JPS5991884A - ポリヌクレオチド配列の検定法とプロ−ブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般に？リヌクレオチド試料の検定法に関する
。特に、本発明は未知のまたは不確定含Ｊｌｉ　（ｃｏ
ｎｔｅｎｔ　）の試料ン！リヌクレオチドエキス中の、
特定の標的ヌクレオチド配列の存在に対する定性または
定量検定を行なう方法に関する。

一般に遺伝物質の操作技術または生物の遺伝特性の評価
においては、特定の遺伝子または遺伝子部分が生物にま
たけ生物からの遺伝物質の細胞外エキス中に存在するか
どうかを確かめることがしばしば望ブしい。遺伝子また
は遺伝子部分は、本質的にポリヌクレオチド分子のすべ
てまたは一部分を形成するヌクレオチド塩基の特定の配
列（５ｅｑｕｅｎｃｅ　）　　であるから、特定の遺伝
子または遺伝子フラグメントが試料中に存在するかどう
かを発見するためには、遺伝子を形成するヌクレオチド
塩基の特定の配列が試料中に存在するかどうかを発見す
るために試料ポリヌクレオチドを直接試験することが可
能である。

ＤＮＡまたけＲＮＡポリヌクレオチド試料における牧定
のヌクレオチド標的配列（ｔａｒｇｅｔ　５ｅｑｕ−ｅ
ｎｃｅ　）　　の検出に一般に使われる現在の方法は、
試験配列（ｔｅｓｔ　−５ｅｑｕｅｎｃｅ　）と呼ばれ
る試料を、扶的配列ケ含む放射性標識した相補ＤＮＡ７
’ローブ°（ｐｒｏｂｅ　）に対しヒプリダイゼーショ
ン（ｈｙｂｒｌｄｌＺａｔｌｏｎ　）するととに依存し
ている。

ｅＤＮＡ７’ロープは多ｉｔ匠単離でき、またはプラス
ミドまたはファージのＯＮ＾ベクターに挿入するような
既知の方法を使いクローン化でき、これを栄養基地で成
長したバクテリアに挿入する。培地が３°２Ｐのようカ
バクチリアによシ自身のＯＮ　、Ａ　Ｋ吸収される放射
性同位体を含むときけ、クローン化したＤＮＡ７”ロー
プは放射性成分を含む。一方、単離しｆＦ−ＯＮ　Ａ　
グローブを試駆管内化学反応により放射性標識もできる
。検出操作においては、典型的には一過器上に固定した
試験配列を放射性標識した相補ＤＮＡグローブに算出し
、その後ＲＣＭ配列を洗う。ついで試験配列の放射能検
定をシンチレーシミン分光器または放射能写真法で行な
う。放射能検定により検出される放射性同位体の景け、
試験配列にヒプリダイゼーションされた放射性ｃＤＮ＾
グローブの量を示し、そこで試験配列が求めている標的
配列を含むかどうかを示している。

放射性標識したぎりヌクレオチドを用いる検定法をこの
ようが配列の検定に有効であるが、このような操作に固
有の幾つかの欠点がある。必要とする放射性物質は本質
的に幾分危険であシ、また本質的に不安定である。さら
に、このよう外検定操作を打力う実験室は、特別に認可
される必要があシ、オた放射性物質を使うためには特別
に訓練された技術者を必要とする。多くの実験室はこの
ような検定を実施できかい。このような物質の使用にお
ける保謁のわずられしい性質と必要な特別の認可操作の
ためである。

本発明の検定法は一部分、放射性物質の使用を避けるこ
とが意図されている。

本発明は、試料ポリヌクレオチド試験エキス中の特定の
標的ヌクレオチド配列の存在の検定法は、まず試験エキ
スを試験試料として単離し、ついで試験試料を０１枦的
ヌクレオチド配列に実質上相補のｃＤＮＡ配列と予め決
めた蛋白質に結合するのに適した蛋白質結付配列の両者
を含む変性グローブにさらし、（２１俊性グローブの蛋
白質結合配列にＰ１合する結合蛋白質にさらすことを含
むと劣約できる。試験試料を洗って未成１（成分を除い
た後、結合蛋白質の存在に対し試験試料の検定を行かう
。

このようが試験試料の検定は、酵素、ケイ先糸、溶解訪
発基、−井たけ他の適当力非放射性マーカー残基のよう
が既知のマーカー型を利用する直接または間接のマーカ
ー結合免疫検定が好着しい。

そこで、本発明の目的に特定のヌクレオチド標的配列の
存在を、放射性物質の必要なしに確かめることができる
ように、できれば増幅したマーカー結合検定により試料
？リスクレオチド試験エキス中の特定の標的ヌクレオチ
ド配列の検出法を提供することにある。

本発明の別の％ｇね、？リヌクレオチド検定挟作に使用
できる変性ポリヌクレオチドグローブでアリ、この変性
グローブは共通の分子内に標的配列に実質上相補のｃＤ
ＮＡ配列と蛋白質結合配列の両者を含んでいる。

本発明の々お別の特徴は、特異な抗原性ヌクレオチドを
ｃＤＮＡ配列に合体するときけ、蛋白質結合配列とｃＤ
Ｎ＾配列が一つで同一配列であることができることであ
る。

本発明の検定法を使うと、生物のｆ）ＮＡ″！たけＲＮ
Ａにおいて特定の標的ヌクレオチド配列を検出できる。

そこで、本発明の方法を診断オたは病気診断のための病
原体または非病原体の同定に、またはウィルス、類ウィ
ルス体、ノ々クチリア、かび、グロトゾア、瞥たけ他の
植物または動物の生命形の同定に使用できる。さらに、
通常の育種技術またＦｉ遺伝子操作によシ生物に導入し
た遺伝子配列の存在を確かめるために、新しく育種した
生物中のまたは生物からのＤＮＡ、ＲＮＡ、首たはｍＲ
ＮＡセグメントの検定に本性を使用できる。

生命形を遺伝子の表現型の表功、が起る段階まで成長さ
せる必要なしに、宿主の細胞中の特に関心の標的遺伝子
の存在１ｆＣはそのｍＲＮＡ複写の存在の決定に本性な
第１１用できる。これは、育種ストックの初期段階での
選択に対しふるい分は検定を可能、にし、望む素質を含
捷力い全子孫を直ちに捨てることを可能にするから、植
物のような育種計画で特に有用である。さらに、表視型
が問題の個体で表塑されるかどう≠・に関係なく、動物
細胞号たけ人間細ル）Ｋおける同−画伝子の存在または
不在の決定に本検定法を使用できる。そこで、情伝病の
検出にまたけ遺伝子が表塑さねてい表い個体におＨ゛る
劣性泣伝素質キャリヤーの検出に、本発明の方法を応用
できる。

本発明の他の目的、利点、特徴は以下の詳し、い記載か
らさらに明らかとなろう。

本醐明の検定法は、試験ポリヌクレオチドの単離試料を
一連の試薬にさらすことを含む。操作法をか、もよく理
解するために、捷ず検定物資の製造法と内芥牧１を談論
し、ついで検定法を記載することにする。

ｌ　検定物質の調製 本検定操作のため率俯し力ければならカい第ｌの千要物
質は、共通の分子内に標的配列に実質上相補のｃＤＮ＾
ＤＮＡ蛋白質結合配列の両者を含むクローン化ＤＮＡ７
’ローブストランドである。プローブストランドを、こ
こでは「変性グローブｊ　（ｍｏｄＮｒｅｄ　ｐｒｏｂ
ｅ　）　　と呼ぶ。変性プローブをつくるためには、検
定しようとする特定の標的ヌクレオチド配列に対ｃＤＮ
Ａ配列のつくシ出し単離できる必要がある。

