JPS602037B2 - 固定化グルコ−スイソメラ−ゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は改良された固定化グルコースィソメラーゼの製
造法に関するものである。

本発明者らは、グルコースィソメラーゼの菌体内酵素の
固定化について、すでにキトサンを菌体と反応させるこ
とにより極めて性能の優れた固定化酵素を得る方法を提
案した（特膿昭５１一４６００７号）。

しかし、このキトサンによる固定化酪はキトサンの特性
から基質あるいは生成物の透過性が優れ、反応性が良い
反面、水中で膨潤しやすく、且つ物理的強度がやや劣り
、粗雑な取扱いにより酵素剤が崩れ易い欠点があるため
に、工業的使用にあたりトラブルの原因になることが認
められた。

また、キトサン凝集法による固定化酵素は比重が非常に
小さく、カラム充填時において沈降し１こく〈、カラム
充填作業に手間取る欠点があった。一方、固定化酵素を
製造する場合にその原料となるグルコースイソメラーゼ
含有菌体は培養を一定におこなっても必ずしも常に同じ
活性を有する菌体でなく、多少の変動は避けがたいもの
であり、このような菌体を用いて最終的には同じ品質の
固定イ技酵素を製造するには、菌体の活性を加減出来る
化合物が必要である。このような添加物はキトサン凝集
物に含有させることになるが、それによって酵素的安定
性は勿論、固定イ捉酵素の物理的な安定性を弱めるもの
であってはならない。本発明者等はこれらの欠点を除く
ため種々鋭意検討したところ、キトサン凝集物に珪酸化
合物を含有させることにより、その量の多少にかかわら
ず固定化酵素は添加しない場合に比べて、物理的強度を
向上することを見出し本発明に達した。

すなわち本発明はキトサンでグルコースィソメラーゼ生
産菌体を凝集させて固定化グルコースイソメラーゼを製
造する方法において、任意の段階で固定化グルコースィ
ソメラーゼに珪酸化合物を含有させることを特徴とする
固定化グルコースィソメ０ラーゼの製造法である。本発
明に使用されるグルコースイソメラーゼ生‐産菌体とし
ては、ストレプトマィセス属、バチルス属、アースロバ
クター属、シュードモナス属等のグルコースィソメラー
ゼを生産する微生物菌体夕があげられる。

これらの菌体は窒素源としてコーンステイープリカー単
独または他の窒素源を添加し、炭素源として澱粉、キシ
ロースなどの炭水化物類、無機塩としては燐酸カリウム
、塩化コパルトおよび塩化マグネシウムなどを含んだ培
地に培養して取得する。使用する菌体は培養菌体そのま
ま、あるいは加熱処理した菌体のいずれでもよい。また
、この菌体はｐＨ５〜９、特に５〜７．０の緩衝溶液に
分散もしくは懸濁されていてもよい。この場合、菌体の
濃度は通常０．１〜５の重量％、好ましくは０．５〜４
の重量％である。キトサンとはキチンを脱アセチル化し
て得られる白色無定形粉末であって、グルコサミンから
なる塩基性多糠類である。

本発明におけるキトサンは上記キトサンあるいはその溶
液、たとえば酢酸、蟻酸、塩酸等の酸およびこれらの酸
の酸性溶液に溶解して得られる溶液である。この溶液の
濃度は０．０５〜２．の重量％、好ましくは０．１〜１
．の重量％である。本発明におけるキトサンでグルコー
スイソメラーゼ菌体を凝集させて固定化グルコースィソ
メラーゼを製造する方法は、具体的には菌体を含む液体
にキトサンもしくはその溶液を添加して混合して凝集反
応を行なう方法、キトサン溶液に菌体を添加して混合し
、凝集反応を行なう方法などがある。

固定化酵素製造の操業性から見て、キトサン溶液に菌体
を添加してよく縄拝するか、あるいは濃練りして菌体を
上記キトサン溶液に分散させることが好ましい。本発明
において使用する珪酸化合物とは珪酸、無水珪酸、珪酸
塩を含み、水に不溶性の物質をいう。

珪酸とは二酸化珪素Ｓｉ０２（シリカ）、二酸化珪素水
和物Ｓｉ０２・ＮＨ２０（シリカゲル、珪藻士、酸性白
土）を言い、珪酸塩とは珪酸カルシウム、珪酸マグネシ
ウム、珪酸コバルト、蓮酸アルミニウム等の水に不溶な
化合物を言う。特に珪酸塩が好ましい。本発明における
珪酸化合物の使用は、任意の段階で行なう。

蓮酸化合物を予め、グルコースイソメラーゼ生産菌体に
混合懸濁しておき、キトサン酢酸溶液と凝集させ、凝集
菌体に含有させてもよい。あるいはキトサン凝集菌体に
珪酸化合物を混合することによって含有させてもよい。
また珪酸化合物は培養液に添加してもよく、また菌体の
加熱処理時に添加してもよい。珪酸化合物の添加量特に
限定するものでなく、多量に添加しても固定化酵素の強
度は変動しないので原料菌体の活性と所望する固定イＱ
酵素の活性の両者を考えて珪酸化合物の添加量を決定出
来る。

特に原料菌体（乾物）に対して１０〜１０の重量％添加
することが望ましい。蓮酸化合物の粒度は菌体と混合し
て懸濁液を調整する場合、珪酸化合物の粒度が大きいと
沈降して菌体と分離することが見られるので６０〜８０
メッシュ以上の粒度のものが望ましい。

