JPS599158B2 - シチジン二リン酸コリンの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はシチジンニリン酸コリンの製造法に関する。

さらに詳しくはサツカロミセス属、クルイベロミセス属
、トルロプシス属、クロツケラ属、キャンジダ属などに
属し、界面活性剤の存在下においてシトシン、糖、コリ
ンもしくはその誘導体、およびリン酸塩からシチジンニ
リン酸コリンを生成する能力を有する酵母の培養液、菌
体またはそれらの処理物を、シトシン、糖、コリンもし
くはその誘導体、リン酸塩および界面活性剤を含有する
反応液に作用せしめてシチジンニリン酸コリンを生成せ
しめることを特徴とするシチジンニリン酸コリンの製造
法に関する。

シチジンニリン酸コリンは、レシチン生合成の前駆物質
であり、脳障害における治療薬などとして有用な物質で
ある。

従来、シチジンニリン酸コリンの酵母による製造法とし
ては、シチジン、シチジン−５′一一リン酸、シチジン
−５′一二リン酸、シチジン−５′一三リン酸を製造原
料とする方法が知られている（特公昭４８−４０７５７
号公報、同４８−４０７５８号公報、同４８−４１５５
５号公報、同５１−４０１５９号公報、同４８−２８５
８号公報、同４８−２３５９号公報）。

即ち、これらの従来法においては、酵母の強い解糖エネ
ルギーを利用して、シチジンまたはシチジンー５′−−
リン酸ヲシチジン−５′一三リン酸にリン酸化した後、
これをさらにシチジンニリン酸コリンに導くものであり
、シチジンニリン酸コリンにおいてシチジンｌの形成の
ためにシチジンまたはそのリン酸エステルの利用を必須
とするものである。

本発明者らは、シチジンニリン酸コリンのより安価な製
造法の開発を目的として種々研究した。

その結果、従来の製法における製造原料である、シチジ
ンやそのリン酸エステルなどよりも、より安価なシトシ
ンからシチジンニリン酸コリンを得る方法を見い出した
。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明によれば、糖とシトシンと、コリンまたはその誘
導体およびリン酸塩および必要な若干の無機塩ならびに
界面活性剤を含有する反応液に酵母を作用させることに
より一挙にシチジンニリン酸コリンを生成させることが
出来る。

使用される糖としては酵母により利用出来るものであれ
ばいずれでもよ《、たとえばグルコース、フラクトース
、シュクロース、マルトースなどが利用出来る。

界面活性剤としては各種のカチオン性、アニオン性、両
性、中性の界面活性剤がいずれも利用出来るが、特にカ
チオン性の界面活性剤その中でも殊に第３級アミンを有
するものである。

好適な界面活性剤の具体例としては、アルキル・トリメ
チル・アンモニウムクロライド、ヘキサデシル・トリメ
チル・アンモニウムクロライド、ジメチル・アルキルベ
タイン、ラウリルアルコール・硫酸エステル・ジエチル
アンモニウム塩、オクタアンル・ジメチルベンジン・ア
ンモニウムクロライド等があげられる。

コリンもしくはその誘導体としては、遊離のコリン、塩
化コリン、臭化コリン、コリンのクエン酸塩、グルコン
酸塩、ホスホリルコリンなどが利用できる。

リン酸塩としてはＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、Ｋ３Ｐ
Ｏ４、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ ２ ＨＰＯ４ 、Ｎａ
３ ＰＯ４、Ｍｇ３（ＰＯ４）２などの無機リン酸塩が
使用できる。

その他、必要に応じて、反応液に、マグネシウムイオン
やマンガンイオンなどを存在せしめるが、これらは硫酸
マグネシウム、硫酸マンガンなどの無機塩として通常加
える。

これらのマグネシウムイオン、マンガンイオンは、反応
に用いる酵母源に付随して加えられる場合は勿論新たに
加える必要はない。

反応に用いる酵母としては、サッカロミセス属、クルイ
ベロミセス属、トルロプシス属、クロッヶラ属、キャン
ジダ属に属し、界面活性剤の存在下において、シトシン
、糖、コリンもしくはその誘導体、およびリン酸塩から
シチジンニリン酸コリンを生成する能力を有する菌株が
あげられ、これらは反応に際しては、培養液、菌体、そ
れらの処理物として用いる。