ｃＤＮＡ配列をつくるためには、まず検定が検出を意図
している特定のヌクレオチド標的配列の試料を単離する
必要がある。標的配列の試料エキスの単離のためＫは、
試験エキスに関し次で議論するよう力操作を利用できる
。一方、桓、的配列のヌクレオチド配列が完全に既知の
ときり、その配列を直接合成で鳶る。ついで標的配列を
含む？リヌクレオチドから複写によってｃＤＮＡ配列を
つくることができる。標的配列なｆＨｉ足し、ＣＤＮ＾
ＤＮＡつくり、単離する方法は１（袈ではなく、この操
作部分に対しては肖″　　核技術分野で此められている
どのような方法も使用できる。好捷しくは、公表された
技術のどわかｆｆ使って、ｃＤＮＡストランドをクロー
ン化ベクターに挿入する。

ｅＤＮＡ配列をつくり出し、とねをクローン什ベクター
に押入する両者のための一つの有第１」カカ活け、ハグ
チラ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｌ。

ｕｓ八へ３巻、３　／’Ｉｔ、〜３１Ｓθ頁（／９’Ｈ
。

年）により実証されている。この操作においてに１、反
転？？写を利用１−１て、ヌクレオチドの各々が標的６
１列のヌクレオチドに対し相補であるＣＤＮＡ＠＠スト
ランドをつくり出す。ついで、こうしてつくりだしたｃ
ｒ）ＮＡストランドをまずエキソヌクレアーゼで処理し
、ついで末端トランスフェラーゼで処理すると、唯一の
ヌクレオチドの存在で反応しｃＤＮ＾ストランド上に唱
定のホモ所すマー尾配列をつくり出す。このホモポリマ
ー尾ｈｅ　列はポリヌクレオチドグラスミドまたはファ
ージベクター中にＴｈ（以のグロセスによりつくり出さ
れた相補ホモポリマー尾配列に釣合っている。ついで上
記ベクターはクローン化のためバクテリアに挿入される
。

このようなりＮＡｔたはｃＤＮ＾ＤＮＡメントをベクタ
ーに挿入し、ついでクローン化のためバクテリアに押入
する幾つかの操作は、文献でよく実証されている。手近
にある操作では、ｃＤＮＡ配列を含んでいるグラス建ド
童たけファージであることのできるベクターを、バクテ
リア内でクローン化し、ｃＤＮＡ配列を含む多数の娘ポ
リヌクレオチドストランドクｉ−ンを発生させ、これを
変性グローブの形成に利用できる。配列が全恨伝子、遺
伝子の一部分管たけ複写、オペロン、ブロモ−ター、イ
ントロン、または他のヌクレオチド１列かどうかとは無
関係に、上記同一操作を使ってＤＮＡ、ＲＮＡ。

またはｍＲＮ＾配列に相補の′ＣＤ　Ｎ　Ａ　ｆｉＦ列
をつくり出す。

ｃＤＮ＾ＤＮＡブをクローン化後、ｃＤＮ＾ＤＮＡンド
を含むクローンオたはクローン化ストランドのセグメン
トを変性して、ある種の蛋白質に特に結合を意図してい
る追加のＤＮＡ配列を含ν）る〇 本発８ｈｉの目的には、この配列は、蛋白５ｆ結合配列
と呼ば−１１、それに結合する蛋白質は結合蛋白質と呼
は名る。面配列が夫々の目的に活性であり、−諸に結合
ｊ−でいる限り、蛋白結合へ「１列をｃ　ｎ　Ｎ　Ａ　
Ｆ！＋？列に結合するため使う力θ−Ｆｉｉ、１１だし
く重要では力い。この結合操作は鈍端結紮（ｂｌｕｎｔ
　ｅｎｄ　１ｌＨａｔｌｏｎ　）　、粘性端結紮、甘た
け他の結紮操作のような既知法によって、着たけ各スト
ランドＶ〆結合されたアダプター結合残基を使って、遂
行−７’きる。ｃＤＮ＾ＤＮＡブを含むストランドのこ
の変性を遂行する一方法は、ストランドを制限（ｒａｓ
ｔｒｌｃｔｌｏｎ　）エンドヌクレアーゼで切る方法で
あ一す、着たけ合成リーンカーを使うか甘たに粘性末８
Ａを冶するストランドをつくり出すためホモＩリマー尾
配列を添加することによりその末端を３Ｐ性する。蛋白
質結合配列な有するＤＮＡの配列は、制限エンドヌクレ
アーゼを使いまたはＣｐＮ＾ストランドの粘性端に相補
でを、る他の方法を使い、同様に謝離し変性する。蛋白
質結合配列を含むセグメントをついでｃＤＮＡを含むセ
グメントに結合して、変性グローブをつくり出す。この
変性プローブは全ベクター自身であるが、オたは変性グ
ローブをベクターに挿入して変性ベクターをつくり出す
。ついで変性ベクターをバクテリアに挿入して、一連の
クローン化費性グローブをつ〈シ出す。

ｃＤＮ＾ＤＮＡストランドターに挿入し、蛋白結合Ｗ４
ｅ列をクローン化ベクターに挿入する前にクローン化す
る上記操作の別法と１−で、二つの１列をクローン化ベ
クターに挿入する順番を逆にすることも含まれている。

たとえば、適当力制限エンドヌクレアーゼまたは他の開
裂法を使ってまず蛋白ｖｉ結合配列を単離し、ついで得
られた蛋白鵞結合西Ｐ列ストランドをクローン化ベクタ
ーに挿入することができる。ベクターをクローン化前ま
たは後で、一層多くの物質を扱えるよう蛋白質結合配列
を含むベクターの初めのクローン化を行なうのが好まし
いが５ｃＤＮ＾ストランドをベクターに挿入し、ついで
さらにクローン化する。そこで、二つの配列の各々を悴
・性ベクターに導入する順番は、両者を同一ベクター１
７ｉ７２ｔ！、入１．てそのベクターに変性プローブを
つくり出す神霊よりも型部でけない。すでに蛋白質結合
ｆｉＰ列を含んでいるデラスミドオたけグローブのベク
ターを使うとともできる。そこＴ、ｃＤＮＡ西１列をク
ローン化のためベクターに挿入！−、ベクターに変性グ
ローブをつ〈ｈ出すことだけが必要である。ｃＤＮＡ配
列および蛋白質結合配列の情が信義単離でき、ついで互
に結合できれば、クローン什＄２作自身は必要でＶ［な
い。

本発明の方法で第１１用できる蛋白質結合配列の（φつ
かのけんちゆうけ沖在知らねており、この蛋白質結合配
列の単動１および第１１用法は公表されている。たとえ
ば、生物の構造遺伝子の表現は、ゼ；、造ＪＮ伝子如よ
りコードされた蛋白ａの合成を抑制御たけ促進できるレ
ギュレーターおよびオペレーター制御遺伝子の絹により
しはしけ変性豊たは制御される。制御遺伝子のなかには
、構造ｌｒ伝子からｍ　ＲＮ　Ａ分子の複写の開始を容
易にするためＲＮＡｙＪ？リメラーゼの結合に対し特異
点であるプロモーター配列がしばしば見出される。そこ
で、このようがプロモーターはＲＮ　Ａ　ｒ　ｌメラー
ゼ、蛋白質酵素に結合する親和力をもつ。大腸菌の１ｅ
ｅ−プロモーターおよびｔｒｐ−プロモーター配列は著
しく研究され、ベクターにクローン化され、よく同定さ
れている。これらプロモーターに隣接した制限エンドヌ
クレアーゼ開裂の位置、および事実これらプロモーター
のヌクレオチド配列も公表されている。そこで、このプ
ロモーター配列を含むＤＮＡフラグメントを単離し、ク
ロン化する方法は既知である。１ａｃ−プロそ一ター訃
よびｔｒｐ−プロモーターが列のように、プロモーター
の塩基配列が同定されていれば、このような蛋白ＩＮ、
結合配列を全部合成することもできる。

