を与えるポリペプチドの 組を包含するように定義される。トランスフオームされた表現型とは、操作上、 単層増殖の密度依存性阻害の欠失、単層における過剰増殖、細胞形態の特徴的な 変化、付着独立性の獲得及びその結果である軟寒天中での増殖可能性によって定 義される。トランスフオームされていない、非腫瘍性細胞は、軟寒天中でコロニ ーを形成しないが、培養細胞の付着独立増殖は、生体内での腫瘍の増殖と特に密 接な関係を有する。

ＴＧＦは最初ウィルスによってトランスフオームされたマウス腫瘍細胞から発見 されたが１組織からペプチドを抽出するための酸／エタノール法の適用によって 、ＴＧＦは、試験した全ての動物種の、はとんど全ての組織中に見出された。Ｔ ＧＦ活性は、通常、生体外における表現型トランスフォーメーション分析によっ て測定されるが、このことは、生体内におけるＴＧＦ活性が、悪性腫瘍の発達と 必ずしも関係を有していることを暗示していない。実際に、トランスフオームさ れた表現型は、正常な胎児発生に伴なう１つの生理的状態であり、ガン遺伝子は 、はとんど全てのを推動物の正常細胞から発見されている。正常細胞からのこれ らのガン遺伝子の機能は現在のところ知られていない。悪性細胞の増殖において 、ＴＧＦ活性が不可逆的に過度に発現されているかもしれないが、手もとにある データによると、ＴＣＦは、より良性のそしておそらく必須的な役割を正常細胞 の機能中に有していることが示されている。現在のところ、　ＴＧＦの本来的な 生理学的役割は何であるのか知られていない。この点、ＴＧＦは最近発見され単 離された他のペプチドホルモン及びホルモン様物質と同様である。このことは、 はっきりした化学構造は知られているかもしれないがその生理学的性質がはっき りしない多くの神経系ペプチドについて特にほんとうである。

最初に単離されたＴＧＦである内挿増殖因子（ＳＧＦ）のだ。なぜなら、それは 、ウィルスによってトランスフオームされた細胞における腫瘍表現型の発現のた めの直接的機構を提供したからである。ＳＧＦの２つの重要な性質がこれらの初 期の研究の中に記載されている。すなわち、（１）表現型のトランスフォーメー ションを引き起こすＳＧＦの効果は、ＳＧＦが連続的に存在することに依存して おり、かつ、その効果は、ＳＧＦが除去されたときに可逆的である、及び（２） 　ＳＧＦの効果は、このペプチドを合成したその細胞中で発現され、この性質は オートクリの性質は、新たに発見された他ΦてのＴＧＦについて明らかに示され たわけではないけれども、ＴＧＦ全体の機能は、局所的なものであり、バラクリ ン（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）　、又はオートタリン機構によって細胞の機能を可逆 的に制御するホルモン様の物質であることが非常に合理的に推測できる。

ＳＧＦが１９７８年に発見されて以来、種々の供給源から得られた多くのＴＧＦ が記載されている。これらのＴＧＦは２つの＠鴎に分けることができる。すなわ ち、培養細胞の規定された培養液から単離された外細胞性ＴＧＦと、細胞又は組 織を直接抽出することによって単離された内細胞性（細胞関連）　ＴＧＦである 。最近、外細胞性ＴＧＦが、ネズミ科動物の非腫瘍細胞から単離されたけれども 、一般的に、規定された培地の使用は、長期間にわたって大規模に培養できる、 ウィルス的又は化学的にトランスフオームされた務歯動物細胞及びヒト腫瘍細胞 ラインを包含する腫瘍細胞ラインに限定されてきた。＃／エタノール抽出法をＴ ＧＦの単離に採用することにより、調べるべき細胞の型及び組織の量に関する制 限が取り除かれた。この方法を用いることにより、全ての組織又は細胞の抽出物 は、それが腫瘍性のものか非腫瘍性のものであるか、おとなのものであるか胎児 のものであるか、ヒト、ウシ、又はネズミのゲノムであるかどうかにかかわらず 、軟寒天分析においてコロニーを形成することがわかった。従って、定義として 、これらの抽出物はＴＣＦ活性を有すると言う。

種々の上皮細胞ライン及び繊維芽細胞ラインは、ＴＧＦの存在下において軟寒天 中でコロニーを形成する。

しかしながら、最も一般的に用いられている指標細胞ラインはラットの腎臓繊維 芽細胞クローン、ＮＨＫ　４９Ｆである。これは、ＴＧＦに対する強いコロニー 形成反応の故に選択されたものである。ラット−１細胞及びマウスＡＫＲ−２８ 細胞も、指標細胞として成功的に使用されている。

上述した全てのＴＣＦは、低分子量のポリペプチドであって、酸及び熱安定性に 関する物理的性質並びにトリプシン及びジチオスレイトール処理に対する感受性 はＳＧＦのそれと共通する。しかしならが、これらのＴＧＦの間には、特にＥＧ Ｆとの関係に関し、きわだった生物学的性質の相違が存在する。あるＴＧＦは、 ＥＧＦとは抗原的に区別できるけれども、レセプターへの結合に関しＥＧＦと競 合するので、ＥＧＦと構造的な類似性を有している。他のＴＧＦはレセプターへ の結合に関しＥＧＦと競合しないが、その代わり、軟寒天分析におけるコロニー 形成の活性に関しＥＧＦに依存している。一般的な用語であるｒＴＧＦＪという 語をこれらの異なる因子に名付けることによるあいまいさを除去するために、Ｅ ＧＦとの相互作用、すなわち、ＥＧＦレセプターへの結合に関する競合及び軟寒 天中でのコロニー形成の誘導にＥＧＦを必要とするかどうかに基づいてＴＣＦ族 のメンバーを操作的に分類することが提案されている。

