JPS63253099A - ヒト腫瘍壊死因子中和モノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒ）［ｆｌＷ壊死因子（以下、ｈ　−ＴＮＦ
と略す）に対する新規な中和モノクローナル抗体に関す
る。さらに詳しくは、ｈ−ＴＮＦと特異的に結合して、
ｈ−ＴＮＦの細胞毒性に対する中和活性をもち、ヒト由
来のリンホトキシンとの結合性をもたないモノクローナ
ル抗体およびその用途に関する。

（従来の技術） 抗１１１ｍ活性を有する蛋白質として注目されている［
１！瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、１９７５年カースウェル
らによって、免疫賦活剤で感作した動物の血清中から殺
腫瘍細胞活性あるいは癌壊死活性を有する物質として見
出された（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、
ＵＳＡ、７２　：　３６６６〜３６７０．１９７５）、
その後、ＴＮＦは宿主に大きな影響を及ぼすことな（、
種々のＩ！ｌ瘍を壊死させること、またｉｎ　　ｖｉｔ
ｒｏでは種々の形質転換した細胞（Ｍ瘍化された細胞）
を殺したり生長を止めるのに対し、正常な細胞には影響
を与えないことが知られ、抗腫瘍剤或いは抗癌剤として
期待されている。ＴＮＦは、生体内の活性化されたマク
ロファージから産生ずることが報告され（ｙ７　（Ｒｕ
ｔ　ｒ）、　　ＨｏＲ，およびギフオード（Ｇｉｆ　ｆ
ｏｒｄ）、Ｇ、Ｅ、、　　リンホカインズ（Ｌｙｍｐｈ
ｏｋｉｎｅｓ）、Ｖｏｌ、２，２３５−２７２．ピンク
（Ｐ　ｉ　ｃｋ）　、　Ｅ、　＆、アカデミツクプレス
、ニューヨーク、１９８１）、近年は株化されたマクロ
ファージ様細胞の培養液からＴＮＦ活性を有する物質が
分離されている。

最近になって二つのグループが、活性化されたヒトマク
ロファージ様細胞が産生ずるし）ＴＮＦ蛋白質のアミノ
酸配列を総換えＤＮＡ技術を利用して明らかにした〔ヘ
ニカ（Ｐｅｎｎｉｃａ）Ｄ。

ら、Ｎａｔｕｒｅ、３１２ニア２４〜７２９．１９８４
およびウォング（Ｗａｎｇ）、ＡｏＭ、　　ら。

Ｓｃ　１ｅｎｃｅ、２２８　：　１４９〜１５４．１９
８５〕、いずれのグループも、活性化したヒトマクロフ
ァージ様細胞ＨＬ−６０からヒトＴＮＦのｍＲＮＡを分
離し、そのｃＤＮＡをクローン化して塩基配列を決定す
る一方、上記細胞の培養液よりＴＮＦを精製しそのアミ
ノ基末端側のアミノ酸を決定することにより、成熟しト
ＴＮＦは第１図に示すようなＶ　ａ　ｌ　−Ａ　ｒ　ｇ
−３ｅ　ｒ・・・に始まりカルボキシル基末端はＬｅｕ
で終わる１５７個のアミノ酸からなるポリペプチドであ
り、その前駆体はさらに７６個のアミノ酸からなるポリ
ペプチドが上記ポリペプチドのアミノ末端に付加された
蛋白質であるとしている。また、彼らは上記ヒトＴＮＦ
ポリペプチドを形質転換された大腸菌で産生ずることに
も成功している。

ところで、ＴＮＦはすでに癌患者に試用されその臨床学
的検討が始まっている。このような状況から、試料中の
ＴＮＦ、特に活性を有するｖ、態にあるＴＮＦを迅速か
つ容易に検出する方法の必要性が叫ばれている０例えば
、患者にＴＮＦを投与するにあたっては、投与後の血中
のＴＮＦ濃度を追跡して、最大の投与効果を得るように
管理する必要がある。ところが、ＴＮＦの測定は、従来
、Ｌ９２９細胞に対する細胞毒性を指標とするバイオア
ッセイで行われており、手間と時間を必要とし、熟練を
要する上、大量の検体を処理できないという問題がある
。