同様に、栴造遣”伝子の表現に効果をもつＤＮＡストラ
ンド上の他の制御点も、蛋白質結合配列として利用でき
る。たとえば、構造遺伝子の表現を抑制する幾つかのオ
ペロンセグメントが大腸菌で同定されている。このよう
な一つのオペロンセグメントはＩａｃ−オペレーターを
含むオペロンにあり、セグメントが１ａｃ−阻害物と呼
ばれる蛋白質に結合すると抑制される。そこで１ａｃｌ
ｌ害物に結合するこのオペロンセグメントも適当な蛋白
質結合配列である。

他の有用な蛋白質結合配列はバクテリオファージ活性に
関連したプロモーターである。Ｔ！ｒおよびＴクバクテ
リオファージのようなバクテリオファージは強いプロモ
ーター配列を含んでおシ、これも感染した生物のＲＮＡ
＆リメラーゼに優先的に結合し、ファージの遺伝子によ
りコードされた蛋白質の蛋白合成を開始させる。

そこで、強いプロモーター配列を含むファージのＤＮＡ
ストランドまたはその部分は、ＲＮＡポリメラーゼに対
する有効な蛋白質結合配列として働らくことができ、フ
ァージが感染した生物から単離される。

別の組の有用な蛋白質結合配列は、特異な抗原性である
ヌクレオチｒ物質の配列である。一般Ｋ。

ｔ）ＮＡ配列は著しく温和な抗原性で、ＤＮＡ配列に対
しつくった抗血清はその配列に特異的でない。

しかし、ある種のヌクレオチド配列は特異な抗原性であ
り、このような配列は本発明の変性グローブにおいて蛋
白質結合配列として使用できる。この特異な抗原性配列
を直接ＣＤＮＡ配列に含めることができ、または変性グ
ローブの別の部分に含めることができる。特異な抗原性
ヌクレオチド配列のコ例はＺ−ＤＮＡ配列および特に稀
なヌクレオチドを含む配列である。

蛋白質結合配列として使用できる特異な抗原性配列の一
つの型けＺ−ＤＮＡである。Ｚ−ｆ）ＮＡけＤＮＡの異
性体であり、大部分のＤＮＡの右手らせんよりも左手ら
せんストラン「の形成に熱力学的に有利な一連の塩基対
（ポリｄＧｄＣ）を含んでいる。Ｚ−ＤＮＡは抗原性で
また比較的自然において稀であるから蛋白質結合配列と
して有用である。Ｚ−ＤＮＡの抗原性はＺ−ＤＮＡに結
合し正常のＤＮＡに結合しない抗血清をつくることを許
し、Ｚ−ＤＮＡが比較的稀である事実は、あや１つだ正
の徴候の割合を下げる。一般ＶＣ，ＤＮＡは著しく温和
な抗原性で、そのためにつくった抗血清はどの配列に対
しても特異的でない。そこで蛋白質結合配列としてＺ−
ＤＮＡを使うと、抗血清により識別できて非特異性の問
題を避けｂヌクレオチド配列を与える。Ｚ−ＤＮＡは著
しく稀であり、抗−Ｚ−ＤＮＡ抗血清はふつうの右手Ｄ
ＮＡを識別しないからである。

本発明内で蛋白質結合配列として使用できる別の型の特
異な抗原性配列は、稀な抗原性ヌクレオチＰを含むヌク
レオチド配列、たとえば！−ブロモデオキシウリジンお
よびＳ−ヨードデオキシウリジンである。この−程の稀
なヌクレオチドは、自然に稀に存在ししかし通常のヌク
レオチドと同一様式でヌクレオチド配列に自由に合体で
き為ヌクレオチドの例である。これらのヌクレオチドの
ハロゲン成分は、これらの稀なヌクレオチドに特異な抗
血清の発生を可能にする。当該ヌクレオチＰけ自然の配
列において著しく稀であるから、当該抗血清は稀なヌク
レオチドを含む配列に対し高度に特異的である。この特
徴を利用するためには、標的配列に対し相補のＣＤＮＡ
　　配列を含むプローブを、これらの稀なヌクレオチド
を含む特異カ培地で生長した宿主中で成長させることが
できる。この方法は標的配列にヒブリダイゼーション□
できまた稀なヌクレオチーを含んでいる特異な抗原性配
列を合体している変性グローブを生体内で生産する。そ
こで、稀なヌクレオチドに対する抗血清はその配列に結
合する。蛋白質結合配列として機能する特異が抗原性配
列を、直接ＣＤＮＡ配列に合体でき、または変性プロー
ブ上の別の配列に合体できる。特異な抗原性ヌクレオチ
ド配列を使おうとするときけ、必要ではないが、稀なヌ
クレオチドおよびＺ−Ｄ　Ｎ　ＡＫ対するモノク四−ン
抗血清が好ましい。

一般に、当該配列が単離できてクローン化ベクターに挿
入でれるときは１、または画が特異的に結合蛋白質に結
合親和性をもつと１！け、また特別の結合蛋白質が検定
操作により検出できるときけ、ＤＮＡフラグメンメ中に
含まれるどのヌクレオチド配列も本発明の方法で蛋白質
結合配列として役立てることができる。Ｚ−ＤＮＡを使
わないときは、結合蛋白質に対し免疫検定を行なうこと
が好ましいから、結合蛋白質は他の種の動物において抗
原反応をひき起し得ることが好ましい。２−ＤＮＡまた
は稀なヌクレオチド配列のような特異な抗原性配列と蛋
白質結合配列として使うときは当該蛋白質結合配列を多
分クーロン化ベクター中に勿論存在させることができ、
または別の配列としてまたｔｆｃ［）ＮＡ配列の一部分
として、り四−ン化ベクターへの特異な抗原性配列およ
びヌクレオチドの体体内−！！たけガラス管内合体によ
りつくり出すことができる。

本発明の方法において試薬として使う結合蛋白質の選択
は勿論、蛋白質結合配列の選択に依存しる。結合蛋白質
の選択に対する唯一の重要な基準は、結合蛋白質が選択
性をもって選ばれた特定の蛋白質結合配列に結合する親
和力をもつことが要求されることであり、また免病検定
を使う場合は、当該蛋白質が別の種の動物において抗原
反応をひき起し得ることが要求される。他物質に対する
蛋白質の錯体、たとえば蛋白質−ハゾテン錯体、蛋白質
−酵素錯体、または他の蛋白質−マーカー錯体を結合蛋
白質として使用もできる。ＲＮＡポリメラーゼは、本発
明の方法で利用するのに特に適した蛋白質である。この
蛋白質は多くの構造遺伝子に関連した多くのプロモータ
ー配列に結合する親和力を有し、そこでこの蛋白質に特
異的である多くの蛋白質結合配列が役立つからである。