この発明の目的のために、レセプターへの結合に関してＥＧＦと競合するが、軟 寒天中でのコロニー形成・の誘導にはＥＧＦを必要としないＴＧＦをＴＧＦ−α と定義する。これらの性質を有するＴＧＦは、ＳＧＦ及び他の腫瘍細胞から誘導 されたＴＧＦ並びにマウス胎児からのいくつかのＴＧＦを包含する。

この発明の目的のために、レセプターへの結合に関しＥＧＦと競合しないが、軟 寒天中でのコロニー増殖に関してＥＧＦを必要とするＴＧＦをＴＧＦ−βと定義 する。　ＥＧＦの存在下で分析すると、ＴＧＦ−βは、腫瘍性及び非腫瘍性細胞 ライン及び組織の内細胞性ＴＧＦの主たるコロニー形成活性を表わす、一旦適当 な分析方法を用いれば、規定された培地にもＴＧＦ−βが発見されるであろうと 推測される。

レセプターへの結合に関し、ＥＧＦと競合しないし、コロニー形成においてＥＧ Ｆを必要としないＴＧＦをＴＧＦ−γ（ガンマ型ＴＧＦ　）と呼ぶ。このような ＴＧＦは、ウィルス的又は化学的にトランスフオームされた細胞の規定された培 地中で発見され、記載された。最後に、レセプターへの結合に関し、ＥＧＦと競 合するし、軟寒天中でのコロニー形成に関してＥＧＦを必要とするＴＧＦをＴＧ Ｆ−δ（デルタ型ＴＧＦ　）と呼ぶ。ＥＧＦ自体は弱いＴＣＦ−δに分類される 。

曜ｌ」じＵ１１ム勇 我々の研究室での研究は、細胞及び組織から直接ＴＧＦを単離することに向けら れていた。この目的のために、酸／エタノール抽出法を、エイ・ビー・ロパーツ ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　［１，Ｓ、Ａ、、　７ ７：３４１１４−３４９８　（ＩＨＯ）に記載しであるように修飾し、さらに精 製するために、クロマトグラフィーと高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ） を採用した。非腫瘍性の指標細胞（ＮＲＫ）を誘導して軟寒天中にコロニーを形 成させる能力によって測定されるＴＧＦ活性を、形成されたコロニーの数及び大 きさの２つに関して像解析装置で解析した。　ＨＰＬＣを用いることにより、２ つの明確に異なるＴＧＦ　、すなわちＴＧＦ−αとＴＧＦ−βとは、ＭＳＶによ ってトランスフオームされた３Ｔ３細胞の酸／エタノール抽出物の同一のプール から単離することができることが示された。この目的のために、０．１％のトリ フルオロ酢酸中に解けたアセトニトリルの直線勾覧を用いたカラムを用いた。マ ーカーＥＧＦよりも先にカラムから溶出されるＴＧＦ−αは、添加ＥＧＦの不存 在下において、軟寒天中での小さなコロニー（８５０−３，１００ｐ−ｍ”）の 形成を誘導する能力と、放射レセプター分析においてＥＧＦと競合する能力によ って特徴づけられる。

ＴＧＦ−α及びマーカーＥＧＦよりも後に溶出されるＴＧＦ−βは、レセプター への結合に関してＥＧＦと競合せず、軟寒天中において大きなコロニー（＞３， １００　ｐ−ｒｌ）の形成を誘導するのにＥＧＦを必要とする。

ＭＳＶによってトランスフオームされた３Ｔ３細胞からのＴＧＦ−αは、同じ細 胞の規定された培地から単離されたＳＧＦ並びにヒト及びラットの腫瘍細胞ライ ンから単離された他のＴＧＦと類似している。最近、ヒトの黒色腫細胞ライン及 びウィルス的にトランスフオームされたラット胎児繊維芽細胞からのＳＧＦとＴ ＧＦ−αを均一になるまで精製した。ヒトの黒色腫ＴＧＦ−αは分子量が７，４ ００の単鎖ポリペプチドである。そのアミノ酸組成及びクロマトグラフィーにお ける挙動はＥＧＦと大きく異なるが、ネズミＳＧＦとラットＴＧＦ−αのそれと 類似している。このことは、ヒト、ラット及びマウスゲノムからのＴＧＦ−αは 、互いにＥＧＦよりも密接に関連していることを示唆している。従って、ＴＧＦ −αは１種を越えた有用性を有しているかもしれないという合理的可能性が存在 する。

肉腫ウィルスによってトランスフオームされた鰯歯動物細胞ラインにおいて、Ｔ ＣＦ−αの培地への放出は、トランスフオームされた表現型の発現と関係を有し 、また、ＴＧＦ−αを放出する選択されたヒト腫瘍細胞ラインにおいては、軟寒 天中で増殖する腫瘍細胞の能力は、それらが分泌するＴＧＦ−αの量と関係する 。しかしながら、腫瘍性の挙動にとって、ＴＧＦ−αの分泌は絶対的に必要なも のではない。ＴＧＦ−αを分泌しない、ある化学的にトランスフオームされたネ ズミ細胞ライン及びヒト肺ガン細胞ラインは、レセプターへの結合に関しＥＧＦ と競合しない、強烈なＴＧＦ活性を示す。

