JPH0682453A - 免疫複合体転移技術の使用による改良免疫アッセイ - Google Patents
免疫複合体転移技術の使用による改良免疫アッセイInfo
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 免疫アッセイの感度と正確度を高める。
【構成】 分析物を、標識特異的結合剤および第１の固
相に可逆的に結合せしめられた特異的結合剤と反応せし
め、標識特異的結合剤−分析物−特異的結合剤−追加成
分−第１の固相複合体を形成する。標識特異的結合剤−
分析物を追加成分−第１の固相から分離して分離複合体
を形成する。分析物上のエピトープのエピトープによ
り、分離複合体を、第２の固相に結合せしめられた第２
の追加成分に再結合せしめる。第２の固相に結合せしめ
られた標識特異的結合剤の量を測定することにより分析
物の量を測定する。ここで分離方法は10分以下で完了せ
しめられる。
相に可逆的に結合せしめられた特異的結合剤と反応せし
め、標識特異的結合剤−分析物−特異的結合剤−追加成
分−第１の固相複合体を形成する。標識特異的結合剤−
分析物を追加成分−第１の固相から分離して分離複合体
を形成する。分析物上のエピトープのエピトープによ
り、分離複合体を、第２の固相に結合せしめられた第２
の追加成分に再結合せしめる。第２の固相に結合せしめ
られた標識特異的結合剤の量を測定することにより分析
物の量を測定する。ここで分離方法は10分以下で完了せ
しめられる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は免疫複合体転移技術の使
用による検定速度を高めた改良免疫アッセイに関するも
のである。
用による検定速度を高めた改良免疫アッセイに関するも
のである。
【０００２】
【従来の技術】過去30年に亘り、免疫化学アッセイはま
すます普及している。最も感度の高い免疫アッセイは、
固相（多相）免疫アッセイである。しかしながら、現在
検出可能な水準より低い水準で存在する分析物を検出す
るためには、そしてその分析物の濃度をより正確に検出
するためには、よりいっそう感度を増大せしめることが
望ましい。固相免疫アッセイの感度は、固相に対するト
レーサーの非特異的結合（ＮＳＢ）を含むいくつかの要
因により制限される。ＮＳＢは、固相表面に対するトレ
ーサーの直接の吸着、または固相の表面に吸着されたア
ッセイ混合物の非特異的成分への結合による間接の吸着
のいずれかの結果である。これらの非特異的成分は、定
量される物質とは少なくとも部分的に異なっているが、
そのトレーサーへの親和性は有するものである。非特異
的成分の吸着は、感度の減少および正確度の減少につな
がる。ＮＳＢを減少せしめる１つの方法は、免疫複合体
転移（ＩＣＴ）と呼ばれる方法を用いることであり、こ
の方法はイシカワにより開拓された（イシカワら、185
クリニカケミカアクタ(1989)223 ；コーノら、22クリン
バイオケム(1989)277 を参照）。
すます普及している。最も感度の高い免疫アッセイは、
固相（多相）免疫アッセイである。しかしながら、現在
検出可能な水準より低い水準で存在する分析物を検出す
るためには、そしてその分析物の濃度をより正確に検出
するためには、よりいっそう感度を増大せしめることが
望ましい。固相免疫アッセイの感度は、固相に対するト
レーサーの非特異的結合（ＮＳＢ）を含むいくつかの要
因により制限される。ＮＳＢは、固相表面に対するトレ
ーサーの直接の吸着、または固相の表面に吸着されたア
ッセイ混合物の非特異的成分への結合による間接の吸着
のいずれかの結果である。これらの非特異的成分は、定
量される物質とは少なくとも部分的に異なっているが、
そのトレーサーへの親和性は有するものである。非特異
的成分の吸着は、感度の減少および正確度の減少につな
がる。ＮＳＢを減少せしめる１つの方法は、免疫複合体
転移（ＩＣＴ）と呼ばれる方法を用いることであり、こ
の方法はイシカワにより開拓された（イシカワら、185
クリニカケミカアクタ(1989)223 ；コーノら、22クリン
バイオケム(1989)277 を参照）。
【０００３】従来の多相免疫アッセイにおいて、定量す
る物質（分析物）は、標識特異的結合剤（トレーサー）
および未標識の固相固定化特異的結合剤により培養す
る。その培養に続いて、未反応トレーサーを除去するた
めに固相を洗浄し、三元複合系：固相−固定化特異的結
合剤／分析物／標識特異的結合剤に関連した信号を測定
する。この測定は、固相の存在下で行なわれ、それゆえ
ＮＳＢを含有する。一方で、ＩＣＴアッセイにおいて、
三元複合系は、固相から溶出され、固相とその関連ＮＳ
Ｂの不在の状態で測定される。ＮＳＢのいくらかは同様
に溶出されるので、ＩＣＴ方法において、標識複合体が
選択的に新たな固相に再捕捉される工程を含有すること
が好ましい。この結果、増大したＳＮ比およびより高い
アッセイ感度となる。
る物質（分析物）は、標識特異的結合剤（トレーサー）
および未標識の固相固定化特異的結合剤により培養す
る。その培養に続いて、未反応トレーサーを除去するた
めに固相を洗浄し、三元複合系：固相−固定化特異的結
合剤／分析物／標識特異的結合剤に関連した信号を測定
する。この測定は、固相の存在下で行なわれ、それゆえ
ＮＳＢを含有する。一方で、ＩＣＴアッセイにおいて、
三元複合系は、固相から溶出され、固相とその関連ＮＳ
Ｂの不在の状態で測定される。ＮＳＢのいくらかは同様
に溶出されるので、ＩＣＴ方法において、標識複合体が
選択的に新たな固相に再捕捉される工程を含有すること
が好ましい。この結果、増大したＳＮ比およびより高い
アッセイ感度となる。
【０００４】ＩＣＴ方法には、穏やかな条件下、すなわ
ち分析物と特異的標識結合剤との間の結合を壊すことの
ない条件下での免疫複合体の溶出が必要である。また、
溶出媒質および溶出条件は再捕捉工程を妨害してはなら
ない。イシカワらは、通常の永久の結合を用いるのでは
なく、固相特異的結合剤と固相との間に免疫化学的可逆
架橋を構成することによりこの困難を克服した。イシカ
ワらは、ジニトロフェニル残留物に対する抗体（抗−Ｄ
ＮＰ）を固相に永久に固定化し、それとは別にジニトロ
フェニル残留物を特異的結合剤に結合せしめ、次いでそ
の２つの試薬を結合せしめて固相−固定化特異的結合剤
を形成した。これにより、過剰のジニトロフェニル−リ
シン（ＤＮＰ−ｌｙｓ）の添加により壊される可逆免疫
結合が得られた。
ち分析物と特異的標識結合剤との間の結合を壊すことの
ない条件下での免疫複合体の溶出が必要である。また、
溶出媒質および溶出条件は再捕捉工程を妨害してはなら
ない。イシカワらは、通常の永久の結合を用いるのでは
なく、固相特異的結合剤と固相との間に免疫化学的可逆
架橋を構成することによりこの困難を克服した。イシカ
ワらは、ジニトロフェニル残留物に対する抗体（抗−Ｄ
ＮＰ）を固相に永久に固定化し、それとは別にジニトロ
フェニル残留物を特異的結合剤に結合せしめ、次いでそ
の２つの試薬を結合せしめて固相−固定化特異的結合剤
を形成した。これにより、過剰のジニトロフェニル−リ
シン（ＤＮＰ−ｌｙｓ）の添加により壊される可逆免疫
結合が得られた。
【０００５】イシカワらによる固相試薬のような固相固
定化抗−ＤＮＰ／ジニトロフェニル化特異的結合剤の使
用によりうまくＮＳＢを減少させたけれども、その方法
には２つの欠点がある：その主な難点は溶出工程に必要
とされるＤＮＰ−ｌｙｓによる長々しい培養である。分
析物と標識特異的結合剤との間の結合の時間依存性解離
による感度の最小限の損失およびより迅速なアッセイ結
果の両方を得るために、この工程の培養時間を減少する
ことが強く望まれている。第２の難点は、増大した複雑
さ、費用並びに免疫化学架橋の構成に関連した不安定で
ある。
定化抗−ＤＮＰ／ジニトロフェニル化特異的結合剤の使
用によりうまくＮＳＢを減少させたけれども、その方法
には２つの欠点がある：その主な難点は溶出工程に必要
とされるＤＮＰ−ｌｙｓによる長々しい培養である。分
析物と標識特異的結合剤との間の結合の時間依存性解離
による感度の最小限の損失およびより迅速なアッセイ結
果の両方を得るために、この工程の培養時間を減少する
ことが強く望まれている。第２の難点は、増大した複雑
さ、費用並びに免疫化学架橋の構成に関連した不安定で
ある。
【０００６】
【発明の構成】本発明は、イシカワらにより用いられた
方法よりもいっそう早く実施できる方法により、免疫化
学アッセイにおいて非特異的結合を減少するのに有効で
あることが分かった方法に関するものである。この技術
は、リポソームのような親油性架橋の使用、または抗体
もしくは抗−イディオタイプ抗体の使用により固相から
の抗原−抗体複合体の溶出、または異種可逆架橋の使用
を含む。
方法よりもいっそう早く実施できる方法により、免疫化
学アッセイにおいて非特異的結合を減少するのに有効で
あることが分かった方法に関するものである。この技術
は、リポソームのような親油性架橋の使用、または抗体
もしくは抗−イディオタイプ抗体の使用により固相から
の抗原−抗体複合体の溶出、または異種可逆架橋の使用
を含む。
【０００７】免疫複合体転移（ＩＣＴ）は、免疫アッセ
イにおいて非特異的結合（ＮＳＢ）を減少せしめるため
に最初にイシカワらにより用いられた技術である。ＮＢ
Ｓの変動はバックグラウンドのノイズを構成し、このノ
イズが除去されたり、減少される場合には、ＳＮ比を増
大せしめ、それゆえ感度を増大させ、より低い分析物の
濃度の検出を可能にする。イシカワらが用いた免疫複合
体の溶出方法は遅く（１−４時間）扱いにくいので、本
発明において開発した３つの新たなＩＣＴシステムは著
しい改善を示す。
イにおいて非特異的結合（ＮＳＢ）を減少せしめるため
に最初にイシカワらにより用いられた技術である。ＮＢ
Ｓの変動はバックグラウンドのノイズを構成し、このノ
イズが除去されたり、減少される場合には、ＳＮ比を増
大せしめ、それゆえ感度を増大させ、より低い分析物の
濃度の検出を可能にする。イシカワらが用いた免疫複合
体の溶出方法は遅く（１−４時間）扱いにくいので、本
発明において開発した３つの新たなＩＣＴシステムは著
しい改善を示す。
【０００８】ＩＣＴのこの検討中（実施例を含む）、ほ
とんどの分析物が抗原である場合について述べられてい