バイオアッセイの代わりに、免疫化学的にＴＮＦを測定
する方法も考えられるが、そのためには、活性を持つＴ
ＮＦのみに特異的に反応する抗体を使用することが必要
である。さもないと、変性して失活したＴＮＦが測定さ
れ、測定値と実際のＴＮＦ活性が一致しなくなるおそれ
が生じるからである。しかしながら、ヒトＴＮＦ　（ｈ
−ＴＮＦ）モノクローナル抗体に関しては、活性型ｈ　
−ＴＮＦのみと特異的に反応性をもつモノクローナル抗
体は得られていない、近年、精製したヒトＴＮＦで免疫
したマウスの抗体産生細胞を骨髄腫細胞（ミエローマ）
との雑種細胞（ハイブリドーマ）により、ヒトＴＮＦに
対するモノクローナル抗体は作製されているが（特開昭
６０・−２０８９２４号）、この抗体はｈ−ＴＮＦと反
応し、ヒト由来のリンホトキシンとも反応するため、反
応特異性において満足すべきものではない、即ち、ｈ−
ＴＮＦ（特に活性型ｈ−ＴＮＦ）のみと特異的に反応す
るモノクローナル抗体は、未だ得られていない。

一方、マウスの骨髄腫細胞と特定抗原に対する免疫化マ
ウスの肺細胞との融合により、試験管内において増殖・
複製可能でしかもモノクローナル抗体を産生ずる雑種細
胞（ハイブリドーマ）を作製する方法は、ケーラーおよ
びミルシュタイン〔ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）、２５
６．４９５−４９７，１９７５）により報告されている
。ハイブリドーマは、ある特定の抗原決定基に対しての
み特異性のある均質な抗体（モノクローナル抗体）を分
泌するという性質をもつことから、種々のモノクローナ
ル抗体を産生ずるハイブリドーマが作製され、各種のウ
ィルス抗原や細菌抗原のみならず、細胞表面の分化抗原
や癌抗原、さらには生体微量抗原成分の検出や精製のた
めの有用な手段として用いられている。さらに、これら
微量抗原成分に対するモノクローナル抗体は、各種の疾
患の診断、検査にも有効に利用されている。

ハイブリドーマの一般的な取得方法としては、まず抗原
で免疫されだ哺乳類動物、例えばマウスやラットの肺細
胞（Ｓｐｌｅｎｏｅｙｔｅ、以下Ｓと略す、）とヒボキ
サンチン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
欠損骨髄腫細胞（Ｍｙｅｌｏｍａ　　ｃｅｌｌｓ、以下
Ｍと略す、）とを融合促進剤、例えばポリエチレングリ
コール１５００　：ＰＥＧ１５００）の存在下で融合さ
せ、ヒボキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡ
Ｔ）を含む培地中で、Ｓ−Ｍ融合細胞のみをマルチプレ
ート上で増殖させ、Ｍ−Ｍ融合細胞および遊離Ｍを死滅
させる０次いで、増殖の見られたウェルから、目的の抗
体を産生ずる細胞（ハイブリドーマ）を限界希釈法など
でクローニングする。

つぎに、該ハイブリドーマをｉｎ　　ｖｉＬｒｏで培養
するか、または動物（例えばマウスの腹腔内）に移植培
養することにより、特定の抗原に対するモノクローナル
抗体を大量に取得することができる。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は、ｈ−ＴＮＦと特異的に結合してその細胞毒性
を中和し、ヒト由来リンホトキシンおよび異種動物由来
のＴＮＦと交叉活性を示さず、また非活性型ｈ−ＴＮＦ
とも交叉反応しない、活性を持つｈ−ＴＮＦに対する特
異的なモノクローナル抗体を取得することを目的とする
。

本発明は、そのような抗体を使用して、免疫化学的方法
、例えばＥＬＩＳＡ法で、活性を有するｈ−ＴＮＦを選
択的に測定する方法を提供することを目的とする。

（問題点を解決するための具体的手段）本発明の抗体は
、ｈ　−ＴＮ　Ｆで免疫された哺乳動物（好ましくはマ
ウス）から取り出した抗体産生細胞と適当な動物（好ま
しくはマウス）の１１瘍細胞、例えばミエローマとを融
合させ、目的抗体を産生ずる融合細胞をクローン化して
得られるハイブリドーマを培養して製造される。