ＭＳＶによってトランスフオームされた３７３細胞の酸／エタノール抽出物中の ＴＧＦ−βは、多くの腫瘍性及び非腫瘍性組織から単離された他のＴＧＦと類似 している。

第２のＨＰＬＣカラム上でさらに精製すると、ＭＳＶによってトランスフオーム された細胞のＴＧＦ−βは、ｎ−プロパツール（４８χ）の勾配中において、ウ シの唾腺のＴＧＦ−βの１つのピークと同じ位置で溶出し、それぞれ２８Ｏｎ＋ ｓにおいて小さなピークを有していた。これら２つのＴＧＦ−βは、一方が腫瘍 性のマウス細胞ラインからのものであり、他方が非腫瘍性のウシ組織からのもの であるが、メルカプトエタノールの存在下での５ＯＳ−ＰＡＧＥにおいて分子量 １２．５００〜１３，０００ダルトンのタンパク質として泳動し、メルカプトエ タノールの不存在下においては見かけ上２５．０００〜２８，０００ダルトンの タンパク質として泳動する。

従って、これらは、互いに緊密に関係しており、丁ＧＦ−α及びＥＧＦの双方と も異なる。調べられた全ての非腫瘍性組織中のＴＧＦ−βの発見により、これら のＴＣＦの正常な生理学的機能が示唆される。従って、ＴＧＦ−βが種を越えた 有用性を有するかもしれないという合理的な可能性が存在する。

ＴＧＦ−βのアミノ酸　び配 操作を組合わせて、ウシの腎臓からのＴＧＦ−βを均一なＴＧＦ−β（２０−５ ０ｐｍｏ＋）の試料を取って乾燥し、密封した空のチューブ内で、０．１％液体 フェノールを含む定常的に沸騰した１００，１の塩酸中で、１５０　”Ｃで２時 間加水分解した。半量シスチンとメチオニンを過ギ酸酸化によって定量し、酸加 水分解した。アミノ酸のオルソ−フタルアルデヒド誘導体の分析を、蛍光光度計 と積分器を備えた修飾アミノ酸分析機上で行なった。

アミノ末端配列分析のために、約５００ピコモル（Ｍ、　２５．０００）　（７ ）　ＴＧＦｉを、ＩＮ）　！ｊ　ス−ＨＣｌ／＜　、　−ｙ　７−（ｐＨ８，４ ）中で、６Ｍのグアニジン−ＨＣｌの存在下において、ジチオスレイトールとヨ ードｔ４ｃ　］酢酸とによって還元し、Ｓ−カルボキシメチル化した。過剰の試 薬を、５ミクロ７５０　ｘ　４．８ｍ＋ｓカ７ム上で、０．１Ｘ　ＴＦＡ中（７ ）、　０−９０％アセトニトリルの勾配（１ｚ／分）で溶出するＨＰＩＣ：にょ って、カルボキシメチル化タンパク質から分離した。フルオレスカミン（ｆ　Ｉ ｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ）検出を用いたアミノ酸分析によって算出されたタンパ ク量に基づく操作全体の回収率は９Ｂ％であった。

気相配列決定機を用いて、約５００ピコモル（Ｍ。

１２．５００）のＳ−カルボキシメチル化タンパク質を自動エドマン分解した。

ＰＴＨ−アミノ酸をＨＰＬＣ：装置を用いて同定した。最初の収率は約３０％で あり、繰り返した収率は約８０％であった。

アミノ酸の分配を次の表にまとめた。

表１ ウシ腎臓ＴＧＦ−βのアミノ酸組成（ａ）ＬｉＺ１　失１乙ｉ亙］）（平均上範 囲）アスパラギン酸　２５±１ スレオニン　７±１ セリン　１６±２ グルタミン酸　２６±１ プロリン　Ｎ、Ｄ。

半量シスチン（ｃ）　１６±２ バリン　１７±１ メチオニン（Ｃ）３±０ （ａ）　１５０℃において８Ｎ　ＨＣ：Ｉ中で２時間加水分解した後に定量した 、精製ウシ腎臓β型ＴＧＦのアミノ酸組成。値は、３つの異なる試料を用いた３ つの異なる定量に基づ〈　。

浄書（内容【こ変更ない　１４ （ｂ）それぞれのアミノ酸の１モル当たりの残基の数は、明らかな２５　、００ ０の分子量Ｃ基づく。

（Ｃ）過ギ酸酸化及び酸加水分解によって定量した。

Ｎ、　ｌ）、一定量せず。

ウシ腎臓ＴＧＦ−βをＮａＤｏｄＳ０４−ポリアクリルアミドゲル上での電気泳 動（二よって分析することＣ二より、いくつかのヅスルフイド結合が鎖内部に存 在することが示唆された。上記結果をヒトの胎盤又はヒトの血小板がらのＴＧＦ −βの分析Ｃ二よって得られた結果と比較することによって、それぞれのアミノ 酸組成の間には有意の差が存在しないことがわかり、Ｎ−末端が極めて類似して いることが予想される。

還元され、Ｓ−カルボキシメチル化されたウシ腎臓ＴＧＦ−βを、気相配列決定 機を用いた自動エドマン分解によってアミノ酸配列分析したところ、次の単−Ｎ −末端アミノ酸配列が明らかになった。（ＣＭＣはＳ−カルボキシメチＬｙｓ− Ａｓｎ　−ＣＭＣ− 初期及び繰り返し収率は、標準タンパクとして用いたミオグロビンについて計算 された収率（二等しいことがわかった。少なくとも、これらの結果は、ＴＧＦ− βのそれぞれの２つのサブユニットのＮ−末端の最初の１５のアミノ酸配列は同 一であり、　ＮａＤｏｄＳＯ４−ポリアクリルアミドゲル上で、還元ＴＧＦ−β の単一タン・ぐり質バンドが見ら／ｌ れることを示している。さらに、ウシ腎臓ＴＧＦ−βのＮ−末端配列は、ヒト胎 盤からのＴＧＦ−βの部分的な配列と同一であり、このことは、異なる種及び異 なる組織源からのβ型ＴＧＦが高度に関連していることが示唆される。