るが、その記載は、分析物が抗体である場合にも適用で
きることに注意されたい。分析物が抗原である場合、両
方の特異的結合剤が抗体であり、分析物が抗体である場
合、両方の特異的結合剤が抗原（または抗イディオタイ
プ抗原または遺伝的に産生された抗原のような抗原擬態
者）であるかまたは１つの特異的結合剤が抗原であり他
方が抗体である。これは、この主な意図がＩＣＴ反応機
構を検討するという事実の結果であり、分析物が抗原で
あるかまたは抗体であるかにはほとんど違いはない。こ
こでは抗原と抗体の両者をさすために「特異的結合剤」
という用語を用い、「結合パートナー」はまた「特異的
結合剤」の同意語として文献中に用いられていることに
も注意されたい。
とんどの分析物が抗原である場合について述べられてい
るが、その記載は、分析物が抗体である場合にも適用で
きることに注意されたい。分析物が抗原である場合、両
方の特異的結合剤が抗体であり、分析物が抗体である場
合、両方の特異的結合剤が抗原（または抗イディオタイ
プ抗原または遺伝的に産生された抗原のような抗原擬態
者）であるかまたは１つの特異的結合剤が抗原であり他
方が抗体である。これは、この主な意図がＩＣＴ反応機
構を検討するという事実の結果であり、分析物が抗原で
あるかまたは抗体であるかにはほとんど違いはない。こ
こでは抗原と抗体の両者をさすために「特異的結合剤」
という用語を用い、「結合パートナー」はまた「特異的
結合剤」の同意語として文献中に用いられていることに
も注意されたい。
【０００９】この出願を通じて用いられるいくつかの用
語を、それらの意味を明確にするために定義する。(1)
異種は、抗体と反応するのに用いられる抗原を意味し、
その抗原は、抗体を産生するのに用いられる抗原とは同
一ではない抗原である。それゆえ、異種抗原は元の抗原
とはいくらか化学的類似性を有していても、その抗体に
は低い親和性を有する。さらに、異種はまた、抗原と抗
体は別として他の反応ぺアーにも適用される。例えば、
同種ペアーアビジン−ビオチンに類似した異種反応ペア
ーは反応ペアーイミノビオチン−アビジンである。(2)
抗イディオタイプ抗体は、第２の抗体の結合部位でまた
はその近くで第２の抗体に対して形成された抗体であ
る。(3) 免疫複合体は、１つの固相から解離されて、本
発明の主題である精製機構において第２の固相に再結合
せしめられた実態である。この解離から分かるように、
免疫複合体はある場合には、少なくとも１つの、標識を
含む特異的結合剤が結合せしめられる分析物からなる。
他の場合には、免疫複合体はさらに、分析物に結合せし
められた第２の特異的結合剤からなる。ある固相から別
の固相に移動する種は、分離複合体と称する。さらに、
ここに検討した全ての実施例は、分析物による第２の固
相への再結合を示す。しかしながら、第２の固相への再
結合はまた免疫複合体の別の成分によっても生じ得た。
さまざまな免疫複合体の組成および固相に結合せしめら
れる方法は、当業者にとって明確である。(4) 正確度は
干渉により生じた系の誤った減少を意味する。(5) 感度
は分析物の低水準を検出する能力をさす。
語を、それらの意味を明確にするために定義する。(1)
異種は、抗体と反応するのに用いられる抗原を意味し、
その抗原は、抗体を産生するのに用いられる抗原とは同
一ではない抗原である。それゆえ、異種抗原は元の抗原
とはいくらか化学的類似性を有していても、その抗体に
は低い親和性を有する。さらに、異種はまた、抗原と抗
体は別として他の反応ぺアーにも適用される。例えば、
同種ペアーアビジン−ビオチンに類似した異種反応ペア
ーは反応ペアーイミノビオチン−アビジンである。(2)
抗イディオタイプ抗体は、第２の抗体の結合部位でまた
はその近くで第２の抗体に対して形成された抗体であ
る。(3) 免疫複合体は、１つの固相から解離されて、本
発明の主題である精製機構において第２の固相に再結合
せしめられた実態である。この解離から分かるように、
免疫複合体はある場合には、少なくとも１つの、標識を
含む特異的結合剤が結合せしめられる分析物からなる。
他の場合には、免疫複合体はさらに、分析物に結合せし
められた第２の特異的結合剤からなる。ある固相から別
の固相に移動する種は、分離複合体と称する。さらに、
ここに検討した全ての実施例は、分析物による第２の固
相への再結合を示す。しかしながら、第２の固相への再
結合はまた免疫複合体の別の成分によっても生じ得た。
さまざまな免疫複合体の組成および固相に結合せしめら
れる方法は、当業者にとって明確である。(4) 正確度は
干渉により生じた系の誤った減少を意味する。(5) 感度
は分析物の低水準を検出する能力をさす。
【００１０】さらに、いくつかの選択肢により、それぞ
れが異なる化学種または異なる方法を用いるいくつかの
ＩＣＴサイクルを用いてさらにＮＳＢを減少させること
も可能である。例えば、放出し、ついで異種固相上に再
捕捉する、第１のサイクル中や、放出し、再び再捕捉す
る等の間に親油性架橋を用いることができる。
れが異なる化学種または異なる方法を用いるいくつかの
ＩＣＴサイクルを用いてさらにＮＳＢを減少させること
も可能である。例えば、放出し、ついで異種固相上に再
捕捉する、第１のサイクル中や、放出し、再び再捕捉す
る等の間に親油性架橋を用いることができる。
【００１１】固相試薬は、形成される抗原−抗体複合体
の分離を補助するために、常磁性粒子のような不溶性粒
子（固相とも称される）上に固定化された抗体（また
は、ある場合には抗原）からなる。ガラスビーズ、プラ
スチック反応ウェル等の他の不溶性マトリックスもまた
容認されると思われる。反応機構はまた、放射線活性標
識、ケミルミネッセンス標識、酵素連結免疫アッセイ標
識等のような標識の使用を含む。使用する標識のタイプ
は我々の検討においては厳密ではない。現在多くの標識
系が従来技術において知られており、将来多くの新たな
ものが発見されることは疑いの余地がない。別記しない
限りは、全ての標識系が容認されると思われる。抗体を
引き出すのに十分に大きな分子を産生するために、より
大きな分子に対する小さな分子の反応のような従来技術
において知られている技術をも検討する。これらの技術
の詳細はここでは示さないが、当業者にはよく知られて
いると思われる。
の分離を補助するために、常磁性粒子のような不溶性粒
子（固相とも称される）上に固定化された抗体（また
は、ある場合には抗原）からなる。ガラスビーズ、プラ
スチック反応ウェル等の他の不溶性マトリックスもまた
容認されると思われる。反応機構はまた、放射線活性標
識、ケミルミネッセンス標識、酵素連結免疫アッセイ標
識等のような標識の使用を含む。使用する標識のタイプ
は我々の検討においては厳密ではない。現在多くの標識
系が従来技術において知られており、将来多くの新たな
ものが発見されることは疑いの余地がない。別記しない
限りは、全ての標識系が容認されると思われる。抗体を
引き出すのに十分に大きな分子を産生するために、より
大きな分子に対する小さな分子の反応のような従来技術
において知られている技術をも検討する。これらの技術
の詳細はここでは示さないが、当業者にはよく知られて
いると思われる。
【００１２】この技術は免疫化学アッセイだけでなく、
多くの他の結合アッセイ、例えば、レセプターアッセイ
およびレクチンアッセイにも有用である（これらの場
合、特異的結合剤はレセプターまたはレクチンをさし、
他の限定の変更や関連事項の変更が必要となる）。しか
しながら、遺伝子プローブアッセイが行なわれる過酷な
条件が除去されない限りは、この技術はそのアッセイに
は用いられない。
多くの他の結合アッセイ、例えば、レセプターアッセイ
およびレクチンアッセイにも有用である（これらの場
合、特異的結合剤はレセプターまたはレクチンをさし、
他の限定の変更や関連事項の変更が必要となる）。しか
しながら、遺伝子プローブアッセイが行なわれる過酷な
条件が除去されない限りは、この技術はそのアッセイに
は用いられない。
【００１３】新たな方法には、追加の選択肢が用いられ
る。例えば、異種免疫化学架橋法において複合ペアーと
してＭＮＰ−抗ＤＮＰを用いるのに難点がある場合、イ
ミノビオチン−アビジンのような他の結合ぺアーを用い
ることができる。
る。例えば、異種免疫化学架橋法において複合ペアーと
してＭＮＰ−抗ＤＮＰを用いるのに難点がある場合、イ
ミノビオチン−アビジンのような他の結合ぺアーを用い
ることができる。
【００１４】別の選択肢は、分析物と固相との間に追加
の成分、例えば、リポソームのような親油性物質の存在
を含む。ある場合には、この追加の成分の部分は、分析
物が第１の固相から溶出されて第２の固相に再結合せし
められるときに分析物とともに除去される。別の選択肢
もこの分野の当業者にとっては明白である。
の成分、例えば、リポソームのような親油性物質の存在
を含む。ある場合には、この追加の成分の部分は、分析
物が第１の固相から溶出されて第２の固相に再結合せし
められるときに分析物とともに除去される。別の選択肢
もこの分野の当業者にとっては明白である。
【００１５】新たな技術の１つである、抗イディオタイ
プの使用は、イシカワ法の使用に際して遭遇するさらな
る不利な点、すなわち二次抗体を使用する必要性をなく
す。その抗イディオタイプ方法において、主な抗体は、
固相上に固定化され、それゆえ調製の労力を省き、より
安定であることが分かった。
プの使用は、イシカワ法の使用に際して遭遇するさらな
る不利な点、すなわち二次抗体を使用する必要性をなく
す。その抗イディオタイプ方法において、主な抗体は、
固相上に固定化され、それゆえ調製の労力を省き、より
安定であることが分かった。
【００１６】その新たなシステムにおいて発見された利
点は予期されなかった。従来の免疫アッセイにおいて、
固定化（未標識）抗体は固相にしっかりと結合せしめら
れる必要があり、さもなければアッセイを行なっている
最中または産生物の貯蔵中に解離する。アッセイを行な
っている最中に遭遇する問題は、過去には洗浄工程中に
最も顕著であって、一方産生物の貯蔵中の遭遇する問題
はそれらの商業的実行可能性を制限することであった。
イシカワのＤＮＰに見られる確実な結合は、発見された
遅い放出の原因であると思われる。新しいシステムは、
