JPH035398B2 - - Google Patents
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- JPH035398B2 JPH035398B2 JP60257690A JP25769085A JPH035398B2 JP H035398 B2 JPH035398 B2 JP H035398B2 JP 60257690 A JP60257690 A JP 60257690A JP 25769085 A JP25769085 A JP 25769085A JP H035398 B2 JPH035398 B2 JP H035398B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12R2001/11—Bacillus megaterium
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Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は抗菌作用抗ウイルス作用および抗腫瘍
作用を有し、医薬品として期待される新規抗生物
質NK84−0218およびその製造方法に関する。 〔従来技術〕 抗腫瘍性を有するアデニン系の抗生物質として
例えばコルデイセピン（3′−デオキシアデノシ
ン：Bio［−］chim・Biophy・Acta，117482
（1966））が知られている。しかし、アデニンにオ
キセタン環のついた化合物は知られていない。 〔発明が解決しようとする問題点〕 抗生物質は耐性菌などの出現のため常に新しい
ものが要望されており、又、ウイルス疾患及び悪
性腫瘍はその性質が千差万別であるため、新しい
抗ウイルス物質及び抗腫瘍性活性物質が要望され
ている。 〔問題点を解決するための手段〕 そこで本発明者らは微生物の代謝産物について
種々検索した結果、バチルス（Bacillus）属に属
する一菌株が抗菌作用、抗ウイルス作及び抗腫瘍
作用を有する式（） で表される新規抗生物質NK84−0218を産生する
ことを見い出した。 本発明は上記知見に基づいて完成されたもので
ある。 上記新規抗生物質NK84−0218はバチルス属に
属するNK84−0218生産菌を培養し、抗生物質
NK84−0218を生成蓄積せしめ、この培養物より
抗生物質NK84−0218を採取することにより得ら
れる。NK84−0218の生産菌の代表的なものとし
て昭和58年12月、日本化薬(株)総合研究所の敷地内
の土壌より分離したバチルスNK84−0218（微工
研条寄第919号：以下「NK84−0218株」と略称
する）があげられる。 以下NK84−0218株の菌学的性状を示す。 １ 形態的特徴 細胞の形：桿状 細胞の大きさ：1.0〜1.3×1.5〜4.7μ 多形性：あり、培養初期は円筒形、培養が
すすむにつれて楕円形（卵円形）に
なる。 運動性：なし。 胞子：あり、0.6〜0.8×1.2〜1.5μ楕円形
（卵円形）、胞子の位置は中位、準端立
または端立 グラム染色性：陽性 抗酸性：なし ２ 各種培地上の生育状態（27℃で１〜７日培
養し常法より観察した。） 肉汁寒天平板培養 生育は良好で増殖と共に円型から不規則な周
縁を示し、コロニーは光沢があり、乳白色か
ら薄い黄色の色調を呈し、可溶性色素は認め
られない。 肉汁寒天斜面培養 生育平面は平滑で、培養経過と共にしわ状を
し、不透明で粘稠性をおび、色素の産生は認
められない。 肉汁液体培養 表面の生育は認められず濁度は極くわずかに
観察され、培養経過と共に試験管の底部に沈
澱がみられ、ガスの発生は認められない。 肉汁ゼラチン穿刺培養 生育と共に層状（液状）を呈し、沈澱は認め
られない。 リトマス・ミルク培養 37℃で凝固する、培養経過と共にペプトン化
を示し、リトマスが薄い赤色を呈する。 ３ 生理的性質 硝酸塩の還元：陰性 脱窒反応：陽性 MRテスト：疑陽性 VPテスト：陰性 インドールの生成：陰性 硫化水素の生成：陰性 澱粉の加水分解：陽性 クエン酸の利用：陽性 無機窒素源の利用： 利用していないよう
である。 色素の生成： King Ａ，Ｂ 共に陰性 ウレアーゼ：陰性 オキシターゼ：陽性 カタラーゼ：陽性 生育の範囲 温度：10〜45℃ （各温度条件にて30日間培養） PH：５〜10 酸素に対する態度：好気性 Ｏ−Ｆテスト：酸化 各種糖類に対する酸およびガスの生成各
種糖類に対する酸やガスの生成の有無は第１
表に示すとおりである。
作用を有し、医薬品として期待される新規抗生物
質NK84−0218およびその製造方法に関する。 〔従来技術〕 抗腫瘍性を有するアデニン系の抗生物質として
例えばコルデイセピン（3′−デオキシアデノシ
ン：Bio［−］chim・Biophy・Acta，117482
（1966））が知られている。しかし、アデニンにオ
キセタン環のついた化合物は知られていない。 〔発明が解決しようとする問題点〕 抗生物質は耐性菌などの出現のため常に新しい
ものが要望されており、又、ウイルス疾患及び悪
性腫瘍はその性質が千差万別であるため、新しい
抗ウイルス物質及び抗腫瘍性活性物質が要望され
ている。 〔問題点を解決するための手段〕 そこで本発明者らは微生物の代謝産物について
種々検索した結果、バチルス（Bacillus）属に属
する一菌株が抗菌作用、抗ウイルス作及び抗腫瘍
作用を有する式（） で表される新規抗生物質NK84−0218を産生する
ことを見い出した。 本発明は上記知見に基づいて完成されたもので
ある。 上記新規抗生物質NK84−0218はバチルス属に
属するNK84−0218生産菌を培養し、抗生物質
NK84−0218を生成蓄積せしめ、この培養物より
抗生物質NK84−0218を採取することにより得ら
れる。NK84−0218の生産菌の代表的なものとし
て昭和58年12月、日本化薬(株)総合研究所の敷地内
の土壌より分離したバチルスNK84−0218（微工
研条寄第919号：以下「NK84−0218株」と略称