工ヒＬ豊渦並部 我々の研究室での最近の研究により、ＴＣＦ−α及びＥＧＦの両方とも、ＴＧＦ −βを活性化して、軟寒天中での大きなコロニーの形成を誘導することが示され た。　ＭＳＶによってトランスフオームされた３Ｔ３細胞からの精製ＴＧＦ−β をそれ自体で分析したところ、２Ｊｌ−ｇ／ｍｌもの高濃度においてもコロニー 形成活性を有してぃなかった。しかしながら、同じ細胞から誘導されたＥＧＦ又 はＴＧＦ−αの存在によって活性化した後に分析すると、ＴＧＦ−βは、　１０ 〜２００　ｍｇ／＋ｗｌ　（７）濃度に−オイ−（、大きなコロニー（＞３，１ ００μ、Ｌ）をその濃度に依存して形成することを促進した。

対照的に、ＥＧＦ又はＴＧＦ−αは、それ自身で分析すると。

最大限でも少数のコロニーしか誘導しない。この反応は、ＴＧＦ−βを加えるこ とによって１０倍に増大される。

ＥＧＦと′ＴａＦ−αが、ＴＧＦ−βに依存した軟寒天中での大きなコロニーの 形成を・促進する相対的能力は、ＥＧＦレセプターへの結合における競合能力と 関連していた。化学的に修飾したＥＧＦ類似体を用いた他の実験により、この関 連性が証明された。強烈なコロニー形成反応を誘導するのに、ＴＧＦ−αとＴＧ Ｆ−β又はＥＧＦの両方を必要とすることを示すこれらのデータにより、全ての 組織に存在するノロ；′　特表昭５９−５０１９０５　（６）ＴＧＦ−βは、腫 瘍性トランスフォーメーションにおいてＴＧＦ−αとＥＧＦの効果の必須的な媒 介物質であるかもしれないことが示唆される。

外来性のＴＧＦが非腫瘍細胞をしてトランスフオームされた表現型を発現せしめ るように誘導する機構はほとんどわかっていない。さらに、ＴＧＦ−αとＴＧＦ −βの相乗的な相互作用により、これら２つのＴＧＦは異なった経路を通って作 用することが示唆される。肉腫ウィルスによってトランスフオームされた餞歯動 物細胞の規定された培地からのＴＧＦを用いた実験により、トランスフォーメー ションが起きる前に新たなＲＮＡ及びタンパク質の合成が必要であることが示さ れた。他の実験は、加リン酸反応におけるＴＧＦの役割に向けられていた。ある ウィルス性トランスフォーミング遺伝子産物及びその正常な細胞性類似体はチロ シン特異性のキナーゼ活性を有しており、トランスフォーメーション過程におい て、特定の基質のチロシンにおける加リン酸反応が重要であることが提案された 。ヒトのカンＡ４３１細胞を、ウィルス的にトランスフオームされた細胞又はヒ ト腫瘍細胞ラインの規定された培地から誘導された種々のＴＣＦ（ＴＧＦ−α） で処理したところ、１８０　Ｋ　ＥＧＦレセプターのチロシン残基の加リン酸化 が起きた。しかしながら、加リン酸化のパターンは、ＥＧＦ自体によって誘導さ れたものと区別することはできなかった。それ故、それはトランスフォーメーシ ョンに特異的なものであるとは思われない。同様に、ラッ７ トー１細胞のアクチン繊維の溶解が、ＴＧＦ又はＥＧＦで処理したときに起きる 。ＴＧＦ　とレトロウィルストランスフォーミング遺伝子生産物との関係及び腫 瘍性トランスフォーメーションにおけるＴＧＦの作用の態様を確立するためにさ らに研究することが必要なことは明らかである。

以下に、この発明の種々の局面を例示する例をまとめる。

実Ｊ１１」 ＭＳＶでトランスフオームされた３Ｔ３細　のＴＧＦ−α及びＴＧヒＬ立肝基次 Ｉ ＭＳＶでトランスフオームされた細胞の酸／エタノール抽出物を、１Ｍ酢酸中で バイオゲルＰ−３０上でクロマトグラフニ架ケタ、分子量？−１０，０００＋７ ）　ＴＧＦ分画を、０．１＄トリフルオロ酢酸に溶けたアセトリノリルの勾配を 用いて、ルポンダバクＣＩ８カラム上でさらに精製した。その１部を軟寒天分析 、２　ｎｇ／ｍｌ　ＥＧＦの存在下、及び放射レセプター分析における”’Ｉ　 −ＥＧＦとの競合においてコロ支直上」 ｏ、ｔｚｈリフルオロ酢　に　けたｎ−１０パノールのム配を　いた、ＭＳＶに よってトランスフオームされたマウス３Ｔ３　ｉ　びウシ唾　からのＴＧＦ−の 、牌ポンダバクＣＭカラム上でのＨＰＬＣ： 酸／エタノール抽出物のＴＧＦ−βをバイオゲルＰ−３０と／２？ ｐポンダバクＣ１８カラム上で精製し、次にＣＮカラムに入れた。その１部を、 軟寒天中で、２　ｎｇ／ｍｌのＥＧＦの存在下における＋１１？に細胞のコロニ ー増殖の誘導を調べた。