さらに、ＲＮＡポリメラーゼの単離および適当なプロモ
ーター配列の単離操作はよく研究され、公表されている
から、これらは本発明の方法で利用するのに特に適した
物質である。ｌａｃ阻害物、蛋白質錯体も特によく実証
され、この操作に使用できる。特異な抗原性配列を蛋白
質結合配列として使うときけ、結合蛋白質は好ましくは
特異”な抗原性配列に対し特電的な抗血清であり、また
は酵素のよった非放射性マーカーに結合した上記抗血清
である。本発明の操作で使用できる他の結合蛋白質は、
他の阻害物、ヒストン、ｒｌＮＡ変性酵素、ポリメラー
ゼ、および異化代謝産物遺伝子賦活体重白質（ＣＡＰ）
のような他の賦活体蛋白質を含む。

結合蛋白質を検出できる既知の検出法によって、結合蛋
白質の検出を遂行できることが含まれている。しかし、
特異な抗原性蛋白質に特異な抗血清が結合蛋白質である
場合を除いて、特異性と感度の理由で当該蛋白質を免疫
検定により検出することが好ましい。このよう表免疫検
定を行なうためには、結合蛋白質に対し特異的な抗血清
を用意することが必要である。うさぎまたは他の動物か
ら、当該技術で既知の常法で抗血清をつくり、単離する
。動物に最大抗原反応を起させるのに十分な時間わくで
、異質の結合蛋白質を抗原として動物に注射する。つい
で血清を動物から取り返し、結合蛋白質に特異的な抗血
清を後で使うため単離する。

下記のように、直接免疫検定操作を使わうとするときは
、マーカー結合免疫検定にふつう使うマーカーの一つ、
たとえばペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスホター
ゼのような酵素、またはフルオレセインのようなケイ光
マーカーに抗血清を結合する。

当該技術分野で熟知の方式で、マーカー効果を増幅する
ため複数のマーカーを抗血清に結合できまた好ましい。

本発明の方法に関連し間接免疫検定を利用しようとする
ときけ、第２抗血清を含む試薬が必要である。結合蛋白
質に対する抗血清の調製に類似の方式でつくり出した山
羊抗−うさぎＩｇＧを、第ａ抗血清として使用できる。

ついで第コ抗血清を酵素ペルオキシダーゼ、β−ガラク
トシダーゼ、またはアルカリ性ホスファターゼのような
マーカー、またはフルオレセインのようカケイ光マーカ
ー、または可視検定で検出できる他の残基と結合する。

酵素の結合なしに羊毛抗−うさぎＩｇＧを利用でき。

また下記のような二重間接検定操作で市販ＰＡＰｍ体＜
Ａ！ルオキシダーゼーうさぎ抗ペルオキシダーゼ）を利
用できる。

ユ、方法 本発明に従う特定のヌクレオチド標的配列の存在の検定
法を記載する。引用数字は添附図面の流れ図に示した工
程を指す。

試験ポリヌクレオチドエキスの試料の単離および固定で
操作を始める。検定用の試験エキスの試料の準備のため
には、遺伝物質の試料または遺伝物質を含む他の細胞物
質の試料を均質化し、必要なときｉｊ精製する。ついで
エキス中の４リヌクレオチドがたとえばニトロセルロー
ス濾過器まだは他の不溶マトリックス上に析出すること
により固定できるような方式で、試料の水性エキスをつ
くる。水性エキスを好ましく中性ないしアルカリ性ｐ■
に緩衝する。このようなポリヌクレオチド試料の単離の
ための幾つかの操作が知られており、この操作は典型的
には高塩濃度でフェノールおよびクロロホルムーイソア
ミルアルコールエキスヲ使うことによりエキスの除蛋白
を含む。エキスの単離は好ましくはニトロセルロース濾
過器上の固定によるが、他の固定ｐ過担体または他の担
体媒体または他の不溶マトリックス上の固定によ不こと
もできる。他のヌクレオチｒ単離または固定操作も使用
できる。マトリックス上に同定した試料ポリヌクレオチ
ド試料配列を以後試験試料と呼ぶ。

固定工程は図の数字で１１で示されている。

検定しようとするポリヌクレオチド試験エキスは、微生
物、バクテリア、ウィルス、類ウィルス体、植物、また
は動物組織を含め、どの生命形からのものであることも
できる。微生物−リヌクレオチドの試験試料エキスをつ
くるには、微生物を直接濾過器上にとらえ、洗剤（すな
わちラウリル硫酸ナトリウム）または酵素（たとえばリ
ゾチーム）で溶解する。ついでポリヌクレオチＹを細胞
物質の残りから分離できる。植物または動物組成に対し
ては、乳ばちと乳棒またけウオーリングブレンダーを使
い植物または動物組織の機械的均質化を行なうことがで
き、ふたたびついで洗剤またげ酵素で処理し、分離工程
を行なう。濾過器上にポリヌクレオチドエキスの固定に
適したノ々クチリア、植物、または動物のエキスの調製
を詳しくあつかった種々の方法が手に入り、たとえばサ
イトウらのＢｌｏｃｈｌｍ、Ｂｌｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ
、クコ巻（１９６３年）ＡＩ９〜６コ９頁、キスレブら
の、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｌｏ１０Ｆ１９．　Ａ　４巻、
／　／’７０〜ｌｌり３頁。

Ｃｌ９１θ年）、ケンプルらのＧａｎｅｔｌｃｓ、　９
　！ｒ巻、ダｓｉ−ダｓｒ頁Ｃｌ９１０年６月）、ムレ
−らのＮｕｃｌｓｌｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ＠５ｅａｒｃｈ
、　ｇ巻、１９号、１１３２／−１１３，２！ｒ頁ｃｔ
ｑｇｏ年）がある。

本発明の方法で比較的純粋ガーリヌクレオチＰエキスを
利用することが可能であね、一般に好ましいが、エキス
中に存在する不純物が本方法で使う他の試薬と反応する
ような性質のものでない限り、本発明の方法内で不純エ
キスを使用もできる。

典型的には、関心のポリヌクレオチド配列を含む細胞か
らの機能質の使用は、本発明の方法の有効性に影響する
過剰量の不純物を含まない。

試Ｍポリヌクレオチドのエキスを、「南プロット」、「
化プロット」、または「ドツトプロット」のような確立
された操作を使って、ニトロセルロース濾過器上に固定
できる。これらの操作は典型的には試料核酸を熱、また
はアルカリ性または他の化学処理（たとえばグリオキサ
ールおよびメチル水銀クロリド処理）Ｋより変性し、つ
いでニトロセルロース濾過器に非共有結合することを含
む。

たとえば［）８Ｍ紙のようにヌクレオチドエキスに共有
結合を形成するマトリックス物質を利用できることも含
まれている。上記のように、試験エキスを固定できる限
り、またマトリックスが操作の残りぢゆう試験エキスを
結合できる限カ、マトリックスの選択は重要でけたい。

検定しようとする試料試験エキス中のポリヌクレオチド
完全なＯＮ八へ子を形成する全４リヌクレオチドストラ
ンドであることができ、または全ＲＮＡ分子であること
ができ、または全ｍＲＮＡ分子であることができ、また
けＤＮＡｔたＦｉＲＮ＾分子の制限酵素開裂または他の
開裂によりつくり出したある長さのポリヌクレオチーフ
ラグメントであることができる。

一過器上に試験配列の固定後、緩衝溶液によるヒブリメ
イゼーショｙ前洗浄ＩＢを行なって、試料から不必要な
不純物を除去し、マトリックス上のすべての非特異的結
合点を飽昭するのが好ましい。