する）があげられる。 以下NK84−0218株の菌学的性状を示す。 １ 形態的特徴 細胞の形：桿状 細胞の大きさ：1.0〜1.3×1.5〜4.7μ 多形性：あり、培養初期は円筒形、培養が
すすむにつれて楕円形（卵円形）に
なる。 運動性：なし。 胞子：あり、0.6〜0.8×1.2〜1.5μ楕円形
（卵円形）、胞子の位置は中位、準端立
または端立 グラム染色性：陽性 抗酸性：なし ２ 各種培地上の生育状態（27℃で１〜７日培
養し常法より観察した。） 肉汁寒天平板培養 生育は良好で増殖と共に円型から不規則な周
縁を示し、コロニーは光沢があり、乳白色か
ら薄い黄色の色調を呈し、可溶性色素は認め
られない。 肉汁寒天斜面培養 生育平面は平滑で、培養経過と共にしわ状を
し、不透明で粘稠性をおび、色素の産生は認
められない。 肉汁液体培養 表面の生育は認められず濁度は極くわずかに
観察され、培養経過と共に試験管の底部に沈
澱がみられ、ガスの発生は認められない。 肉汁ゼラチン穿刺培養 生育と共に層状（液状）を呈し、沈澱は認め
られない。 リトマス・ミルク培養 37℃で凝固する、培養経過と共にペプトン化
を示し、リトマスが薄い赤色を呈する。 ３ 生理的性質 硝酸塩の還元：陰性 脱窒反応：陽性 MRテスト：疑陽性 VPテスト：陰性 インドールの生成：陰性 硫化水素の生成：陰性 澱粉の加水分解：陽性 クエン酸の利用：陽性 無機窒素源の利用： 利用していないよう
である。 色素の生成： King Ａ，Ｂ 共に陰性 ウレアーゼ：陰性 オキシターゼ：陽性 カタラーゼ：陽性 生育の範囲 温度：10〜45℃ （各温度条件にて30日間培養） PH：５〜10 酸素に対する態度：好気性 Ｏ−Ｆテスト：酸化 各種糖類に対する酸およびガスの生成各
種糖類に対する酸やガスの生成の有無は第１
表に示すとおりである。
【表】
尚、各種糖類からの酸の生成およびガスの発生
は液体培地では生育しにくいので寒天培地で行つ
た。 以上の各所見をもとにパージエイズ・マニユア
ル・オブ・デターミナテイブ・バクテリオロジ
ー、第８版を参照した結果、バチルス・メガテリ
ウムに属する一菌株であることが明らかになり、
本菌株をバチルス・メガテリウムNK84−0218
（Bacillus megaterium NK84−0218）と命名し
た。 本発明に用いるバチルス・メガテリウムに属す
る菌株は他のバチルス属の菌株と同様、その性状
が変化しやすく、例えば紫外線、エツクス線およ
び薬品など用いる人工的変異手段で容易に変異し
うるものであり、どの様な変異株であつても本発
明の対象とする抗生物質NK84−0218の生産能を
有るものはすべて本発明に使用することができ
る。 本発明によりNK84−0218を製造するには、先
ず前記菌株を細菌の培養が利用し得る栄養物を含
有する培地で好気的に培養する。栄養源として
は、従来から細菌に利用されている公知のものが
使用でき、例えば、炭素源としてはグルコース、
フラクトース、グリセリン、シユクロース、デキ
ストリン、ガラクトース、有機酸など単独かまた
は組み合せて用いることができる。無機および有
機窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモ
ニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硫酸ナトリウ
ム、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵
母、コーン・スチープ・リカー、大豆粉、綿実油
カス、カザミノ酸、バクトソイトン、ソリユプ
ル・ベジタブル・プロテイン、オートミールなど
を単独または組み合せて用いることができる。そ
の他必要に応じて食塩、炭酸カルシウム、硫酸マ
グネシウム、硫酸銅、硫酸鉄、硫酸亜鉛、塩化マ
ンガン、燐酸塩などの無機塩類を加えることがで
きるほか有機物、たとえばアミノ酸類、ビタミン
類、核酸類や無機物を適当に添加することができ
る。 培養法としては液体培養法、特に深部撹拌培養
法が最も適している。培養温度は20〜45℃、PHは
微酸性ないし微アルカリ性で培養を行うことが望
ましい。液体培養では通常１〜４日間培養を行う
とNK84−0218物質が培養液中に生成蓄積され
る。培養液中の生成量が最大に達したとき培養を
停止し、菌体を別して得られる培養液中より目
的物を精製単離する。 なお培養液中のNK84−0218の生成量は高速液
体クロマトクラフイー〔条件、カラム：
Nucleogil5C18，4.6φ×250mm、溶媒系：0.1Mク
エン酸バツフア（PH4.0）−アセトニトリル−メタ
ノール＝100：４：２、流速：0.8ml／min、21
℃，259nm〕にて測定した。 培養液から本物質の精製単離には一般に微生
物代謝生産物をその培養液から単離する為に用い
られる分離精製の方法が利用される。NK84−
0218は水、メタノール、ジメチルスルホキサイド
に溶けるがプロパノール、アセトンをはじめとす
る一般有機溶媒に不溶ないしは溶けにくい物質
で、その精製はいわゆる核酸系抗生物質の精製に
用いられる方法により行われる。すなわち活性炭
およびイオン交換樹脂よる吸脱着法、アビセル
、セフアデツクス 類のカラムクロマトグラフ
イーなどの方法を適当に組み合せて用いることが
できる。例えば培養液をPH3.5〜6.5好ましくは
PH４〜4.5に調整したのち、活性炭末に吸着させ、
水洗後50％アセトン水溶出し、活性区分を濃縮後
凍結乾燥する。得られた茶褐色の粗粉末をメタノ
ールで不溶部分を除去し、可溶物を乾燥後水に溶
解し、活性炭末カラムに吸着後水洗し、水と50％
アセトン水によるアセトンの直線濃度勾配溶出法
により溶出し、活性区分を濃縮後凍結乾燥する。
得られた薄茶色のNK84−0218を含有する粗粉末
を少量の水に溶かし、アビセルカラムに充填した
後、含水アルコールにて展開し、水含量を段階的
にたかめることにより溶出し、活性区分を集め、
濃縮後凍結乾燥する。次にこの粉末を極く少量の
水に溶かし、予め0.02Mの食塩水で平衡化した