早い放出と、同時に機能的なアッセイとするのに十分に
確実な結合とを提供する。
点は予期されなかった。従来の免疫アッセイにおいて、
固定化（未標識）抗体は固相にしっかりと結合せしめら
れる必要があり、さもなければアッセイを行なっている
最中または産生物の貯蔵中に解離する。アッセイを行な
っている最中に遭遇する問題は、過去には洗浄工程中に
最も顕著であって、一方産生物の貯蔵中の遭遇する問題
はそれらの商業的実行可能性を制限することであった。
イシカワのＤＮＰに見られる確実な結合は、発見された
遅い放出の原因であると思われる。新しいシステムは、
早い放出と、同時に機能的なアッセイとするのに十分に
確実な結合とを提供する。
【００１７】３つの新しいＩＣＴシステムを開発した。
これらのシステムは、より速いということ（１分未満か
ら30分まで）とある場合には単純（試薬を製造するのが
容易）という点で過去の技術より改善されたものであ
る。各システムは新たな原理を使用する反応システムに
より説明される。しかしながら、そのシステムを説明す
るのに用いられる実施例は、ＩＣＴシステムの有用さま
たは範囲を限定するものと考えるべきではない。
これらのシステムは、より速いということ（１分未満か
ら30分まで）とある場合には単純（試薬を製造するのが
容易）という点で過去の技術より改善されたものであ
る。各システムは新たな原理を使用する反応システムに
より説明される。しかしながら、そのシステムを説明す
るのに用いられる実施例は、ＩＣＴシステムの有用さま
たは範囲を限定するものと考えるべきではない。
【００１８】異種架橋において、抗−ＤＮＰのような抗
−ハプテンは固相上に永久に固定化される。特異的結合
剤に関しては、同種ハプテン（ＤＮＰ）を結合せしめる
代りに、モノニトロフェニル残留物（ＭＮＰ）またはト
リニトロフェニル残留物（ＴＮＰ）のような異種ハプテ
ンを結合せしめる。この異種免疫化学架橋は驚いたこと
に免疫アッセイ試薬として作用するのに十分に安定であ
ることが発見され、しかし、過剰のＤＮＰ−ｌｙｓが添
加された場合には、同種架橋よりも早く壊される。以下
の反応機構および実施例１のアッセイの詳細の記載を参
照のこと。
−ハプテンは固相上に永久に固定化される。特異的結合
剤に関しては、同種ハプテン（ＤＮＰ）を結合せしめる
代りに、モノニトロフェニル残留物（ＭＮＰ）またはト
リニトロフェニル残留物（ＴＮＰ）のような異種ハプテ
ンを結合せしめる。この異種免疫化学架橋は驚いたこと
に免疫アッセイ試薬として作用するのに十分に安定であ
ることが発見され、しかし、過剰のＤＮＰ−ｌｙｓが添
加された場合には、同種架橋よりも早く壊される。以下
の反応機構および実施例１のアッセイの詳細の記載を参
照のこと。
【００１９】異種免疫化学架橋を含む第１の方法の反応
機構 ＣＫＭＢのアッセイのための試薬： １． 第１の固相 − 抗−ＣＫＭＭをＭＮＰに関して
誘導し、このＭＮＰは常磁性粒子上の抗−ＤＮＰに結合
する。抗−ＤＮＰとＭＮＰとの間の結合は可逆的であ
る。
機構 ＣＫＭＢのアッセイのための試薬： １． 第１の固相 − 抗−ＣＫＭＭをＭＮＰに関して
誘導し、このＭＮＰは常磁性粒子上の抗−ＤＮＰに結合
する。抗−ＤＮＰとＭＮＰとの間の結合は可逆的であ
る。
【００２０】２． トレーサー − 抗ＣＫＭＢをケミ
ルミネッセンス標識としてのアクリジニウムエステルに
関して誘導した。
ルミネッセンス標識としてのアクリジニウムエステルに
関して誘導した。
【００２１】３． 第２の固相 − 常磁性粒子上に固
定化された抗−ＣＫＢＢ。
定化された抗−ＣＫＢＢ。
【００２２】アッセイ方法： ａ． 第１の固相、分析物ＣＫＭＢおよびトレーサーを
培養してその固相上に免疫複合体を形成せしめる。
培養してその固相上に免疫複合体を形成せしめる。
【００２３】図１参照 （いくらかの省略形が図中で用いられていることに注意
する。Ｍ／ＢはＣＫ ＭＢを意味し、ここでＣＫはクレ
アチンキナーゼ；ＤＮＰはジニトロフェノールまたはジ
ニトロフェニルを意味する；ＭＮＰはモノニトロフェノ
ール；ＡＥはアクリジニウムエステルを意味する。） ｂ． 免疫複合体を、10分間のＤＮＰ−ｌｙｓの培養に
より第１の固相から溶出する。その免疫複合体は、第１
の固相（例えば、第１の試験管から移送される）から分
離されるか、あるいは、２つの固相は後に互いに分離さ
れる場合、例えば、１つの粒子が、磁性特性を有する
か、またはある別の物理特性において第１の粒子とは異
なる場合、第２の固相は第１の試験管に加えられる。
する。Ｍ／ＢはＣＫ ＭＢを意味し、ここでＣＫはクレ
アチンキナーゼ；ＤＮＰはジニトロフェノールまたはジ
ニトロフェニルを意味する；ＭＮＰはモノニトロフェノ
ール；ＡＥはアクリジニウムエステルを意味する。） ｂ． 免疫複合体を、10分間のＤＮＰ−ｌｙｓの培養に
より第１の固相から溶出する。その免疫複合体は、第１
の固相（例えば、第１の試験管から移送される）から分
離されるか、あるいは、２つの固相は後に互いに分離さ
れる場合、例えば、１つの粒子が、磁性特性を有する
か、またはある別の物理特性において第１の粒子とは異
なる場合、第２の固相は第１の試験管に加えられる。
【００２４】図２参照 ｃ． 溶出した免疫複合体を第２の固相により再捕捉し
てルミノメーター中で読み出す。
てルミノメーター中で読み出す。
【００２５】図３参照 異種構造の上述した説明はさておき、例えば、ルミネッ
センスマーカーとは別のマーカーおよび当業者にとって
明白な他変種を用いて、著しくシステムを変更すること
ができる。
センスマーカーとは別のマーカーおよび当業者にとって
明白な他変種を用いて、著しくシステムを変更すること
ができる。
【００２６】抗イディオタイプシステムにおいて、固相
固定化特異的結合剤は従来のアッセイにおけるように固
相上に永久に固定化でき、それゆえ可逆架橋を構成する
必要がなくなる。免疫複合体の溶出は、分析物に対する
抗体または抗イディオタイプ抗体または部分的分析物擬
態者またはそれらから誘導された断片の過剰の添加によ
り行なわれる。（部分的分析物擬態者は、未標識抗体上
の結合部位に関して分析物と競合でき、それ自体、未標
識抗体から分離する分析物を生じるように、分析物のエ
ピトープの部分を十分に含有する物質である。）以前
は、固相上に固定化された抗体と同一の抗体の溶液を添
加することにより、この目的に対しての試みが行なわれ
た。固相固定化抗体間の相互作用の強度のために、競合
抗体による置換は、数時間または数日のオーダーで非常
に遅いことがこれらの試みにより分かった。抗体／抗原
ペアーのあるまれな組合せに関して、30分以内の培養で
著しい溶出を達成できることが分かった。さらに驚いた
ことには、固定化抗体の抗イディオタイプ抗体が溶出剤
としてより速くそしてより能率的であることが分かっ
た。加えて驚いたことには、固定化抗体と同一の抗体を
添加する代わりに緊密に関連する抗体を加えた場合、溶
出はより速いことが分かった。加えて、分析物に対する
抗体と固相との間に可逆架橋を構成する必要がないの
で、このシステムは製造しやすい（以下の反応機構およ
び実施例２の詳細の記載を参照のこと）。
固定化特異的結合剤は従来のアッセイにおけるように固
相上に永久に固定化でき、それゆえ可逆架橋を構成する
必要がなくなる。免疫複合体の溶出は、分析物に対する
抗体または抗イディオタイプ抗体または部分的分析物擬
態者またはそれらから誘導された断片の過剰の添加によ
り行なわれる。（部分的分析物擬態者は、未標識抗体上
の結合部位に関して分析物と競合でき、それ自体、未標
識抗体から分離する分析物を生じるように、分析物のエ
ピトープの部分を十分に含有する物質である。）以前
は、固相上に固定化された抗体と同一の抗体の溶液を添
加することにより、この目的に対しての試みが行なわれ
た。固相固定化抗体間の相互作用の強度のために、競合
抗体による置換は、数時間または数日のオーダーで非常
に遅いことがこれらの試みにより分かった。抗体／抗原
ペアーのあるまれな組合せに関して、30分以内の培養で
著しい溶出を達成できることが分かった。さらに驚いた
ことには、固定化抗体の抗イディオタイプ抗体が溶出剤
としてより速くそしてより能率的であることが分かっ
た。加えて驚いたことには、固定化抗体と同一の抗体を
添加する代わりに緊密に関連する抗体を加えた場合、溶
出はより速いことが分かった。加えて、分析物に対する
抗体と固相との間に可逆架橋を構成する必要がないの
で、このシステムは製造しやすい（以下の反応機構およ
び実施例２の詳細の記載を参照のこと）。
【００２７】抗イディオタイプによる溶出を含む第２の
方法の反応機構 ＣＫＭＢのアッセイの試薬： １． 第１の固相 − 常磁性粒子上に固定化された抗
−ＣＫＢＢ。
方法の反応機構 ＣＫＭＢのアッセイの試薬： １． 第１の固相 − 常磁性粒子上に固定化された抗
−ＣＫＢＢ。
【００２８】２． トレーサー − アクリジニウムエ
ステルで標識した抗−ＣＫＭＢ。
ステルで標識した抗−ＣＫＭＢ。
【００２９】３． 第２の固相 − 常磁性粒子上に固
定化された抗−ＣＫＭＭ。
定化された抗−ＣＫＭＭ。
【００３０】アッセイ方法： ａ． 第１の固相、分析物ＣＫＭＢおよびトレーサーを
培養して、第１の固相上に免疫複合体を形成する。
培養して、第１の固相上に免疫複合体を形成する。
【００３１】図４参照 ｂ． 抗イディオタイプ抗体（抗−抗−ＣＫＢＢ）によ
る30分の培養により免疫複合体を第１の固相から溶出す
る。
る30分の培養により免疫複合体を第１の固相から溶出す
る。
【００３２】図５参照 ｃ． 第２の固相により溶出した免疫複合体を再捕捉し
てルミノメーター中で読み出す。
てルミノメーター中で読み出す。
【００３３】図６参照 本発明において開発した第３の架橋システムは親油性架
橋を含む。ある組成物のリポソーム、リポタンパク質、
エマルジョン、六方晶相、ミセル、二重層および単層の
ような親油性化合物の凝集物を、洗浄剤またはある酵素
により第２のシステム中に分散できる。リポソームまた
は固相と特異的結合剤との間の架橋のような親油性物質
の使用により、アッセイ中に安定な結合が得られる。次
いで洗浄剤の添加により迅速に免疫複合体が溶出する。
実施例として、以下にリポソームを用いたシステムの反
応機構を示し、リポソーム架橋を用いた詳細の結果を実