ａ）抗体産生細胞のｍ製 本発明のハイブリドーマを得るためには、まずｈ　−Ｔ
Ｎ　Ｆで哺乳動物を免疫感作する。哺乳動物としてはマ
ウス、ラット、ウサギ、モルモット等−Ｃに用いられて
いる動物が使用できる０例えば、マウスに抗原としてｈ
−ＴＮＦを腹腔または皮下環に接種することにより免疫
する。接種は一回当たり抗原１０〜３０ｐｇ／マウスを
同量のアジュバントと混和懸濁液として、１〜２週間毎
に数回繰り返す、最終免疫は抗原をそのまま５０〜１５
０ｐｇ／マウス静脈内または腹腔内に注射して、３〜４
日目に膵臓を摘出し、抗体産生細胞として使用する。ｈ
−ＴＮＦは、ヒト由来のリンパ系ｔＭ胞から誘導産生さ
れ、精製されたものでも組換えＤＮＡ技術によって造成
されたｈ　−ＴＮ　Ｆ産生微生物の培養物から調製され
たものでもよい。

ｂ）骨髄腫細胞の調製 使用する骨髄腫細胞（ミエローマ）に特別の制限はなく
、マリス、ラット、ウサギ、ヒト等の動物の細胞株が使
用できるが、通常マウスのミエローマ細胞が用いられる
。一般的にはヒボキサンチン・グアニン・ホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ欠…（ＨＧＰＲＴ−）あるいはチ
ミジンキナーゼ欠損（ＴＫ−）等の適切な選択マーカー
をもったミエローマ等のＩＩｌｉｇＩ細肥株、例えばＰ
３−Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕｌ。

ＳＰ２Ｏ−Ａｇ１４、Ｘ６３−Ａｇ８−６．５゜３を用
意する。このａｍ細胞は８−アザグアニン抵抗性の細胞
株で、ＨＡＴ培地中では生育できない性質をもつ。

Ｃ）細胞融合 培地としてイーグル最小基本培地（ＭＥＭ）、ダルベツ
コの改良ＭＥＭ、ロズウェル・パーク・メモリアル・イ
ンスティテユート（ＲＰＭＩ）１６４０などの通常使用
されているものに１０％Ｃ３（ｃａｌｆ　　ｓｅｒｕｍ
）または５％ＦＣ３（ｒｅｔａｌ　　　ｃａｌｆ　　　
ｓｅｒｕｍ）＋５％Ｃ３、あるいは１０％ＦＣ５を加え
る。親細胞の通常の維持は上記のいずれの培地でもよい
が、雑種細胞の作製にはｌＯ％ＦＣ３が望ましい、細胞
融合は、親細胞であるミエローマ等のＩｌ瘍細胞と免疫
感作された肺細胞（抗体産生細胞）どを１：５〜１：１
０の割合で混合して融合促進剤の存在下で行われる。融
合促進剤としてはＨＶＪ（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔ
ｉｎｇ　　Ｖｉｒｕｓ　　ｏｒＪａｐａｎ）、ポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ）等を使用する。特に、ＰＥＧ
Ｌ５００の３０〜５０％程度が良い。

ｄ）バイプリドーマのＨＡＴ選択 融合後の細胞を２０％ＦＣ５含有ＲＰＭ１１６４０培地
などで適当に希釈し、マイクロカルチャープレート（通
常９６ウエルタイブ）に１０ｓ〜ｌ　Ｏ６／１００．ｄ
／ウェル程度に植えつける。

各ウェルにＨＡＴ選択培地を加え、通常１〜２日毎に培
地の交換を行い培養す粂、ミエローマ細胞として８−ア
ザグアニン抵抗性株を用いれば、未融合のミエローマ細
胞およびＭ−Ｍ融合細胞はＨＡＴ培地中では約１０日で
死滅し、また肺細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）は正常細
胞であるから寿命があり、ｉｎ　　ｖｉｔｒｏでは２週
間以上は生育できない、従って、培５１０−１４日位か
ら生育してくるものは全てＳ−Ｍハイブリドーマと考え
られる。