試験試料として試料ヌクレオチドエキスの固定工程およ
びヒブリダイゼーション前洗浄後、水洗の次の工程は試
験試料をヒブリダイゼーションのため変性グローブにさ
らすことである。上記の変性プ四−プをつくり出す操作
を図の数字１８に示す。ヒプリメイゼーション操作１４
でけ、試験試料を化学量論量より過剰の変性プローブを
添加した緩衝溶液に浸漬する。化学量論量より過剰の変
性プ四−プを使って、標的配列を含む試料エキス中に含
まれるデリヌクレオチｒストランドの各々のヒブリダイ
ゼーションに十分量の変性グローブが役立つことを確実
にする。このようなヒブリダイゼーション操作には既知
である。たとえばトー”ｔｒＸ、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、
＾ｃａｄ、ｓｃｌ、ＵＳＡ、クク巻、９号、！；２０／
　〜！ｒ：ｌθｔｒ頁＜１ｑｔｒｏ年）　オＪ：　（ｉ
　ｆ”　ｙハート、Ｅｌｌｏｃｈｅｍ、ａｎｄ　ＢＩｏ
、ｐｈｙｓ、Ｃｏｍｍａ　ｌ　　２３巻、ＡＩＩ／〜６
頁（１９６１，年）参照。試料ヌクレオチド試９エキス
の一部分のヌクレオチド配列が変性プローブ中の相当す
る相補ヌクレオチド配列配列と釣合ったときだけ、成功
するヒブリダイゼーションが起る。そこで、試料試験ポ
リヌクレオチドエキスにおいて標的配列を有するストラ
ンドがあれば、変性プローブからのｃＤＮＡ配列はその
標的配列にヒブリダイゼーションし、二重ストランド錯
体を形成する。溶液中のｃＤＮＡストランドの若干の部
分は変性プローブの他のストランドに含まれる他のｃＤ
ＮＡ配列にヒブリダイゼーションでき、変性グローブの
互につながったストランド錯体を形成する。互につなが
ったストランドのなかのｃＤＮＡ配列のどれか一つが試
験試料中のストランドの一つに結合すると、全錯体は試
験試料に結合する。試料試験エキスは固定されているか
ら、試料に結合したｃＤＮＡ配列を含む変性プローブの
上記錯体または単一ストランドも固定される。こうして
固定した変性プローブの上記ストランドも蛋白結合配列
を含む。

ｃＤＮＡ配列と試験配列との間には正確な相補を必要と
しないことを理解すべきである。がなりの数の釣合って
いない塩基対、ある場合には３θ係まｆｃはそれ以上が
存在してさえ、ヒブリダイゼーションは起る。ヒプリダ
イゼーション操作のきびしさを変えることにより、ヒブ
リダイゼーションに対し一層多くのまたは一層少ない相
補を必要とすることが可能である。

ヒブリダイゼーション九ついで、ヒブリダイゼーション
後洗浄１５を行なって、試験試料に直接または間接に結
合していない変性プローブの過剰の非ヒプリダイゼーシ
ョン１１を試験試料からすすぎ去る。ヒプリダイゼーシ
ョン後洗浄は緩衝溶液で行なう。

操作の次の工程は試験試料を結合蛋白質にさらすことで
ある。試験試料を結合蛋白質を含む溶液にさらす。この
溶液は結合蛋白質を含む必要があり、また結合蛋白質が
変性プローブ中の蛋白質結合配列に結合するのを促進す
る条件に試料を保つ必要がある。変性プローブが固定さ
れた試料ポリヌクレオチド試験エキスに結合していれば
、結合配列を含む変性プローブの一部分けなお試験試料
中にある。蛋白質結合配列が試験試料中に存在すれば、
結合蛋白質は蛋白質結合配列に結合し、試験試料中に固
定される。図の１６で示した蛋白質結合工程も、完全な
結合を確実とするために過剰量の結合蛋白質を含むべき
である。

結合操作後、過剰の結合蛋白質をν過器から洗ｔｎ去る
。１７で示したこのヒブリダイゼーション後洗浄操作は
、変性プローブに結合し、ついで結合蛋白質に結合した
固定された試験ｙｊ？　ＩＪヌクレオチド試料間に形成
され得る錯体を邪ましない緩衝溶液を利用すべきである
。

ｃＤＮＡ配列が試料ポリヌクレオチドエキス中に含まれ
る一つまたはそれ以上のストランドの配列に実質上釣合
うときは、試験試料はマトリックス上に試料エキス、変
性プローブの一つまたはそれ以上のストランド、変性グ
ローブに結合した結合蛋白質を含む錯体を含んでいる。

ここで結合蛋白質の存在に対し検定を行なう。結合蛋白
質のｌ検出法は、酵素またはケイ光体のよう表マーカー
残基を結合蛋白質に直接結合することである。たとえば
、抗−Ｚ−ＤＮＡ抗血清を結合蛋白質として使うときけ
、イルオキシダーゼを抗血清に直接結合でき、この酵素
を試験することによって当該蛋白質の存在を検出できる
。結合蛋白質の検出にどの他の非放射性法を使用できる
が、蛋白質の免疫検定が好ましく、この操作を詳Ｌ　＜
試験する。

直接免疫検定のためには、試験試料を結合蛋白質に対し
てつくった抗血清のリン酸塩緩衝食塩溶液のような水溶
液にさらす。抗血清は結合蛋白質に特異的であるから、
結合蛋白質が錯体中に存在するときだけ、抗血清は試験
試料に含まれるとの錯体に結合する。抗血清結合工程を
１８に示す。

試料試験？リヌクレオチドエキスのどの部分本質性ゾロ
ープ中のｃＤＮＡと釣合わないときけ、変性プローブは
試験試料に結合せず、そこで結合蛋白質本試験試料に結
合せず、この段階で抗血清は結合するための結合蛋白質
を見出さない。これに対比し、錯体が形成されていれば
、抗血清も錯体に結合する。この反応についで、リン酸
塩緩衝食塩溶液のような緩衝液により、試験試料から過
剰の抗血清を洗う１９゜ 操作におけるこの抗血清結合工程では、酵素またはケイ
光マーカーのようなマーカーを結合している結合蛋白質
に特異的な抗血清を利用できる。

このようなマーカーを結合した抗血清を使うときけ、抗
血清に結合したマーカーの存在のため、試験試料の適当
な検定がすぐできる。マーカーとして抗血清への結合に
利用できる適当な酵素はアルカリ性ホスホターゼ、ペル
オキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼを含む。ｚＯで示
したこの直接免疫検定は、しかし抗血清の存在を検定す
るための多くの方法の一つにすぎない。

一方、結合蛋白質に特異的な抗血清がマーカーに結合し
ていないときけ、通常の間接またけ二重間接マーカー結
合免疫検定を行って、結合蛋白質に対する抗血清の存在
を検出できる。このような間接および二重間接免疫検定
およびその変形はよく知られており、当該技術で実証さ
れている。間接検定は、蛋白質に結合させるために使っ
た抗血清、すなわちうさぎＩＦｌ、Ｇ’に特異的である
山羊抗−うさぎＩｇＧのような抗血清を使う。マーカー
Ｆｉ第コの抗血清、すなわち山羊抗−うさぎＩｇＧに結
合している。二重間接検定はマーカーを結合していない
こわら二つの抗血清の両者を使い、つｈでマーカーを結
合している抗血清、すなわち酵素でマーカーした々ルオ
キシダーゼーうさぎアンチペルオキシダーゼ（ＰＡＰ）
を使い、これを第ａ抗血清に結合する。このような間接
または二重間接検定を使う利点は、第コ抗血清が第１抗
血清を発生した種からのすべての抗血清眞対し一般的な
ことである。このようなマーカーを結合した抗血清本商
業上入手できる。検定結果を増幅するために、一つ以上
のマーカーを各ＩｇＧ分子に結合本できる。