施例３に記載する。
橋を含む。ある組成物のリポソーム、リポタンパク質、
エマルジョン、六方晶相、ミセル、二重層および単層の
ような親油性化合物の凝集物を、洗浄剤またはある酵素
により第２のシステム中に分散できる。リポソームまた
は固相と特異的結合剤との間の架橋のような親油性物質
の使用により、アッセイ中に安定な結合が得られる。次
いで洗浄剤の添加により迅速に免疫複合体が溶出する。
実施例として、以下にリポソームを用いたシステムの反
応機構を示し、リポソーム架橋を用いた詳細の結果を実
施例３に記載する。
【００３４】リポソーム架橋を含む第３の方法の反応機
構 ＣＫＭＢのアッセイの試薬： １． 第１の固相 − 抗−ＣＫＭＭおよびＤＮＰ残留
物を共有結合でリポソームに結合せしめる。リポソーム
は免疫化学的に常磁性粒子上の抗−ＤＮＰに結合せしめ
る。
構 ＣＫＭＢのアッセイの試薬： １． 第１の固相 − 抗−ＣＫＭＭおよびＤＮＰ残留
物を共有結合でリポソームに結合せしめる。リポソーム
は免疫化学的に常磁性粒子上の抗−ＤＮＰに結合せしめ
る。
【００３５】２． トレーサー − アクリジニウムエ
ステルで標識した抗−ＣＫＭＢ。
ステルで標識した抗−ＣＫＭＢ。
【００３６】３． 第２の固相 − 常磁性粒子上に固
定化した抗−ＣＫＢＢ。
定化した抗−ＣＫＢＢ。
【００３７】アッセイ方法： ａ． 第１の固相、分析物ＣＫＭＢおよびトレーサーを
培養して固相上に免疫複合体を形成する 図７参照 ｂ． 0.1 ％のトリトンＸ−100 洗浄剤の１分間の培養
により免疫複合体を第１の固相から溶出する（その溶出
は実際には数秒で完了したが、アッセイは手動で行なわ
れたので１分以内でこの工程を終了することはできなか
った）。
培養して固相上に免疫複合体を形成する 図７参照 ｂ． 0.1 ％のトリトンＸ−100 洗浄剤の１分間の培養
により免疫複合体を第１の固相から溶出する（その溶出
は実際には数秒で完了したが、アッセイは手動で行なわ
れたので１分以内でこの工程を終了することはできなか
った）。
【００３８】図８参照 ｃ． 溶出した免疫複合体を第２の固相により再捕捉し
てルミノメーター中で読み出した。
てルミノメーター中で読み出した。
【００３９】図９参照
【００４０】
【実施例】以下は上述した進展の用途を例証するために
提供したものであるが、その有用さを限定することを意
図するものではない。
提供したものであるが、その有用さを限定することを意
図するものではない。
【００４１】（実施例１） 異種架橋 ａ． 単クローン性抗体の調製 コーラーおよびミルスタインによりネイチャー（ロンド
ン）256 巻、494-497頁、（1975）中に記載された方法
に従って、免疫化と続いてのＳｐ２／０−Ａｇ１４骨髄
腫細胞による脾細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）の融合
によりネズミ（菌株Ａ／Ｊ）中に単クローン性抗体を産
生した。所望の抗体を分泌する雑種細胞を、プリスタン
−プライムド（ｐｒｉｓｔａｎｅ−ｐｒｉｍｅｄ）ネズ
ミ（菌株ＣＡＦ）中の腹腔内に注射した。３−５週間後
にこれらのネズミから腹水を採取した。キットに付属の
プロトコールに従ってアフィ−ゲルタンパク質Ａ ＭＡ
ＰＳ ＩＩキット（ＣＡ94801 、リッチモンド、バイオ
−ラド ラボラトリーズ）を用いたタンパク質Ａカラム
クロマトグラフィーにより腹水から抗体を精製した。ウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）−接合ＤＮＰでの免疫化に
より２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）に対する単
クローン性抗体を調製した。クレアチンキナーゼアイソ
エンザイムＭＭ、ＢＢおよびＭＢに対する単クローンの
調製は、ピランらによりクリニカルケミストリー33巻、
1517-1520 頁（1987）に記載されている。
ン）256 巻、494-497頁、（1975）中に記載された方法
に従って、免疫化と続いてのＳｐ２／０−Ａｇ１４骨髄
腫細胞による脾細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）の融合
によりネズミ（菌株Ａ／Ｊ）中に単クローン性抗体を産
生した。所望の抗体を分泌する雑種細胞を、プリスタン
−プライムド（ｐｒｉｓｔａｎｅ−ｐｒｉｍｅｄ）ネズ
ミ（菌株ＣＡＦ）中の腹腔内に注射した。３−５週間後
にこれらのネズミから腹水を採取した。キットに付属の
プロトコールに従ってアフィ−ゲルタンパク質Ａ ＭＡ
ＰＳ ＩＩキット（ＣＡ94801 、リッチモンド、バイオ
−ラド ラボラトリーズ）を用いたタンパク質Ａカラム
クロマトグラフィーにより腹水から抗体を精製した。ウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）−接合ＤＮＰでの免疫化に
より２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）に対する単
クローン性抗体を調製した。クレアチンキナーゼアイソ
エンザイムＭＭ、ＢＢおよびＭＢに対する単クローンの
調製は、ピランらによりクリニカルケミストリー33巻、
1517-1520 頁（1987）に記載されている。
【００４２】ｂ． 常磁性粒子上への抗体の固定化 常磁性粒子（ＰＭＰ）をアドバンストマグネティク社か
ら購入した。次いで、その粒子をグルタルアルデヒドに
より活性化せしめ、グローマン、Ｅ．Ｖ．らによりバイ
オテクニックス、３巻、156 頁（1985）に記載されてい
る２段階グルタルアルデヒド法により様々な抗体に接合
した。
ら購入した。次いで、その粒子をグルタルアルデヒドに
より活性化せしめ、グローマン、Ｅ．Ｖ．らによりバイ
オテクニックス、３巻、156 頁（1985）に記載されてい
る２段階グルタルアルデヒド法により様々な抗体に接合
した。
【００４３】ｃ． 標識またはハプテンのタンパク質へ
の接合 以下のようにして抗体をアクリジニウムエステル（Ａ
Ｅ）で標識した：0.1 Ｍのリン酸ナトリウム、0.15Ｍの
塩化ナトリウム、ｐＨ8.0 中の250 μｇの抗体を、50μ
ｌのジメチルホルムアミド中の２′、６′、−ジメチル
１−４′−（Ｎ−サクシンイミジルカルボニル）フェニ
ルアクリジン−９−カルボキシル酸塩（0.4 ｍｇ）と混
合し、室温で15分間培養した。0.5 ｍｌのＤＬ−リシン
の10ｍｇ／ｍｌ溶液を混合物に加え、その混合物を、セ
ファデックスＧ−25の10ｍｌカラムを通過せしめるゲル
濾過により精製した。標識した抗体はカラムの溶媒容積
（ｖｏｉｄ ｖｏｌｕｍｅ）中に出現し、それを集積し
た。
の接合 以下のようにして抗体をアクリジニウムエステル（Ａ
Ｅ）で標識した：0.1 Ｍのリン酸ナトリウム、0.15Ｍの
塩化ナトリウム、ｐＨ8.0 中の250 μｇの抗体を、50μ
ｌのジメチルホルムアミド中の２′、６′、−ジメチル
１−４′−（Ｎ−サクシンイミジルカルボニル）フェニ
ルアクリジン−９−カルボキシル酸塩（0.4 ｍｇ）と混
合し、室温で15分間培養した。0.5 ｍｌのＤＬ−リシン
の10ｍｇ／ｍｌ溶液を混合物に加え、その混合物を、セ
ファデックスＧ−25の10ｍｌカラムを通過せしめるゲル
濾過により精製した。標識した抗体はカラムの溶媒容積
（ｖｏｉｄ ｖｏｌｕｍｅ）中に出現し、それを集積し
た。
【００４４】他の小さな分子を同様の方法で抗体に接合
した。Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド−活性化Ｎ−２、
４−ジニトロフェニル−ｂ−アラニンを用いてジニトロ
フェノール（ＤＮＰ）を接合し、Ｎ−ヒドロキシサクシ
ンイミド−活性化Ｎ−４−ニトロフェノール−ｂ−アラ
ニンを用いてモノニトロフェノール（ＭＮＰ）を接合し
た。
した。Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド−活性化Ｎ−２、
４−ジニトロフェニル−ｂ−アラニンを用いてジニトロ
フェノール（ＤＮＰ）を接合し、Ｎ−ヒドロキシサクシ
ンイミド−活性化Ｎ−４−ニトロフェノール−ｂ−アラ
ニンを用いてモノニトロフェノール（ＭＮＰ）を接合し
た。
【００４５】ｄ． 固相粒子からの接合抗体の放出 抗体に対して様々な比率の小分子を用いて、ＤＮＰとＭ
ＮＰをクレアチンキナーゼ−ＭＭ（ＣＫＭＭ）に対する
単クローン性抗体に接合した。抗体分子当たりのＤＮＰ
とＭＮＰ分子の数を、分光光度的に測定した。各接合抗
体をヨードゲン法を用いてヨウ素125 で放射線標識し
た。
ＮＰをクレアチンキナーゼ−ＭＭ（ＣＫＭＭ）に対する
単クローン性抗体に接合した。抗体分子当たりのＤＮＰ
とＭＮＰ分子の数を、分光光度的に測定した。各接合抗
体をヨードゲン法を用いてヨウ素125 で放射線標識し
た。
【００４６】各接合物の試料を、ＰＭＰに共有結合した
ＤＮＰに対する単クローン性抗体で培養した。室温での
１時間の培養後、ＰＭＰの抗体を磁気分離ラック（Ｍ
Ａ、ミッドフィールド、チバコーニングダイアグノウス
ティク社）により磁気的に分離し、１ｍｌの水で洗浄
し、５ｍＭのＤＮＰ−リシンの溶液で再懸濁せしめた。
ＤＮＰ−リシンにより室温での10分間の培養後、試料を
再度磁気的に分離して洗浄し、続いてガンマカウンター
中で計算し、ＤＮＰ−リシン溶液により行なわれた置換
の程度を測定した。
ＤＮＰに対する単クローン性抗体で培養した。室温での
１時間の培養後、ＰＭＰの抗体を磁気分離ラック（Ｍ
Ａ、ミッドフィールド、チバコーニングダイアグノウス
ティク社）により磁気的に分離し、１ｍｌの水で洗浄
し、５ｍＭのＤＮＰ−リシンの溶液で再懸濁せしめた。
ＤＮＰ−リシンにより室温での10分間の培養後、試料を
再度磁気的に分離して洗浄し、続いてガンマカウンター
中で計算し、ＤＮＰ−リシン溶液により行なわれた置換
の程度を測定した。
【００４７】以下の表に結果を示す： 10分間に放出された 小分子 抗体当たりの数 パーセント ＤＮＰ ６ １０．６ ＤＮＰ １２ ３．２ ＭＮＰ ８ ７３．１ ＭＮＰ １４ ６５．３ ＭＮＰ ２４ ８５．１ ｅ． 異種架橋を有するＣＫＭＢの免疫アッセイ ＰＭＰに抗−ＤＮＰ単クローン性抗体を共有結合せし