上記の方法で得た蓮酸化合物を含有する凝集菌体は櫨過
または遠心分離あるいは圧搾により、水分２０〜５０％
に調節して造粒機で造粒し、そのまま乾燥するかあるし
、は整粒機にかけて整形した後、乾燥する。

本発明方法に従って製造される固定化グルコースィソメ
ラーゼは珪酸化合物を含有しない場合に比して、膨潤度
が低く、堅さが大きくかつ崩壊性が全くない。

したがって、カラム充填時の沈降性も改善され、かつ物
理的強度もあり工業的使用に耐えるものである。以下実
施例を用いて本発明を説明する。

実施例中、単に％とあるのは重量％を示す。

酵素活性は国際グルコースィソメラーゼ単位を用い、グ
ルコース溶液（グルコース濃度２Ｍ，０．０２ＭＭｇＳ
Ｑ，０．００１ＭＣｏｄ２ ｐＨ６．８５）で反応温度
６０ｑｏにおいて１分間に１ムモルのグルコースを異性
化する酵素活性を１単位（ＩＧＩＵと略する）とした。
なお、各測定項副ま下記の方法に従った。

ｍ 膨潤度 固定化グルコースィソメラーゼ１ｇを水に懸濁し、沈降
せしめた時に水中で占める体積（私）で表わす。

■堅さ 粒状の固定化グルコースィソメラーゼを４０Ｗ／Ｗ％ブ
ドウ糖液（ｐＨ８５）中、室温で一夜放置後、次の方法
に従って堅さを検査した。

すなわち、人差し指と親指でつまみ、３人のパネルで感
覚的に堅さを判定した。竪さの程度 判 定 基
準 １ 糖夜中で放置するとくずれる ２ やわらかい ３ 竪い ４ かなり竪い ５ 非常に竪く押してもつぶれない 工業的使用に耐える堅さは３．５以上であると考えられ
る。

‘３１ 崩壊性は活性測定時の１時間の蝿梓反応中にお
いて固定化グルコースィソメラーゼが崩壊する程度を表
わす（十十十崩壊が著しい、十十かなり崩壊、十やや崩
壊、一崩壊なし）。

‘４’沈降性 ４０Ｗ′Ｗ％のグルコース溶液中での沈降速度で表わし
た。

実施例 Ｉ Ｚグル
コースィソメラーゼ生産凍結菌体（放線＊＊菌）２．１
４ｋ９（固形分３３．槌％、７０１１０１Ｕ／ｇ）を６
０その水に懸濁し、４Ｚずつに１申等分し、この懸濁液
に下記第１表に示される化合物を菌体（乾物）当り３０
％添加し、次いで０．２％のキトサンの酢酸溶液（ｐＨ
６．０）４．６そを加えて凝集反応を行なわせた。

さらに凝集された菌体を櫨遇し、固形分６５％になるよ
うに造粒機で造粒し、８ぴ０の熱風で１５分間乾燥しさ
らに３０℃で一夜放置した。得られた固定化グルコース
ィソメラーゼの性質を第１表に示す。

第 １表 （１）シリカセル（日本タルク製） （２ シリカゲル（和光純薬製） （３） ラジオライト＊６００（昭和化学製）（心 酸
性白土（半井化学製）（５）白鷲Ａ（武田化学製） （６）活性ァルミナ（半井化学製） 第１表から明らかな如く、珪酸化合物を添加すると、無
添加に比して膨潤度が低く、堅さは同等もしくは一層増
大し、かつ沈降性に優れ、物理的な強度が低下すること
なく、活性のある固定化酵素が得られる。

しかも原菌体に対して３０％の珪酸化合物を添加してい
るのに、活性はそれ程低下していない。実施例 ２ グルコースイン〆ラーゼ放線菌凍結菌体１．２ｋ９（固
形債３２．８％、グルコースィソメラーゼ活性８０８Ｇ
ＩＵ／ｇ）を６２．５その水に懸濁した（ｐＨ７．０）
。

これを１２．５ぐずつ５等分した。この菌体懸濁液に珪
酸マグネシウム〔Ｍｇ３（Ｓｉ４０，ｏ）（ＯＨ）２〕
を菌体乾物量当り１０％、２５％、５０％、１００％添
加してよく混合した。この懸濁液各々に０．２％キトサ
ン・酢酸溶液（ｐＨ６．０）１０そをよく櫨拝しながら
加えて凝集させた。凝集後、猿過し、更に脱水機にかけ
て水分を６０％程度として造粒機で造粒後、乾燥した。
このようにして得た固定イは酵素（３０〜４０メッシュ
）の物性は次の通りである。第２表 第２表から明らかなように、珪酸マグネシウムを菌体と
等量に混合しても充分に堅さは保持され、むしろ無添加
のものより堅さは強くなることが認められる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ キトサンでグルコースイソメラーゼ生産菌体を凝集
   させて固定化グルコースイソメラーゼを製造する方法に
   おいて、任意の段階で固定化グルコースイソメラーゼに
   珪酸化合物を含有させることを特徴とする固定化グルコ
   ースイソメラーゼの製造法。 ２ 特許請求の範囲１に記載された珪酸化合物が珪酸塩
   であることを特徴とする固定化グルコースイソメラーゼ
   の製造法。