抗血清に結合したマーカー酵素により接触される灰石に
よって、検定が検出を求めている蛋白質の存在に対し目
による表示を与えることけ、このような操作の常法であ
る。標的配列の存在の検出に、＃素の代りに抗血清に結
合したフルオレセインのようなケイ光マーカー、または
他のマーカー残基を利用できる。このようなケイ光マー
カーを使うときけ、洗浄後の試験試料をＵＶ照射ｋかけ
、得られたケイ光水準は試験試料エキス中に存在する特
定のヌクレオチド配列の量の直接の表示である。

こうして、本発明の方法は放射性核酸プ四−ブの使用を
含まないＲＮＡまたはＯＮ＾配列の検定を可能にする。

そこで、このよう壜放射性プローブの使用忙固有の欠点
が避けられる。当該操作は、抗原性蛋白質の検出に広く
使われる熟知の操作であるマーカー結合免疫検定のよう
表蛋白質検出に　“適する方法により検出できる蛋白質
−ヌクレオチド錯体を生じる。Ｚ−１）ＮＡ以外の核酸
は一般に最小に抗原性であり、また核酸に対する抗血清
は一般に特定の配列に対し非特異的であるから、上記操
作はふつうはポリヌクレオチド配列の検出に役立た力い
。本発明の方法はポリヌクレオチド配列の単一検定操作
をつくり出すために、ｆリヌクレオチドヒプリダイゼー
シ目ンの特異性とマーカー結合免疫検出のような蛋白質
検出検定の感度の利点を組合せ、そこで著しく特異的で
著しく敏感であり、またポリヌクレオチド配列を検出で
きる。

特異性を与えるｃＤＮＡ配列および蛋白質検出検定操作
の感度の利用を許す蛋白質結合配列の両者を含む変性ゾ
ローブを利用するととＫより、当該方法を遂行する。そ
こで、この操作は極度に高い感度を与えるが、なお著し
く選択的で、特別の認可または特別の取扱を必要とする
危険な物質を使用しない。

本発明の方法の別の利点け、操作に利用する試薬の多く
が多くの検定に共通であゆ、そこで、多数の検定操作で
使うため多ｔに製造できることである。検出しようとす
る特定のヌクレオチド配列に特異的であるｃＤＮ＾配列
以外け、操作に使う残りの成分と試薬は標準化できる。

たとえば、蛋白質結合配列をり四−ン化ベクターに挿入
し、なかに蛋白質結合配列を含む上記ベクターの妥当な
供給をつくり出すことができ、また結合蛋白質、マーカ
ーの結合した結合蛋白質、″またはその結合蛋白質に特
異的な抗血清の類似のストックをつくり出すことができ
る。そこで、本発明の検定法を開始する前に、ｃＤＮＡ
配列をつ〈す、蛋白質結合配列を含むストランドに挿入
することだけが必要である。また、同一検定操作を多数
反覆し行なわうとするときは、本発明の変性プローブを
多数のクローン化のためクーロン化ベクターに挿入して
、この検定を行なうのに使う変性プローブの大きなため
をつくり出すこともできる。変性プローブはこれをクロ
ーン化する生物から単離する以外は、使うのに特別の処
理を必要としないから、操作に使うため多量のプローブ
をつくることができる。

次の実施例はさらに本発明を具体的に例示するものであ
る。これらの実施例は、どのような方式でも本発明の技
術的範囲を制限する意図のもので示すものではない。

実施例１ 結合蛋白質配列をつくるために、Ｔ７バクテリオフアー
ジのＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＨｅ　５ｌｉｔ　
　にさらした。完全消化後、強いプロモーターＡ／、Ａ
、２、Ａ３を含むフラグメントを電気泳動により分離し
、アガロースゲルから回収した。

これらのプロモーター配列を蛋白質結合配列として使っ
た。回収したプロモーターフラグメン）？結紮して高分
子量重合体をつくり、ついで直接ＴｌｌＤＮＡリガーゼ
を使い鈍端結紮によりプラスミトヘクｐ−ｐＮｏｉｓｉ
ｑ”＋たけｐ　Ｎ　Ｏ／！ｒ２３のＳｍａｌｉたけＨｐ
ａ１部分に接合し、変性プローブをつくり出した。つい
で変性プローブを大腸菌菌株ＭＣ／θ０９中でクローン
化し、多量につくった。

ベクターｐＮｏ　／　、５−　／　’７およびｐＮｏ　
／　３２　、？けシラスミドｐＢＲ３２２の誘導体で、
そこでそれに相同の配列を示す。ベクター１）Ｎｏ　／
　左／りまたけｐＮｏ　／　３　ａ２３　またけプラス
ミドｐＢＲ３２２はＴ７パクテリオフアーゾの蛋白質結
合配列に相同の配列を含まない。

試験エキスとして、プラスミドｐＢＲ３２コのＤＮＡを
制限エンドヌクレアーゼＴａｑ　ｌ　　で消化し、最高
分子量の２フラグメントをアガロースゲル中に分離し、
サウザン、Ｊｏｕｒ、　ｏｆ　Ｍｏ、　Ｂｌｏｔｓ、　
９　！ｒ巻、３０３〜３／７頁（／９７左年）に記載の
方式でニトロセルロース濾過器上に固定した。

対照試験エキスとして、子牛胸腺からの［）ＮＡを同様
に固定した。ついでニトロセルロース濾過器を予備洗浄
し、コｘｓｓｃ％Ｏ，コ係ＢＳＡ。

０．２係フイコル、０．．２％ｐｖｐ、変性鮭精子ｏ　
Ｎ　Ａ　！；　Ｏｔｔ　ｉ　／　ｙＬｔを含む緩衝液中
で、エラブロモ−ターを有する変性プローブｐＮｏ　／
　、ｔ　／りおよびｐＮｏ　／　５２３に対しヒブリダ
イゼーションした。

ヒブリダイゼーション前、変性プローブをｇＯ℃ＶＣ１
０分加熱することにより変性した。ヒブリダイゼーショ
ン後、濾過器をまず、４．！ｔ’ｃでＯ，、ｌＳＳフコ
ル、０，２％ＰＶＰを含む、ｌ　ｘ　ｓ　Ｓ　Ｓ　Ｑ、
３Ｍの緩衝液中で、第コに６．５−”Ｃで０．２係フイ
コル、０．２’４ＰＶＰを含む／Ｘ５ＳＣの緩衝液中で
、最後に室温で（，２，２〜、２左’Ｃ）ＲＮＡポリメ
ラーゼ結合緩衝液（ＲＮＡＰＢＢ）中で、各々７０〜３
０分洗浄した。ついで濾過器を１０ｍＭへｄ　ｘ　（ｐ
Ｈ７ｍ　−２）、／　Ｏｍ　Ｍ　ＭｇＣｌ２　、θＱｍ
’Ｍ’ｔＤＴＡ、ｔｈ／ＰＪＩＮｊＩＣ１，、′ＪＦ３
ＳＭ’ＳＯｐ　１１　／　ｔＬｌを含むＲＮＡＰＢＢｏ
、２ｍｌに、３７℃で２分浸漬した。大腸菌からのＲＮ
Ａポリメラーゼ２５μｇを加え、濾過器と混合した。濾
過器を３７℃でコル３分培養した。

ついで濾過器を除去し、ｒＨ４ＡｐＢＢＯ，！；ｒｎｒ
、中でツ回１，２　、ｔ　”Ｃで／３分洗った。ついで
濾過器をＲＮＡＰＢＢＱ、左ｒｎεに移し、うさぎでつ
くった抗−ＲＮＡポリメラーゼ抗血抗血ｒ　００　ｔｉ
　／ｌを加えた。３７℃で６θ分後、濾過器を除去し、
ＲＮＡＰＢＢｏ、３ｍｌ中でコ回１．２５　”Ｇで７５
分洗った。ツいで濾過器をＲＮＡＰＢＢＯ，、ｔ＃Ｉｆ
ｆＫ移し、山羊抗−うさぎＩｇ０２３μｇを加えた。