Ｃ）ハイブリドーマのスクリーニング スクリーニングは、主にハイブリドーマの増殖したウェ
ルの培養上清を用いたＥＬ　ｆｓＡ　（Ｅｎｚｙｍｅ　
　ｌｉｎｋｅｄ−ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　　ａｓ
ｓａｙ）法など公知の方法を用いて目的の抗体を分泌し
ているハイブリドーマのクローンをひろいあげることに
より行う。

ｒ）クローニング 各ウェル中には、異なる抗体を産生じている２種以上の
ハイブリドーマが生育している可能性があるが、限界宿
駅法などによりクローニングを行い、最終的に目的のモ
ノクローナル抗体を産生じている単一性のハイブリドー
マを得ることができる。

ｇ）モノクローナル抗体の取得 上記で得られたハイブリドーマを培養容器中（ｉｎ　　
ｖｉＬｒｏ）または動物体内（ｉｎ　　ｖｉｖｏ）で培
養する。ｉｎ　　ｖｉｔｒｏで培養する場合、培地は先
に述べた通常培地にＣ３またはＦｅ２を添加したもので
よく、この培地で３〜５日培養の後、培地上清より目的
の抗体を得ることが出来る。±ｎ　　ｖｉｖｏによる培
養ではミエローマ細胞と同系の動物にブリスタン（２，
６゜１０．１４−テトラメチルペンタデカン）などの鉱
物油を腹腔内に投与した後、少なくとも１週間以上経過
してから、ハイブリドーマを腹腔内に接種し、７〜１４
日後に貯留してくる腹水を採取し、これより目的の抗体
を得ることができる。

このようにして得られるモノクローナル抗体は、ｈ−Ｔ
ＮＦ　（特に活性型ｈ−ＴＮＦ）の測定や検出に利用す
ることができる。ＴＮＦのＬ９２９ｍ胞に対する細胞毒
性は、ＴＮＦの主要な指標であリ、従来、ＴＮＦの力価
測定はＬ９２９細胞を用いたバイオアッセイが行われて
いるが、この方法は高感度である反面、時間がかかり、
バイオアッセイ特存の煩雑さがある。そこで、本発明に
おけるモノクローナル抗体をｈ−ＴＮＦポリクローナル
抗体と併用して、迅速かつ筒便な酵素免疫測定法（ＩＥ
Ｌ　Ｉ　ＳＡ）を確立した。ここで用いられるポリクロ
ーナル抗体はモノクローナル抗体を得た動物と異なる種
由来のｈ−ＴＮ　Ｆに特異的な抗体であれば、何れのも
のでも使用することができる。

以下、実施例により本発明の詳細な説明する。

（実施例） 実施例１　　ｈ−ＴＮＦモノクローナルＦｙ木ｑ木型４
盟）放凰東週Ｘ ＴＮＦ遺伝子を含むプラスミドｐＴ４ＴＮＦＳＴ８ｒｏ
ｐ−形質転換された大腸菌株Ｗ３１１０／ｐＴ４ＴＮＦ
ＳＴ８ｒｏｐ−（特願昭６０−２１７７４０号）を、テ
トラサイクリンｌＯ１！ｇ／ｒｎ１を含むＧＣ培地（２
％グリセリン、３％カザミノ酸、０．５％ＫＨ２ＰＯ４
，０，２％酵母エキス、０．１％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０
、聞６．５）で３７℃、１５時間、３！用量（実容量２
ｆｆｉ）のジャーファーメンタ−を用いて培養した０次
に１０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ＰＨ８）（以下単にトリ
スバッファーと称する）に遠心集菌した菌体を懸濁し、
冷却上高圧ホモゲナイザ−（Ｍａｎ、ｔｏｎ−Ｇａｕｌ
ｉｎ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｈｏｍ。

ｇｅｎｉｚｅｒ　　１５Ｍ−８７Ａ）を用い８０００ｐ
ｓ＋で破砕した後、遠心し上清を得た。これに硫酸アン
モニウムを８０％飽和になるよう添加して生じる蛋白質
沈澱をトリスバッファーに溶解し、同バッファーに対し
充分透析を行った後、ＤＥＡＥ　トヨバール６５０Ｃ（
東洋曹達社製）カラムクロマトグラフィーにかけた。Ｔ
ＮＦ活性画分はＯｍＭから３００　ｍ、Ｍの直線的濃度
勾配をもつ塩化ナトリウム溶液を流すことにより溶出さ
れた。