好適な酵母の具体例としては、サツ力ロミセス・セレビ
シエＡＴＣＣ１５２４８、サツ力ロミセス・ルキシーＡ
ＴＣＣ１５２４９、クルイベロミセス・ラクチスＡＴＣ
Ｃ１２４２５、トルロプシス・スフエリカＡＴＣＣ８５
４９、クロッケラ・アフリカナＡＴＣＣ１６５１２、キ
ャンジダ・ギレモンデイＡＴＣＣ９０５８などがあげら
れる。

これらの微生物の培養法については、通常の酵母の培養
法が適用できる。

即ち、培地の炭素源としては、たとえばグルコース、シ
ヨ糖、デンプン加水分解物などの炭水化物、酢酸などの
有機酸、エタノール、メタノールなどのアルコール、ｎ
−パラフィンなどの炭化水素などが利用できる。

窒素源としては、硫酸アンモン、塩化アンモン、尿素、
酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスチープリカ
ーなどの無機および有機の窒素源が利用できる。

さらに、無機塩として、燐酸カリ、硫酸マグネシウム、
塩化カルシウムなどが使用できる。

さらに鉄、マンガン、亜鉛などの金属イオンの他、菌株
の生育に必要な物質に応じて培地に加える。

培養は、振とう培養または通気攪拌深部培養などの好気
的条件下で、通常、培養温度２５〜３５℃、ｐＨ５．０
〜９．０で、５〜４０時間行う。

（なお使用菌によっては、前記の温度やｐＨの範囲外で
も培養を行うことができる）。

本発明においては、上記の如き酵母の培養を行う際に、
培養にシトシン、コリン、界面活性剤などを存在せしめ
て培養液にシチジンニリン酸コリンを生成せしめること
も可能であるが、より好ましくは上記の培養法によって
得られる培養液そのもの、菌体、または、菌体の破砕物
、菌体のエタノール、トルエン、エーテル、アセトンな
どの溶剤による処理物などを酵素源として用いる。

菌体はそのま匁反応液に懸濁してもよいし、たとえばア
セトンなどを用いて乾燥したものを用いてもよいし、あ
るいは菌体を固定化して用いてもよい。

酵母の菌体を固定化する方法には、主として包括法が用
いられ、触媒重合、放射線重合、光重合、マイクロカプ
セル化等が適用されるが、マイクロカプセル化が比較的
良好な結果を与える。

本発明における反応に際しては、シトシン１〜７ｍ９７
ｍｌ，糖５ 〜１ ５ ０ｍ９７ｍｌ！、コリンモシ＜
ハその誘導体（コリンとして）０．５〜５０〜／ｒａｉ
！、リン酸塩（ＰＯ４として）２〜２００ｍ９／ｍｌ、
界面活性剤０．０５〜２％（Ｖ／Ｗ）、特に０．１〜０
．５％（Ｖ／Ｗ）の濃度で用いることにより効果的にシ
チジンニリン酸コリンを得ることができる。

マグネシウムイオンやマンガンイオンを添加する場合は
１ｍ９／１〜３？／７３の範囲で加える。

反応液に作用せしめる酵素源の使用量は酵素源の使用態
様（菌体、培養液、菌体処理物）や反応原料の使用濃度
などによって異るが菌体を用いる場合は２０〜１５０〜
／ｍｌ！ （乾燥重量）が好適である。

反応は、通常、ｐＨ４．０〜９．０、反応温度１５〜４
０℃で３〜３０時間行う。

反応液からのシチジンニリン酸コリンの精製単離は公知
のイオン交換樹脂を用いる手法などによって行うことが
できる。

次に本発明の実施例を示す。

実施例 １ サツ力ロミセス・セレビシエＡＴＣＣ１５２４８を用い
、該菌株一白金耳を第一次種培養培地〔グルコース１
０ ？／ｌ，肉エキス１０グ／ｌ１ペプ｝ン１ ０ ｆ
ｌ／ｌ！， ＮａＣｌ ３ ？／ｌ： （ ｐＨ ７．
２ ）殺菌前〕３０ｍｌを含む３００ｍｌ容三角フラス
コに植菌し、３０℃、２４時間培養を行った。