SPセフアデツクス Ｃ−25（Na+）に充填し、
0.02M食塩水で活性区分を溶出し、活性炭末にて
脱塩することにより無色の粉末を得る。この精製
粉末を水または含水アルコールにて処理し、
NK84−0218の無色の針状結晶が得られる。尚簡
便法として培養中の力価は枯草菌（Bacillus
subtilis PCI 219）の平板よるカツプアツセイ法
にて測定した。 又、次の方法によつても本物質を精製単離でき
る。即ち、培養液をPH４〜4.5に調整したのち、
強酸性陽イオン交換樹脂に吸着させ、水洗後、希
アンモニア水にて溶出し、抗菌活性を有する
NK84−0218を含有する活性区分を得る。次にこ
の活性区分を集め中和後、吸着樹脂に通塔し、水
洗したのち、含水メタノールで溶出し、活性区分
を減圧下濃縮することによりNK84−0218を含む
粗粉末を得る。得られた粗粉末のメタノール可溶
部よりメタノールを減圧下で除去したのち弱酸性
陽イオン交換樹脂に通塔し水洗後希アンモニア水
にて溶出する。得られた活性区分を集め減圧下で
濃縮してアンモニアを除いたのち氷室にて１液放
置することによりNK84−0218の粗結晶が得ら
れ、水にて再結晶することによりNK84−0218の
無色の針状結晶を得る。 以上のようにして得られたNK84−0218の理化
学的性状を次に示す。 (1) 外 観 無色の針状結晶 (2) 元素分析（％）（C10H13O3N5・H2Oとして） Ｃ Ｈ Ｏ Ｎ 理論値 44.60 5.42 2.377 26.01 実測値 44.75 5.58 2.365 25.98 (3) 分子式（分子量） C10H13O3N5（251・24） (4) 融 点 197℃ (5) 比旋光度 〔α〕20/D＝−44.3゜（Ｃ 0.21、ピリジン） (6) 紫外線吸収スペクトル 紫外線吸収スペクトルを第１図に示す。 水、0.1N塩酸および0.1N水酸化ナトリウム溶
液中の紫外吸収と分子吸光係数値はそれぞれ λH 2 O/max（logε）＝259nm（4.10） λ0.1N/max HCl（logε）＝257nm（4.09） λ0.1N/max NaOH（logε）＝259nm（4.11） (7) 赤外線吸収スペクトル 臭化カリウム錠にて測定した赤外線吸収スペ
クトルを第２図に示す。その吸収極大値（波数
cm-1）を以下に示す。 3470，3420，3325，3200，2925，2890，
1655，1615，1587，1565，1548，1510，1490，
1455，1440，1430，1388，1370，1333，1317，
1300，1257，1230，1200，1165，1130，1100，
1045，1030，1010，975，955，910，860，810，
795，743。 (8) 溶剤に対する溶解性 水、メタノール、エタノール、ジメチルスル
ホキサイドに溶けるがプロパノール、アセト
ン、酢酸エチル、エーテルおよびベンゼンなど
の有機溶媒には不溶ないし溶けにくい。 (9) 呈色反応 ライドン・スミス反応、10％硫酸各反応に陽
性、ニンヒドリン反応、坂口氏反応は共に陰性
を示す。 (10) 薄層クロマトグラフイーのRf値 シリカゲル薄層（Kiesel gel 60 F254 0.25
mmMerck）を使用し、ｎ−ブタノール：酢
酸：水（４：１：２）およびｎ−ブタノール：
28％アンモニア水：水（10：0.5：１）の各展
開溶媒系で展開することによりRf＝0.51および
0.48を示す。 1H−核磁気共鳴スペクトル 重ジメチルスルホキサイド中テトラメチルシ
ランを内部基準にして測定した1H−核磁気共
鳴スペクトルを第３図に示す。 13C−核磁気共鳴スペクトル 重水中ジオキサン（δ67.4）を内部基準にし
て測定した13C−核磁気共鳴スペクトルの化学
シフト（δ−値）は 156.4，153.5，149.3，141.5，119.4，82.6，
80.1，63.3，59.9，45.4。 以上のデーター及び臭素酸塩の結晶のＸ線回折
のデーターよりNK84−0218の構造は式(1)の2′R，
3′R，4′Sの絶対配置を有する。 本発明のNK84−0218は後記の如く抗菌剤抗ウ
イルス剤および制癌剤などの医薬品として期待さ
れるものである。医薬品として使用する場合の製
剤化および投与方法は従来公知の種々の方法が適
用できる。すなわち、投与方法としては注射、経
口、直腸投与などが可能である。製剤形態として
は注射剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、坐薬などの形
態がとり得る。 製剤化の際にはNK84−0218に悪影響を与えな
い限り、医薬用に用いられる種々の補助剤、すな
わち、担体やその他の助剤、例えば安定剤、防腐
剤、無痛化剤、乳化剤等が必要に応じて使用され
うる。 製剤において、NK84−0218の含量は製剤形態
等により広範囲に変えることが可能であり、一般
にはNK84−0218を0.01〜100％（重量）、好まし
くは0.1〜70％（重量）含有し、残りは通常医薬
用に使用される担体その他の補助剤からなる。 NK84−0218の投与量は症状等より異なるが、
成人１人１日当り0.01〜800mg程度である。連投
を必要とする場合には１日当りの使用量をおさえ
ることが好ましい。 NK84−0218の製剤化には、通常、塩酸塩や硫
酸塩などの医薬用に許容される塩の形で用いられ
る。 次に本発明のNK84−0218の生物活性について
示す。 １ 抗菌スペクトル NK84−0218の0.5％ペプトン寒天平板希釈法
よる抗菌スペクトルを第２表に示す。 NK84−0218は第２表に示すようにグラム陽
性菌スタフイロコツカス・アウレウス
FDA209P、バチルス・ズブチリスPCI219、バ
チルス・セレウスIAM1072などバチルス属お
よびミクロコツカス・フラプスATCC10240に
対し極めて強い発育阻止作用を示すがグラム陰
性菌はその作用を示さない。
は液体培地では生育しにくいので寒天培地で行つ
た。 以上の各所見をもとにパージエイズ・マニユア