支農遺」 軟寒　中での、　きなＮＲＫ細　コロニーの形　誘−る、ＴＧＦ−βとＴＧＦ− αとの相　相　作　（活　化ＭＳＶによってトランスフオームされた３Ｔ３細胞 から誘導され、ルポンダパクＣＮカラムで精製した種々の濃度のＴＧＦ−βの、 軟寒天中でのコロニー形成活性を、ＴＧＦ−βのみについて、及び、同じ細胞又 はネズミＥＧＦから誘導され、ＣＮカラムで精製したＴＧＦ−αの存在下におい て調べた。種々の濃度のＥＧＦ及びＴＧＦ−αの軟寒天中でのコロニー形成活性 を、それらのみについて、及びＴＧＦ−βの存在下において調べた。

体内での　の治癒の証 上述のようにこの発明の組成物の実効性を生体外において証明した後、臨床適用 においてこの組成物が働くことを確かめることが重要であると考えた。この目的 のために、ウシからＴＧＦを比較的大量に単離し、鰯歯動物外傷治癒実験プロト コールを用いて、この発明の組成物の外傷治癒活性が満足に証明された。

以下の実施例は、この発明の組成物が生体内において有効であるだけでなく、Ｔ ＧＦは種を越えて採用することができることを示している。

支電皇」 １Ｓ ＴＧＦ−α　びＴＧＦ−び 屠殺場から新鮮に得られ、直ちにドライアイス上で冷凍したウシの組織を、エイ ・ビー―ロバーツら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｕ、 Ｓ、Ａ、、　？７：３４９４　（＋９８０）に従って、２　ｋｇのパッチで酸／ エタノールで抽出した。

６〜８ｋｇの組織からの抽出物を１つにまとめ、ＩＭの酢酸を用いて、カラムの 床体積が８０リツトルのバイオゲル・Ｐ−３０上でクロマトグラフにかけた。ウ シ腎臓及びウシ唾腺からの抽出物のＴＧＦは、ＲＮａｓｅ（１３，７００）とイ ンシュリン（５，７００）マーカーの間で広いピークをもって溶出した。これは 、マウス腎臓及びマウス呼線について観察されたのと同じである。この精製段階 におけるＴＣＦは、その特異的活性が、酸／エタノール抽出物よりも１０〜２５ 倍高く、組織１　ｋｇ当たり１５０，０００〜２００，０００のコロニー形成単 位が回収された。以下において報告されている生体実験のほとんどのものは、こ の段階にまで精製された１腺又は腎臓ＴＧＦを用いて行なわれた。生体外でのＴ ＧＦ活明に従って、約２０倍高められた。

バイオゲルＰ−３０上でクロマトグラフィーにかけた後、ウシＴＧＦ−βを、０ ．１％トリフルオロ酢酸中に溶けたアセトニトリル勾配を用いて、舊ポンダバク ＣＩ８カラム上で高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけることによっ てさらに精製した。次に、ｏ、ｔｘトリフルオロ酢酸中に溶けたｎ−プロパツー ル勾配を用い、ルポンダパクＯＮカ北　待表昭５９−５０１９０５　（７）ラム 上で第２のＨＰＬＣを行なった。２回のＨＰＬＣの後、１腺及び腎臓からのウシ のＴＧＦ−βを、還元環境下においてドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア ミドゲル電気泳動にかけたところ、見かけ上の分子量が１３．０００ダ°ルトン の単一のバンドが見られた。この精製段階においては、それぞれのウシＴＧＦ− βは、コロニー形成活性のためにＥＧＦを絶対的に要求した。ＨＰＬＣ精製ＴＣ Ｆ−βの収量は、組織１　ｋｇ当たり２０〜１００　ｐ−ｇであり、総括性は７ ，０００〜１８．０００コロニ一形成単位であった。

支臭遺」 プロトコール 単離された１腺ＴＧＦ−β及び腎臓ＴＧＦ−βの生体での活性を、ティ・ケイ＋ １ハントら、Ａｍｅｒ、　Ｊ、　Ｓｕｒｇｅｒｙ、　１１４：３０２　（１９８ ７）によって記載された方法に従って測定した。