かくして得られる第一次種培養を、グルコース２０′？
／ｌ、ペプトン１１’／ｌ：、酵母エキス５？／７３、
ＫＨ，２Ｐ０４１グ／ｌ， Ｋ２ＨＰＯ４２−５ｆｔ／
ｌ，ＮａＣｌＯ． ５ ？／ｌ：， ＭｇＳ０４・７
Ｈ２０ ０． ５？／ Ｌ ＦｅＳ０４・７ Ｌ，０
０． １ ？／ｌ、ＭｎＳＯ４ ｊ ４ Ｈ２ ０
０． Ｉ Ｓ’ ／ ｌ１ｐＨ ６− ５ （殺菌
前）の第二次種培養培地３００ＴＬｌを含む２ｌ三角フ
ラスコに１０％の割合で植菌し、３０℃で２４時間培養
した。

かくして得られる第二次種培養を、下記組成の培地３ｌ
を含む５ｌ容のジャーファーメンターに１０％の割合で
植菌した。

培地組成：グルコース５０グ／ｌ、 （ ＮＨ４ ） ２ ＳＯ４ ５ ？／ ｌ， ＫＨ２
ＰＯ４１グ／ｌ、ＭｇＳ０４− ７Ｈ２０ ０．５
？／ｌ１ＮａＣｌＯ．１？／ Ｌ ＣａＣｌ２ ０．
１ ？／ ｌ！， Ｎａ２Ｍｏ０４３ ２ｒ／Ｌ ＫＩ
６３ｒ／Ｌ ＭｎＳ０４− ４Ｈ２０６７ｒ／ ｌ，
Ｈ３ ＢＯ３ ４ ３ ｒ／ｌ！， ＺｎＳ０４・７
Ｈ２０３ ３ ０ ｒ／ｌ：， ＣｕＳＯ４ ・７Ｈ
２０ ３ ０ ｒ／ｌ、ビチオンＯ． Ｚ ｒ／ Ｌ
Ｆｅ ＳＯ４ ・７ Ｈ２０１ ”ｉｉｉ’／ ｌ（
殺菌前ｐＨ．’ ６． ０ ）。

培養は３０℃で、培地のｐＨを水酸化カリウムで５．０
に調節して攪拌数６ ０ Ｏ ｒ． ｐ．ｍ．通気量３
ｌ／ｍＶＬで４８時間通気攪拌培養を行った。

培養後、培養液を５℃で、遠心分離して菌体を分離し、
この菌体を０．１Ｍ−ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に
て３回洗浄した。

か《して得られた菌体を反応に供した。

前記の生菌体１５００ｍ９（乾燥重量）シトシン２２．
２ｍｇ、グルコース１０８０〜、塩化コリン１４０〜、
硫酸マグネシウム１０雫、ヘキサデシル・トリメチル・
アンモニウム・クロライド（カチオンＰＢ−４０、日本
油脂株式会社製）０．５％を含む０．６Ｍ−リン２緩衝
液（ １）Ｈ ７．５ ） １ ｏｒｎｌを用いて３０
℃で５時問および２４時間反応を行った。

結果を表−１に示す。なお、対照として上記の反応液中
、ヘキサデシル・トリメチル・アンモニウム・クロライ
ドを存在せしめない他は同一条件で反応を行った。

実施例 ２ 実施例１で得られた生菌体を凍結乾燥し、該菌体を用い
て次の方法によりマイクロカプセル化菌体を得た。

ベンゼン２９？、ｎ−ヘキサン１１グにエチルセルロー
ス（ １ ０ ０ ｃｐｓのもの）３グを溶解し、分散
剤として、スパン−２０（ンルビタンモノラウリル酸）
ｏ．ｓｙを溶解する。

この溶液に、凍結乾燥菌体２１を生埋食塩水５グと１％
キトサン水５グの混合液に懸濁したものを強く攪拌しな
がら、５〜１０℃にて完全に分散するように添加しＷ／
Ｏエマルジョンを生成させる。

