JPS5971694A - 肝炎ｂ型ウイルスワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は組換型ＤＮＡ技法を用いることによる酵母にお
けるＢ型肝炎表面抗原をコードする遺伝子のクローニン
グおよび該酵母が産生ずる抗原からの肝炎Ｂ型ウィルス
ワクチンの製造に関する。

発明の背景 肝炎Ｂ型ウィルス（ＨＢＶ　）による感染症は重く、広
範囲にわたる健康上の問題である。感染症は急性または
慢性の様相で発現する。米国における急性肝炎の症例数
は少なくとも１年につき１０万件であシ、致死率が１〜
２％と見積られている。

米国においては、健常成人中の慢性保菌者の蔓延率は年
令、社会的階級により、０．１〜１％の間で変化してい
る。南アメリカでは、慢性保菌者の蔓延率は約１〜３％
、ソ連および南ヨーロッパでは、約３〜６％、アジアお
よびアフリカでは１０％以上である。

発達しだ国々では、血液を取扱う医療部署の患者および
要員、軍要員、慢性保菌者の配偶者、高ＨＢ　Ｖ風土地
域への旅行者、慢性保菌者の新生児、ホモセックスの人
、売春婦および麻薬常用者のようなウィルス接触の高い
危険性のある人々のだめのワクチンの要求が存在する。

第三世界の国々においては大衆免疫付与のだめの安価な
ワクチンの要求が存在する。大衆免疫付与計画は急性肝
炎の発生や慢性保菌者が留ることに究極的に影響するば
かりでなく、慢性活性肝炎および肝細胞癌の罹病率およ
び死亡率も減少させることができる。

肝炎Ｂｚのピリオンであると考えられ、感染患者から単
離できるゾーン（Ｄａｎｅ）粒子は約４２ｎｍの径を有
する。各々、肝炎Ｂ型表面抗原（ＨＢｓＡｇ）からなる
外皮、キャプシド（ＨＢｃＡｇ）、内生ポリメラーゼお
よびＤＮＡゲノムから構成されている。該ゲノムは環状
で、約２００の塩基からなる１本鎖域を有する２本鎖で
ある。該１本鎖域はｉｎ　　ｖｉｔｒｏで該内生ポリメ
ラーゼの作用によって詰込み（ｆｉｌｌ　　ｉｎ）を行
なうことができる。より長い鎖は約３２００の塩基を含
有する。

組織培養中でＨＢＶを増殖させるのが困難であることか
示されており、また、唯一公知の宿主がヒトであるため
、従来、ＨＢＶワクチンを製造することは困難であった
。感染したヒトから少量のＨＢ　Ｖ抗原標品が単離され
ている。エフ・ディ・シイ−１／ボーア（Ｆ−Ｄ−ＣＲ
ｅｐｏｒｔｓ、ｐｐ。

３〜４．Ｊｕｌｙ１９，１９８２）には最近開発された
Ｂ型肝炎ワクチンの臨床研究の雑文が掲載されている。

バレンツエラらＣＶａｌ′ｅｎｚｕｅｌａ　ｅｔ　ａｌ
、、Ｎａｔｕｒｅ。

Ｖｏｌ、２９８，３４７〜３５０（１９８２））は表現
ベクターを用いた酵母におけるＨＢｓＡｇの合成を報告
しており、それでは該ｌ−ｌＢｓＡｇコード付は配列が
８３５　ｂｐのＴａｑｌ−Ｈｐａ１７　ラグメントで、
プロモーターが該酵母アルコーｌｖ俸デヒドロゲナーゼ
■、プロモーターである。この文献より以前にいくつか
の簡単な研究雑文がある。これらは、酵母アルコール・
デヒドロゲナーゼ・プロモーター域に結紮されているＩ
（ＢｓＡｇに類似した蛋白をコードする配列を含むＤＮ
Ａフラグメントの酵母における表現を報告しているバレ
ンツエラらの雑文（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ　　ｅＬ　　
ａｌ、、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｌ。

Ｍｅｄ、Ｅｘｐ、（Ｃｈｉｌｅ）、Ｖｏｌ、　　１４　
（１）　、　２１〜２２（１９８１））、ビイ・バレン
ツエラおよびダブ！Ｊ−Ｊ−ウ−ジエイ、　）ｖ７　ｐ
　−（Ｐ、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａａｎｄ　Ｗ、Ｊ、Ｒｕ
ｔｔｃｒ）を含む米国の研究チームが酵母における「蛋
白−被膜周囲肝炎Ｂ型ウィルス」の産生を発表したと報
じているスフリップ中の報告Ｃ５ｃｒｉｐＮｏ　６１６
　、　ｐ、１４（Ａｕｇ、　１２　、１９８１　）ｌお
よびダブリユウ・ジエイ・ルッター（Ｗ、Ｊ、Ｒｕｔｔ
ｅｒ）が酵母細胞におけるグリコジル化ＨＢｓＡｇの表
現を報告したと報じているツカーマンノ報文ＣＺｕｃｋ
ｅｒｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ、２９５．９８〜９
９（１９８２））である。

ｌ−ｌＢｓＡｇのようなＨＢ　Ｖの抗原性成分は該抗原
をコードする遺伝子を含む組換型ＤＮＡ分子を挿入した
細菌中で製造されてきた。バージルら〔Ｂｕｒｒｅｌｌ
　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ、２７９゜
ＮＯ，５７０８，４３〜４７（１９７９）：）はプラス
ミｌ’ｐＢＲ３２２中でりｏ−ンｌ、たＨＢＶ　ＤＮＡ
配列のイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＨＢ　１０１株にお
ける表現を報告している。

ヨーロッパ特許出願第１３８２８号において、７Ｌ／−
ら（Ｍｕｒｒａｙ　　ｅｔ　　ａｌ、）は、イー・コリ
ＨＢＩＯＩ株において、ｌｌ−１１１ｓＡを含めて、Ｈ
ＢＶ抗原をコードできる組換型ベクターの製造を開示し
ている。このベクターはゾーン粒子ＤＮＡおよびプラス
ミドｐ　ＢＲ３２２から製造される。マレ−らは、有用
な宿主には他のｗｌ菌宿主、酵母および他の真菌、動物
まだは植物細胞およびその池の宿主が包含されうると述
べているが、示されている唯一の宿主はイー・コリであ
る。

チャーネイら（Ｃｈａｒｎｅｙ　ｅＬ　ａｌ、、　Ｎａ
ｔｕｒｅ。

Ｖｏｌ、２８６，８９３〜８９５（１９８０）〕は〕β
−ガラクトシダーゼ遺伝と該ＨＢｓＡｇ構造遺伝子の融
合物を有するバタテリオファージの構造を報告している
。該バタテリオファージはＨＢ　ｓ　Ａｇおよびβ−ガ
ラクトシダーゼ両方の抗原性決定子からなる融合蛋白の
合成を命令する。

英国特許出願第２０３４３２３号において、チオライス
ら（Ｔｉｏｌｌａｉｓ　ｅｔ　ａｌ）はＨＢＶＤＮＡを
含有するコリファージの製造を５開示している。

融合ファージ−ＨＢＶ　　ＤＮＡがイー、コリＣ６００
株中に形質転換されている。

最初にＰＣＴ出願ＷＯ３１１００５７７号として公開さ
れた英国特許出願第２０７０６２１号には、ＦＩＢｓＡ
ｇ遺伝子の一部、プロモーターおよびラクトース・オペ
ロンのＺ遺伝子からなり、イー・コリ中でクローンでき
るプラスミドが開示されている。

ヨーロッパ特許出願第２０２５１号においてルツターら
（Ｒｕｔｔｅｒ　　ｅｔ　　ａｔ）はプラスミドＰＢＲ
３２２およびＨＢＶ　　ＤＮＡ（７）ＢａｔｎＨ］：７
ラグメントからなり、イー・コリの形質転換に使用でき
る組換型ベクターを包含する組換型ベクターを開示しテ
イル。ＨＢＶ　　ＤＮＡのＢａｍＨ，ｌ：７ラグメント
およびトリプトファン・オペロンの一部からなる他のベ
クターがイー・コリＩ−Ｉ　Ｂ　１０１株における表現
を得るために使用された。

エドマンら［Ｅｄｍａｎ　　ｅｔ　　ａｌ　、、ＮａＬ
ｕｒｅ。

Ｖｏｌ、２９１．ＮＧ、５８１５．５０３〜５０６（１
９８１）〕はトリプトファン・オペロン調節戦の調節の
下、イー・コリにおいてＨＢｃＡｇおよびβ−ラクタマ
ーゼーＨＢｓＡｇ融合蛋白の合成を命令するプラスミド
の構造を記載している。

ＨＢ　Ｖ　　Ｄ　Ｎ　Ａの細菌中への挿入を開示した池
の文献にはチャーネーらの文献（Ｃｈａｒｎａｙ　ｅＬ
　ａｌ、。

ＰｒｏｇｏＭｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、、Ｖｏｌ、２７　、　
Ｂ　８〜ｇ　２　（１９８１）〕、マツケイらの文献（
Ｍａｃｋａｙ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、Ａｃａｄ＋Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ　、
、Ｖｏｌ、７　Ｂ　、　ＮＯ，７。

４５１０〜４５１４（１９８１）’：］、フリツチェら
ＣＦｒ１ｔｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃ，Ｒ８Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、、Ｖｏｌ。

２８７、ＮＯ，１６，１４５３（１９７８））、英国特
許明細書第２０３４３２３号（Ｄｅｒｗｅｎｔ　ＮＯ４
６８７４Ｃ）およびパセクらの文献〔Ｐａ５ｅｋｅｔａ
１．、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ、’２８２　、ＮＯ，６、
５７５（１９７９）〕が包含される。

ＨＢ　Ｖ　　Ｄ　Ｎ　Ａは哨乳動物細胞中でもクローン
されている。これらには、ヒト、マウスおよびヒト肝癌
細胞系が包含される。例えば、デュボイスらＣＤｕｂｏ
ｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、、Ｖｏｌ、７７　、ＮＯ，８、４５４９〜４５
５３　（１９８０）〕はマウス細胞のＨＢＶゲノム含有
プラスミドによる形質転換およびＨＢｓＡｇの表現を報
告シている。ヒルシュマンラ〔Ｈｉ　ｒ　ｓ　ｃｈｍａ
ｎ　ｅｔａｌｌＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、Ｕ、Ｓ、、Ｖｏｌ、７７　。

Ｎｏ、９．５５０７〜５５１１　（１９８０）　〕はＨ
ＢＶ　　ＤＮＡで形質転換させたＨｅＬａ細胞によるＨ
ＢＶ様粒子の産生を報告している。

ヒト血液からのＨＢｓＡｇを用いるＨ　Ｂ　Ｖワクチン
ノ製造法がフナコシら（Ｆｕｎａｋａｓｈｉ　ｅＬ　ａ
ｌ、。

Ｐｒｏｇ、Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、、Ｖｏｌ、２７　、１
６３〜１６７（１９８１）’ｌ）およびマウパスら〔Ｍ
ａｕｐａ；　ｅｔａｌｌＰｒｏｇｏＭｅｄ、Ｖｉｒｏｌ
、、Ｖｏｌ、２７　、１８５〜２０１（１９８１）〕に
よシ報告されている。フナコシらによって製造されたワ
クチンは４０μｆの精製したホルマリン処理ＨＢｓＡｇ
、！Ｊン酸塩、塩化ナトリウム、２０ツのマンニトール
およびアジュバントとして０．１％の水酸化アルミニウ
ムを含有する。後者の雑文において、マウパスらはワク
チンの１投与量が２〜１０μｆ／／ｍｌの蛋白〔ローリ
−（Ｌｏｗｒｙ　）法〕および０．１％の水酸化アルミ
ニウムを含有する精製したホルマリン処理ＨＢ　ｓ　Ａ
ｇ１ｒｎｌであると報告している。マウパスらによって
報告された研究で用いた方法では１ケ月間隔で３回注射
し、１年後に１回ブースターを要求しており、マウパス
らは３ケ月間隔で２回濃ＨＢｓＡｇの注射を提案してい
る。