め、次いでこのＰＭＰをＣＫＭＭに対するＭＮＰ−誘導
単クローン性抗体と混合することにより抗−ＣＫＭＭ固
相を形成する。接合抗−ＤＫＭＭ単クローン性抗体が抗
−ＤＮＰ固相に結合する間の１時間の培養期間後、その
固相を磁気的に分離し洗浄する。一連の標準物、対照物
および患者の血清試料（各１ｍｌ）を、この固相にＡＥ
−標識単クローン性抗−ＣＫＭＢを加えたＰＢＳ／ＢＳ
Ａ緩衝液（50ｍＭのリン酸ナトリウム、150 ｍＭの塩化
ナトリウム、0.1 ％のＮａＮＯ3 、１ｍＭのエチレンジ
アミンテトラ酢酸、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミ
ン、ｐＨ7.4 ）により30分間培養する。次いで反応混合
物を磁気的に分離して洗浄し、未結合のＡＥ−標識抗体
を除去する。次いでＰＭＰ−結合免疫複合体を0.25ｍｌ
の５ｍＭ ＤＮＰ−リシン溶液と混合し、ここでこのＤ
ＮＰ−リシン溶液は、固定化抗−ＤＮＰからのＭＮＰ接
合抗体を置換することにより固相からの免疫複合体の放
出を開始せしめる。放出工程の10分後、試験管を３分間
磁気分離ラック上に配して固相を磁気的に分離し、放出
した標識免疫複合体を含有する0.2 ｍｌの上澄み液を吸
引し、ＰＭＰ−固定化抗−ＣＫＢＢ単クローン性抗体か
らなる新たな固相と結合せしめる。ＰＭＰ−抗−ＣＫＢ
ＢによるＡＥ−含有免疫複合体の捕捉に続いて、培養混
合物を磁気的に分離し、洗浄し、ＡＥ標識をルミノメー
ター中で測定する（ＭＡ、ミッドフィールド、チバコー
ニングダイアグノウシス社、マジックライトアナライザ
ー）。
め、次いでこのＰＭＰをＣＫＭＭに対するＭＮＰ−誘導
単クローン性抗体と混合することにより抗−ＣＫＭＭ固
相を形成する。接合抗−ＤＫＭＭ単クローン性抗体が抗
−ＤＮＰ固相に結合する間の１時間の培養期間後、その
固相を磁気的に分離し洗浄する。一連の標準物、対照物
および患者の血清試料（各１ｍｌ）を、この固相にＡＥ
−標識単クローン性抗−ＣＫＭＢを加えたＰＢＳ／ＢＳ
Ａ緩衝液（50ｍＭのリン酸ナトリウム、150 ｍＭの塩化
ナトリウム、0.1 ％のＮａＮＯ3 、１ｍＭのエチレンジ
アミンテトラ酢酸、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミ
ン、ｐＨ7.4 ）により30分間培養する。次いで反応混合
物を磁気的に分離して洗浄し、未結合のＡＥ−標識抗体
を除去する。次いでＰＭＰ−結合免疫複合体を0.25ｍｌ
の５ｍＭ ＤＮＰ−リシン溶液と混合し、ここでこのＤ
ＮＰ−リシン溶液は、固定化抗−ＤＮＰからのＭＮＰ接
合抗体を置換することにより固相からの免疫複合体の放
出を開始せしめる。放出工程の10分後、試験管を３分間
磁気分離ラック上に配して固相を磁気的に分離し、放出
した標識免疫複合体を含有する0.2 ｍｌの上澄み液を吸
引し、ＰＭＰ−固定化抗−ＣＫＢＢ単クローン性抗体か
らなる新たな固相と結合せしめる。ＰＭＰ−抗−ＣＫＢ
ＢによるＡＥ−含有免疫複合体の捕捉に続いて、培養混
合物を磁気的に分離し、洗浄し、ＡＥ標識をルミノメー
ター中で測定する（ＭＡ、ミッドフィールド、チバコー
ニングダイアグノウシス社、マジックライトアナライザ
ー）。
【００４８】（実施例２） 抗体および抗イディオタイプ： ａ． 単クローン性抗体の調製 実施例１の工程ａに記載したように、ネズミを、精製し
たヒトクレアチンキナーゼアイソエンザイムおよびヒト
甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）で免疫化することにより
クレアチンキナーゼアイソエンザイムとＴＳＨに対する
単クローン性抗体を調製した。実施例１の工程ｂおよび
ｃに記載したように、抗体を、ＡＥで標識し、またはＰ
ＭＰ上に固定化した。
たヒトクレアチンキナーゼアイソエンザイムおよびヒト
甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）で免疫化することにより
クレアチンキナーゼアイソエンザイムとＴＳＨに対する
単クローン性抗体を調製した。実施例１の工程ｂおよび
ｃに記載したように、抗体を、ＡＥで標識し、またはＰ
ＭＰ上に固定化した。
【００４９】抗−ＣＫＢＢ（ＣＡ８）に対する抗−イデ
ィオタイプ単クローン性抗体を以下のようにして調製し
た： 免疫原の調製：タンパク質Ａクロマトグラフィーにより
腹水から抗−ＣＫＢＢ（ＣＡ８）を精製した。精製した
抗体をペプシンで切断し、Ｆ（ａｂ）′２断片を産生し
た。異種二重機能架橋ＳＰＤＰ（ＩＬ、ロックフォー
ド、ピアースケミカル社）を用いて、Ｆ（ａｂ）′２断
片をキーホールリンペッスヘモシアニン（ＫＬＨ）に結
合せしめた。
ィオタイプ単クローン性抗体を以下のようにして調製し
た： 免疫原の調製：タンパク質Ａクロマトグラフィーにより
腹水から抗−ＣＫＢＢ（ＣＡ８）を精製した。精製した
抗体をペプシンで切断し、Ｆ（ａｂ）′２断片を産生し
た。異種二重機能架橋ＳＰＤＰ（ＩＬ、ロックフォー
ド、ピアースケミカル社）を用いて、Ｆ（ａｂ）′２断
片をキーホールリンペッスヘモシアニン（ＫＬＨ）に結
合せしめた。
【００５０】免疫化：Ａ／Ｊネズミを100 μｇのＦ（ａ
ｂ）′２−ＫＬＨで腹腔内に３回免疫化した。１回目の
注射は完全フロインドアジュバントであった。続いての
免疫化は不完全フロインドアジュバントであった。融合
の４日前に、ネズミを10μｇの抗体で静脈内に免疫化し
た。
ｂ）′２−ＫＬＨで腹腔内に３回免疫化した。１回目の
注射は完全フロインドアジュバントであった。続いての
免疫化は不完全フロインドアジュバントであった。融合
の４日前に、ネズミを10μｇの抗体で静脈内に免疫化し
た。
【００５１】細胞融合：コーラーおよびミルステインに
よりネイチャー（ロンドン）256 巻、494-497 頁（197
5）に記載したプロトコールに従って、免疫化したネズ
ミからの脾臓細胞を５：１の比率でＳＰ２／Ｏ骨髄腫細
胞と融合せしめた。肉眼的コロニーを観察したときに、
細胞培養上澄み液を融合後７−21日後に抗体産生につい
てスクリーニングした。以下に記載する方法によりスク
リーニングした陽性細胞系を細胞希釈を制限することに
よりクローンした。
よりネイチャー（ロンドン）256 巻、494-497 頁（197
5）に記載したプロトコールに従って、免疫化したネズ
ミからの脾臓細胞を５：１の比率でＳＰ２／Ｏ骨髄腫細
胞と融合せしめた。肉眼的コロニーを観察したときに、
細胞培養上澄み液を融合後７−21日後に抗体産生につい
てスクリーニングした。以下に記載する方法によりスク
リーニングした陽性細胞系を細胞希釈を制限することに
よりクローンした。
【００５２】スクリーニング方法：抗−ＣＫＢ（ＣＡ
８）のパパイン切断によりＦ（ａｂ）断片を調製し、続
いてタンパク質Ａカラム上で精製した。ＰＢＳ中10μｇ
／ｍｌのＦ（ａｂ）断片を、室温で一晩ポリスチレン管
上に吸着せしめた。次いでその管を洗浄し、ＰＢＳ中の
１％のＢＳＡで遮断した。精製タンパク質ＡをＡＥで標
識した。
８）のパパイン切断によりＦ（ａｂ）断片を調製し、続
いてタンパク質Ａカラム上で精製した。ＰＢＳ中10μｇ
／ｍｌのＦ（ａｂ）断片を、室温で一晩ポリスチレン管
上に吸着せしめた。次いでその管を洗浄し、ＰＢＳ中の
１％のＢＳＡで遮断した。精製タンパク質ＡをＡＥで標
識した。
【００５３】アッセイ：室温で１時間、Ｆ（ａｂ）被覆
管中で上澄み液を培養し、次いで水で洗浄した。ＡＥ−
標識タンパク質Ａを各管に加えた。室温で１時間に亘り
培養を続けた。次いで管を洗浄し、ルミノメーター中で
読み出した。バックグラウンドの10倍の信号を示した上
澄み液は陽性であると考えられ、さらなる特徴付けに選
択した。
管中で上澄み液を培養し、次いで水で洗浄した。ＡＥ−
標識タンパク質Ａを各管に加えた。室温で１時間に亘り
培養を続けた。次いで管を洗浄し、ルミノメーター中で
読み出した。バックグラウンドの10倍の信号を示した上
澄み液は陽性であると考えられ、さらなる特徴付けに選
択した。
【００５４】特異性試験：２通りの方法で抗−イディオ
タイプ単クローンを特異性について試験した。ＣＡ８以
外の２つの異なる単クローンを用いて、被覆管を作成
し、抗−イディオタイプを、上述したタンパク質Ａアッ
セイにおける結合について試験した。抗−イディオタイ
プ単クローンは、ＣＡ８ Ｆ（ａｂ）については陽性で
あり、Ｆ（ａｂ）については陰性であった。
タイプ単クローンを特異性について試験した。ＣＡ８以
外の２つの異なる単クローンを用いて、被覆管を作成
し、抗−イディオタイプを、上述したタンパク質Ａアッ
セイにおける結合について試験した。抗−イディオタイ
プ単クローンは、ＣＡ８ Ｆ（ａｂ）については陽性で
あり、Ｆ（ａｂ）については陰性であった。
【００５５】抗−イディオタイプ単クローンはまた、Ｃ
Ａ８抗−ＣＫＢＢ ＭａｂのＡＥ−標識ＣＫＢＢへの結
合を阻害することが示された。
Ａ８抗−ＣＫＢＢ ＭａｂのＡＥ−標識ＣＫＢＢへの結
合を阻害することが示された。
【００５６】ｂ． 免疫複合体を放出する能力について
の抗体の試験 (1) ＣＬＭＢアッセイ ＣＫＭＭ、ＣＫＢＢ、ＣＫＭＢおよびＴＳＨに対する様
々な単クローン性抗体を試験して、それらがＰＭＰ−固
定化抗−ＣＫＢＢに免疫化学的に結合した標識複合体Ａ
Ｅ−抗−ＭＢ−ＣＫＭＢを放出するかどうかを測定し
た。０または45ｎｇ／ｍｌのＣＫＭＢを含有する100 μ
ｌの血清標準物を、100 μｌのＡＥ−抗−ＣＫＭＢ、入
力ケミルミネッセンス一千万相対光単位（ＲＬＵ）およ
500 μｌのＰＭＰ−固定化抗−ＢＢ（ＣＡ８）で１時間
培養した。
の抗体の試験 (1) ＣＬＭＢアッセイ ＣＫＭＭ、ＣＫＢＢ、ＣＫＭＢおよびＴＳＨに対する様
々な単クローン性抗体を試験して、それらがＰＭＰ−固
定化抗−ＣＫＢＢに免疫化学的に結合した標識複合体Ａ
Ｅ−抗−ＭＢ−ＣＫＭＢを放出するかどうかを測定し
た。０または45ｎｇ／ｍｌのＣＫＭＢを含有する100 μ
ｌの血清標準物を、100 μｌのＡＥ−抗−ＣＫＭＢ、入
力ケミルミネッセンス一千万相対光単位（ＲＬＵ）およ
500 μｌのＰＭＰ−固定化抗−ＢＢ（ＣＡ８）で１時間
培養した。
【００５７】固相を磁気的に分離して脱イオン水で２回
洗浄した。次いでＰＭＰを、45μｇの抗体を含有する0.