６個の空のシリング−ハントワイヤメツシュ傷室ヲ、ラットの背中の皮下に以下 に示すように対称的に（Ａ−１１゜Ｂ−Ｅ、　Ｃ−Ｆ）外科的に挿入した。

表１ 頭 尾 １ ラットは、これらの室があたかも傷であるかのように反応し、最後には、これら の室は繊維芽細胞及びコラーゲンで満たされた。挿入後４日目までに、室は結合 組織によって囲包されたが、室の中自体には細胞はほとんど存在しなかった。こ のように、室内に、傷治癒反応が定量的に測定できる囲包された空間が規定され た。この時から、室Ａ、Ｂ及びＣに、ＴＧＦ−β（０，１ｍｌ、　Ｉ＆菌リン酸 塩緩衝液中）を毎日注射し始めた。ＴＧＦ−βを活性化するために、他に明示が ない限り、全てのＴＧＦ−β注射には低濃度のネズミＥＧＦが含まれている。室 り、Ｅ及びＦは対照として用い、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はこれとＴＧ Ｆ−β若しくはＥＧＦとの混合物を、そのタンパク量が室Ａ、Ｂ及びＣに注射し たものと同じになるように注射した。注射は、５日間（表３）又は９日間（表４ ）、１日１回行なった。ラットを最後のＴＧＦ−β注射６詩間後に殺した。表３ においては、ラットは、最後のＴＧＦ−β注射の際に、０．５　ｍｃｉ、比活性 が８．７　Ｇｉ／ミリモルのチミジン−３Ｈを腹内注射されている。室をラット から取りはず１し、ワイヤメツシュの外側の結合組織を全て剥ぎ取り、２３ 表３から、ウシの呼線又はウシ腎臓からのＴＧＦ−βでラットを５日間処理する と、処理した室の総タンパク量が、等量のウシ血清アルブミンで処理した対照室 のそれと比べて有意に増加していることがわが・る（実験ｌ、３）呼線Ｔ’ＧＦ −βは、２回の高圧液体クロマトグラフィーによる精製後もなお非常に活性であ った（実験２）。観察された効果は、ＴＧＦ−βの活性を高めるために用いられ た少量のＥＧＦにのみ基づくものではない。なぜなら、対照物質としてＥＧＦを 用いた場合（実験４）でさえ、処理室Ａ、Ｂ、Ｃと対照室り、Ｅ、Ｆとの間に大 きな差異が見られるからである。さらに、全ての室をＴＧＦ−βで処理し、ＡＢ Ｃ室のみをＥＧＦで処理した場合（実験５）にも有意の差が認められなかった。

実験ｌ〜４の終了時、室Ａ、Ｂ、Ｃは、それぞれ対応する室よりも、これを囲包 する結合組織中により堅固に固定されていることが常に観察された。このことは 、ＴＧＦ−βの効果はまた、室の直近傍の領域においても発現されることを示唆 している。

室内のＤＮＡ及びコラーゲン量に対するウシ１腺ＴＧＦ−βの効果を測定するた めに、動物を５日間以上処理することが必要であった。表４は、１３匹のラット が９日間処理された、より大がかりな実験の結果を示している。総タンパク、ｆ ｆ１ＤＮＡ、ＤＮＡ中へのチミジンの取り込み及び総コラーゲンの増加は、全て 非常に十分であった。ＴＧＦ−βで処理した室の内容物を組織学的に調べたと２ か ころ、繊維芽細胞の増殖及びコラーゲンの形成が確認された。炎症細胞の無菌の 浸潤物もまた、処理室及び対照室の両方内で見出された。

双方の実験において得られた結果は、ＴＧＦ−βは、この発明に従って活性化さ れると、傷の＃３倫反応を有意に加速することを示している。

この　の組　の 活性成分がＴＧＦ−α又はＥＧＦの少なくともいずれかによって活性化されたＴ ＧＦ−βであるこの発明の組成物は、動物、特に哺乳動物、とりわけヒトの臨床 的な用途を有していることが合理的に予想される。この結論に至るいくつかの合 理的な証拠がある。

上述した生体外試験において、この組成物は、遺伝子型を変えることなく顕著に 細胞を増加させることが示された。この発明の組成物の成分の重要な特徴は、そ れらが種特異的であるとは思われないことである。すなわち、１つの種からのＴ ＧＦ−βは、他の種からのＴＧＦ−α及びダ又はＥＧＦによって活性化される。

繊維芽細胞の増殖促進が最も大きな医療上の有用性を有しているけれども、増殖 が促進される細胞は、繊維芽細胞や上皮細胞のような、あらゆる細胞である。

極めて良好な結果が得られた上述した生体実験プロトコールは、傷を囲包する細 胞の増殖を急速に促進することによって傷の治療に有用性を有していることを明 らかに示している。

２に の発明の組成物の用途には２つの型が考えられる。

１つは、そして好ましい適用は、表面外傷の治癒を促進するために局所的に適用 することである。治療できる傷や他の外傷の型に制限はない。これらは（これに 限定されないけれども）第１．２．３度のやけど（特に第２．３度）：整形手術 を含む、外科的切開部分；裂傷。

切り傷、刺し傷を包含する傷；褥槍（床ずれ）、糖尿病性、素性、血友病性、及 び静脈瘤性潰瘍を包含する表面潰瘍を包含する。第１の重要性は、繊維芽細胞の 再生による大きな傷のＭ！であるけれども、この組成物は小さな傷にも有用であ り、上皮細胞の美容的再生をも意図している。また、この組成物を、内部の外科 的切り傷に局所的に適用することも意図している。

局所的に適用する場合、この組成物は、坦体及び／又はアジュバントのような他 の成分と組み合わせることができる。このような他の成分は、薬理的に許容でき るものであり、意図する効果を有し、この発明の活性成分の活性を低下させるこ とができないものであるならば、どのような性質のものでも用いることができる 。この発明の組成物をやけどに適用するときは、好ましくは生理食塩液と組合わ せて液体の形態で用いることができる。

組成物はまた、好ましくは精製コラーゲンと組合わせて軟膏又はサスペンション の形態で用いることもできる。

組成物はまた、好ましくは液体又は半液体の形態で、経：２７ 皮パッチ、プラスター及び包帯に含浸させることもできる。

第２の用途は、体内の傷及び同様な傷を治癒するために全身的に適用することで ある。このような適用は、腫瘍細胞の増殖を促進したりするような副作用がない か制限されている場合には有用である。

全身的に適用する場合には、組成物は、経口投与のために、液体、ビル、錠剤、 薬用ドロップの形態や、非経口注射のための液体形態に製剤することができる。

活性成分は、坦体及び／又はアジュバントのような他の成分と組合わせることも できる。このような他の成分は、薬理的に許容できるものであり、意図する効果 を有し。

この発明の活性成分の活性を低下させることができないものであるならば、どの ような性質のものでも用いることができる。

活性化剤（ＴＧＦ−α又はＥＧＦ　）の量は、この発明の活性組成物中に存在す るＴＧＦ−βの量に直接依存する。この号性化は触媒的な性質のものでないこと が示されているので、はぼ化学量論的な（等モルの）量を用いることが好ましい 。