続いて、ＴＮＦ活性画分をトリスバッファー（ｐＨ７）
で希釈後、ＤＥＡＥセフｙＯ−ＸＣＬ−６Ｂ（ファルマ
シア社製）カラムにかけ、ＯｍＭから２００ｍＭの直線
的濃度勾配をもつ塩化ナトリウム溶液を流し、ＴＮＦ活
性丙分を得た。この精製工程でも、ＳＤＳ　　ＰＡＧＥ
による解析でほぼ単一のＴＮＦ活性を有する蛋白質のバ
ンドが得られたが、さらにこの両分をマドレックスブル
ーＡ（アミコン社製）およびフェニルセファロースＣＬ
−４Ｂ（ファルマシア社製）カラムにかけることにより
精製した。また、上記再クロマトグラフィーによって得
られたＴＮＦ標品をゲル濾過担体であるセファクリル３
２００を用いてさらに純度をあげることができた。

最終的に得られたＴＮＦ標品は、マイクロポンダバフク
ＣＩ８カラム（ウォーターズ社製）を用いた逆用高速液
体クロマトグラフィー（島津製作所社！５２）により精
製後、自動アミノ酸分析２３（日立製作所社製８３５−
５０型）を用い常法に従いアミノ酸分析を行ワた。その
結果、第１図のアミノ酸配列から期待されるアミノ酸組
成とよく一致した。

また、上記精製蛋白質のアミノ酸末端のアミノ酸配列を
エドマン法に準じ、気相プロテインシークエンサーＭｏ
ｄｅｌ　　４７０Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍ社製）を用いて解析した結果、第１図に示すアミ
ノ酸配列と完全に一致していることが認められた。以下
、ここで得られたｈ−ＴＮＦをｒ、ｈ−ＴＮＦと呼ぶ。

（ｂ）立宜坐免炎 精製したｒ、ｈ−ＴＮＦ　（１０ａｇ）をフロイント・
コンプリート・アジユバント（ＦＣＡ）とともに懸濁し
て４〜５週令Ｂ　ａ　Ｉ　ｂ　／　ｃマウス腹腔内に５
ｎ／マウス投与した。追加免疫は、２〜４週間隔で２回
、各々初回免疫と同量のｒ、ｈ−ＴＮＦをフロイント・
インコンプリート・アジユバント（Ｆ　Ｉ　ＣＡ）に懸
濁してＢａ１ｂ／ｅマウス腹腔内に５＃ｇ／マウス投与
した。３回目の免疫注射の３週間後にｒ、ｈ−ＴＮＦを
リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解し、１０ｎ／マウス投与
して最終免疫とした。

（ｃ）ＭＭｘｆＬ 最終免疫の３日後にマウスより１ｌＩＩ！臓を摘出して
細断したのち、ステンレスメツシュで減退することによ
って得た肺細胞をマウスミエローマ細胞（Ｐ３−Ｘ６３
−Ａｇ８Ｕ１　：略称Ｐ３Ｕ１）と４：１で混合し、５
０％ポリエチレングリコール１５４０（ＢＤＨ社製）を
用いて細胞融合を行った。１０％ＦＣ３−ＲＰＭ［培地
にミエローマ細胞としてｌＸ１０６細胞／−前後になる
ように懸濁し、９６ウエルマイクロカルチヤープレート
に１００１１！／ウエルづつ分注した。

１日後、ＨＡ　Ｔ培地を各ウェルに１００μｊづつ添加
し、以後３日ごとに半分量を）Ｉ　Ａ　Ｔ培地で交換し
たところ、５日目位からいくつかのウェルにハイプリド
ーマの生育が認められ、２週間後にはほぼ全ウェルでハ
イブリドーマが増殖した。