Ｉ−Ｉ　Ｂ　Ｖワクチン製造についての曲の文献にはへ
パチテイスＢワクチンＩＮＳＥＲＭシンポジウム（ｌ１
ｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　Ｖａｃｃｉｎｅ　ＩＮＳＥＲＭ
　ＳｙｍｐｏｓｉｕｍＮ（１１８，ｅｄｉｔ、ｂｙ　Ｍ
ａｕｐａｓ　ａｎｄ　Ｇｕｅｓｒｙ、　１９Ｂ　１　、
　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、４’Ｊｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ
　ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＰｒｅｓｓ、）　　の、各々、
３．３７および５７頁のマウパスら、アダモビツツら（
Ａｄａｍｏｗｉｃｚ　ｅｔ　ａｔ）およびフナコシらの
ものが包含される。

酵母は他のある種のＤＮＡ配列の宿主生物として使用さ
れている。例えば、英国特許出願第２０６８９６９号に
おいて、フレーザーら（Ｆｒａｓｅｒｅｔ　ａｌ）は酵
母におけるニワトリ・オバルブミンの製造を開示してい
る。スクリップ６４０号Ｃ５ｃｒｉｐ　　Ｎｏ、６４０
　、　ｐ　１１　（Ｎｏｖ、４．１９８１）〕はあるタ
イプのインターフェロンが酵母中で製造される旨の報告
を包含している。ヨーロッパ特許第１１５６２号（Ｄｅ
ｒｗｅｎｔ　Ｎｏ、３８７６２　Ｇ　）では、２μプラ
スミド中にｕｒａ十酵母遺伝子を含有するハイブリッド
酵母プラスミドが報告されている。

発明の概要 本発明は、ＦＩＢｓＡｇをコードできるヌクレオチド配
列および酵母、サツカロミセス・セレビシアｘ　（Ｓａ
ｃｃｂａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）にお
いて該ｌ−ｌＢｓＡｇ配列の転写を行なうことのできる
酵母ａｒｇ３遺伝子から誘導された調節域からなる組換
型ＤＮＡ分子の製法に関する。該分子は該１−ＩＪ３　
ｓ　Ａｇ配列および該調節域が挿入されたベクターを含
有し、該ベクターは酵母ベクターの製造まだは該ＨＢｓ
Ａｇおよび調節域の保存に使用できる。本発明のプラス
ミドで形質転換された微生物のような該組換型ＤＮＡ分
子を含有する微生物も本発明に包含される。本発明はま
た、ＨＢｓＡｇ配列のようＶなコード付は配列挿入のだ
めのａｒｇ３調節域およびそれに隣接する制限部位を有
し、該コード付は配列の表現によって合成された蛋白が
異質アミノ酸残基を欠くようになるプラスミドも包含す
る。

まノ辷、本発明には、本発明によって製造されたＨＢｓ
Ａｇのワクチン有効量および適当な担体からなるヒトに
おけるＨＢＶ感染に対する保護惹起用のワクチンも包含
される。

さらに、本発明は、該組換型ＤＮＡ分子および該分子を
含有する微生物の製法ならびにＨＢｓＡｇおよびＨＢｓ
Ａｇ含有ワクチンの製法も包含する。

図面の概要 添付図面中、第１図はＰＲＩＴ１０６０１の制限エンド
ヌクレアーゼ開裂地図である。

第２図はＰ　Ｒ’Ｔ　１０６０６　　の制限エンドヌク
レアーゼ開裂地図である。

第３図はｐＭＣ２００の制限エンドヌクレアーゼ開裂地
図である。

第４図はｐＭｃ２００における３３００ｂＰＨｉｎｄＩ
［酵［ＤＮＡ挿入物の一部分のヌクレオチド配列で、こ
の部分にはＨｉｎｃｌＪ、ＢｇｌｌＩ　　およびＥｃｏ
Ｒｆｉ部位が含まれている。

第５図はｐＲＩＴ　１０６７１およびｐＲＩＴＩ　Ｑ６
７３の製造を示すフローシートである。

第６図はｐＲＩＴ　１０７４９の製造を示すフローシー
トである。

第７図はｐＲＩＴ１０７６１およびｐＲＩＴ１０７６４
の製造を示すフローシートである。

発明の詳細 な説明の組換型ＤＮＡ分子は、ＨＢｓＡｇ用の構造遺伝
子を含むヌクレオチド配列を、酵母において該ＨＢｓＡ
ｇ配列の転写を命令でき、それに疋り、その表現が行な
うことのできる酵母ａｒｇ３調節域と融合させることに
よシ製造される。本明細書において、「組換型ＤＮＡ分
子」なる語は該ＨＢ　ｓ　Ａｇコード付は配列および該
調節域を含有するＤＮＡフラグメントならびにプラスミ
ドまだはファージ・ベクターのような該フラグメントを
含む他のＤＮＡ分子を意味する。

「調節域」なる語はプロモーター域および転写に必要な
池の配列を含む配列を意味する。該酵母ａｒｇ３調節域
は、それがＨＢｓＡｇコード付は配列表現用の強力なプ
ロモーターとなることができるので、特に有利である。

「ＨＢｓＡｇＪなる語は構造的にｌ−ｌＢｓＡｇ標品と
同じであるか、ＨＢｓＡｇ標品と実質的に同じ抗原性決
定子を有する蛋白、すなわち、ＨＢｓＡｇ標品を特異的
に認識し、それと反応する抗体の生成を惹起することが
できるか、抗Ｉ（ＢｓＡｇ抗体によって特異的に認識さ
れる蛋白を意味する。

該ＨＢｓＡｇコード付は配列は、感染したヒト血清中の
ゾーン粒子より抽出したＤＮＡから、ＤＮＡポリメラー
ゼ、好ましくは、内生ポリメラーゼで１本鎖域に詰込み
、ついで、制限エンドヌクレアーゼで消化することによ
り単離できる。エンドヌクレアーゼの選択は、部分的に
、実際に用いるゾーン粒子に依存する。例えば、後記の
実施例で示すように、ａｄｗ抗原型のある種のゾーン粒
子のＨＢ　Ｖ　　Ｉ）　Ｎ　ＡのＨＢｓＡｇコード付は
配列は単一のＢａｍＨｌフラグメント上で単離でき、ａ
ｙｗ抗原型のある種のゾーン粒子のＨＢＶ　　ＤＮＡの
ＨＢｓＡｇコード付は配列はＨｈａＩフラグメント上で
単離できる。同じ抗原型のゾーン粒子のＨＢ　ＶＤＮＡ
が制限部位の異なったパターンを示すこともある。

本発明で用いるＤＮＡフラグメントを製造するだめのＤ
ＮＡの制限、本発明で用いる組換５ＤＮＡ分子製造のだ
めのかかるフラグメントの結紮および微生物への挿入は
前記の、まだ、後記する文献に開示されている技法のよ
うな、公知の技法によって行なわれる。条件はＤＮＡお
よび酵素の変性をさけるように選択する。例えば、ｐＨ
は約７゜０〜１１．０に保持するように緩衝され、温度
は約６０°Ｃ以下に保つ。好ましくは、制限は約３０〜
４０℃で行ない、結紮は約０〜１０°Ｃで行なう。

本発明の実施に用いる制限酵素およびリガーゼは商業的
に入手でき、それに付されている指示に従って使用すべ
きである。Ｔ４　　ＤＮＡＩＪガーゼが好ましいリゼー
ゼである。

調節域へのＨＢｓＡｇ配列の融合は後記の実施例に示す
ような中間ベクターの使用によって行なうことができる
。別法として、ＨＢｓＡｇ配列は、調節域を含むベクタ
ー中に直接挿入することができる。ベクターは本発明の
ＤＮＡフラグメントを担持し、保持できるＤ　Ｎ　Ａで
、例えば、ファージやプラスミドを包含する。ファージ
中でＤＮＡフラグメントをクローンする技法は、例えば
、チャーネーらＣＣｈａｒｎａｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａ
ｔｕｒｅ、Ｖｏｌ、２８６゜８９３〜８９５（１９８０
）〕および英国特許出願第２０３４３２３号（Ｔｉｏｌ
ｌａｉｓ）によッテ開示されている。好ましくは、ＨＢ
ｓＡｇ配列は調節域に対して、ＨＢｓＡｇ配列の表現に
よって合成されにＨＢｓＡｇが異質アミノ酸残基を持た
ないように位置させる。

特に有用であることが判明している調節域は、オルニチ
ン−カルバモイルトランスフェラーゼ（ＱＣ；Ｔ）をコ
ードする酵母ａｒｇ３遺伝子から由来するものである。

このａｒｇ３調節域の使用は、その作用が特異的および
一般的調節機構の両方に支配されるので有利である。ク
ラビールら［Ｃｒａｂｅｅｌｅｔ　　ａｌ　、、ｌ’ｒ
ｏｃ、Ｎａ、ｔｌ　、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、
、Ｖｏｌ。

７８．５０２６（１９８１））によって報告されている
ように、これはプラスミドｐＹｅ　ｕｒａ３ａｒｇ３上
で、イー・コリ中でクローンされている。好ましい宿主
は、アルギニン生合成経路が抑制解除されたサツカロミ
セス・セレビシアエ株、例、ｔば、ＩＣ１６９７ｄ株で
ある。かかる菌株の使用は、実施例で用いた他の菌株、
ｌ）　（、５株と比較して、ａｒｇ３プロモーターから
の表現増加をもたらせる。

融合ＤＮＡフラグメントを酵母中にクローンするための
好ましいベクター−ニブラスミドＹＥｐ　１３で、これ
はイー・コリおよびサツカロミセス・セレビシアエの両
方において複製、維持することができ、それ故、シャト
ｔＶ・ベクターとして知られている。数種の他の酵母ベ
クターが知られておシ、利用できる。ＨＢｓＡｇおよび
調節域は、順次あるいは、後記の実、薙倒に示すように
同時に酵母中に挿入できる。プラスミド・ベクターによ
る形質転換は、通常、本発明のＤＮＡ分子をプラスミド
として取込むこととなる。しかし、組換現象のような他
の反応では該ＤＮＡ分子の染色体ＤＮＡ中への取込みと
することもできる。

本発明による酵母によって製造されだＨＢｓＡｇと、適
当な担体からなるヒトにおけるＨＢＶｇ染に対する保護
を惹起するワクチンは公知の技法によって製造すること
ができる。水酸化アルミニウムのようなアジュバントを
使用することが望ましい。まだ、得られたＨＢｓＡｇを
他の免疫原と組合せて複合ワクチンを製造することもで
きる。該Ｉ−ＩＢＶまだは複合ワクチンは、例えば、皮
下、静脈内または筋肉内経路で投与できる。本発明のＤ
ＮＡフラグメントおよびそれによって製造されたＨＢｓ
Ａｇはまた、ＤＮＡハイブリッド形成技法および種々の
イムノアッセイによる生物試料中のＩ−ＴＢＶ検出用の
探針としても用いることができる。

つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。

実施例中、％は、特に断らない限り重量％を意味する。

実施例Ｉ ＨＶＢ　　ＤＮＡをｐＢＲ３２２と組合わせることによ
る中間プラスミドｐ　ＲＩＴＩ　Ｏ６０１の調製ａｙｗ
抗原型のＨＢｓＡｇ陽性血清に、０．２８％の最終濃度
になるようにＣａＣｌ２を加えて脱繊維化し、５Ｗ２７
ｏ−／２−中、１０ｍＭトロメタミンー　ＨＣｌ　、　
ｌ　ＭＮａＣｌおよびｌ　ｍＭ　Ｅ　Ｄ　ＴＡを含む緩
衝液（ｐＨ７，５）中で調製した１０〜２０％シヨ糖ダ
レジエント上、２７００　Ｏｒ、ｐ、ｍで２時間で遠心
分離する。ゾーン粒子を含む透明なペレットを同じ緩衝
液中に再懸濁させ、６５％ショ塘クッションに重層させ
た緩衝２０％ショ糖上で遠心分離する。該クッション界
面での乳白光バンドを回収し、同様な２０〜６５％グレ
ジエント上、２０００００Ｘ、Ｇで４時間遠心分離し、
ゾーン粒子をペレット化する。

Ａ、該ゾーン粒子を、５０ｍＭトロメタミンーＨＣＩ、
　Ｉ　ＱｒｎＭ　ＭｇＣｌ２　．５００ｍＭ　ＮａＣ１
。

Ｑ、　５　ｍ　Ｍジチオトライトール、各５ＱｍＭのｄ
ＡＴＰ　、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰならびに８μＭ３２
Ｐ−ｄＴＴＰ　（３５ＱＣｉ／ｍｍｏｌｅ）を含有する
反応混合液（ｐＨ８，０）に再懸濁させ、該再懸濁粒子
を３７°Ｃで５時間インキュベートすることによシ内生
ＤＮＡポリメラーゼを用いてゾーン粒子内のＩ−ＩＢＶ
ゲノムの１本鎖域を修便する。該再懸濁液をＩＱｍＭ）
ｏメタミニ／−ＨＣｌ、ｌ　ＱｍＭ　ＥＤＴＡ。

ｌ　Ｑ　Ｑ　ｍ　Ｍ　　ＮａＣ１および０．０２％ドデ
シル硫酸す）　ＩＪウムを含有する緩衝液（ｐＨ７，、
５）で希釈してｐｉ−１７，５とし、３７°Ｃにて１時
間プロナーゼ０、５　ｍ／／　／−と共にインキュベー
トし、ついで、フェノール抽出およびエタノール沈澱を
行なう。

Ｂ　ａ　ｍＨ■制限エンドヌクレアーゼによる該ＤＮＡ
の消化は、アガロースゲル電気泳動および該ゲルのオー
トラジオグラフィーによって判定されるように、約１４
５０　ｂｐおよび１６００　ｂｐのサイズを有する放射
活性フラグメントを産生する。

Ｂ、ゾーン粒子ＤＮＡ的３０ｎｇを、標識していないｄ
ＴＴＰの存在下、内生ＤＮＡポリメラービを用いて修復
し、前記と同様にして抽出、回収する。該ＤＮＡを、あ
らかじめＢ　ａ　ｍＨ工制限エンドヌクレアーゼで消化
し、アルカリ性ホスファターゼで処理した１００１’ｌ
のプラスミドｐ　ＢＲ３２２と混合する。プラスミドｐ
ＢＲ３２２は組換型ＤＮＡ法に通常用いられるもので、
入手の制限なしにアメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクショ：ｙ　（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１
ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託８号３７０１
７として寄託されている。

該混合液をフェノールで抽出し、エタノールで沈澱させ
、遠心分離し、乾燥させて、５９ｍＭトロメタミンー　
ＨＣＩ、　ｌ　ｍＭＡＴ　Ｐ、　Ｉ　Ｑ　ｍＭ　ＭｇＣ
ｌ２．１９ｍＭジチオトライトール、５０１Ｌｆ／＋ｎ
ｌゼラチンおよび２単位／ｒｎｌＴ４ＤＮＡリガーゼを
含有する混合液１２μｌ　（ｐＩ−Ｉ　７．５　）に再
懸濁させる。

該懸濁液を１０°Ｃで４時間インキュベートし、ついで
氷上で１８時間保持する。

結紮したＤＮＡ混合物は、コーヘンら［Ｃｏ　ｈ　ｅ　
ｎｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、Ｕ、Ｓ、、Ｖｏｌ、６９゜２１１０、（１９７２）
）の方法に従って調製し。

だイー・コリに１２株Ｃ６００のコンピテント細胞を形
質転換するのに用いられる。形質転換体をアンピシリン
２００μｆ／−を含有する固体培地上で選択する。単離
したコロニーについて、ｐＢＲ３２２０ＢａｍＨ］：部
位への異種ＤＮＡフラグメント挿入を示すテトラサイク
リン耐性の欠失をスクリーニングする。このような形質
転換体クローンの１つがプラスミドＰＲＩＴ１０６０１
を含有することが判明し、これはＢａｍＴ（ｉエンドヌ
クレアーゼによる消化によって４３６０ｂｐのｐ　Ｂ　
Ｒ３２２フラグメントならびに１６００　ｂｐおよび１
４５０ｂｐ　（７）ＨＢＶ　　ＤＮＡ７ラグメｙ）　を
与えることが判明した。イー・コリに１２株Ｃ６００（
ＰＲＩＴ１０６０１）培養物は欧州特許条約（ＲＰＣ）
およびブダペスト条約に従い、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション（アメリカ合衆国メリイランド
州、ロックビル）に１９８２年６月２日付で寄託番号Ａ
ＴＣＣ３９１３２として寄託されている。プラスミドＰ
”Ｉ’Ｔ１０６０１の制限エンドヌクレアーゼ開裂地図
を第１図に示す。

Ｃ０種々の制限酵素によるゾーン粒子ＤＮＡおよびｐＲ
ＩＴ１０６０１の消化によって生じるフラグメントのサ
イズをつぎのとおり比較した。デーン粒子ＤＮＡ１すな
わち、ＨＢＶ　　ＤＮＡを前記の内生ポリメラーゼ反応
によシ、壕だけ精製ＤＮＡをイー・コリ由来のＤＮＡポ
リメラーゼエで処理することによって　Ｐで標識する。

標識されたＨＢＶ　　ＤＮＡをｐＲＩＴ１０６０１と混
合し、該混合物を制限エンドヌクレアーゼで処理し、ア
ガロースゲル上で電気泳動にかける。該ゲルを臭化エチ
ジウムで染色し、紫外線光下で写真撮影してＤＮＡフラ
グメントの位置づけをし、ついで、乾燥してオートラジ
オグラフィーにかけ、放＠活性１−ＩＢＶ　　ＤＮＡフ
ラグメントの位置づけをする。つぎの標識されたＨＢＶ
フラグメントがｐＲＩＴ１０６０１フラグメントのサイ
ズに正確に一致することが判明した：１４５０および１
６００　ｂｐＢａｍＨＩ’フラグメントｉ　１３３　Ｑ
ｂｐ　ＨｐａＩフラグメント；および１１３０　ｂｐ　
　ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩフラグメント。標識されたゾー
ン粒子ＤＮＡはまだ、サザーン（５ｏｕｔｈｅｒｎ、Ｊ
ｌＭｏｌ　、Ｂｉｏｌ、、Ｖｏｌ　。

９８．５０３（１９７５））の技法により、アガロース
ゲルからニトロセルロース・フィルター上に移しだ後、
ｐ　ＲＩＴＩ　０６０１のＢ　ａ　ｍ　Ｈ■消化によっ
て遊離される１４５０および１６００ｂｐ　の両方のフ
ラグメントと特異的にハイブリッド形成する。

これらの結果は、ＰＲＩＴＩ　Ｏ６０１上のクローンさ
れたＤＮＡ挿入物がＩＩ　Ｂ　Ｖゲノムに相当し、ＰＲ
ＩＴ１０６０１上での２つのＢａｍＨＩフラグメントの
相対的な方向が該ピリオンにおけると同じであることを
示している。ｐＲＩＴ　１０６０１は後記の実施例１０
においてｐＲＩＴ　１０６７１を調製するのに使われる
。

実施例２ １−Ｉ　Ｂ　Ｖ　　Ｄ　Ｎ　ＡをＰＡＣＹＣ１８４（！
：組合わせることによる中間プラスミド、ｐｋｌＴ　１
０６１６の調製 ゾーン粒子を前記と同様にａｄＷ抗原型のｌ−ｌＢｓＡ
ｇ陽性血清から単離する。　Ｐで標識されだＨＢ　ＶＤ
ＮＡの制限エンドヌクレアーゼ分析は該ＤＮＡが１つの
ＥｃｏＲ１部位を含んでいることを示した。

標識されていないヌクレオチドと用いる内生ポリメラー
ゼ反応によって詰込んだＨＢＶ　　ＤＮＡをＥ　ｃ　ｏ
　Ｒ■で消化する。この制限ＤＮＡを、あらかじめＥｃ
ｏＲＪで消化し、アルカリ性ホスファターゼで処理した
プラスミドｐＡＣＹＣＩ　Ｂ４と混合する。プラスミド
ｐＡｃＹｃ１８４は、入手の制限なしにアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクションに寄託番号３７０３３
として寄託されている。該混合物をＴ４ＤＮＡ！Ｊガー
ゼで結紮する。

この結紮ＤＮＡ混合物をイー・コＩＪ　Ｋ　１２株Ｃ６
００のコンピテント細胞を形質転換するのに用いる。形
質転換体をテトラサイクリン（１５μｆ／ｒｎｌ）寒天
培地上で選択し、ｐＡｃＹｃ１８４のＥｃｏＲ１部位に
おける挿入を示すクロラムフェニコール耐性の欠失につ
いてスクリーニングする。

形質転換コロニーは、該１（Ｂ　Ｖ　　Ｄ　Ｎ　Ａから
なる３　２００　ｂｐ挿入物をＥｃ　ｏＲ工部位に有す
るｐＡｃｙｃ　Ｉ　Ｂ　４からなるプラスミドｐ　ＲＩ
Ｔ　Ｉ　９５１６を含有することが判明した。ｐ　ＲＩ
Ｔ　　１０６１６の制限地図を第２表に示す。イー・コ
！Ｊ　Ｋ１２株Ｃ：５ＱＱ（ｐＲＩＴ　　１０６１６）
はヨーロッパ特許条約およびブタペスト条約に従いアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクションに１９８２
年６月２日付で寄託番号ＡＴＣＣ３９１３２として寄託
されている。

実施例３ ｐＲＩＴ　１０６１６をｐＢＲ３１３と組合わせること
による　ＨＢｓＡｇをコードするヌクレオチド配列を含
有する中間プラスミド、ｐＲＩＴ　　Ｉ　Ｑ６４０の調
製 ｐＲＩＴ１０６１６をカーノら〔Ｋａｈｎ　ｅｔ、ａｌ
。

、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖ
ｏｌ　、５８．２５８、（１９７９））の記載に実質的
に従いＣｓＣ１−臭化エチジウム密度グレジエント遠心
分離法によシ精製する。

該ＤＮＡをＢａｍＨｌエンドヌクレアーゼで消化し、プ
ラスミドｐＢＲ３１３のＢａｍＨＪ消化、アルカリ性ホ
スファターゼ処理ＤＮＡと混合し、結紮し、実施例１の
記載と実質的に同様にしてイー・コリに１２株Ｃ６００
のコンピテント細胞を形質転換するのに用いる。プラス
ミドＰＢＲ３１３は、入手の制限なしにアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクションに寄託番号３７０１８
として寄託されている。

形質転換体をアンピシリン含有寒天培地上で選択し、ｐ
ＢＲ３１３のＢａｔｎＨ工部位における挿入を示すテト
ラサイクリン耐性の欠失についてスクリーニングする。

形質転換コロニーは、ＢａｍＨＩ部位に１３５０　ｂｐ
挿入物を有するｐＢＲ３１３からなるプラスミド、ｐＲ
ＩＴ　１０６４０　　を含むことが判明した。該挿入物
は、ｌ−ｌＢｓＡｇをコードできるヌクレオチド配列で
ある。該挿入物は推定的ＨＢｓＡｇ前駆体蛋白部分およ
び完全表面抗原をコードし、また、５６５　ｂｐの３′
非コード付は配列を含有する。