25ｍｌのＰＢＳ／ＢＳＡ緩衝液（実施例１の工程ｅを参
照）で30分間培養した。再度固相を分離して洗浄し、残
留するケミルミネッセンスをルミノメーター中で測定し
た。その結果を以下に示す： 抗体 ＲＬＵ結合 緩衝液対照 （抗体含まず） ゼロＣＫＭＢ ２６０９ 45ｎｇ／ｍｌＣＫＭＢ ２１２７９９ 抗−ＢＢ（ＣＡ８） ０ ２０６８ ４５ １１６０４５ 抗イディオタイプ 抗−抗−ＣＫＢＢ（ＣＡ８） ０ ２５１３ ４５ ７０１８２ 抗−ＣＫＭＭ（１３Ｆ１０） ０ ２２３２ ４５ ２２９９９４ 抗−ＣＫＢＢ（１２Ａ１） ０ ２０２６ ４５ １３５８１４ 抗−ＣＫＢＢ（５Ｇ１２） ０ １９４７ ４５ １９８６４８ 抗−ＣＫＢＢ（２Ｄ１２） ０ １９０１ ４５ １５３８１３ 抗−ＣＫＢＢ（８Ａ２） ０ ２１２５ ４５ １４８８３３ 抗−ＣＫＭＭ（ＨＨ３） ０ １９２２ ４５ ２１９４４８ 抗−ＣＫＭＭ（ＧＢＢ） ０ １９１９ ４５ ２２６４４８ 抗−ＣＫＭＭ（Ｈ４４） ０ １８６２ ４５ ２１６６６９ 抗−ＴＨＳ（２Ｃ１０） ０ ２０４３ ４５ ２２５０３１ 抗−ＣＫＭＢ（００７） ０ ２１００ ４５ １９５７０５ それゆえ、固定化抗体（ＣＡ８）と同一の抗体およびよ
り少ない程度で緊密に関係した抗−ＣＫＢＢ抗体による
培養によって、特異的で迅速な放出が行なわれる。驚い
たことに、抗イディオタイプ（抗−ＣＡ８）はＣＡ８そ
れ自身よりも効果的な放出剤であった。
洗浄した。次いでＰＭＰを、45μｇの抗体を含有する0.
25ｍｌのＰＢＳ／ＢＳＡ緩衝液（実施例１の工程ｅを参
照）で30分間培養した。再度固相を分離して洗浄し、残
留するケミルミネッセンスをルミノメーター中で測定し
た。その結果を以下に示す： 抗体 ＲＬＵ結合 緩衝液対照 （抗体含まず） ゼロＣＫＭＢ ２６０９ 45ｎｇ／ｍｌＣＫＭＢ ２１２７９９ 抗−ＢＢ（ＣＡ８） ０ ２０６８ ４５ １１６０４５ 抗イディオタイプ 抗−抗−ＣＫＢＢ（ＣＡ８） ０ ２５１３ ４５ ７０１８２ 抗−ＣＫＭＭ（１３Ｆ１０） ０ ２２３２ ４５ ２２９９９４ 抗−ＣＫＢＢ（１２Ａ１） ０ ２０２６ ４５ １３５８１４ 抗−ＣＫＢＢ（５Ｇ１２） ０ １９４７ ４５ １９８６４８ 抗−ＣＫＢＢ（２Ｄ１２） ０ １９０１ ４５ １５３８１３ 抗−ＣＫＢＢ（８Ａ２） ０ ２１２５ ４５ １４８８３３ 抗−ＣＫＭＭ（ＨＨ３） ０ １９２２ ４５ ２１９４４８ 抗−ＣＫＭＭ（ＧＢＢ） ０ １９１９ ４５ ２２６４４８ 抗−ＣＫＭＭ（Ｈ４４） ０ １８６２ ４５ ２１６６６９ 抗−ＴＨＳ（２Ｃ１０） ０ ２０４３ ４５ ２２５０３１ 抗−ＣＫＭＢ（００７） ０ ２１００ ４５ １９５７０５ それゆえ、固定化抗体（ＣＡ８）と同一の抗体およびよ
り少ない程度で緊密に関係した抗−ＣＫＢＢ抗体による
培養によって、特異的で迅速な放出が行なわれる。驚い
たことに、抗イディオタイプ（抗−ＣＡ８）はＣＡ８そ
れ自身よりも効果的な放出剤であった。
【００５８】(2) ＴＳＨアッセイ ＴＳＧに対する単クローン性抗体、多クローン性抗−Ｔ
ＳＨ、およびＣＫＭＭとＣＫＢＢに対する単クローンを
試験して、それらがＰＭＰ−固定化抗−ＴＳＨ（２Ｃ１
０）からＡＥ標識抗−ＴＳＨ結合ＴＳＨ複合体を放出で
きるかどうかを測定した。
ＳＨ、およびＣＫＭＭとＣＫＢＢに対する単クローンを
試験して、それらがＰＭＰ−固定化抗−ＴＳＨ（２Ｃ１
０）からＡＥ標識抗−ＴＳＨ結合ＴＳＨ複合体を放出で
きるかどうかを測定した。
【００５９】０または６μＩＵ／ＬのＴＳＨを含有する
100 μｌの血清標準物を、100 μｌのＡＥ−標識抗−Ｔ
ＳＨ（Ｅ２１）、三千五百万ＲＬＵの合計入力水準で２
時間培養した。次いで500 μｌのＰＭＰ−固定化抗−Ｔ
ＳＨ（２Ｃ１０）を添加し、30分培養してサンドイッチ
複合体を形成した。固相を磁気的に分離し、脱イオン水
で２回洗浄した。
100 μｌの血清標準物を、100 μｌのＡＥ−標識抗−Ｔ
ＳＨ（Ｅ２１）、三千五百万ＲＬＵの合計入力水準で２
時間培養した。次いで500 μｌのＰＭＰ−固定化抗−Ｔ
ＳＨ（２Ｃ１０）を添加し、30分培養してサンドイッチ
複合体を形成した。固相を磁気的に分離し、脱イオン水
で２回洗浄した。
【００６０】次いで、50μｇの抗体を含有する0.25ｍｌ
のＰＢＳ／ＢＳＡによる30分間の培養によって、結合複
合体を放出せしめた。固相を磁気的に分離し、蒸留水で
１回洗浄し、ＰＭＰに結合したＡＥ−抗−ＴＳＨ（２Ｃ
１０）−ＴＳＨ複合体残留物の量を、ルミノメーター中
で測定した。
のＰＢＳ／ＢＳＡによる30分間の培養によって、結合複
合体を放出せしめた。固相を磁気的に分離し、蒸留水で
１回洗浄し、ＰＭＰに結合したＡＥ−抗−ＴＳＨ（２Ｃ
１０）−ＴＳＨ複合体残留物の量を、ルミノメーター中
で測定した。
【００６１】 放出抗体 ＲＬＵ結合 緩衝液対照物 （抗体含まず） ０ ＴＳＨ １０００ ６μＩＵ／Ｌ ＴＳＨ １３０５８１ 抗−ＴＳＨ（２Ｃ１０） ０ １０００ ６ １１０７０２ 多クローン性抗−ＴＳＨ ０ １０００ ６ １１７５９４ 抗−ＴＳＨ（Ｅ２１） ０ １０００ ６ １２９１７５ 抗−ＴＳＨ（７Ａ１０） ０ １０００ ６ ６１６２４ 抗−ＴＳＨ（１１Ａ８） ０ １０００ ６ １２８００３ 抗−ＣＫＢＢ（ＣＡ８） ０ １０００ ６ １３２２３３ 抗イディオタイプ 抗−抗−ＣＫＢＢ（ＣＡ８） ０ １０００ ６ １３１０２６ 抗−ＣＫＭＭ（１３Ｆ１０） ０ １０００ ６ １２９６８０ それゆえ、過剰の溶液−相捕捉抗体の添加によっては培
養時間内に明らかな量の複合体を放出しなかったが、驚
いたことに、別の抗−ＴＳＨ（７Ａ１０）は放出した。
養時間内に明らかな量の複合体を放出しなかったが、驚
いたことに、別の抗−ＴＳＨ（７Ａ１０）は放出した。
【００６２】ｃ． 放出剤として抗イディオタイプ抗−
抗−ＣＫＢＢ（ＣＡ８）または抗−ＣＫＢＢを使用した
ＣＫＭＢ免疫複合体転移アッセイ トレーサーとしての100 μｌのＡＥ−抗−ＭＢ（００
７）（合計一億ＲＬＵ）および500 μｌのＰＭＰ−抗−
ＢＢ（ＣＡ８）により室温で１時間、100 μｌのＣＫＭ
Ｂ標準物を培養した。固相を分離し、１ｍｌの脱イオン
水で２回洗浄した。0.25ｍｌのＰＢＳ／ＢＳＡ中の10μ
ｇの抗−ＣＫＢＢ（ＣＡ８）または抗イディオタイプ抗
−ＣＫＢＢ（ＣＡ８）をＰＭＰに添加し、固相から標識
複合体を放出せしめた。ＰＭＰを混合して、次いで室温
で30分間培養した。次いでそれらを磁気ラック上に配し
て磁気的に固相を分離せしめ、0.2 ｍｌの各上澄み液を
500μｌのＰＭＰ−抗−ＣＫＭＭ（ＡＨ６）と混合せし
めた。室温での15分間の培養後、ＰＭＰを分離して、脱
イオン水で１回洗浄し、ルミノメーター中で読み出し
た。
抗−ＣＫＢＢ（ＣＡ８）または抗−ＣＫＢＢを使用した
ＣＫＭＢ免疫複合体転移アッセイ トレーサーとしての100 μｌのＡＥ−抗−ＭＢ（００
７）（合計一億ＲＬＵ）および500 μｌのＰＭＰ−抗−
ＢＢ（ＣＡ８）により室温で１時間、100 μｌのＣＫＭ
Ｂ標準物を培養した。固相を分離し、１ｍｌの脱イオン
水で２回洗浄した。0.25ｍｌのＰＢＳ／ＢＳＡ中の10μ
ｇの抗−ＣＫＢＢ（ＣＡ８）または抗イディオタイプ抗
−ＣＫＢＢ（ＣＡ８）をＰＭＰに添加し、固相から標識
複合体を放出せしめた。ＰＭＰを混合して、次いで室温
で30分間培養した。次いでそれらを磁気ラック上に配し
て磁気的に固相を分離せしめ、0.2 ｍｌの各上澄み液を
500μｌのＰＭＰ−抗−ＣＫＭＭ（ＡＨ６）と混合せし
めた。室温での15分間の培養後、ＰＭＰを分離して、脱
イオン水で１回洗浄し、ルミノメーター中で読み出し
た。
【００６３】以下の表は、抗−ＣＫＢＢおよび抗イディ
オタイプ抗体による放出を含むアッセイ中の各ＣＫＭＢ
血清標準物に得られた信号を示す。
オタイプ抗体による放出を含むアッセイ中の各ＣＫＭＢ
血清標準物に得られた信号を示す。
【００６４】 抗−ＣＫＢＢによる放出 抗イディオタイプによる放出 ＲＬＵ ＣＫＭＢ ｎｇ／ｍｌ ＲＬＵ ６９０ ０．００ ６４０ ２５９５ ０．４５ ２４０３ １００２５ ４．５０ １０１９６ １８１３１８ ４５．００ １５５１８０ （実施例３） リポソーム架橋 ａ． リポソーム架橋によりＰＭＰ上に固定化された捕
捉抗体抗−ＣＫＭＭ（１３Ｆ１０）の調製 (1) リポソーム結果ジニトロフェニル群の調製 85.5μモルのジオレオイルホファチジルコリン、7.35μ