ル・オブ・デターミナテイブ・バクテリオロジ
ー、第８版を参照した結果、バチルス・メガテリ
ウムに属する一菌株であることが明らかになり、
本菌株をバチルス・メガテリウムNK84−0218
（Bacillus megaterium NK84−0218）と命名し
た。 本発明に用いるバチルス・メガテリウムに属す
る菌株は他のバチルス属の菌株と同様、その性状
が変化しやすく、例えば紫外線、エツクス線およ
び薬品など用いる人工的変異手段で容易に変異し
うるものであり、どの様な変異株であつても本発
明の対象とする抗生物質NK84−0218の生産能を
有るものはすべて本発明に使用することができ
る。 本発明によりNK84−0218を製造するには、先
ず前記菌株を細菌の培養が利用し得る栄養物を含
有する培地で好気的に培養する。栄養源として
は、従来から細菌に利用されている公知のものが
使用でき、例えば、炭素源としてはグルコース、
フラクトース、グリセリン、シユクロース、デキ
ストリン、ガラクトース、有機酸など単独かまた
は組み合せて用いることができる。無機および有
機窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモ
ニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硫酸ナトリウ
ム、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵
母、コーン・スチープ・リカー、大豆粉、綿実油
カス、カザミノ酸、バクトソイトン、ソリユプ
ル・ベジタブル・プロテイン、オートミールなど
を単独または組み合せて用いることができる。そ
の他必要に応じて食塩、炭酸カルシウム、硫酸マ
グネシウム、硫酸銅、硫酸鉄、硫酸亜鉛、塩化マ
ンガン、燐酸塩などの無機塩類を加えることがで
きるほか有機物、たとえばアミノ酸類、ビタミン
類、核酸類や無機物を適当に添加することができ
る。 培養法としては液体培養法、特に深部撹拌培養
法が最も適している。培養温度は20〜45℃、PHは
微酸性ないし微アルカリ性で培養を行うことが望
ましい。液体培養では通常１〜４日間培養を行う
とNK84−0218物質が培養液中に生成蓄積され
る。培養液中の生成量が最大に達したとき培養を
停止し、菌体を別して得られる培養液中より目
的物を精製単離する。 なお培養液中のNK84−0218の生成量は高速液
体クロマトクラフイー〔条件、カラム：
Nucleogil5C18，4.6φ×250mm、溶媒系：0.1Mク
エン酸バツフア（PH4.0）−アセトニトリル−メタ
ノール＝100：４：２、流速：0.8ml／min、21
℃，259nm〕にて測定した。 培養液から本物質の精製単離には一般に微生
物代謝生産物をその培養液から単離する為に用い
られる分離精製の方法が利用される。NK84−
0218は水、メタノール、ジメチルスルホキサイド
に溶けるがプロパノール、アセトンをはじめとす
る一般有機溶媒に不溶ないしは溶けにくい物質
で、その精製はいわゆる核酸系抗生物質の精製に
用いられる方法により行われる。すなわち活性炭
およびイオン交換樹脂よる吸脱着法、アビセル
、セフアデツクス 類のカラムクロマトグラフ
イーなどの方法を適当に組み合せて用いることが
できる。例えば培養液をPH3.5〜6.5好ましくは
PH４〜4.5に調整したのち、活性炭末に吸着させ、
水洗後50％アセトン水溶出し、活性区分を濃縮後
凍結乾燥する。得られた茶褐色の粗粉末をメタノ
ールで不溶部分を除去し、可溶物を乾燥後水に溶
解し、活性炭末カラムに吸着後水洗し、水と50％
アセトン水によるアセトンの直線濃度勾配溶出法
により溶出し、活性区分を濃縮後凍結乾燥する。
得られた薄茶色のNK84−0218を含有する粗粉末
を少量の水に溶かし、アビセルカラムに充填した
後、含水アルコールにて展開し、水含量を段階的
にたかめることにより溶出し、活性区分を集め、
濃縮後凍結乾燥する。次にこの粉末を極く少量の
水に溶かし、予め0.02Mの食塩水で平衡化した
SPセフアデツクス Ｃ−25（Na+）に充填し、
0.02M食塩水で活性区分を溶出し、活性炭末にて
脱塩することにより無色の粉末を得る。この精製
粉末を水または含水アルコールにて処理し、
NK84−0218の無色の針状結晶が得られる。尚簡
便法として培養中の力価は枯草菌（Bacillus
subtilis PCI 219）の平板よるカツプアツセイ法
にて測定した。 又、次の方法によつても本物質を精製単離でき
る。即ち、培養液をPH４〜4.5に調整したのち、
強酸性陽イオン交換樹脂に吸着させ、水洗後、希
アンモニア水にて溶出し、抗菌活性を有する
NK84−0218を含有する活性区分を得る。次にこ
の活性区分を集め中和後、吸着樹脂に通塔し、水
洗したのち、含水メタノールで溶出し、活性区分
を減圧下濃縮することによりNK84−0218を含む
粗粉末を得る。得られた粗粉末のメタノール可溶
部よりメタノールを減圧下で除去したのち弱酸性
陽イオン交換樹脂に通塔し水洗後希アンモニア水
にて溶出する。得られた活性区分を集め減圧下で
濃縮してアンモニアを除いたのち氷室にて１液放
置することによりNK84−0218の粗結晶が得ら
れ、水にて再結晶することによりNK84−0218の
無色の針状結晶を得る。 以上のようにして得られたNK84−0218の理化
学的性状を次に示す。 (1) 外 観 無色の針状結晶 (2) 元素分析（％）（C10H13O3N5・H2Oとして） Ｃ Ｈ Ｏ Ｎ 理論値 44.60 5.42 2.377 26.01 実測値 44.75 5.58 2.365 25.98 (3) 分子式（分子量） C10H13O3N5（251・24） (4) 融 点 197℃ (5) 比旋光度 〔α〕20/D＝−44.3゜（Ｃ 0.21、ピリジン） (6) 紫外線吸収スペクトル 紫外線吸収スペクトルを第１図に示す。 水、0.1N塩酸および0.1N水酸化ナトリウム溶