実施例４ 酵ｆｎａｒｇ３遺伝子をｐＢＲ３２２と組合わせること
による、ａｒｇ３調節域を含有する中間プラスミド、ｐ
Ｍｃ２００の調製 ａｒｇ３遺伝子を特定する３　３００　ｂｐ酵母ＤＮＡ
フラグメントを、ｐＹｅｕｒａ３ａｒｇ３をＨｉｎｄｌ
Ｉ［で消化することにより得る。プラスミドｐＹｅｕｒ
ａ３ａｒｇ３については、クラビールら〔Ｃｒａｂｅｅ
ｌ　ｅｔａｌ、、ｐｒｏｃ、ｌ’Ｊａｔｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、、Ｖｏｌ、　　７８゜５０２６、（１
１９８１））によって記載されている。該３３００　ｂ
ｐフラグメントをｐＢＲ３２２のＦＩｉｎｄ■部泣中に
クローンし、実質的に前記と同様にしてイー・コリに１
２株ＭＭ２９４中に形質転換させる。形質転換体をアン
ピシリン培地上で選択し、テトラサイクリン耐性につい
てスフ１ノーニングする。形質転換コロニーは、Ｈｉｎ
ｄｌ［部位に挿入物を有するｐＢＲ３２２からなるプラ
スミドｐＭｃ２００を含有することが判明した。このプ
ラスミドは、以下の実施例に記載するように酵母細胞に
おいてＨＢｓＡｇヌクレオチド配列の転写を行なうこと
のできるａｒｇ３調節誠を含んでいる。イー・コリに１
２株ＭＭ２９４　（ｐＭｃ　２００）はヨーロッパ特許
条約およびブダペスト条約に従いアメリカン・タイプ−
カルチャー中コレクションに１９８２年６月２日付で寄
託番号ＡＴＣＣ３９１３０として寄託されている。

オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼＯＣＴ）の
ためのＮ−末端コード付は配列部分および５′−非翻訳
先端域の部分を含め、ａｒｇ３遺伝子の一部のヌクレオ
チド配列は、ヒュイゲンら（Ｉ−Ｉｕｙｇｈｅｎ　ｅｉ
　ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｌ．Ｐｈｙｓｉｃａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ．、Ｖｏｌ．８９　、Ｂ１７２，　（１
９８１　）〕によって決定されている。第４図（てこの
公知の配列の２　１　０　ｂｐフラグメントを示す。該
２１０ｂｐフラグメントはｐＭｃ２００中の３３００１
）ｐＨｉｎｄｌ［酵母ＤＮＡ挿入物上に独特なＩ−Ｉ　
ｉ　ｎ　ｃ　ＩＩ、Ｂｇｌ［およびＥｃｏＲ］：部位を
含有し、該ＯＣＴ蛋白コード付は配列のだめの開始コー
ドンは第４図中の四角で囲んだＡＴＧコードンと考えら
れる。

ＨＢｓＡｇ単独またはＨＢｓＡｇ前駆体とクローンした
Ｈ　Ｂ　ＸＩ　　Ｄ　Ｎ　Ａ由来のＨＢｓＡｇをコード
する配列の酵母１）ＮＡのＩ−Ｉ　ｉ　ｎ　ｃ　■、Ｂ
ｇｌｌｌまだはＥｃｏＲＩ部位への導入は遺伝子融合を
もたらし、該遺伝子融合が融合部位を越えて翻訳を継続
させるだめの正しい方向にある場合には、該ａｒｇ３調
節域から転写、翻訳されたノ１イブリッド蛋白を産生ず
るものと考えられる。

実施例５ ｐｔ’！−ＩＴ１０６４１をｐＭｃ２００と組合わせる
ことによる、ＨＢｓＡｇおよび調節域を含む中間プラス
ミド、ｐＲＩＴ　　１　０　６　７　１およびｐＲＩ−
ｒｌ　１１　６　７　２の調製 ｐＭｃ２００　　５μｆをＢｇｌｌＩ　６．４単位で３
７°Ｃにて２．５時間消化し、０．１Ｍグｌノシン、０
．０１Ｍ　Ｍｇ　Ｃ　ｌ　２　−　６Ｈ２０および０．
Ｑ　ｌ　ｍ　Ｍ　ＺｎＣｌ　２を含有する等容量の緩衝
液（ＰＨ１０．５）で希釈し、ウシ腸アルカリ性ホスフ
゛ｒターゼ０．５単位と共に３７°Ｃにて３０分間イン
キュベートし、５′末ス藺リン酸堪残基を除去する。該
混合液を緩衝液−飽和フェノールで２回、エーテルで３
１田抽υΔする。

ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、０．０１Ｍトロメタミ
ン緩菌液（ｐＨ７．５）に溶解する。

ｐＲＩＴ　１０６４０　　２５μｇをＢ　ａ　ｍｌ−Ｉ
　■で４１化し、ＨＢＶ　　ＤＮＡの１　３　５　０　
ｂｐ　　ＢａｍＨ１７ラグメントを切除する。該１　３
　５　０　ｂｐフラク゛メントを調製アガロースゲル電
気泳動および電気溶出により精製する。溶出ＤＮＡをエ
タノール沈澱により回収、濃縮し、０．０１Ｍ）ロメタ
ミン緩衝液（ＰＨ７，０）２０μ＃中に溶解する。ｌ−
ｌＢｓＡｇコード付は配列を含むＢａｍＨＩフラグメン
ト０．３ｐｙをＢｇｌｌｌ：消化ＰＭＣ２０００，５１
ＬＩ／と混合し、該混合物をＴ　４　Ｄ　Ｎ　Ａ　！Ｊ
ガーゼと共にインキュベーションして結紮する。

該結紮ＤＮＡをイー・コリＫ　１２株ＭＭ２９４のコン
ビテン１１胞を形質転換するのに用いる。

形質転換体を２００μｆ／ｍｌ　　アンピシリン含有寒
天平板上で選択する。アンピシリン寒天培地上で連続継
代して１２個の耐性コロニーを単離し、ビ／Ｖンボイム
ら〔Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　ｅＬ　ａｌ、、Ｎｕｃｌ、Ａｃ
１ｄ。

Ｒｅｓ、、Ｖｏｌ、７　、１５１３　（１９７９））に
より記載された方法によってプラスミドを単離する。

アガロースゲル電気泳動による分析は、すべてのプラス
ミドがＨｐ　ａ　■によって制限され、Ｂａｍ）［フラ
グメントの挿入を示し、また、挿入フラグメントの両方
の方向が１２個の形質転換コロニー中にあることを示し
ている。′該プラスミドはＣｓＣ１−臭化エチジウム密
度グレジエント遠心分離法によって単離される。１つの
プラスミド、ｐＲＩＴ１０６７１は、ＨＢｓＡｇコード
付は配列の転写のだめの正しい方向でＢｇｌ［部位に融
合されたＢａｍ１［フラグメントを含み、ＯＣＴの１８
個のＮ−末端アミノ酸、推定的ＨＢｓＡｇ前躯体蛋白の
４２個のアミノ酸およびＨＢｓＡｇの２２６個のアミン
酸からなる２８６個のアミノ酸融合蛋白を生じる。

該融合蛋白は以下の実施例８で示されるＨ　Ｂ　ｓ　Ａ
　ｇである。ｐＲＩＴ　１０６７１を含有する形質転換
体を、イー・コリに１２株ＭＭ　２　（４４（ｐＲＩＴ
　　　　　′１０６７１）と命名する。ｐＲＩＴ　　１
０６７１を第５図に示す。

中間プラスミドとしてのｐＲＩＴ　１０６４０の使用は
必須ではない。例えば、該Ｂ　ａ　＋ｎ　Ｉ−Ｉ　■フ
ラグメントはｐＲＩＴ　１０６１６から切り出すことが
できる。

もう１つのプラスミド、ｐＲＩＴ　１０６７２は、ＨＢ
ｓＡｇコード付は配列の転写のための正しくない方向唇
あるＢａｍＨエフラグメントを含んでいる。このプラス
ミドを含む形質転換体をイー・コリに１２株ＭＭ２９４
（ＰＲＩＴ　１０６７２）と命名する。

実施例６ ｐＲＩＴ　　１０６７１およびｐＲＩＴ１０６７２をシ
ャトルベクターＹＥｐ１３と組合わせることによるプラ
スミド、ｐＲＩＴ　１０６７１およびｐＲＩＴ　１０６
７４シヤトルベクターの調製ベクターＹＥｐ１３はイー
・コリー・サツカロミセス・セレビシアエ・シャトルベ
クターである。

ベクターＹＥｐ１３はブローチらＣＢｒｏａｃｈ　ｅｔ
ａｌ、、　Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ、Ｆ３　、１２１　、　（
１９７９））に記載されておシ、ジエイ・ヒックス（Ｊ
、ｌ−ｌ１ｃｋｓ。

Ｃｏ１ｄ、Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ　ＮｅｗＹｏｒｋ、Ｕ、Ｓ、Ａ）によって
供給された。小さイＨｉｎｄ■フラグメントを、Ｈｉｎ
ｄｌｌ［による消化でプラスミドから切除し、該プラス
ミドを再結紮して、単一のＨｉｎｄｌｌＩ部位を含む誘
導プラスミド、ＹＥｐ１３Ｈｉｎｄｌ［を調製する。精
製ＹＥｐ１３Ｈｉｎｄ■をＨｉｎｄｌ［で消化し、アル
カリ性ホスファターゼで処理して再結紮を抑制する。該
ＤＮＡをフェノール抽出およびエタノール沈澱によって
回収する。

精製ｐＲＩＴ１０６７１およびｐＲＩ−ｒ　１０６７２
をＢａｍ１（］：で消化し、アルカリ性ホスファターゼ
で処理してｐ　１３　Ｒ３２２部分の再形成を抑制する
。

該処理ＤＮＡをさらにＨｉｎｄｌ［で消化して調節酸−
ＨＢｓＡｇ遺伝子融合を含む４６５０　ｂｐ　Ｈｉｎｄ
■フラグメントを遊離させ、ついで、その試料をフェノ
ールで抽出し、エタノールで沈澱させる。

ｐＲＩＴ　１０６７１　およびｐＲＩＴｌ　０６．７２
から誘導したＤ　Ｎ　Ａ調製物者０．４μｍを、別々に
、１４ｉｎｄＮ消化Ｙ　Ｅ　ｐ　ｌ　３　ＨｉｎｄｌＩ
［０，４μｆと混合し、該混合物をＴ４ＤＮＡＩＪガー
ゼと共ｉ（インキュベートする。

各結紮混合物の一部分をイー・コ！ＪＫ１２株ＭＭ２９
４のコンピテント細胞を形質転換するのに用いる。形質
転換体をアンピシリン寒天培地上で選択する。形質転換
体コロニーを単離し、ビルンボイムらＣＢｉｒｎｂｏｉ
ｍ　ｅｔ　ａｌ　、　、Ｎｕｃｌ　、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ
。

Ｖｏｌ、７．１５１３（１９７９）〕によって記載され
た方法により、それらのプラスミドの内容を調べた。形
質転換体コロニーの１つ、イー・コリ■（１２株ＭＭ２
９４（ｐＲＩＴ　１０６７３）は第６図に示すような正
しい方向で、Ｙ　Ｅ　ｐ　ｌ　３　Ｈｉｎｄ■上に挿入
されたｐＲＩＴ１０６７１がらのｌ−ｌ１ｎｄ■フラグ
メントを含むプラスミド、ｐ　ＲＩＴ　１０６７３を含
有する。もう１つの形質転換体コロニー、イーーｍｌ！
ＪＫ１２株ＭＭ２９４（ｐＲＩＴ　１０６７４）は、Ｙ
　Ｅ　ｐ　ｌ　３　Ｈｉｎｄｌ［上に正しくない方向で
挿入されたｐＲＩＴ１０６７２からのＨｉｎｄｌ［フラ
グメントを含むプラスミド、ｐＲＩＴ　１０６７４を含
有している。