更にこの一次エマルジョンを１％ホリエチレングリコー
ル溶液（ｐＨ８．５）１２０ＴＬｌ中に添加しＷ／ ０
／Ｗ′エマルジョンを生成せしめる。

５〜１０℃に温度を保ちながらベンゼンを除去しエチル
セルロースを析出させるために、氷冷したｎ−ヘキサン
を１０〜１５ｍｌ／ｍｍの速度で約１時間程度定量ポン
プにて供給する。

このようにして得られたマイクロカプセル化菌体を沢別
し更にｎ−ヘキサンにて２度洗浄し真空下完全にｎ−ヘ
キサンを除去して反応に使用した。

生成した固定化菌体の性状は約５０〜１００μの完全球
状マイクロカプセルであり約３００〜４００ｍ９／ｍｌ
（マイクロカプセル容量）の菌体が包括されたものであ
る。

このようにして得られたマイクロカプセル化菌体を５
ｍｌ（菌体として約１５００雫）（乾燥重量）使用し実
施例１と同様の反応液組成で回分反応を３０℃、５時問
および２４時間行った結果、シチジンニリン酸コリンが
、それぞれ２． ０ ２ ｍ９１／ｒｕｌ、３． ０
３ ｍ９／ｍＡ’生成した。

実施例 ３ 使用菌株として、表−２記載のものを用いて、実施例１
と同様の方法で培養した。

培養液から菌体を分離し、該生菌体を凍結乾燥し、該乾
燥菌体（１５００１ｎ９）を用いて、実施例１と同様の
条件で５時間反応を行った結果は次の通りであった。

実施例 ４ トルロプシス・スフエリカＡＴＣＣ８ ５４ ９を用い
、実施例１におけると同様の方法で種培養を行い、該種
培養を下記組成の培地３ｌを含む５ｌ容のジャーファー
メンターに１０％の割合で植菌した。

培地組成：グルコース５０グ／ｌ、 （ＮＨ４） ２Ｓｏ４５ｆ！／ｌ，ＫＨ２ｐｏ４ １．
５グ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４０．５ ？／ｌ， ＭｇＳＯ４
− ７Ｈ２０ ０．５？／ ７３， ＮａＣＩ ０．
１ ？／ ｌ，酵母エキス０． ２？／Ｌ ＭｎＳ０
４・４ Ｈ２０ １ ０ ０ ｒ／ ｌ、β−アラニ
ン５０γ／ｌ１ＺｎＳＯ４・７Ｈ２０ ５００γ／ｌ，
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０ １１ｎ９／ｌ、Ｆｅ２（ ＳＯ
４ ）３１ ０ ０ ｒ／ｌ， ｐＨ ６．０ （殺菌
前）培養は３０℃で攪拌数４ ０ Ｏ ｒ． ｐ．ｍ．
、通気量２ ｌ ／ｍｉｙｔで４８時間行った。

培養液から菌体を分離し、実施例２におけると同様の方
法によって菌体を固定化（マイクロカプセル化）し、実
施例２の反応液において、ヘキサデシル・トリメチル・
アンモニウム・クロライドの使用量を０．１％にする他
は、実施例２の方法と同様に５時間反応を行い、２−２
３〜／ｒａｉｌのシチジンニリン酸コリンを得た。

実施例 ５ 実施例１の方法において、塩化コ’Ｊ ：／ １ ４
０〜の代りに、ホスホリルコリン１００即を用いる他は
同一の菌株を使用し、同一の反応条件（界面活性剤添加
）で６時間反応を行い、７．３ｍ９／ｍｌのシチジンニ
リン酸コリンが得られた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 界面活性剤の存在下において、シトシン、糖、コリ
   ンもしくはその誘導体、およびリン酸塩からシチジンニ
   リン酸コリンを生成する能力を有し、サツカロミセス属
   、クルイベロミセス属、トルロプシス属、クロツケラ属
   もしくはキャンジダ属に属する酵母の培養液、菌体また
   はそれらの処理物を、シトシン、糖、コリンもし《はそ
   の誘導体、リン酸塩および界面活性剤を含有する反応液
   に作用せしめてシチジンニリン酸コリンを生成せしめる
   ことを特徴とするシチジンニリン酸コリンの製造法。