液中の紫外吸収と分子吸光係数値はそれぞれ λH 2 O/max（logε）＝259nm（4.10） λ0.1N/max HCl（logε）＝257nm（4.09） λ0.1N/max NaOH（logε）＝259nm（4.11） (7) 赤外線吸収スペクトル 臭化カリウム錠にて測定した赤外線吸収スペ
クトルを第２図に示す。その吸収極大値（波数
cm-1）を以下に示す。 3470，3420，3325，3200，2925，2890，
1655，1615，1587，1565，1548，1510，1490，
1455，1440，1430，1388，1370，1333，1317，
1300，1257，1230，1200，1165，1130，1100，
1045，1030，1010，975，955，910，860，810，
795，743。 (8) 溶剤に対する溶解性 水、メタノール、エタノール、ジメチルスル
ホキサイドに溶けるがプロパノール、アセト
ン、酢酸エチル、エーテルおよびベンゼンなど
の有機溶媒には不溶ないし溶けにくい。 (9) 呈色反応 ライドン・スミス反応、10％硫酸各反応に陽
性、ニンヒドリン反応、坂口氏反応は共に陰性
を示す。 (10) 薄層クロマトグラフイーのRf値 シリカゲル薄層（Kiesel gel 60 F254 0.25
mmMerck）を使用し、ｎ−ブタノール：酢
酸：水（４：１：２）およびｎ−ブタノール：
28％アンモニア水：水（10：0.5：１）の各展
開溶媒系で展開することによりRf＝0.51および
0.48を示す。 1H−核磁気共鳴スペクトル 重ジメチルスルホキサイド中テトラメチルシ
ランを内部基準にして測定した1H−核磁気共
鳴スペクトルを第３図に示す。 13C−核磁気共鳴スペクトル 重水中ジオキサン（δ67.4）を内部基準にし
て測定した13C−核磁気共鳴スペクトルの化学
シフト（δ−値）は 156.4，153.5，149.3，141.5，119.4，82.6，
80.1，63.3，59.9，45.4。 以上のデーター及び臭素酸塩の結晶のＸ線回折
のデーターよりNK84−0218の構造は式(1)の2′R，
3′R，4′Sの絶対配置を有する。 本発明のNK84−0218は後記の如く抗菌剤抗ウ
イルス剤および制癌剤などの医薬品として期待さ
れるものである。医薬品として使用する場合の製
剤化および投与方法は従来公知の種々の方法が適
用できる。すなわち、投与方法としては注射、経
口、直腸投与などが可能である。製剤形態として
は注射剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、坐薬などの形
態がとり得る。 製剤化の際にはNK84−0218に悪影響を与えな
い限り、医薬用に用いられる種々の補助剤、すな
わち、担体やその他の助剤、例えば安定剤、防腐
剤、無痛化剤、乳化剤等が必要に応じて使用され
うる。 製剤において、NK84−0218の含量は製剤形態
等により広範囲に変えることが可能であり、一般
にはNK84−0218を0.01〜100％（重量）、好まし
くは0.1〜70％（重量）含有し、残りは通常医薬
用に使用される担体その他の補助剤からなる。 NK84−0218の投与量は症状等より異なるが、
成人１人１日当り0.01〜800mg程度である。連投
を必要とする場合には１日当りの使用量をおさえ
ることが好ましい。 NK84−0218の製剤化には、通常、塩酸塩や硫
酸塩などの医薬用に許容される塩の形で用いられ
る。 次に本発明のNK84−0218の生物活性について
示す。 １ 抗菌スペクトル NK84−0218の0.5％ペプトン寒天平板希釈法
よる抗菌スペクトルを第２表に示す。 NK84−0218は第２表に示すようにグラム陽
性菌スタフイロコツカス・アウレウス
FDA209P、バチルス・ズブチリスPCI219、バ
チルス・セレウスIAM1072などバチルス属お
よびミクロコツカス・フラプスATCC10240に
対し極めて強い発育阻止作用を示すがグラム陰
性菌はその作用を示さない。
【表】
【表】
２ 抗HeLa活性
次にNK84−0218の抗HeLa細胞活性につい
て調べた結果を第３表に示す。
て調べた結果を第３表に示す。
【表】
数
この表から明らかなように本発明のNK84−
0218の抗HeLa活性値（IC50）は約47.0μg／mlで
ある。 ３ 抗ウイルス活性 96穴（Well）のマイクロプレートを使用し、
Vero細胞の一重層上にNK84−0218の一定量
を含む培地およびヘルスペス−１型（HGV−
Ｉ）５〜10TCID50を加え、37℃、５％（Ｖ／
Ｖ）炭酸ガスフ卵器中にて96〜120時間培養し
たのち、顕微鏡下でVero細胞に対するHSV−
ＩのCPE（cytopathic effect）の観察により抗
ウイルス活性を測定した。 結果を第４表に示す。
この表から明らかなように本発明のNK84−
0218の抗HeLa活性値（IC50）は約47.0μg／mlで
ある。 ３ 抗ウイルス活性 96穴（Well）のマイクロプレートを使用し、
Vero細胞の一重層上にNK84−0218の一定量
を含む培地およびヘルスペス−１型（HGV−
Ｉ）５〜10TCID50を加え、37℃、５％（Ｖ／
Ｖ）炭酸ガスフ卵器中にて96〜120時間培養し
たのち、顕微鏡下でVero細胞に対するHSV−
ＩのCPE（cytopathic effect）の観察により抗
ウイルス活性を測定した。 結果を第４表に示す。
【表】
但しウエル中にCPEが観察されないものを有
効とし、例えば同濃度で10ケのウエル中１ケに
CPEが観察された場合を90％阻害率とする。 この表から明らかなように本発明のNK84−
0218は抗ウイルス作用を有している。 マウスに対するNK84−0218の急性毒性値
（LD50）は100mg／Kg（iv）以上を示し、公知の
種々の核酸系抗生物質に比較して弱い毒性値を示
した。 以上の結果から明らかのように本発明のNK84
−0218は抗ウイルス活性、抗腫瘍活性及び黄色ブ
ドウ状球菌、枯草菌などのグラム陽性菌に対する
抗菌活性を有し、かつ従来の核酸系抗生物質とそ
の化学構造をかなり異にすることから新たな作用