実施例７ ＰＲＩＴ　１０６７３おｊびｐＲＩＴ　１０６７４によ
る酵母の形質転換 プラスミドｐＲＩＴ”　　１０６７３およびｐＲＩＴ　
　１６７４）の清澄な溶解質よりＣｓＣ１−臭化エチジ
ウム密度グレジエント遠心分離法によって単離する。

Ａ、サツカロミセス・セレビシアエ株ＤＣ５ブローチら
（Ｂｒｏａｃｈ　ｅｔ　ａｌ＋、Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ、　
Ｂ。

１２１、（１９７９）、：）によって記載されているサ
ツカロミセス・セレビシアエ株Ｄｃ　５　（ｌｅｕ　２
〜３．１ｅｕ２〜１１３、ｈｉｓ３、Ｃａｎ１〜１１）
は、ジェイ、ヒックＸ　（Ｊ＋Ｈｉｃｋｓ、Ｃｏ１ｄ　
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｕ、Ｓ、Ａ）から得られ、ヨーロ
ッパ特許条約およびブダペスト条約に従ってアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション（アメリカ合衆国
メリイランド州、ロックビル）に１９８２年６月２日に
寄託番号２０６３０として寄託されている。プロトプラ
スト化をβ−グルコウロニダーゼ（０，２４単位／ｍｌ
最終ｕ度）およびアリールスルファターゼ（１，２単位
／ｒｎｌ最終濃度）の混合物を用いて０．８Ｍソルビト
ール、０．０３Ｍβ−メルカプトエタノールおよび０．
１　Ｍ　！Ｊン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７，５）中で
行なう以外は、ハイネンら［Ｈｉｎｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ
、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、、Ｓ、Ａ
、、Ｖｏｌ、　　７５　、１９２９　（１９７８））に
よって記載された方法によってＤＣ５株の細胞を増殖さ
せ、形質転換用に調製する。酵母プロトプラストを、別
々に、ｐＲＩＴ１０６７３　１０μｇおよびｐＲＩＴ　
１０６７４１０μｆと共にインキュベートし、形質転換
体をロイシン欠損再生寒天培地中で選択する。−再生寒
天培地中で増殖したコロニーを回収し、０．６７５％ア
ミノ酸欠損酵母窒素基本培地、２％グルコース２％寒天
および８０μｆ／ｍｌヒスチジンを含有する固体培地上
に画線塗抹し、３０°Ｃで増殖させる。

ＤＣ５株の１コロニーはｐＲＩＴ　１０６７３で形質転
換され、これをサツカロミセスφセレビシア工株ＤＣ５
（ｐＲＩＴ　１０６７３　）と命名する。

もう１つのコロニーはｐＲＩＴ１０６７４で形質転換さ
れ、これをサツカロミセス・セレビシアエ株ＤＣ５（ｐ
ＲＩＴ　　１０６７４）と命名する。

ＤＣ５（ＰＲＩＴ　１０６７３　）株およびＤＣ５（Ｐ
ＲＩＴ１０６７４）株の培養物を８０μｂ勺ヒスチジン
加酵母窒素基本培地中で、６２０　Ｐｍにおいて０．３
３〜１．０の光学密度が得られるまで増殖させる。ＤＣ
５（ｐＲＩＴ　１０６７４）株は調節域に対して正しく
ない方向で融合されだＨＢｓＡｇコード付は配列を含ん
でいるので陰性対照として有用である。細胞を遠心分離
鈍より回収し、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ　）で洗滌
し、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニ／Ｌ／（ＰＭ
ＳＦ）加Ｐ　Ｂ　Ｓ　５　ｍｌ中に２０〜１６０倍濃度
で再懸濁させる。細胞ヲ、フレンチ・プレッシャーセｌ
しくＦｒｅｎｃｈＰｒｅｓｓｕｒｅ　Ｃｅ１ｌ）に１２
０００　ｐｓ　ｉ　（８３ＭＰａ）で２回通過させて破
壊し、溶解質を７７００ＸＧで１５分間、ついで３００
００ＸＧで３０分間遠心分離する。上澄液を回収し、マ
イレックス（Ｍｉ　ｌ　ｌ　ｅｘ　）Ｇ　Ｖメンプラン
上で濾過する。

゛上澄液における特異抗−ＨＢｓＡｇ抗体と反応する蛋
白の存在を、Ａｕ５ｒｉａ■ラジオイムノア“ンセイ法
によυテストする。このようにして調製されたサツカロ
ミセス・セレビシアエ株Ｄｃ５（ｐＲＩＴ１０６７３）
の清澄細胞抽出物はＰＢＳで１６〜２５６倍に希釈して
テストした場合でも陽性反応を与え、一方、ＤＣ５（ｐ
ＲＩＴ　　１０６７４）株抽出物は、抗−１−ＩＢｓＡ
ｇ抗体と反応する蛋白の存在に関するこの分析では陰性
であった。

Ｂ、　　サツカロミセス・セレビシアエ株Ｉ　Ｃ１６７
ｄ サツカロミセス・セレビシアエ株ＩＣ１６９７ｄはヨー
ロッパ特許条約およびブダペスト条約に従ってアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションに１９８２年６
月２日に寄託番号ＡＴＣＣ２０６３１として寄託されて
いる。前記の方法を用い、アルギニン栄養緩徐株ＩＣｌ
Ｃ１６９７ｄ（ａｒ　−１ｌｅｕ　２〜１　）をＰＲｘ
Ｔ１０６７３およびｐＲＩＴ　１０６７４で形質転換さ
せる。該栄養緩徐株のロイシン非依存性コロニーの１つ
をｐＲＩＴ　’１０６７３で形質転換させ、サツカロミ
ー！＝スｅセレビシアエ株ＩＣ１６９７ｄ（ｐＲＩＴ１
０６７３）と命名する。もう１つのロイシン非依存性コ
ロニーを、ｐＲＩＴ　Ｉ　Ｑ　６７４で形質転換させサ
ツカロミセス・セレビシアエ株ＩＣ１６９７ｄ（ｐＲＩ
Ｔ　　１０６７４）と命名する。

１ｃ１６９７ｄ（ｐＲＩＴ　１０６７３）株および１ｃ
１５９７ｄ（ｐＲＩＴ　１０６７４）株の培養物を２０
μｇ／ｒｎｌアルギニン補足酵母窒素基本培地中で増殖
さする。細胞を回収し、細胞抽出物を前記と同様にして
調製する。ＩＣ１６９７ｄ（ＰＲＩＴ１０６７３）株の
清澄細胞抽出物は、１／２０４８まで希釈してもＡ・・
・ｉ＝■ラジオイムノアッセイにおいて陽性の結果を示
すが、ＩＣｌ６９７ｄ（ＰＲＩＴ　１０６７４）株の抽
出物では、この分析において一様に陰性であった。

これらの結果から、ＤＣ５株およびｐＲＩＴ１０６７３
で形質転換されだｌｃ　　１６９７ｃｉ株の酵母細胞１
４、ＨＢｓＡｇ決定子を有する融合蛋白の形態でｉ（Ｂ
ｓＡｇを特異的に合成すると結論づけられる。

実施例８ サツカロミセス・セレビシアエ株１ｃ１６９７ｄ（ｐＲ
ＩＴ　１０６７３　）からのＨＢｓＡｇにヨルウサギの
免疫法 サツカロミセス・セレビシアエ株１ｃ１６９７ｄ　（ｐ
ＲＩＴ　１０６７３　）を６２０ｐｍにおける光学密度
が０．６０となるまで増殖させ、遠心分離によって採集
する。細胞を１　ｍ　Ｍ　　Ｐ　ＭＳ　Ｆ　７ＪｌＪＰ
Ｂ　Ｓ中に４０台濃度で再懸濁する。清澄細胞抽出物を
実施例７に記載の方法に従って調製する。同様にして、
ＩＣ１６９７ｄ（ＰＲＩＴ　　１０６７４）株の清澄細
胞抽出物を調製する。これらの抽出物をウサギの免疫付
与に用いる。６匹のウサギからなる第１群には、７０イ
ンド完全アジユバント１ｄと混合した１　ｃ　１６９７
ｄ　（ｐＲＩＴ　　ＩＱ５７３）味抽出物１ｄを非経口
的注入で第０．９．１５．３０および３７日目に与える
。３匹のウサギからなる’ＩＪ　２群には、７０インド
完全アジユバント１ｄと混合したＩ　Ｃ１６９７ｄ　（
ｐＲＩＴ１０６７４）株抽出物１１ｎｌを非経口的注入
で同じ日に与える。

両群から第０（免疫付与前）、２３．５１、および６５
日目に、また、第１群からは第４４日日にも血清を採取
し、Ａｕ５ａｂ■ラジオイムノアツセイを用’ｈて抗−
ＨＢｓＡｇ抗体の存在をテストシタ。

これらの結果を第１表に示す。これらの結果は、１ｃ１
６９７ｄ（ｐＲＩＴ　１０６７３）株からの抽出物の注
入を受けだ６匹の・ウサギのうち４匹がｉ（Ｂ　ｓ　Ａ
　ｇ　Ｋ　Ｅする抗体を生じたことを示している。

ＩＣ１６９７ｄ’（ｐＲＩＴ　１０６７４）株からの抽
出物の注入を受けた３匹の対照のウサギはいずれも抗−
ｉ−ＩＢｓＡｇ抗体産生の形跡を示していない。

これらの結果から、１ｃ１６９７ｄ（ｐＲＩＴ　１０６
７３）味抽出物はＨＢｓＡｇを含み、重篤な副作用なし
にヒトにおけるＩ（Ｂ　Ｖ　ｇ染に対する保護を惹起す
るためのワクチンに用いることができると結論される。

実施例９ ａｒｇ３調節戦を含有するｐＭｃ２００からのプラスミ
ド、ｐＲＩＴ　１０７４９の調製：に’ｌｐＭＣ２ｏｏ
を）（ｉｎｃ［で消化し、１０％アクリルアミドゲル上
で電気泳動にかける。ａｒｇ３調節戦を含有するｌ　９
４０　ｂｐフラグメントを電気溶出およびエタノール沈
澱によって該ゲルより回収する。該フラグメント約４μ
ｇを１２．５ｍＭ　　　　ＭｇＣｌ２、　１　２．５　
　ｍＭ　　　ＣａＣｌ２、　２００　ｍ　八ｌＮａＣ１
、１ｍＭ　　ＥＤＴＡおよび２００ｍＭトロメタミンー
ＨＣＩを含有する緩衝液（ｐＨ８，０）１００μＡ　中
でＢａ１３’ｌエキソヌクレアーゼ０，２単位と共に３
０°Ｃにて１〜３秒間インキュベートする。該処理ＤＮ
Ａをフェノールで抽出し、エタノールで沈澱させる。そ
の１μｇをデオキシヌクレオチド三リン酸塩の存在下で
Ｔ４ＤＮＡポリメラービと共にインキュベートしていず
れもの１本鎖端部を修復し１．ついで、ＥｃｏＲエエン
ドヌクレアーゼで消化する。この方法で、Ｂａ１３１に
よる切除により種々の長さのＤＮＡフラグメントが産生
される。各７ラグメントは一端に固定したＥｃ。

Ｒｉ延長部を有し、もう一つの端部は元のＨｉｎｃ１１
部位およびＯＣＴ蛋白開始コードンからいくらかの距１
馳を置いて位置した鈍化端（ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ）とな
っている。ａｒｇ３調節誠を含有する約１４８０ｂｐの
７ラグメントを７．５％アクリルアミドゲル上で電気泳
動、ついで、電気溶出およびエタノール沈澱に付して単
離する。このカットバック調節域は、以下の実施例１０
に記載されるように、ＯＣＴアミノ酸１ｊ己列を欠く蛋
白合成に先立つ転写をプロモートすることができるので
好ましい。