モルのジオレオイルホスファチジルグリセロール、1.0
μモルのジニトロフェニル−アミンオカプロイック−ジ
オレオイルホスファチジルエタノールアミン（全てアラ
バマ州、バーミンガム、アバンティポラーリピズ社から
得た）および4.0 μモルのＮ−［４−（ｐ−マレイミド
フェニル）ブチリル］ホスファチジルエタノールアミン
（マーチンＪ．Ｆ．およびパパハジョポロス、Ｄ．らに
より257 Ｊバイオケム（1982）286 に記載されたように
調製した）。
捉抗体抗−ＣＫＭＭ（１３Ｆ１０）の調製 (1) リポソーム結果ジニトロフェニル群の調製 85.5μモルのジオレオイルホファチジルコリン、7.35μ
モルのジオレオイルホスファチジルグリセロール、1.0
μモルのジニトロフェニル−アミンオカプロイック−ジ
オレオイルホスファチジルエタノールアミン（全てアラ
バマ州、バーミンガム、アバンティポラーリピズ社から
得た）および4.0 μモルのＮ−［４−（ｐ−マレイミド
フェニル）ブチリル］ホスファチジルエタノールアミン
（マーチンＪ．Ｆ．およびパパハジョポロス、Ｄ．らに
より257 Ｊバイオケム（1982）286 に記載されたように
調製した）。
【００６５】脂質を小さく清浄なペトリ皿中の３ｍｌの
クロロホルム中に溶解せしめた。クロロホルムを蒸発せ
しめ、乾燥した脂質混合物フイルムを、真空下のデシケ
ーター中で一晩さらに凍結乾燥せしめた。次いで脂質
を、室温においてｐＨ6.1 で10ｍｌの2.7 ％ｖ／ｖのグ
リセロール、１ｍＭのＥＤＴＡにより水和せしめて、大
きなオリゴラメラリポゾームを形成した。これらを、0.
8 、0.6 、0.4 および0.2 μｍの孔直径（ヌクレオポ
ア）を有するポリカーボネート膜を通じて押し出して、
均一な小胞を形成した。10ｍｌのＰＢＳを加え、超遠心
分離によりリポソームを沈殿せしめ、ｍｌ当たり16.67
μモルのリン脂質の最終濃度まで６ｍｌのＰＢＳ中に再
懸濁せしめた。
クロロホルム中に溶解せしめた。クロロホルムを蒸発せ
しめ、乾燥した脂質混合物フイルムを、真空下のデシケ
ーター中で一晩さらに凍結乾燥せしめた。次いで脂質
を、室温においてｐＨ6.1 で10ｍｌの2.7 ％ｖ／ｖのグ
リセロール、１ｍＭのＥＤＴＡにより水和せしめて、大
きなオリゴラメラリポゾームを形成した。これらを、0.
8 、0.6 、0.4 および0.2 μｍの孔直径（ヌクレオポ
ア）を有するポリカーボネート膜を通じて押し出して、
均一な小胞を形成した。10ｍｌのＰＢＳを加え、超遠心
分離によりリポソームを沈殿せしめ、ｍｌ当たり16.67
μモルのリン脂質の最終濃度まで６ｍｌのＰＢＳ中に再
懸濁せしめた。
【００６６】(2) リポソーム結合抗−ＣＫＭＭの調製 単クローン性抗−ＣＫＭＭ（１３Ｆ１０）を精製し、50
ｍＭの酢酸、50ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤ
ＴＡおよび50ｍＭの塩化ナトリウムからなるｐＨ6.1 の
緩衝液に対して一晩透析した。２ｍｌの抗体溶液（2.5
ｍｇ）を、ジチオトレイトールに関して20ｍＭ生成し、
室温で30分間培養した。次いで減少した抗体を、ＰＢＳ
中の10ｍｌのセファデックスＧ−２５カラムのゲル濾過
により過剰のジチオスレイトールから分離した。
ｍＭの酢酸、50ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤ
ＴＡおよび50ｍＭの塩化ナトリウムからなるｐＨ6.1 の
緩衝液に対して一晩透析した。２ｍｌの抗体溶液（2.5
ｍｇ）を、ジチオトレイトールに関して20ｍＭ生成し、
室温で30分間培養した。次いで減少した抗体を、ＰＢＳ
中の10ｍｌのセファデックスＧ−２５カラムのゲル濾過
により過剰のジチオスレイトールから分離した。
【００６７】５ｍｇの抗体を25μモルのホスファチジル
コリンと混合することにより、リポソームをこの抗体と
結合せしめた。室温での16時間の培養後、リポソーム溶
液を、超遠心分離により４ｍｌのＰＢＳ中で３回洗浄し
た。最終的に、リポソームを2.5 ｍｌのＰＢＳの中に再
懸濁せしめた。
コリンと混合することにより、リポソームをこの抗体と
結合せしめた。室温での16時間の培養後、リポソーム溶
液を、超遠心分離により４ｍｌのＰＢＳ中で３回洗浄し
た。最終的に、リポソームを2.5 ｍｌのＰＢＳの中に再
懸濁せしめた。
【００６８】(3) ジニトロフェニル化抗体結果リポソー
ムのＰＭＰ−固定化抗−ＤＮＰヘの結合 セクション(2) に記載したように調製したリポソーム
を、10ｍｇのＰＭＰを室温で16時間、２ｍｌのＰＢＳ中
の10μモルのホスファチジルコリンで培養することによ
りＰＭＰ−固定化抗−ＤＮＰに結合せしめた。次いでリ
ポソーム−ＰＭＰ混合物を0.1 ％のＢＳＡを有する等量
のＰＢＳで洗浄し、未結合リポソームを除去し、次いで
アッセイに使用するために、ＰＢＳ／ＢＳＡの１ｍｌ当
たり100 μｇのＰＭＰに再懸濁せしめた。
ムのＰＭＰ−固定化抗−ＤＮＰヘの結合 セクション(2) に記載したように調製したリポソーム
を、10ｍｇのＰＭＰを室温で16時間、２ｍｌのＰＢＳ中
の10μモルのホスファチジルコリンで培養することによ
りＰＭＰ−固定化抗−ＤＮＰに結合せしめた。次いでリ
ポソーム−ＰＭＰ混合物を0.1 ％のＢＳＡを有する等量
のＰＢＳで洗浄し、未結合リポソームを除去し、次いで
アッセイに使用するために、ＰＢＳ／ＢＳＡの１ｍｌ当
たり100 μｇのＰＭＰに再懸濁せしめた。
【００６９】ｂ． ＣＫＭＢ免疫複合体転移アッセイ セクション(3) で調製した抗−ＣＫＭＭ（１３Ｆ１０）
−リポソーム−ＰＭＰ複合体を、0.5 ｍｌのＰＢＳ／Ｂ
ＳＡ（50μｇ ＰＭＰ）中に加え、その混合物を室温で
１時間培養した。次いで、マジック分離ラック（チバコ
ーニングダイアグノーシス社）を用いて、ＰＭＰを磁気
的に分離し、１ｍｌのＰＢＳ／ＢＳＡで３回洗浄した。
次いで、脱イオン水中の0.25ｍｌのトリトンＸ−100 の
0.1 ％溶液を添加することによりリポソーム架橋を溶解
せしめ、続いて直ちに試験管をグネチック分離ラック中
に配した。放出標識免疫混合物を含有する上澄み液0.2
ｍｌのアリコートを、直ちに洗浄な試験管に直ちに転移
した。これらの管に関して、50μｇのＰＭＰを含有する
0.5 ｍｌのＰＭＰ−固定化抗−ＣＫＢＢ（ＣＡ８）を直
ちに加え、免疫複合体を再捕捉するためにその管を室温
で１時間培養した。このＰＭＰを磁気的に分離し、１ｍ
ｌのＰＢＳ＋ＢＳＡで洗浄し、続いてルミノメーター中
でケミルミネッセンスの読み出しを行なった。対照実験
において、トリトンＸ−100 の添加前に、ＰＭＰをルミ
ノメーター中で読み出した。典型的な検量線を以下に示
す： 対照アッセイ 放出／再捕捉のアッセイ （放出／再捕捉なし） ＣＫＭＢ ＲＬＵ ＣＫＭＢ ＲＬＵ ｎｇ／ｍｌ ｎｇ／ｍｌ ０ ７８６２６ ０ ９５８ ０．４５ １１７３９１ ０．４５ ５７２１ ４．５０ ２５８０７９ ４．５０ ７４０６９ ４５．００ １８１９０７８ ４５．００ ７２１０８５ それゆえ、リポソーム架橋と洗浄剤を用いた免疫複合体
の放出と、続いてのその複合体の新たな固相への再捕捉
により、バックグラウンドの信号を除去でき、信号／バ
ックグランド比を増大できる。
−リポソーム−ＰＭＰ複合体を、0.5 ｍｌのＰＢＳ／Ｂ
ＳＡ（50μｇ ＰＭＰ）中に加え、その混合物を室温で
１時間培養した。次いで、マジック分離ラック（チバコ
ーニングダイアグノーシス社）を用いて、ＰＭＰを磁気
的に分離し、１ｍｌのＰＢＳ／ＢＳＡで３回洗浄した。
次いで、脱イオン水中の0.25ｍｌのトリトンＸ−100 の
0.1 ％溶液を添加することによりリポソーム架橋を溶解
せしめ、続いて直ちに試験管をグネチック分離ラック中
に配した。放出標識免疫混合物を含有する上澄み液0.2
ｍｌのアリコートを、直ちに洗浄な試験管に直ちに転移
した。これらの管に関して、50μｇのＰＭＰを含有する
0.5 ｍｌのＰＭＰ−固定化抗−ＣＫＢＢ（ＣＡ８）を直
ちに加え、免疫複合体を再捕捉するためにその管を室温
で１時間培養した。このＰＭＰを磁気的に分離し、１ｍ
ｌのＰＢＳ＋ＢＳＡで洗浄し、続いてルミノメーター中
でケミルミネッセンスの読み出しを行なった。対照実験
において、トリトンＸ−100 の添加前に、ＰＭＰをルミ
ノメーター中で読み出した。典型的な検量線を以下に示