機作を有する医薬用製剤、例えば新規抗ウイルス
剤、新規抗菌剤、および新規制癌剤として期待で
きるものである。 以下本発明の実施例を示すが、これは単なる一
例示であつて何等本発明を限定するものではな
く、種々の変法が可能である。 実施例 １ レツプロ型振盪機用500ml容坂口氏型フラスコ
に、溶性デンプン２％、グルコース0.5％、ペプ
トン0.5％、酵母エキス0.5％、燐酸第２カリウム
0.05％、硫酸マグネシウム0.05％、大豆粉0.5％の
培地（PH7.2）を調製後炭酸カルシウム0.2％別途
加えた培地100mlを分注し、120℃、20分間オート
クレープ減菌した。これにNK84−0218株（微工
研条寄919号）の１白金耳を接種し、28℃、130
回／分、１日間振盪培養した。これとは別にロー
タリー型振盪機用500ml容三角フラスコにガラク
トース２％、デキストリン２％、バクト・ソイト
ン（Difco社）1.0％、コーン・スチーブ・リカー
（味ノ素kk）0.5％、硫酸アンモニウム0.2％、炭
酸カルシウム0.2％の培地（PH7.4）100mlを分注
し、120℃20分間オートクレープ減菌したフラス
コに前記培養液２mlを移植し、27℃、192回転／
分の条件下で４日間振盪培養した。培養液はPH
6.9で過し、液18を得た（培養力価はバチ
ルス・ズブチリスPCI219を被検菌とするペプト
ン寒天平板よるカツプ法にておこない、培養液
を1U／mlとした）。活性炭末 （和光純薬kk：
クロマト用）1200mlを充填したカラムにこの液
を通し、NK84−0218を吸着させ、水洗後、水お
よび50％アセトン水各2400mlよりなるアセトン直
線濃度勾配溶出法て溶出した。活性区分を進め、
減圧下で濃縮し、凍結乾燥することにより茶褐色
の粗粉末4.72g（0.6U／mg）を得た。次にこの粉末
を92mlのメタノールで処理し、不溶部を除去した
後、可溶部を減圧下で乾燥し、茶色の粗粉末
1.91g（2.0U／mg）を得た。これを47mlの水に溶か
し活性炭末150mlのカラムに吸着させ、水洗後、
水および50％アセトン水各300mlよりなるアセト
ン直線濃度勾配溶出法にて溶出し、活性区分を集
め、減圧下で濃縮し、凍結乾燥することより薄茶
色を帯びた粉末657mg（3.9U／mg）を得た。次に
この粉末を2.8mlの水に溶かし、予めｎ−プロパ
ノール：水（97.5：2.5）で平衡化したアビセル
600mlのカラムに充填し、ｎ−プロパノール：水
（97.5：2.5）1200ml、ついでｎ−プロパノール：
水（95：５）1200ml、さらにｎ−プロパノール：
水（90：10）1200mlで溶出し、活性区分を集め、
減圧下で濃縮し、凍結乾燥することにより薄黄色
を呈する粉末55.5mg（34.8U／mg）を得た。次に
この粉末を極く少量の水に溶かし、予め0.02M食
塩水で平衡化したSPセフアデツクス Ｃ−25
（Na+）460mlのカラムに充填し、上記食塩水で溶
出し、活性区分を集め、活性炭末にて脱塩操作を
行うことにより無色の粉末11.2mg（155.3U／mg）
を得た。この粉末を1.1mlの水に溶かした後一夜
室温にて放置することによりNK84−0218の無色
の針状結晶10.1mgを得た。 実施例 ２ ロータリー型振盪機用500ml容三角フラスコに、
溶性デンプン２％、グルコース0.5％、大豆粉
（プロリツチ）0.5％、ペプトン0.5％、酵母エキ
ス0.5％、リン酸第２カリウム0.05％、硫酸マグ
ネシウム0.05％、炭酸カルシウム0.2％の培地
（PH7.2）100mlを分注し、120℃、20分間オートク
レープ減菌した。これにバチルス・メガテリウム
NK84−0218（微工研条寄第919号）の１白金耳を
接種し、27℃、200回／分、18時間培養した。こ
れとは別にロータリー型振盪機用5000ml容三角フ
ラスコに上記培地800mlを分注し、120℃、20分間
オートクレープ減菌したフラスコへ前記培養液10
mlを移植し、同条件下で18時間培養した。さらに
これとは別に200−ステンレスタンクに溶性デ
ンプン2.0％、大豆粉（プロリツチ・味ノ素kk1.5
％リン酸第１カリウム0.3％、リン酸第２ナトリ
ウム0.2％、塩化コバルト0.0002％、硫酸第１鉄
0.0002％、硫酸マグネシウム0.05％の培地（PH
6.7）140を仕込み、120℃30分加圧蒸気減菌し
た中へ前記培養液2.4を無菌的に移植し培養温
度37℃、通気量2/3VVM、270回／分の条件にて
43時間通気撹拌培養した。培養終了液を80℃、５
分間熱処理したのち、室温まで冷却し、10％硫酸
にてPH3.8に調整した。次に過助剤（ダイカラ
イト（Dicalite Orient社）16Kgを添加し、菌体
を別した得られた液290（16.4μg／ml）を
Dowex 50W×８ （H+，19）のカラムに通
塔し、水洗後0.5N−NH4OH水200にて溶出し
た。得られたNK84−0218を含有する活性区分を
4N−HCl水にてPH9.5に調整し、Diaion HP−20
（10）のカラムに通塔し、水洗後、40％メタ
ノール水30で溶出し、活性区分を減圧下濃縮、
凍結乾燥することにより茶褐色を呈するNK84−
0218の粗粉末18.8g（199μg／mg）を得た。次にこ
の粉末にメタノール380mlを加え、室温にて１〜
２時間撹拌したのち、メタノール可溶部を減圧下
でメタノールを除去し水を加え、２％水溶液に調
製したのち、Amberlite IRC−50 （H+，500
ml）のカラムに通塔し、水洗後、0.5N−NH4OH
水にて溶出した。活性区分を減圧下で濃縮し、氷
室にて一夜放置することによりNK84−0218の粗
結晶3.16g（950μg／mg）を得た。次にこの粗結晶
に水130mlを加え、40〜45℃に加温溶解したのち、
氷室にて一夜放置することによりNK84−0218の
無色の針状結晶2.85gを得た。尚NK84−0218の
結晶１mgを1000μgとする。 製剤例 １ 化合物(1)30重量部に対し精製水を加え全量を