第２の一連の反応では、ｐＭＣ２００ｅＸｂａＩで消化
し、５′−１本鎖端部をＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよび
デオキシヌクレオチド三リン酸塩と共にインキュベート
して詰込むか、鈍化端とする。

このＤＮＡをＥｃｏＲｌで消化し、３′からＸｂａ工部
位までに位置する酵母ＤＮＡ配列と、ｐ　Ｂ　Ｒ３２２
を含む約５７００　ｂｐの大きなＥｃｏＲｌ−Ｔ４／Ｘ
ｂａ■フラグメントを電気泳動、電気溶出およびエタノ
ール沈澱によって精製する。このフラグメントを該１４
８０ｂｐプロモーター含有フラグメントと混合し、これ
に結紮する。

該結紮混合物をイー・コ！ＪＫ１２株ＭＭ２９４のコン
ピテント＜ａ胞を形質転換するのに用いる。

形質転換体をアンピシリン寒天培地上で選択する。

プラスミドＤＮＡをビルンボイムら（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ
ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、、Ｖｏｌ
、７　、　ｌ　５１３、（１９７９）、ｌの記載した方
法によって形質転換体コロニーよシ単離し、Ｘｂａ■で
の消化によってＸｂａ■部位の存在についてスクリーニ
ングする。

Ｘｂａ■部位は、第２の一連の反応からのフラグメント
上の詰込まれだＸｂａ１部位が、ＸｂａＩ’認識配列で
あるＴＣＴＡＧＡを新しい位置で復元させるように、３
１Ｔ残基で終わる第１の一連の反応からのもう１つのフ
ラグメントに結紮しているプラスミドにのみ存在してい
る。Ｘｂａ１部位を有するプラースミドをｐＲＩＴ１０
７４９と命名した。これらの操作を示すフローシートを
第６図に示す。イー・コリに１２株ＭＭ　２９４　（Ｐ
　ＲＩＴ１０７４９）は、ヨーロッパ特許条約およびブ
ダペスト条約に従ってアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（アメリカ合衆国メリイランド州、ロッ
クビル）に、１９８２年６月２日付で寄託番号Ａ　−、
ｒＣＣ３９１３３として寄託されている。

ＰＲＩＴ１０７４９の試料をＢｓｔＥｌｌ：およびＸｂ
ａｌの組合せで消化する。切除されたａｒｇ３調節域の
サイズは、ＢｓｔＥｌｌ：およびＸｂａｌ：で同様に消
化されたｐＭｃ２００との比較にょシ、また、フックら
［：　Ｆｕｃｈｓ　ｅｔ、ａｌ、、　Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ
、４　、１（１９７８）〕によって記載されているファ
ージφｘ１７４ＤＮＡフラグメントの公知の分子量を参
照することによシ約２１０　ｂｐと算定された。

ｐＲＩＴ　　１０７４９のＢｓｔＥ［−Ｘｂａエフラグ
メントのＤＮＡ配列を決定するため、プラスミドＤＮＡ
を１３ｓｔＥＩＩで消化し、交換キネ−ジョンによって
γ−Ｐ−ＡＴＰで標識し、ついで、ＢａｍＨエエンドヌ
クレアーゼで消化して２０００　ｂｐフラグメントを遊
離させ、電気溶出およびエタノール沈暇によって精製す
る。標識フラグメントのＤＮＡ配列化はマキサムら［Ｍ
ａｘａｍ　ｅｔ　　ａｌ　、　。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　ＥｎｚｙｍｏｌＯｇｙ、Ｖ
ｏｌ＋６５　。

４９９　、（１９８０））によって記載された化学的修
飾法に従って行なわれる。この配列の１部分は、ＣＣＣ
ＡＴＣＡ八Ｇ　−ｒ　へ　Ｇ　−ｒ　Ａ　ＣＡ　Ｃ，Ｔ
ＣＧＴＣＴＡＧＡと決定された。アンダーラインを施し
たヌクレオチドは、５７００　ｂｐ　　ＥｃｏＲＩ−Ｔ
４／Ｘ　ｂ　ａ　Ｉフラグメントから誘導される。第４
図に示すＤＮＡ配列の相当区域と比Ｉ咬すると、修復さ
れたＸｂａＩ部位が、ｐＭｃ２００酵母ＤＮＡ挿入物に
おける元のＨｉ　ｎ　ｃ　ＩＩ部位のヌクレオチド９個
上流の５′非翻訳先端戚中に位置することがわかる。

実施例１０ ＰＲＩＴ１０７４９をｐＲＩＴ１０６０１と組合わせる
ことによる、ＨＢｓＡｇおよび調節戦を含有するプラス
ミド、ｐＲＩＴ　１０７５９およびｐＲＩＴ　１０７６
１の調製 ｐＲＩＴ　　１０６０１をＨｈａ１ｘンドヌクレアーピ
で消化し、７，５％アクリルアミドゲル上で電気泳動に
付−ｙｏ　１１００ｂＰフラグメントを電気溶出および
エタノール沈叔によって回収する。このフラグメントの
一部のＤ　Ｎ　Ａ配列は、ピーターソンら（Ｐｅｔｅｒ
ｓｏｎ　　ｅｔ　　ａｌ　、、Ｖｉｒａｌ　Ｈｅｐａｔ
ｉｔｉｓ、Ｇ、Ｎ、Ｖｙａｓ、Ｓ、Ｎ、Ｃｏｈｅｎ　ａ
ｎｄ　Ｒ，Ｓｃｈｍｉｄ、Ｅｄｓ。

Ｆｒａｎｋｌｉｎ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　Ｐｒｅｓｓ、
Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、（１９７８、Ｐ５６９　）によって記載さ
れているような、ａｙｗ抗原型ＨＢｓＡｇの公知のＮ−
末端アミノ酸配列に対応する配列を含有する。

該フラグメントは、５′〜ＨＢｓＡｇ開始コードンに位
置する６個のヌクレオチド、完全なＨＢｓＡｇコード付
は配列および約３９０個の３′非翻訳ヌクレオチドを含
有する。

プラスミドｐＲＩＴ１０７４　ｇ（７）ＤＮＡをＸｂａ
ｌで消化し、該ＤＮＡ約４０　Ｏｎ’ｌを精製ＨｈａＩ
７ラグメント約２８０　ｎｆｌと混合する。該混合物を
２０ｍＭトロ、Ｉｌｌ　ミン−ＨＣｌ　　、ｌＱｍＭ　
ＭｇＣｌ２．１ｍＭジチオトレイトールならびにｄＡＴ
Ｐ。

ｄｃＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ各３３ｍＭを含有す
る緩衝液（ＰＨ７，５）　２０μｌ中で３７°Ｃにて３
０分間Ｔ４ＤＮＡポ！Ｊ　メーｙ−ゼｏ、５Ｑ位と共Ｇ
Ｃインキュベートする。該反応混合液に１ｍＭＡＴ　Ｐ
　２，５　μｌ、　　ｌ　Ｑ　ｍＭ　　ＥＤＴＡ２．５
１１＃）およびＴ４ＤＮＡリガーゼ２μｇ　（２単位）
を加え、該混合液を１５°Ｃにて１６時間インキュベー
トする。

該結紮混合物をイー・コ！ＪＫ１２株ＭＭ２９４のコン
ピテント細胞を形質転換するのに用い、アンピシリン耐
性形質転換体を選択する。プラスミド調製物をいくつか
のこれらの形質転換体より作シ、制限エンドヌクレアー
ゼ消化およびゲル電気泳動によυ分析した。その結果は
鈍化端ＨＢ　ＶフラグメントがＸｂａ■消化ｐＲＩＴ　
１０７４９中に両方の可能な方向で挿入されていること
を示している。このようなプラスミドの１つ、ｐ　ＲＩ
Ｔ　　Ｉ　Ｑ７６１はａｒｇ３プロモーターからｌ−ｌ
ＢｓＡｇ配列ヲ転写するだめの正しい方向の１１００１
１１）挿入物を含み、ＢｓｔＥ］’［およびＸｂａ　■
による連続的消化によｆｉ２７１ｂｐフラグメントを生
ずる。このＰＲＩＴＩＯ’／６１を第７図に示す。第２
のプラスミド、ρＲＩＴ１０７５９は正しくない方向で
挿入物を包含し、ＢｓｔＥｌｌ：およびＸｂａＪエンド
ヌクレアーゼの組合せで消化すると、１１７５ｂｐと算
定されるフラグメントを生ずる。ｐ　ＲＩＴ　　ｌ　０
７６１にライて、ａｒｇ３調節域−ＨＢｓＡｇ挿入接合
部におけるヌクレオチドの配列を、γ−Ｐ−Ａ　Ｔ　Ｐ
によるＸｂａｌ：末端の交換キネ−ジョン標識付けの後
、マキサムら〔Ｍａｘａｍ、ｅｔ　　ａｌ、。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖ
ｑｌ、６５　。

４９９　（１９８０）”］の化学的修飾法を用いて２７
１　ｂｐ　　ＢｓｔＥＩＩ−ＸｂａＩ　７ラグメントを
配列化することにより決定する。ａ　ｒ　ｇ　３　閘節
域−ＨＢｓＡｇ接合部に対して決定された配列はＴＡＣ
ＡＣＴＣＧＴＣＴＡＣＴＧＡＡＣＡＴＧである。Ｘｂａ
■制限部位がＴ　４　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼによって
完全には修復されず、グアニン残基１つを欠失している
ことがわかる。該ａｒｇ３非翻訳先端部にはＩ−Ｉ　Ｂ
　Ｖ起源の６個のヌクレオチド、ＣＴＧＡＡＣが直接続
き、さらにＨＢｓＡｇ開始コードン、ＡＴＧおよびｉ（
ＢｓＡｇ構造遺伝子のコード付は配列が絖いてイル。Ｈ
Ｂ　ｓ　Ａｇ　開始コードンはａｒｇ３プロモーターの
下流にある最初の開始コードンである。そのため、該Ｄ
ＮＡから転写されたｍ　ＲＮ　Ａの翻訳はそのコードン
で開始され、合成されだＨＢｓＡｇは異質アミノ残基を
欠失することになる。合成されたＨＢｓＡｇは融合蛋白
ではなく、ＨＢｓＡｇ標品と構造的に本質的に同じもの
である。

実施例１１ ｐＲｌＴＩ　Ｏ７６１をＹ　Ｅ　ｐ　ｌ　３　Ｈｉｎｄ
ｌｌｌ：と組合わせることによるプラスミドｐＲＩＴ　
１０７６４およびｐＲＩＴ　　１０７６５の調製 ｐＲＩＴ１０７６１およびｐＲＩＴ　１０７５９を別々
にＰｓｔ■およびＢａｍＨｌで消化してｐＢＲ３２２レ
プリコン部分を破壊し、ついでＨｉｎｄｌｌｉで消化し
て挿入されだＨＢ　Ｖ　　Ｄ　Ｎ　Ａおよび調節域を担
持するＤＮＡフラグメントを遊離させる。

Ｘ　ｌ）　Ｎ　Ａ　ラフエノールで抽出し、エタノール
で沈澱させ、０．０１ＭトロメタミンーＨＣＩ　および
０、ＯＱＩＭ　　ＥＤ−Ｉ”Ａを含有する緩衝液（ｐＨ
７，５）に溶解する。各ＤＮＡ調製物の０．６μｆを前
記と同様な方法で調製されるＹ　Ｅ　ｐ　ｌ　３　Ｈｉ
ｎｄｌＩのＨｉｎｄｌ［消化、アルカリ性ホスファター
ゼ処理ＤＮ　Ａ　Ｑ、　３μｆと混合し、該混合物を結
紮する。