す： 対照アッセイ 放出／再捕捉のアッセイ （放出／再捕捉なし） ＣＫＭＢ ＲＬＵ ＣＫＭＢ ＲＬＵ ｎｇ／ｍｌ ｎｇ／ｍｌ ０ ７８６２６ ０ ９５８ ０．４５ １１７３９１ ０．４５ ５７２１ ４．５０ ２５８０７９ ４．５０ ７４０６９ ４５．００ １８１９０７８ ４５．００ ７２１０８５ それゆえ、リポソーム架橋と洗浄剤を用いた免疫複合体
の放出と、続いてのその複合体の新たな固相への再捕捉
により、バックグラウンドの信号を除去でき、信号／バ
ックグランド比を増大できる。
【図１】本発明の第１の方法の第１段階を模式的に説明
する概略図
する概略図
【図２】本発明の第１の方法の第２段階を模式的に説明
する概略図
する概略図
【図３】本発明の第１の方法の第３段階を模式的に説明
する概略図
する概略図
【図４】本発明の第２の方法の第１段階を模式的に説明
する概略図
する概略図
【図５】本発明の第２の方法の第２段階を模式的に説明
する概略図
する概略図
【図６】本発明の第２の方法の第３段階を模式的に説明
する概略図
する概略図
【図７】本発明の第３の方法の第１段階を模式的に説明
する概略図
する概略図
【図８】本発明の第３の方法の第２段階を模式的に説明
する概略図
する概略図
【図９】本発明の第３の方法の第３段階を模式的に説明
する概略図
する概略図
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウィリアム ジェイ リョーダン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02116 ボストン ボイルストン ストリ ート 62 (72)発明者 デボラ アール シルバート−ショステク アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02072 ストートン オレンジウッド ド ライヴ 11
Claims (13)
- 【請求項１】 十分に穏やかな条件下で行なわれる結合
アッセイの感度および正確度を増大せしめる方法であっ
て、 ａ． 分析物を、標識特異的結合剤および第１の固相に
直接的または間接的に可逆的に結合せしめられた特異的
結合剤と反応せしめ、標識特異的結合剤−分析物−特異
的結合剤−追加成分−第１の固相複合体を形成し、 ｂ． 前記標識特異的結合剤−分析物および、ときには
前記特異的結合剤を、前記追加成分−第１の固相から分
離して分離複合体を形成し、 ｃ． 該分離複合体を、前記分析物上のエピトープまた
は前記特異的結合剤上のエピトープのいずれかにより第
２の固相に結合せしめられた第２の追加成分に再結合せ
しめ、 ｄ． 前記第２の固相に結合せしめられた前記標識特異
的結合剤の量を測定することにより存在する前記分析物
の量を測定する各工程からなり、 工程ｂのような分離方法が10分以下で完了せしめられる
ことを特徴とする方法。 - 【請求項２】 前記結合アッセイが、免疫化学アッセ
イ、レクチンアッセイまたはレセプターアッセイである
ことを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記工程ｂのような分離方法が１分以下
で完了せしめられることを特徴とする請求項１記載の方
法。 - 【請求項４】 免疫化学アッセイの感度および正確度を
増大せしめる方法であって、 ａ． 分析物を、標識特異的結合剤および異種架橋の使
用により第１の固相に可逆的に結合せしめられた特異的
結合剤と反応せしめ、標識特異的結合剤−分析物−特異
的結合剤−第１の固相複合体を形成し、 ｂ． 前記標識特異的結合剤−分析物−特異的結合剤複
合体を前記第１の固相から分離し、 ｃ． 前記標識特異的結合剤−分析物−特異的結合剤
を、前記分析物または免疫複合体の別の成分と結合せし
め、第２の固相に結合せしめられる第２の特異的結合剤
に再結合せしめ、 ｄ． 前記第２の固相に結合せしめられた前記標識特異
的結合剤の量を測定することにより存在する前記分析物
の量を測定することを特徴とする方法。 - 【請求項５】 前記可逆的な結合が前記第１の固相の結
合せしめられた抗−ジニトロフェニルの使用により行な
われ、モノニトロフェニルが前記特異的結合剤に結合せ
しめられ、前記分離が、ジニトロフェニル−リシンの添
加により行なわれ、前記分析物が前記第２の固相−抗体
複合体により適切に捕捉されるように、前記再結合が、
前記分析物に十分に類似した物質に対する抗体を前記第
２の固相に結合せしめることにより行なわれることを特
徴とする請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 免疫化学アッセイの感度および正確度を
増大せしめる迅速な方法であって、 ａ． 分析物を、標識特異的結合剤および第１の固相に
可逆的に結合せしめられた特異的結合剤と反応せしめ、
標識特異的結合剤−分析物−特異的結合剤−第１の固相
複合体を形成し、 ｂ． 抗−イディオタイプ特異的結合剤、部分的分析物
擬態者、またはこれらのうちの１つから誘導された断片
の使用により、前記標識特異的結合剤−分析物複合体を
前記第１の固相から分離し、 ｃ． 前記特異的結合剤−分析物複合体を、前記分析物
または免疫複合体の別の成分と結合せしめ、第２の固相
に結合せしめられる第２の特異的結合剤に再結合せし
め、 ｄ． 前記第２の固相に結合せしめられた前記標識特異
的結合剤の量を測定することにより存在する前記分析物
の量を測定することを特徴とする方法。 - 【請求項７】 前記可逆的な結合が、前記分析物に対す
る抗体または前記第１の固相に結合せしめられた分析物
状物質に対する抗体の使用により行なわれ、前記分離
が、抗イディオタイプ抗体またはその断片の過剰の添加
により行なわれ、前記再結合が、前記分析物に十分に類
似した物質に対する抗体を前記第２の固相に結合せしめ
て第２の固相−抗体複合体を形成し、前記分析物が前記
第２の固体相−抗体複合体により適切に捕捉されること
を特徴とする請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 免疫化学アッセイの感度および正確度を
増大せしめる迅速な方法であって、 ａ． 分析物を、 １．標識特異的結合剤および ２．親油性物質の使用により第１の固相に可逆的に結合
せしめられた特異的結合剤 と反応せしめ、標識特異的結合剤−分析物−親油性物質
−第１の固相複合体を形成し、 ｂ． 前記標識特異的結合剤−分析物−特異的結合剤複
合体を前記第１の固相から分離し、 ｃ． 前記特異的結合剤−分析物−特異的結合剤複合体
を、前記分析物または免疫複合体の別の成分と結合せし
め、第２の固相に結合せしめられる第２の特異的結合剤
に再結合せしめ、 ｄ． 前記第２の固相に結合せしめられた前記標識特異
的結合剤の量を測定することにより存在する前記分析物
の量を測定することを特徴とする方法。 - 【請求項９】 前記親油性物質が、リポソーム、エマル
ジョン、六方晶相、ミセル、二重層、単層、またはこれ
らの物質の２つ以上の組合せであることを特徴とする請
求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 前記可逆的な結合がリポソームの使用
により行なわれ、前記分離が洗浄剤の添加により行なわ
れ、前記再結合が、前記分析物の十分に類似した物質に
対する抗体を前記第２の固相に結合せしめることにより
行なわれ、前記分析物が前記第２の固相−抗体複合体に
より捕捉されることを特徴とする請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 前記標識特異的結合剤を、前記分析物
を特異的結合剤−第１の固相複合体と反応せしめたのと
は異なる工程または同一工程中に前記分析物と反応せし
めることを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項１２】 前記分離複合体を、該分離複合体が前
記第２の固相に再結合せしめたのとは異なる工程または
同一工程中に前記第１の固相から分離せしめることを特
徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項１３】 前記固相の１つまたは両方が常磁性粒
子からなることを特徴とする請求項１記載の方法。
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