2000部としてこれを溶解後ミリポアフイルター
GSタイプを用いて除菌過する。 この液2gを10mlのバイアル瓶にとり凍結乾
燥し、１バイアルに化合物(1)の塩酸塩30mgを含む
凍結乾燥注射剤を得た。 製剤例 ２ 顆粒剤 化合物(1)50重量部、乳糖600部、結晶セルロー
ス330部及びヒドロキシプロピルセルロース20部
をよく混和し、ロール型圧縮機（ローラーコンパ
クター ）を用いて圧縮し、破砕して16メツシユ
と60メツシユの間に入るよう篩過し、顆粒とし
た。 製剤例 ３ 錠 剤 化合物(1)30重量部、結晶乳糖120部、結晶セル
ロース147部及びステアリン酸マグネシウム３部
をＶ型混合機で打錠し、１錠300mgの錠剤を得た。
効とし、例えば同濃度で10ケのウエル中１ケに
CPEが観察された場合を90％阻害率とする。 この表から明らかなように本発明のNK84−
0218は抗ウイルス作用を有している。 マウスに対するNK84−0218の急性毒性値
（LD50）は100mg／Kg（iv）以上を示し、公知の
種々の核酸系抗生物質に比較して弱い毒性値を示
した。 以上の結果から明らかのように本発明のNK84
−0218は抗ウイルス活性、抗腫瘍活性及び黄色ブ
ドウ状球菌、枯草菌などのグラム陽性菌に対する
抗菌活性を有し、かつ従来の核酸系抗生物質とそ
の化学構造をかなり異にすることから新たな作用
機作を有する医薬用製剤、例えば新規抗ウイルス
剤、新規抗菌剤、および新規制癌剤として期待で
きるものである。 以下本発明の実施例を示すが、これは単なる一
例示であつて何等本発明を限定するものではな
く、種々の変法が可能である。 実施例 １ レツプロ型振盪機用500ml容坂口氏型フラスコ
に、溶性デンプン２％、グルコース0.5％、ペプ
トン0.5％、酵母エキス0.5％、燐酸第２カリウム
0.05％、硫酸マグネシウム0.05％、大豆粉0.5％の
培地（PH7.2）を調製後炭酸カルシウム0.2％別途
加えた培地100mlを分注し、120℃、20分間オート
クレープ減菌した。これにNK84−0218株（微工
研条寄919号）の１白金耳を接種し、28℃、130
回／分、１日間振盪培養した。これとは別にロー
タリー型振盪機用500ml容三角フラスコにガラク
トース２％、デキストリン２％、バクト・ソイト
ン（Difco社）1.0％、コーン・スチーブ・リカー
（味ノ素kk）0.5％、硫酸アンモニウム0.2％、炭
酸カルシウム0.2％の培地（PH7.4）100mlを分注
し、120℃20分間オートクレープ減菌したフラス
コに前記培養液２mlを移植し、27℃、192回転／
分の条件下で４日間振盪培養した。培養液はPH
6.9で過し、液18を得た（培養力価はバチ
ルス・ズブチリスPCI219を被検菌とするペプト
ン寒天平板よるカツプ法にておこない、培養液
を1U／mlとした）。活性炭末 （和光純薬kk：
クロマト用）1200mlを充填したカラムにこの液
を通し、NK84−0218を吸着させ、水洗後、水お
よび50％アセトン水各2400mlよりなるアセトン直
線濃度勾配溶出法て溶出した。活性区分を進め、
減圧下で濃縮し、凍結乾燥することにより茶褐色
の粗粉末4.72g（0.6U／mg）を得た。次にこの粉末
を92mlのメタノールで処理し、不溶部を除去した
後、可溶部を減圧下で乾燥し、茶色の粗粉末
1.91g（2.0U／mg）を得た。これを47mlの水に溶か
し活性炭末150mlのカラムに吸着させ、水洗後、
水および50％アセトン水各300mlよりなるアセト
ン直線濃度勾配溶出法にて溶出し、活性区分を集
め、減圧下で濃縮し、凍結乾燥することより薄茶
色を帯びた粉末657mg（3.9U／mg）を得た。次に
この粉末を2.8mlの水に溶かし、予めｎ−プロパ
ノール：水（97.5：2.5）で平衡化したアビセル
600mlのカラムに充填し、ｎ−プロパノール：水
（97.5：2.5）1200ml、ついでｎ−プロパノール：
水（95：５）1200ml、さらにｎ−プロパノール：
水（90：10）1200mlで溶出し、活性区分を集め、
減圧下で濃縮し、凍結乾燥することにより薄黄色
を呈する粉末55.5mg（34.8U／mg）を得た。次に
この粉末を極く少量の水に溶かし、予め0.02M食
塩水で平衡化したSPセフアデツクス Ｃ−25
（Na+）460mlのカラムに充填し、上記食塩水で溶
出し、活性区分を集め、活性炭末にて脱塩操作を
行うことにより無色の粉末11.2mg（155.3U／mg）
を得た。この粉末を1.1mlの水に溶かした後一夜
室温にて放置することによりNK84−0218の無色
の針状結晶10.1mgを得た。 実施例 ２ ロータリー型振盪機用500ml容三角フラスコに、
溶性デンプン２％、グルコース0.5％、大豆粉
（プロリツチ）0.5％、ペプトン0.5％、酵母エキ
ス0.5％、リン酸第２カリウム0.05％、硫酸マグ
ネシウム0.05％、炭酸カルシウム0.2％の培地
（PH7.2）100mlを分注し、120℃、20分間オートク
レープ減菌した。これにバチルス・メガテリウム
NK84−0218（微工研条寄第919号）の１白金耳を
接種し、27℃、200回／分、18時間培養した。こ
れとは別にロータリー型振盪機用5000ml容三角フ
ラスコに上記培地800mlを分注し、120℃、20分間
オートクレープ減菌したフラスコへ前記培養液10
mlを移植し、同条件下で18時間培養した。さらに
これとは別に200−ステンレスタンクに溶性デ
ンプン2.0％、大豆粉（プロリツチ・味ノ素kk1.5
％リン酸第１カリウム0.3％、リン酸第２ナトリ
ウム0.2％、塩化コバルト0.0002％、硫酸第１鉄
0.0002％、硫酸マグネシウム0.05％の培地（PH
6.7）140を仕込み、120℃30分加圧蒸気減菌し
た中へ前記培養液2.4を無菌的に移植し培養温
度37℃、通気量2/3VVM、270回／分の条件にて
43時間通気撹拌培養した。培養終了液を80℃、５
分間熱処理したのち、室温まで冷却し、10％硫酸
にてPH3.8に調整した。次に過助剤（ダイカラ