該結紮混合物をイー・コ！ＪＫ１２株ＭＭ２９４のコン
ビテン１−ｆａ胞の形質転換に用い、アンピシリン耐性
形質転換体を選択する。１つの形質転換体は、ＰＲＩ−
［１０７６１由来のＨｉｎｄ［７７グメントをＹ　Ｅ　
ｐ　１３　Ｈｉｎｄｕ上に挿入してなるプラスミドＰＲ
ＩＴ１０７６４を含有することが示された。また、別の
形質転換体はＰＲＩＴ１０７５９由来Ｈｉｎｄｆｆｉ７
ラグメントをＹＥ　Ｐ　１３　Ｈｉｎｄ■上に挿入して
なるプラスミドｐＲＩＴ　１０７５９を含有することが
示された。ｐＲＩＴ　Ｉ　Ｑ　７６１およびｐＲＩＴ　
１０７６４の調製７０−シートを第７図に示す。

実施例１２ ｐＲＩＴ１０７６４およびｐＲＩＴ　１０７６５による
酵母の形質転換 ｐＲＩＴ　１０７６４およびＰＲＩＴ１０７６５を実施
例１１で調製された形質転換体の培養物よりＣｓＣ１−
臭化エチジウム密度ダレジエント遠心分離法によって単
離し、各１０μｆを実施例７に記載の方法により酵母株
ＩＣ１６９７ｄの細胞を形質転換するのに用い、再生寒
天培地上でロイシン−非依存性形質転換体を選択する。

これらの形質転換から生ずるロイシン−非依存性コロニ
ーを菌株ＩＣ１６９７ｄ（ｐＲ’ＩＴ　１０７６４）と
命名する。もう１つの形質転換体をサツカロミセス・セ
レビシアエ株ＩＣ１６９７ｄ（ｐＲＩＴ　１０７６５）
と命名する。これらの菌株の培養物を、２％クルコース
および２０μｆ／ｍｌアルギニン補足酵母窒素基本培地
中で６２０μｍにおける光学密度が０．８０〜０．８８
となるまで増殖させる。細胞を集め、細胞不含抽出液を
調製し、実施例７に記、■−１゜ 載されるようにＡｕ　ｓ　ｒ　ｌａ　　フンオイムノア
゛ノセイによりＩ（Ｂ　ｓ　Ａ　ｇについて分析する。

ＩＣ１６９７ｄ（ＰｖＬＩＴ１０７６４）の抽出物ハ、
ＰＢＳＫよる希釈度がｌ／１０２４まででもこの分析に
おいて陽性の結果を示すが、１　ｃ　ｌ　５９７ｄ　（
ＰＲＩＴ１０７６５）株は非希釈抽出物でもこの分析に
おいて一様に陰性であった。遺伝学およびラジオイムノ
アッセイの結果より、サツカロミセス・セレビシアエ株
１　ｃ　１６９７ｄ　（ｐＲＩＴ１０６７４）の細胞は
、ヒトにおけるＨＢＶ感染に対する保護を重篤な副作用
なしで惹起するだめのワクチンに使用できるＨＢｓＡｇ
を合咳すると結論される。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＲＩＴ　１０６０１の制限エンドヌクレアー
ゼ開裂地図、第２図はｐＲＩ’Ｔ　１０６０６の制限エ
ンドヌクレアーゼ開裂地図、第３図は２ＭＣ２００の制
限エンドヌクレアーゼ開裂地図、・第４図はｐＭｃ２０
０における３　３００　ｂｐＨｉｎｄｌ［酵母ＤＮＡ挿
入物の一部分のヌクレオチド配列、第５図はｐＲＩＴ１
０６７１および、ＲＩ　Ｔ　１０６７３の製造を示すフ
ローシート、第６図１はｐＲＩＴ１０７４９の製造を示
すフローシート、第７図ばＰＲＩＴ１０７６１およびｐ
ＲＩＴ１０７６４の製造を示すフローシートである。 特許出（願人　スミス・クライン−アール・アイ・ティ 代理　人　弁理士　青白葆ほか２名 第１１Ｏ ｃｏＲ１ 口＝＝コＨ１ｉＶ　ＯＮＡ 第２図 ｃｏＲ１ ■■Ｉ■ｐａｃｙｃ　１８４ ０：＝コＨＢＶＤＮＡ 第３図 １１６曲３２２ ０：コ」３ 第４図 ＴＣ丁ＡＡＡＧＧＣＡ　　　　ＧＴＴＴＡＴＴＣＣＴ　
　　　ＴＧＴＡＴＧＴＣＣＴＴＴＡＡＧＴＡＣＡＧ　　
　　ＴＴＡＡＴＡＡＣＧＡ　　　　ＧＣＡＡＴＴＴＴ丁
Ｔ５ａｌ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　　　ＴＡＧＣＣＡＴＣＴＡ　　
　ＣＣＣＡＴＣＡＡＣＴＴＣＣＡＣＧＣＣＴ丁　　　Ｃ
ＡＴＣＴＴＴＡＣＧ　　　　ＴＣＡ丁ＴＴＧＡＴＴＡＧ
ＡＡＴＣ丁ＴＡＧ　　　　ＴＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＣＡ
ＡＣＡＴＴＴＣ０発　明　者　クラベール・マリオレン
ベルギー国ベー−１６３０リンケベ ーク・ドウエルスボス３２番 ０発　明　者　ドウ・ビルド・ミシエルベルギー国ベー
−１３２０ジエンパ ル・アベニュー・シュバール１３ ６番 ＠発明者　　ハーフオード・ニジエル ベルギー国ベー−１９００オベリー ジユ・シェフ・ランボーラン９ 番 ４３６一