（ｄ）ｍ種細胞の進疋ζ久ユニ三７９’ｒ、ｈ−ＴＮＦ
を０．１Ｍ炭酸水素ナトリウムバッファー（ＰＨ９，６
）で１０ｕｇ／ｍｌに調整したものを、９６六マイクロ
プレート（Ｃｏｓｔａｒ社製）にｆｏｏｄ／ウェルずつ
分注した。プレートを４℃で一晩放置後、その上清を除
去し、ウェル内の残りの蛋白質結合部位は１％卵白アル
ブミンを含むＰＢＳでブロッキングした０次に０．１％
ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０含有ＰＢＳ　（略称Ｐ　Ｂ
　５−Ｔ）で洗浄後、雑種細胞培養上清を１００１１／
ウエル分注して、３７℃で２時間保温後、プレートをＰ
ＢＳ−Ｔで３回洗浄して、アルカリフォスファターゼ標
識山羊１ｇＧ抗マウス夏ｇＧ（Ｈ）（ＰＬ　　Ｂｉｏｃ
ｈｅｒｎｉｃａｌｓ社製、Ｌ　ｏ　ｔ　＃　１２１　２
　）　０）　Ｉ　Ｏ００Ｍ希Ｙ’！’！Ａｊ、’Ｅ　１
００ｐ！／ウエルずつ分注した。室温で２時間保温後、
ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、４−メチルアンペリフェリルーフ
ォスファターゼ（４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅ
ｒｙｌ−ｐｈｏｓｐｈａＬａｓｅ）を１．７■１５０ｐ
ｌ／ウエルずつ分注した８次いで、室温で１０分間保温
した後、ＩＭＫ２ＨＰ０４−ＫＯＨ（９ＨＬ０．３）を
Ｌ５Ｑｄ／ウェル添加して反応を停止させ、反応生成物
の蛍光強度をコロナ・マルチスペクトロフルオロメータ
ーを用いて、抗ｈ−ＴＮＦ抗体の分泌量を測定した（励
起波長：λ３６５ｎｍ、消光波長：λ４５０ｎｍ）ａ 強い抗体活性が認められたウェルについて、限界希釈法
によりクローニングを行い、１個のクローンを得、この
ハイブリドーマの培養によって得られるモノクローナル
抗体をＭＡＢ−３８１０と命名した。

ＭＡＢ−３８１０は、組換えヒトＴＮＦ　（ｒ。

ｈ−ＴＮＦ）で免疫感作したマウスの抗体産生細胞とマ
ウスミエローマとのバイプリドーマより得られたモノク
ローナル抗体であるのでｒ、ｈ−ＴＮ　Ｆ　トＴＮ　Ｆ
産生細胞（Ｕ９３７細胞：ＡＴＣＣＣＲＬ　　１５９３
）の培養上清より精製したｈ−ＴＮＦに対する中和活性
を比較検討した。

ｈ−ＴＮＦとｒ、ｈ−ＴＮＦを各々１０％ＦＣ３−ＭＥ
Ｍで２５６Ｕ／ｍｊに：Ａ製したものをＭＡＢ−３８Ｉ
　Ｑと等■混合した。４℃で一晩放置後、Ｌ９２９１１
１胞を用いたバイオアッセイにより中和活性をみると両
者とも細胞毒性に対する中和活性を示した。さらに詳し
く反応性を検討する目的で、ｈ−ＴＮＦおよびｒ、ｈ−
ＴＮＦを１０％ＦＣ３−Ｍ　Ｅ　Ｍで２．　６００　Ｕ
／ｌｎｌに調製したものを０゜５〜５００■／ｄの各濃
度のＭＡＢ−３３１０と等量混合し、４℃で一晩放置し
た後、Ｌ　９２９を用いたバイオアッセイにより、両Ｔ
ＮＦに対するＭＡＲ−３Ｂ１０の中和活性を調べた。結
果を第２図に示す、ｈ−ＴＮＦに対する中和活性のほう
が若干強かったが、バイオアッセイにおけるサンプルの
蛋白質濃度標定段階での相対的誤差範囲内であり、ＭＡ
Ｒ−３Ｂ１０のｈ−ＴＮＦとｒ、ｈ−ＴＮＦに対する活
性中和反応性はほぼ同程度であった。