ＴＧＦの活性、＃Ｉ癒すべき傷／及び又は外傷の性質の故に、この発明の方法に 用いることができる活性組成物の量を述べることはできない。先に示したように 、　ＴＧＦは、先ず細胞のレセプター部位に結合し、次に新しいタンパク質を合 成するために細胞に吸収されて利用される２８　１情昭５９−５０１９０５　（ ９）ことによって細胞を活性化し、その結果細胞の増殖をもたらす。このように 、ＴＧＦは、酵素や他の触媒のような態様で作用するのではなく、細胞再生過程 そのものによって消費される。ゴンザレズらによってＪ、　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、、　８８：１０８−１４４　（１９８０）開示されているように、Ｅ ＧＦのためのレセプターは、広範囲の繊維芽細胞、上皮細胞、及び壁細胞上に発 見されている。さらに、エム［相］イー・ラフィテら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　 １１４（２：２４３−２４８　（１９８０）に開示されているように、個々のラ ットの小腸上皮細胞には３，０００のＥＧＦ結合部位（レセプター）が存在する と計算されている。また、細胞増殖促進物質（この発明の組成物のような）の量 は、治療すべき傷又は他の外傷の大きさによって異なることは明らかである。

この発明の組成物は、細胞の再生を引き起こし、かつ維持するので、連続的な適 用又は周期的な再適用が示される。

投与のための組み合わせた医薬の単位体積当たりの活性成分の量を特定すること も極めて困難である。なぜなら、それは、傷又は他の外傷の細胞の再生に直接用 いられる活性成分の量に依存するからである。しかしながら、一般的に言うと、 好ましくは、ＴＧＦ−βは、組合わされた組成物１ミリリツトル当たり少なくと も約１．ｏナノグラム、さらに好ましくは、１ミリリツトル当たり約１．０　ミ リグラム以下台まれる。

この　の　いた゛　・な ２？ この発明の活性化されたＴＧＦ−β組成物をそれ自身で用いることに加え、これ を第２の増殖因子と組み合わせて用いることも可能である。

この発明の活性化されたトランスフォーミング増殖因子は、多くの他の（第２の ）ペプチド及び非ペプチド因子と物理的に混合することもできる。このような混 合物は、この発明の活性化されたトランスフォーミング増殖因子のみを用いる場 合とと同じ態様で同じ目的で、細胞の増殖及び修復を促進する活性を高めるため に用いることができる。

活性化されたトランスフォーミング増殖因子と第２の増殖因子との有用な比率は 、１：０．１〜１０であり、好ましくは等モル量である。

第２の増殖因子は、単独で又は生理学的及び薬剤的に許容できる組み合わせとし て用いることができる。

既知の第２の増殖因子を、この発明における有用性の順序に記載すると次のもの を包含する。

１、血小板から誘導された増殖因子 ２、繊維芽細胞増殖因子 脈管発生因子 ３、ソマトメジンを包含する、インシーリン様増殖因子 ４、インシュリン 神経増殖因子 ５．７ナポリツクステロイド ０ 上述した第２の増殖因子に加え、いまだ発見されていない第２の増殖因子も混合 物として用いるのに有用であろう。

この発明は、また、不活性な中間物質ＴＧＦ−β自身も用いることができる。こ の発明の以前に、この物質は単離され、又は同定されていなかった。ＴＧＦ−β は、個々の動物種において実質的に同一か又は極めて類似していると信じられて おり、その種に属するイ固体や、それが誘導された特定の体細胞に左右されない 。ＴＧＦ−βは、鰯歯動物、家畜、及びヒトについて種特異的でないことが示さ れているので、この物質は、どんな哺乳動物、そしておそらくどんな動物源から 誘導されたものも実質的に同一か極めて類似していると合理的に信じることがで きる。

さらに、この発明は、遺伝子工学的に誘導された細胞も含めて、いかなる供給源 から単離され誘導されたものも含むことに注意すべきである。細胞をＴＧＦ−β を生産するように遺伝子的に操作することは現在の生化学技術においても可能で ある。

不活　ヒされたＴＧＦ−βの ＴＧＦ−βは、上述した剤により活性化されない限り、傷治癒及び他の組織修復 活性を有さないと信じられる。

しかしながら、上述の表３の実験５では、ＥＧＦで活性化したＴＧＦ−β（室Ａ 、Ｂ、Ｃ）と、ＴＧＦ−β自体（室り、Ｅ、Ｆ）についての結果が統計学的に類 似しているように見える。

３１ これに対する最も論理的な説明は、ＴＧＦ−β自体が、試験動物の中にもともと 存在していたＴＧＦによって活性化されたというものである。ＥＧＦのような種 々のＴＧＦが血漿中に存在することが知られている。

このように、実験５の結果はこの発明と矛盾するものではなく、その代わりにこ の発明の変形例を構成している。さらに詳細に述べると、細胞増殖及び組織修復 を促進するのに十分な量のＴＧＦ−βを活性化することができる、十分な量の内 発的な活性化剤が動物中に存在している場合には、活性化されたＴＧＦ−βに代 えて、ＴＧＦ−β自体をこの発明に従って投与することができる。ここで意図す る外傷を患っている動物は、通常、十分な量の自発生活性化剤を有していないと 予想される。