イト（Dicalite Orient社）16Kgを添加し、菌体
を別した得られた液290（16.4μg／ml）を
Dowex 50W×８ （H+，19）のカラムに通
塔し、水洗後0.5N−NH4OH水200にて溶出し
た。得られたNK84−0218を含有する活性区分を
4N−HCl水にてPH9.5に調整し、Diaion HP−20
（10）のカラムに通塔し、水洗後、40％メタ
ノール水30で溶出し、活性区分を減圧下濃縮、
凍結乾燥することにより茶褐色を呈するNK84−
0218の粗粉末18.8g（199μg／mg）を得た。次にこ
の粉末にメタノール380mlを加え、室温にて１〜
２時間撹拌したのち、メタノール可溶部を減圧下
でメタノールを除去し水を加え、２％水溶液に調
製したのち、Amberlite IRC−50 （H+，500
ml）のカラムに通塔し、水洗後、0.5N−NH4OH
水にて溶出した。活性区分を減圧下で濃縮し、氷
室にて一夜放置することによりNK84−0218の粗
結晶3.16g（950μg／mg）を得た。次にこの粗結晶
に水130mlを加え、40〜45℃に加温溶解したのち、
氷室にて一夜放置することによりNK84−0218の
無色の針状結晶2.85gを得た。尚NK84−0218の
結晶１mgを1000μgとする。 製剤例 １ 化合物(1)30重量部に対し精製水を加え全量を
2000部としてこれを溶解後ミリポアフイルター
GSタイプを用いて除菌過する。 この液2gを10mlのバイアル瓶にとり凍結乾
燥し、１バイアルに化合物(1)の塩酸塩30mgを含む
凍結乾燥注射剤を得た。 製剤例 ２ 顆粒剤 化合物(1)50重量部、乳糖600部、結晶セルロー
ス330部及びヒドロキシプロピルセルロース20部
をよく混和し、ロール型圧縮機（ローラーコンパ
クター ）を用いて圧縮し、破砕して16メツシユ
と60メツシユの間に入るよう篩過し、顆粒とし
た。 製剤例 ３ 錠 剤 化合物(1)30重量部、結晶乳糖120部、結晶セル
ロース147部及びステアリン酸マグネシウム３部
をＶ型混合機で打錠し、１錠300mgの錠剤を得た。
第１図はNK84−0218の紫外線吸収スペクトル
を示す。第２図は臭化カリウム錠として測定した
NK84−0218の赤外線吸収スペクトルを示す。第
３図はNK84−0218の重ジメチルスルホキサイド
中でテトラメチルシランを内部基準にして400M
Hzの装置で測定した1H−核磁気共鳴スペクトル
曲線を示す。
を示す。第２図は臭化カリウム錠として測定した
NK84−0218の赤外線吸収スペクトルを示す。第
３図はNK84−0218の重ジメチルスルホキサイド
中でテトラメチルシランを内部基準にして400M
Hzの装置で測定した1H−核磁気共鳴スペクトル
曲線を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 式 で表わされる新規抗生物質NK84−0218 ２ バチルス属に属し、抗生物質NK84−0218を
生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培
養物中に抗生物質NK84−0218を生成蓄積せし
め、これを採取することを特徴とする抗生物質
NK84−0218の製造法。 ３ 式 で表される新規抗生物質NK84−0218を有効成分
とする抗菌剤 ４ 式 で表される新規抗生物質NK84−0218を有効成分
とする抗ウイルス剤 ５ 式 で表される新規抗生物質NK84−0218を有効成分
とする抗腫瘍剤
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59-243172 | 1984-11-20 | ||
| JP24317284 | 1984-11-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61293992A JPS61293992A (ja) | 1986-12-24 |
| JPH035398B2 true JPH035398B2 (ja) | 1991-01-25 |
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ID=17099884
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60257690A Granted JPS61293992A (ja) | 1984-11-20 | 1985-11-19 | 新規抗生物質ｎｋ８４−０２１８、その製造法およびその医薬製剤 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4743689A (ja) |
| EP (1) | EP0182315B1 (ja) |
| JP (1) | JPS61293992A (ja) |
| DE (1) | DE3569245D1 (ja) |
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| NL6601640A (ja) * | 1965-02-11 | 1966-08-12 | ||
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- 1985-11-16 EP EP85114555A patent/EP0182315B1/en not_active Expired
- 1985-11-19 JP JP60257690A patent/JPS61293992A/ja active Granted
-
1987
- 1987-11-02 US US07/115,980 patent/US4904585A/en not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| US4743689A (en) | 1988-05-10 |
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