３７℃で６θ分後、濾過器を除去し、ＲＮＡＰＢＢθｅ
　３　ｍｚ中でコ回洗った。ついで濾過器を３り℃のＲ
ＮＡＰＢＢ１０θμを中で７時間西洋わさびベルオキシ
ダーゼ−りさぎ抗−ペルオキシダーゼ錯体（ＦＡＡ）１
１．３ｉ’μｇと反応させた。ついで濾過器をＲＮＡＰ
ＢＢｏ、左ｖでコ回、Ｊ　、ｔ　”Ｃで各々／！ｒ分洗
った。濾過器を乾燥プロットし、ペルオキシダーゼ基質
溶液（左Ｏｍ　Ｍ二塩基性リン酸ナトリウム、２！；ｍ
Ｍクエン酸、０．０’１４ｏ−フェニレンジアミン、Ｏ
０θ／　！ｒＩ　Ｈ２Ｏ２）と室温で３分反応させた。

試料が試験の標的配列である１）ＢＲ３２２フラグメン
トを含むときけ、鮮明外帯黄かっ色が発展し、正の結果
を示した。試料がＤＮＡを含まないかまたは子牛胸腺か
らのＤＮＡを含むときは、認められた結果は負で、強い
色は発展しなかった。この実施例では、結合蛋白質、大
腸菌ＲＮＡポリメラーゼは、酵素結合二重間接免疫検定
により検出した。

実施例コ 実施例／と同一操作に従ったが、ただしハイブリダイゼ
ーション前洗浄およびハイブリダイゼーションを直接Ｒ
ＮＡＰＢＢおよびＱ、７ｍＭジチオスレイトール中で行
ない、ハイブリダイゼーション後洗浄はＲＮＡＰＢＢ中
であった。

実施例３ 実施例コと同一操作に従ったが、ただ１−結合蛋白ηＲ
ＮＡポリメラーゼをハイブリダイゼーション工程中伯接
変性グローブと共に加えた。

実施例 実施例１と同一操作に従ったが、ただしＤＮＡフラグメ
ントをアガロースゲル中に分離後、これを霜、気溶出に
より回収し１、アンドレ、５ｃｈｌｅｌｃｔ＋ｅｒ＆　
５ｃｈｅｌｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ＸＡｐｐＨｃａｔ
ｌｏｎ　Ｕｐｄａｔ＠。

１９ｇ２年に記載の方法に従いニトロセルロース濾過器
上に「ドツトプロット」した。

実施例Ｓ 実施例１と同一操作を使ったが、ただし第コ抗廂清をア
ルカリ性ホスファターゼに接合した。

３り’ｃテｌ、　０’Ａ−後、Ｆ？ｌａｆ除去Ｌ、ＲＮ
　Ａ　Ｂ　Ｂ中で洗い、乾燥プロットした。ついで濾過
器を色発展のためアルカリ性ホスシアターゼ基質溶液（
７Ｍジェタノールアミン（ｐｌ童９−ｇ＞、ｏ、；ｍＭ
ＭｇｃＡ　　、／　ｊｍＭ　　ｐ−、−トロフェニルホ
スフアート）と反応させた。本実施例では、結付蛋白質
をＰ紫結合間接免疫検定により検出した。

実施例６ 実施例Ｓの掃作に従ったが、ただしハイブリダイゼーシ
ョン前洗浄とハイブリダイゼーションをＲＮＡＢＢおよ
び０　＊　／ｍＭジチオスレイトール中で実施し、ハイ
ブリダイゼーション後洗浄はＲＮＡＢＢ中であった。

実施例７ 実施例６の操作に従ったが、ただし結合蛋白質ＲＮＡ／
リメラーゼをハイツリメイゼーション工程中直接費性グ
ローブと共に加えた。

実施例ざ 実施例コと同一操作に従ったが、ただしうさぎ抗−ＲＮ
Ａ−リメラーゼ抗抑清の結合ついで洗浄後、濾過器を過
剰量の黄色ぶどう球菌コワン蛋白質Ａ−８ガラクトシダ
ーゼ接合体を含むＱ、３；ｍｌのＲＮＡＢＢＫ移した。

３７℃で６０分後、濾過器を除去し、ＲＮＡＢＢ中で洗
い、乾燥プロットした。ついで色発展のため、濾過器を
β−ガラクトシダーゼ基質溶沿（４Ｑ　ｍＭ　Ｎａ、Ｈ
ＰＯ４、＃　ＯｍＭＮａＨ２ＰＯ４、／　ｍＭ　ＭｇＳ
Ｏ４、／　ＯｍＭ　Ｋｃｇ　、β−メルカプトエタノー
ルコ、７ｍｌ／）、０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシド３■（＃！／）と反応させた。本実施例
では、第コ抗抑清の代りに黄色ぶどう球菌カワンから単
離した蛋白質＾を第１」用する酵素結合間接免疫検定に
より、結合蛋白質を検出した。

実施例９ 実施例ｇと同一操作に従ったが、ただし結合蛋白＠ＲＮ
Ａｆリメラーゼをハイツリダイゼーション工程中直接変
性グローブと共に加えた。

実施例ＩＱ 仮定的には、実施例１と同一操作を打力うことができる
が、ただし山羊抗−うさぎＩｇＧをフルオレセインに結
合できる。山羊抗−うさぎＩｇＧの結合および洗浄後、
濾過器をＵＶ照射下に観察できる。特定のヌクレオチド
配列を含む試料では、ケイ光が銭さつされるだろう。

これはケイプ・マーカー結合した間接免疫検定の例であ
る。

実施例／／ 仮定的には、実施例１と同一操作を行なうことができる
が、たたし濾過器を酵素ペルオキシダーゼに結合した山
羊抗−うさぎＩｇＧにさらすことができる。反覆洗浄後
、濾過器を検出のためペルオキシダーゼ基質溶液に浸漬
する。試料ヌクレオチドエキスが特定のヌクレオチド配
列を含んでｈるときは、強い帯赤かっ色が発展するのを
観さってきる。