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ＨＢ　ｓ　Ａｇをコードできるヌクレオチド配列
   および酵母において該１−ｌＢｓＡｇ配列の転写を行な
   うことのできる、酵母ａｒｇ３遺伝子由来の調節域から
   なることを特徴とするＭ換型ＤＮＡ分子。 （２）該ＨＢｓＡｇ配列が該調節域に関して、ＨＢｓＡ
   ｇ配列の表現によって合成されだＨＢｓＡｇが実質的に
   異質アミノ酸残基を欠くように位置する前記第（１）項
   の分子。 （３）調節域がｐＹｅｕｒａ３ａｒｇ　３から由来する
   前記第（１）項の分子。 （４）調節域がｐＹｅｕｒａ３ａｒｇ３のＨｉｎｄｌ［
   制限エンドヌクレアーゼによる消化によって得られるａ
   ｒｇ３遺伝子を特定する３　３００　ｂｐ酵母ＤＮＡフ
   ラグメントから由来する前記第（１）項の分子。 ［５）ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ配列がＨＢＶ　　ＤＮＡのＢａ
   ｍＨ工制限エンドヌクレアーゼ処理にょシ誘導される前
   Ｅ第（１）項の分子。 （６）ＨＢｓＡｇ配列がＨｉ　ｎ　ｃ　ＩＩ、Ｂｇｌ、
   ［またはＥｃｏＲ工部位で酵母調節域に挿入されている
   前記第（１）項の分子。 （７）ＨＢｓＡｇ配列がａｄｗ抗原型のゾーン粒子から
   抽出されだＨＢＶ　　ＤＮＡ由来のものである前記第（
   １）項の分子。 （８）ＨＢｓＡｇ配列がａｙｗ抗原型のゾーン粒子から
   抽出されたＨＢＶ　　ＤＮＡ由来のものである前記第（
   １）項の分子。 （ｇｌＨＢｓＡｇ配列がＨＢ　Ｖ　　Ｄ　Ｎ　Ａ　（７
   ）　ＢａｍＨＩ　７　ラグメントである前記第（７）項
   の分子。 ＱＯ）Ｉ（ｎｓＡｇ配列がＨＢＶ　　ＤＮＡのＢａｍＨ
   ■７ラグメントの融ａ対から由来するＨｈ　ａ　Ｉフラ
   グメントである前記第（８）項の分子。 Ｑｌ）ＨＢ　ｓ　Ａｇ配列が酵母調節域のＢｇｌ　ｆ（
   部位に挿入されている前記第（９）項の分子。 Ｑ２）調節域が、１つの端部にＥｃｏＲ１延長部を有し
   、鈍化端である他端で３１”’ｆ残基で終る、ｐ　Ｍ　
   Ｃ２００の１４８０ｂｐフラグメントである前記第（１
   ０）項の分子。 Ｑ３）ＨＢ　ｓ　、Ａ　ｇ　配列力、ｐＭＣ２００ノ５
   ７００　ｂｐＸｂａｌ−ＥｃｏＲ工７ラグメントにおけ
   るＸｂａ１部位のポリメラーゼ修復後に該フラグメント
   に融合した１４８０ｂｐフラグメントを有する分子の該
   Ｘｂａ１部位に挿入されている前記第（１２）項の分子
   。 Ｑ４）プラスミドＰＲＩＴ１０６７１　テアルｆｊＪ記
   第（１１項の分子。 Ｃ１５）プラスミドＰＲＩＴ１ｏ６７３であ７：ｒ　ｔ
   ｌｌ　記第（１）項の分子。 ０のプラスミドｐＲＩＴ１０７６１である前記第（１）
   項の分子。 ０７）プラスミドｐＲＩＴ１０７６４　ｆ　ｈ　７：ｒ
   　前記第（１）項の分子。 Ｑ８）　ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇをコードできるヌクレオチド
   配列および酵母において該１−ｌＢｓＡｇ配列の転写を
   行なうことのできる、酵母ａｒｇ３遺伝子由来の調節域
   からなる組換型ＤＮＡ分子を含有する微生物。 Ｑ９）該ＨＢｓＡｇ配列が該調節域に関して、Ｉ−（Ｂ
   　ｓ　Ａｇ配列の表現によって合成されだＨＢｓＡｇが
   実質的に異質アミノ酸残基を欠くように位置する該組換
   型ＤＮＡ分子を含有する前記ｔ８　（１８）項の微生物
   。 ■）プラスミドｐＲＩＴ１０６７１で形質転換されたイ
   ー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）である前記第（１８）頃の微
   生物。 ＠）プラスミドＰＲＩＴ１０６７３で形質転換されたイ
   ー・コリである前記第（１８）項の微生物。 ＠）プラスミドｐＲ，ｌＴ１０７６１で形質転換された
   イー・コリである前記第（１８）項の微生物。 ＠）プラスミドＰＲＩＴ１０７６４で形質転換されだイ
   ー・コリである前記第（１８）項の微生物。 ■）サツカロミセス・セレビシアエ （Ｓａｃｃｈａｒｏ＋ｎｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｒｉｓｉａ
   ｅ）である前記第０８）項の微生物。 イ）サツカロミセス・セレビシアエである前記第（１９
   ）項の微生物。 （２））ＤＣ５株まだはＩＣ１６９７ｄ株である前記第
   （２４）項の微生物。 （５）アルギニン生合成経路が抑制解除されている前記
   第（２４）項の微生物。 ■）サツカロミセスΦセレビシアエ株ＤＣ−５（ＰＲＩ
   Ｔ１０６７３　　）である前記第（２４）項の微生物。 ■）サツカロミセス・セレビシアエ株１ｃ１６９７ｄ（
   ＰＲＩＴ１０６７３）である前記第（２４）項の微生物
   。 （３））サツカロミセス・セレビシアエ株ＩＣ１６９７
   ｄ（ｐＲＩＴ１０７６４）である前記第（２４）項の微
   生物。 （３１）Ｄ　Ｃ５株まだはＩＣ１６９７ｄ株である前記
   第（２５）項の微生物。 （至）アルギニン生合成経路が抑制されている前記第（
   ２５）項の微生物。 ■）Ｉ　Ｃ１６９７ｄ株である前記第（２７）項の微生
   物。 α）Ｉ　Ｃ１６９７ｄ株である前記第（３２）項の微生
   物。 缶勝母ａｒｇ３調節域およびこれに隣接する制限部位か
   らなシ、該制限部位に挿入されたコード付は配列の表現
   によって合成蛋白が異質アミノ酸残基を欠くようになる
   ベクター。 ■）１端にＥｃｏＲ］：延長部を有し、鈍化端である他
   端で３／Ｔ残基で終るｐＭｃ２００の１４８０ｂＰフラ
   グメントである調節域が、ｐＭｃ２００の５７００　ｂ
   ｐＸｂａｌ−ＥｃｏＲＩ　７　ラグメントのＸｂａ１部
   位のポリメラーゼ修復後にこれと融合してなるプラスミ
   ドである前記・第（３５）項のベクター。 ■）ｐＲＩＴＩ　Ｏ７４９である前記第（３５）項のベ
   クター。 （３３）ｒｔ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇをコードできるヌクレオ
   チド配列および酵母において該ＨＢｓＡｇ配列の転写を
   行なうことのできる、酵母ａｒｇ３遺伝子由来の調節域
   からなる組換型ＤＮＡ分子を含有するサツカロミセス・
   セレビシアエによって産生されたワクチン有効量のＨＢ
   ｓＡｇと適当な担体からなることを特徴とする重篤な副
   作用なしにヒトにおけるＨＢＶｇ染に対する保護を惹起
   するだめのワクチン。 （イ））該ＨＢｓＡｇ配列が調節域に関して、ＨＢｓＡ
   ｇ配列の表現によって合成されたＨＢｓＡｇが実質的に
   異質アミノ酸残基を欠くように位置した組換型ＤＮＡ分
   子を含有するサツカロミセス・セレビシアエによって産
   生されたワクチン有効量のＩ−ＩＢ　ｓ　Ａｇと適当な
   担体からなる前記第（３８）項のワクチン。 （４））サツカロミセス・セレビシアよりＣ５株または
   ＩＣ１６９７ｄ株によって産生されたワクチン有効量の
   ＨＢｓＡｇと適当な担体からなる前記第■）項のワクチ
   ン。 ■）サツカロミセス・セレビシアよりＣ５株まだはＩＣ
   １６９７ｄ株によって産生されたワクチン有効量のＩ（
   ＢｓＡｇと適当な担体からなる前記第（３９）項のワク
   チン。 （４２）Ｉ（Ｂ　ｓ　Ａ　ｇをコードできるヌクレオチ
   ド配列を酵ｆｊａｒｇ３遺伝子由来の調節戦と融合させ
   ることを特徴とするｌ−ｌＢｓＡｇをコードでき、酵母
   において表現できるヌクレオチド配列を含有する組換型
   ＤＮＡ分子の製法。 （４３）■］Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ配列が調節域に関して、該
   ＨＢｓＡ、ｇの表現によって合成されだＨＢｓＡｇが異
   質アミノ酸残基を欠くような位置に融合される前記第（
   ４２）項の製法。 （４４）調節域がｐＹｅｕｒａ３ａｒｇ３の制限エンド
   ヌクレアーゼによる消化によって誘導される前記第（４
   ２）項の製法。 ■）調節域がｐＹｅｕｒａ３ａｒｇ３のＨｉｎｄｌｌＩ
   制限エンドヌクレアーゼによる消化で、該ａｒｇ３遺伝
   子を特定する３　３００　ｂｐ酵［ＤＮＡフラグメント
   を調製することにより誘導される前記第（４２）項の製
   法。 （４３）ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ配列および調節：或をベクタ
   ーに挿入することからなる前記第（４２）項の製法。 （４７）Ｉ（Ｂ　Ｖ　　Ｄ　Ｎ　ＡをＢａｍＨＪ制限エ
   ンドヌクレアーゼで処理してＨＢｓＡｇ配列を調製する
   ことからなる「）１Ｊ記第（４２）項の製法。 （４３）ａｄｗ抗原型のゾーン粒子から抽出しだＩ−Ｉ
   　Ｂ　ＶＤＮＡよりのＢａｍＨ■フラグメントを、あら
   かじめベクター中に挿入された調節域のＨｉｎｄｌｌＩ
   フラグメントのＢｇｌ［部位に挿入することからなる前
   記第（４６）項の製法。 （４））ａｙｗ抗原型ゾーン粒子から抽出したＨＢＶＤ
   ＮＡのＢａｍＨＪフラグメントの融合対から誘導したＨ
   ｈａＩフラグメントを、調節域を含有し、一端にＥｃｏ
   Ｒ工延長部を有し、鈍化端である他端で３／Ｔ残基で終
   るｐ　Ｍ　Ｃ２００の１４８０ｂｐフラグメントが、ｐ
   　Ｍ　Ｃ２００の５７００ｂｐＸｂａｌ−ＥｃｏＲ■７
   ラグメントのＸ　ｂ　ａ　１部位のＤＮＡポリメラーゼ
   修復後、それに融合したものであるベクターのＸｂａ１
   部位に挿入することからなる前記第（Ｍ３）項の製法。 ■）ａｄｗ抗原型のゾーン粒子から抽出しだＩ−Ｉ　Ｂ
   　ＶＤＮＡのＢａｍＨＪフラグメントを調節域に融合さ
   せることからなる前記第（４７）項の製法。 （５１）ａｙｗ抗原型のゾーン粒子から抽出したＨ　Ｂ
   　ＶＤＮＡのＢａｍＨ］：フラグメントの融合対から誘
   導したＨｈａＩフラグメントを調節域と融合させること
   からなる前記％Ｓ　（４７）項の製法。 ■）Ｈｉｎｄｌｌ（フラグメントがあらかじめｐ　ＢＲ
   ３２２に挿入されている自ｊＪ記第（４８）項の製法。 ■）さらに、Ｈｉｎｄｌ［の処理によってＨＢｓＡｇ挿
   入物と調節域を含有するＨｉｎｄｌｌ）フラグメントを
   解離させ、このＨｉｎｄ［フラグメントを酵母ベクター
   中に挿入することからなる前記第（４８）項の製法Ｏ ■烏合１４８０ｂＰ〜５７００ｂｌ）フラグメントをＨ
   ｉｎｄｌ［で処理してＨＢｓＡｇ配列および調節域を担
   持するＨｉｎｄｌＩ［フラグメントを切除し、このｆ−
   Ｉｉｎｄｌ［フラグメントを酵母ベクター中に挿入する
   ことからなる前記第（４９）項の製法。 （５５）Ｂ　ａ　ｍＨＩフラグメントを調節域のＢｇｌ
   ［部位に挿入することからなる前記第（５０）項の製法
   。 ＠）Ｈｈ　ａ　１フラグメントを、調節域を含み、一端
   にＥｃｏＲＩ延長部を有し、他端で３／Ｔ残基で終り、
   ｐＭＣ２００（７）５７００　ｂｐＸｂａｌ−ＥｃｏＲ
   ＩフラグメントのＸｂａ１部位のポリメラーゼ修復後に
   これと融合したｐ　Ｍ　Ｃ２００の１４８０ｂｐフラグ
   メントのＸｂａ１部位において調節域に挿入することか
   らなる前記第（５１）項の製法。 収）さ１ろに、Ｈｉｎｄｌ［の処理により、ＨＢｓＡｇ
   ｆｉ己列および調節戦を含有するＨｉｎｄｌ［フラグメ
   ントを解離させ、このＨｉｎｄｌ［フラグメントを酵母
   ベクターに挿入することからなる前記第（５２）項の製
   法。 ＠扁母ベクターが、あらかじめ、ｌ−１ｉｎｄＪ［フラ
   グメントの切除により修飾されているＹＥｐ　１３であ
   る前記第（５４）項の製法。 ＠腓母ベクターが、あらかじめ、Ｈｉｎｄｌ［フラグメ
   ントの切除により修飾されているＹＥｐｌ　３である前
   記第（５７）項の製法。 ＠）ＨＢ　ｓ　Ａｇをコードできるヌクレオチド配列お
   よび酵母において該ＨＢｓＡｇ配列の転写を行なうこと
   のできる、酵母ａｒｇ３遺伝子由来の調節域からなる組
   換型ＤＮＡ分子を酵母細胞中に挿入し、酵母を培養し、
   産生されだＨＢｓＡｇを収集することを特徴とするＨＢ
   ｓＡｇの製法。 ＠）該ＨＢｓＡｇ配列が調節域に関して、ＨＢｓＡｇ配
   列の表現によって合成されたＨＢｓＡｇが実質的に異質
   アミノ酸残基を欠くように位置する該組換型ＤＮＡ分子
   を酵母細胞中に挿入し、酵母を培養し、産生されたｌ−
   ｌＢｓＡｇを収集することからなる前記・第（６０）項
   の製法。 ＠）　ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ配列がａｄｗ抗原型のゾーン粒
   子から抽出されたＨ　Ｂ　Ｖ　　Ｄ　Ｎ　Ａより由来し
   、たＢ　ａ　ｍＩ−Ｉ　■フラグメントで、酵母調節域
   のＢｇｌｌＩ部位に挿入されている該組換型ＤＮＡ分子
   を酵母細胞中に挿入し、酵母を培養し、産生されたＨＢ
   ＳＡｇを収集することからなる前記第（６０）項の製法
   。 ＠）ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ配列がａｙｗ抗原型のゾーン粒子
   から抽出されたＨ’ＢＶ　　ＤＮＡのＢａｍＨ４７ラグ
   メント融合対から由来するＨｈａ■フラグメントで、ｐ
   　Ｍ　Ｃ２００の５７　Ｑ　Ｑ　ｂｐＸｂａｌ　−Ｅｃ
   ｏＲＩ　７　ラグメントにおけるＸｂａ１部位のポリメ
   ラーゼ修復後にそのフラグメントに融合した１４８０ｂ
   ｐフラグメントを有する分子の該Ｘｂａ１位に挿入され
   てお９、調節域が、１つの端部にＥｃｏＲＩ延長部を有
   し、鈍化端である他端で３′Ｔ残基で終る、ｐＭｃ２０
   ０の１４８０ｂｐフラグメントである該組換型ＤＮＡ分
   子を酵母細胞中に挿入し、酵母を培養し、産生されたＨ
   ＢｓＡｇを収集することからなる前記第（６０）項の製
   法。 ＠＞５１　ｆｆｌがサツカロミセス・セレビシアよりＣ
   ５株またはＩＣ１６９７ｄ株である前記第（６０）項の
   製法０ ＠）酵母かサツカロミセス・セレビシアよりＣ５株また
   はＩＣ１６９７ｄ株である前記第（６１）項の製法。 （６３）酵母がサツカロミセス・セレビシアよりＣ５株
   またはＩＣ１６９７ｄ株である前記第（６２）項の製法
   。 （６７Ｍ母のアルギニン生合成経路が抑制解除されてい
   る前記第（６２）項の製法。 ＠扇母のアルギニン生合成経路が抑制解除されている前
   記第（６３）項の製法。 ■春母がサツカロミセス・セレビシアエＩＣ１６９７ｄ
   株である前記第（６３）項の製法。 ＱＯ）一端にＥｃｏＲ■延長部を有し、鈍化端である他
   端で３／Ｔ残基で終るｐＭＣ２００の１４８０ψフラグ
   メントである調節域を、ｐ　Ｍ　Ｃ２００ノｐＭＣ５７
   ００ｂｐＸｂａｌ−ＥｃｏＲ］：フラグメントのＸｂａ
   １部位のポリメラーゼ修復後にこのフラグメントと融合
   させることを特徴とする酵母ａｒｇ３調節域およびこれ
   に隣接する制限部位からなシ、該制限部位に挿入された
   コード付は配列の表現によって合成蛋白が異質アミノ酸
   残基を欠くようになるベクターの製法。