この１部継続出願と同日に出願された以下の出願の開示の全部を、文献としてこ の明細書に組み入れられたものとする。

１、「ヒト血小板からのトランスフォーミング増殖因子β」ｙチャード・ケイ・ アソイアン、チャールズ・エイ・フロリック、ミッチェル・ビー・スポーン及　 びアニタ拳ビーゆロバー゛ツ ２、「ヒト胎盤からのトランスフォーミング増殖因子β」リチャード・ケイ・ア ソイアン、チャールズ・エイ・フロリック、ミッチェル・ビー・スポーン及　び アニタ・ビー・ロバーツ Ｉ績唱９−５０１９０５　（１ｏ） 手続補正書 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８３１０１４６０ ２、　発明の名称 動物組織の修復 ３、補正をする者 事件との関係　特註出願人 名称　アメリカ合衆国 ４、代理人 住所　東亨都港区虎ノ門１丁目２６番５号　第１７森ビル昭和５９年７月１７日 ６、補正の対象 所定の書面（代表者の氏名）、 明細書の翻訳文（１４頁）、代理権を証するもの国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、活性成分が、イ）β型トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β）と、口 ）前記ＴＧＦ−βを活性化するのに十分な量存在し、表皮増殖因子（ＥＧＦ）及 びα型トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−α）から成る群より選ばれる、 少なくとも１つの活性化剤とから木質的に成り、かつ、該活性成分が、細胞の増 殖を促進するのに十分な置台まれる、動物の細胞増殖及び組織修復を促進するた めの組成物。 ２　、７ＧＦ−βと少なくとも１つの活性化剤がほぼ等モル量存在する、哺乳動 物の繊維芽細胞増殖の局所的促進に用いられる請求の範囲第１項記載の組成物。 ３、前記ＴＧＦ−βは、組成物１ミリリツトル当たり少なくとも１．０ナノグラ ム存在する、請求の範囲第２項記載の組成物。 ４、前記ＴＧＦ−βは、組成物１ミリリツトル当たり１ミリグラム以下存在する 、請求の範囲第３項記載の組成物。 ５、再性化剤はＥＧＦである、請求の範囲第２項記載の組成物。 ６、活性化剤はＴＧＦ−αである請求の範囲第２項記載の組成物。 ７、少な乏とも１つの薬剤的に許容できる坦体をさらに含む請求の範囲第２項記 載の組成物。 ８、坦体は精製コラーゲンであり、組成物は局所的適用３ のためのサスペンションである。請求の範囲第７項記載の組成物。 ９、坦体は生理食塩水であり、組成物は液状である、請求の範囲第７項記載の組 成物。 １０　、７ＧＦ−βと、少なくとも１つの活性化剤とはほぼ等モル量存在し、薬 剤的に許容できる坦体をさらに含む、哺乳動物の細胞増殖及び組織修復の全身的 促進に用いられる、請求の範囲第１項記載の組成物。 １１、薬剤的に許容できる坦体中にある請求の範囲第２項記載の組成物を少なく とも１回局所的に適用することを含む、＠乳動物の局所的外傷、やけど、潰瘍、 又は他の傷の治療方法。 １２、局所的に周期的に再適用することをさらに含む、請求の範囲第１１項記載 の方法。 １３、連続的に局所的に適用することをさらに含む請求の範囲第１１項記載の方 法。 １４、薬剤的に許容できる坦体中にある請求の範囲第１０項記載の組成物を少な くとも１回全身的に投与することを含む、哺乳動物の全身的傷の治療方法。 １５、周期的に全身的に再投与することをさらに含む請求の範囲第１４項記載の 方法。 １６、連続的に全身的に投与することをさらに含む請求の範囲第１４項記載の方 法。 １７、活性化されたＴＧＦ−βは、モル比で１：Ｑ、１ないし１：１０の割合の 、少なくとも１つの第２の増殖因子と混合３り されている請求の範囲第１項記載の組成物。 １８、第２の増殖因子は、血小板から誘導された増殖因子、繊維芽細胞増殖因子 、脈管発生増殖因子、インシュリン様増殖因子、インシュリン、神経増殖因子、 及びアナポリックステロイドから成る群より選ばれる少なくとも１つである、請 求の範囲第１７項記載の組成物。 １９、第２の増殖因子は、血小板から誘導された増殖因子、繊維芽増殖因子、及 び脈管発生因子から成る群より選ばれる少なくとも１つである、請求の範囲第１ ７項記載の組成物。 ２０　、７ＧＦ−βと第２の増殖因子とは、はぼ等モル量存在する、請求の範囲 第１８項記載の組成物。 ２１、活性化された丁ＧＦ−βは、少なくとも１つの第２の増殖因子と、１：０ ．１ないしｌ：１０のモル比で混合されている、請求の範囲第１１項記載の方法 。 ２２、第２の増殖因子は、血小板から誘導された増殖因子、ｍ維芽細胞増殖因子 、脈管発生増殖因子、インシュリン様増殖因子、インシュリン、神経増殖因子、 及びアナポリックステロイドから成る群より選ばれる少なくとも１つである、請 求の範囲第２１項記載の方法。 ２３、β型トランスフォーミング因子。 ２４、哺乳動物から誘導された請求の範囲第２３項記載の増殖因子。 ２５、遺伝子工学的に操作された細胞から誘導された請求の範囲第２３項記載の 増殖因子。 ２６、ウシの腎臓から誘導され、精製された請求の範囲第２４項記載の増殖因子 。 ２７、ヒトから誘導された請求の範囲第２４項記載の増殖因子。