これは結合蛋白質の検出のため酵素結合間接免疫検定の
例である。

本発明の精神内で、本発明を実施するため上記方法の変
形が可能であシ、そこで本発明は上記明細に限定される
べきものではない。

【図面の簡単な説明】

添付図面は本発明に従い試料ポリヌクレオチド試験エキ
ス中の特定の標的ヌクレオチド配列の存在を検定する方
法を例示したオとめた流れ図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｆｉｌ（ａ）　　試料ポリヌクレオチドエキスを試験試
   料中に単離し、 （ｂ）　　試験試料を（１）％定のヌクレオチド配列に
   実質上相補のｃＤＮＡ配列および蛋白質結合配列を含ん
   でいるポリヌクレオチド変性プローブにさらし、また（
   １１）変性グローブの結合配列に結合する結合蛋白質に
   さらし、 （Ｃ）　　試験試料を単離して試料？リヌクレオチドエ
   キスに結合しなかった成分を除去し、（ｄ）　　結合蛋
   白質の存在に対し試験試料の検定″を行なう工程を特徴
   とする試料４リヌクレオチド試験エキス中の特定のヌク
   レオチド標的配列の存在の検定法。 （２１試料？リヌクレオチドエキスの単離工程が試料エ
   キスを不溶マトリックス上に肯定することを含む特許請
   求の範囲０１に記載の検定法。 （３）変性グローブ中の蛋白質結合配列がプロモーター
   、オペレーター、ＩＪＰ異か抗原性配列、反覆配列、ヒ
   ストン結合配列の群から選ばれる特許請求の範囲（１１
   に記載の検定法。 （４）　　変性グローブ中の蛋白質結合配列が１ａｃ−
   プロモーター、１８ｃｍオペレーター、ｔｒｐ−プロモ
   ーター、Ｔ３バクテリオファージ、Ｔ７バクテリオフア
   ージ配列の群から選ばれる特許請求の範囲（３）に記載
   の検定法。 （５）結合蛋白ηがＲＮＡ−？リメラーゼ、オペロンレ
   ギュレーター、ヒストン、ＤＮＡ変性酵素、抗−Ｚ−Ｄ
   Ｎ＾抗血抗血群から、′ＪＩ４ばれる特許請求の範囲０
   １に記載の検定法。 （６１（ａ）　　％定のヌクレオチド配列配列に相補の
   ｃＤＮＡ配列をつ〈υ、 （ｂ）ｃＤＮ＾配列をクローン化するベクターに挿入し
   、°。 （ｃｌｃＤＮＡ配列を含むベクターをクローン化し、 （ｄｌｃＤＮＡ配列を含むクローン化ベクターを単離し
   、 （ｅ）　　蛋白質結合配列をクローン化ベクターに挿入
   する工程によって変性グローブをつくり出す特許請求の
   範囲（１１に記載の検定法。 ＋７１　（ａ）　　Ｗ白質結合耐外を含むベクターを単
   離し、（ｂ）　　！定のヌクレオチド標的配列に相補の
   ＣＤＮＡ配列をつ〈シ、 （ｃ）ＣＤＮＡ配列を蛋白質結合配列を含むベクターに
   挿入する工程により変性グローブをつくり出す特許請求
   の範囲（１１に記載の検定法。 （８）　　蛋白質結合配列を含むベクターの単離工程が
   （ａ）　　一つの釉のＤＮＡから蛋白質結合配列を単離
   し、 （ｂ）　　ＭＥ白質結合配列を第２の種からのクローン
   化するベクターに挿入し、 （ｅ）　　クローン化するベクターを単細胞生物中でク
   ローン化し、 （ｄ）　　ｉ白’ＪＩＪ−合配列を含むクローン化ベク
   ターまたはそのセグメントを単離する工程を含む特許請
   求の範囲（７）に記載の検定法。 （９）　　すでに蛋白質結合配列を含んでいるベクター
   として働らくことのできるバクテリオファージポリヌク
   レオチドを単離することにより、ベクターの単離工程を
   遂行する特許請求の範囲（７）に記載の検定法。 （ＩＱ　　さらに変性グローブをクローン化する工程を
   含む特許請求の範囲（６）または（７）にト１ツ載の検
   定法。 ａｎ　　ｙ、験試料をさらす工程がさらに各試薬にさら
   した後、試験試料から未反応成分を除去するための分離
   工程を含む特Ｗ■・請求の範囲（１１に記載の４・ｒ定
   法。 Ｏ２結合蛋白質の検定を行７Ｃう工程か、試験試料を結
   合蛋ｌｉｉ仙に特異的な抗血清にさらし、抗血清の存在
   に対し試験試料の検定を行なう工程を含む特許請求の範
   囲（１：に記載の怜声法。 ＯＪ　　抗血清がマーカーを結合しており、結合マーカ
   ーの存在を試駆することによシ試験試料の検定を行なう
   特Ｗ１−稍求の範囲０２に記載の検定法。 ０４１　　抗血清に対する１１１接またけ二重間接マー
   カー結合免疫検定により試験試料の相定を行なう特許請
   求の範囲ａ”ａに記載の検定法。 ０！９　　マーカーが酵翠である特許請求の範囲α３−
   またけ０４に記載の検定法。 （１６１蛋白質結合配列が特異な抗原性配列であり、結
   合蛋白質が％異方抗原性配列に対し特異的な抗血清であ
   る特許請求の範囲（１！に記載の検定法。 （１７１抗−Ｚ−ＤＮＡ抗而清面マーカーを結合してい
   る特許請求の範囲（ＩＱに記載の検定法。 ６８　　特定の蛋白質に結合するための蛋白質結合配列
   および標的配列に結合するため標的ヌクレオチド配列に
   対し実質上相補であるように選ばれたＣＤＮＡ配列の両
   者を含んでいる単一ポリヌクレオチド分子からなる標的
   ヌクレオチド配列の検定に使うのに適合した変性グロー
   ブ。 Ｏｌ　　蛋白質結合配列がブロモ−ター、オペレーター
   、特異な抗原性配列、反覆配列、ヒストン結合配列の群
   からがばれる特許請求の範囲０櫓に記載の検定法。 ■　蛋白質結合配列がＨａ（Ｈ−ブロモ−ター、Ｉａｅ
   −第４レータ−１ｔｒｐ−ブロモ−ター、Ｔｊバクテリ
   オファージプロモーター、Ｔクバクテリオファージグロ
   モーターの群から選ばれる特許請求の範囲６１に記載の
   変性グローブ。 ！２、特許請求の範囲０１に記載の変性グローブの有効
   量を含んでいる特定のヌクレオチド配列の検定に使う試
   薬。 （２２１（ａ）　　％定のヌクレオチド標的１列に実質
   上相補のＣＤＮＡ配列をつくり、 （ｂ）ＣＤＮＡ配列をクローン化するベクターに挿入し
   、 （Ｃ）　ＣＤＮＡ配列を含むベクターをクローン化し、 （ｄ）　　ｅ　Ｄ　Ｎ　Ａ　配列を含むクローン化ベク
   ターを単離し、 （ｅ）　　蛋白質結合配列をクローン化ベクターに挿入
   する工程から々る標的ヌクレオチド配列の検定に使う変
   性グローブの製造法。 （ハ）（ａ）　　蛋白質結合配列を含むベクターを単離
   し、（ｂ）　　％定のヌクレオチド標的配列に実質上相
   補のＣＤＮＡ配列をつくり、 （ｃｌｃＤＮ＾配列を蛋白質結合配列を含むベクターに
   押入する工程からなる標的ヌクレオチド配列の検定に使
   う質性グローブの製造法。 ｃ１４　　蛋白質結合配列を含むベクターの単離工程が
   （ａ）　　一つの種のＤＮＡから蛋白質結合配列を単離
   し、 （ｂ）　　蛋白質結合配列を第２の種からり四−ン化す
   るベクターに押入し、 （ｃ）　　クローン化するベクターを単細胞生物中でク
   ローン化ｌ−１ （ｄ）　　蛋白質結合配列を含むクローン化ベクターま
   たはそのセグメントを単離する工程を含む特許請求の範
   囲（至）Ｋ配−のｆ性グローブの製造法。 ＠　％異な抗原性配列がＺ−ＯＮ＾配列であシ、結合蛋
   白質が抗−Ｚ−ＤＮ＾抗血清である特許請求の範囲６ｅ
   に記載の検定法。 （至）％異珍抗原性配列が稀な特異々抗原性ヌクレオチ
   ドを含む配列であシ、結合蛋白質が上記ヌクレオチドを
   含む配列に対し特異的な抗血清である特許請求の範囲Ｏ
   １に献敞の検定法。 ｈｍ々ヌクレオチドが５−ブロモデオキシウリジンおよ
   びＳ−ヨードデオキシウリジンの群から犀ば力る特許請
   求の範囲（イ）に記載の検定法。