ヒトＴＮＦ　（ｈ−ＴＮＦ）、　ｔＪ１換え型ヒトＴＮ
Ｆ　（ｒ、ｈ−ＴＮＦ）　、マウスＴＮＦ　（ｍ−ＴＮ
Ｆ）、組換え型マウスＴＮＦ　（ｒ、ｍ−ＴＮＦ）、ウ
サギＴＮ　Ｆ　（ｒ　　ＴＮ　Ｆ　）をＰＢＳで各々２
５６単位／　ｒｎｌに調製したものをＭＡＲ−３Ｂ　１
０またはｈ−ＴＮ　Ｆに対するウサギポリクローナル抗
体（以下この抗体をＰＡＢ−Ｒ５と呼ぶ）と等昨混合し
た。４℃で一晩放置後、Ｌ９２９を用いたパイオアフセ
イ法により、各種ＴＮＦのＬ９２９細胞毒性に対するＭ
ＡＢ−３８１０の中和活性を検討した。その結果を第１
表に示す。

第１表　各種ＴＮＦのＬ９２９９２９細胞毒性対するＰ
　Ａ　Ｂ　−Ｒ５およびＭＡｂ−３８１０の中和活性 ＭＡＢ−３Ｂ　ｌ　ＯおよびＰ　Ａ　Ｂ　−Ｒ５はヒト
ＴＮＦ　（ｈ−ＴＮＦ、ｒ、ｈ−ＴＮＦ）にのみ中和活
性を示し、異種動＠ＩＪ（マウス、ウサギ）由来のＴＮ
Ｆに対しては中和活性を示さなかった。

抗ＴＮＦ抗体を用いて免疫学的測定法でＴＮＦの力価を
測定する場合、特に活性型ＴＮＦと非活性型ＴＮＦを識
別できる抗体を使用することが重要である。そこで、本
発明のモノクローナル抗体を使用したＥＬＩＳＡ法によ
る活性型ＴＮＦの力価測定の再現性と有用性を調べる目
的で、加ｒＡ変性ＴＮＦ　（不活型ＴＮＦ）がＥＬＩＳ
Ａ法により交叉反応を示すか検討し、バイオアッセイと
比較した。５０ｙｇ／−のｒ、ｈ−ＴＮＦをＰＢＳ中に
調製し、７０℃で３０．６０．９０，１２０および１８
０分間インキエベートした。各時間に於けるインキエベ
ート後、各サンプルを直ちに水冷し、１０．００Ｏｒｐ
ｍ、５分間の遠心分離を行った。

次にその上清についてＥＬＩＳＡ法およびＬ９２９細胞
を用いた細胞毒性試験を行った。その結果を第３図に示
す、ＥＬＩＳＡ法による結果と、バイオアッセイによる
結果は明らかに正の相関性を示した。ＭＡＢ−３８１０
は、７０℃の加熱により変性したヒトＴＮＦ、つまり不
活化したヒトＴＮＦには結合しなかった事実は、ＭＡＢ
−３Ｂ１０がＴＮＦのＬ９２９細胞に対する細胞毒性を
中和する活性を有していることと合わせ考えるなら、Ｍ
ＡＢ−３８１０はＴＮＦの生物学的活性に関与する部分
のみを特異的に認識していることを強く示唆するもので
ある。

ヒト由来リンホトキシン（ｈ−ＬＴ）および組換え型ヒ
ドリンホトキシン（ｒ、ｈ−ＬＴ）をＰＢＳ中で各々６
．　４００　Ｕ／ｍｌおよびＩＯＢ／ｍｆｆ１に調製し
、１００　ｔｒｉをウサギ由来抗リンホトキシン抗体（
ＰＡＢ−Ｒａｂｂｉｔ　　ａｎｔｉ−ｈＬＴ）またはＭ
ＡＢ−３８ＩＯと等計混合した。４℃で一晩放置後、Ｌ
９２９を用いたバイオアッセイにより、各リンホトキシ
ンのＬ９２９細胞毒性に対するＭＡＲ−３８１０の中和
活性を検討した。

その結果を第２表に示す。

第２表　ｈ−ＬＴのＬ９２９細胞毒性作用に対するＭＡ
Ｒ−３３１０の中和活性 ＭＡＢ−３８１０はヒト由来リンホトキシンおよびＭＥ
換え型リンホトキシンに対して、全く中和活性を示さな
かった。

実施例３−１ノン仏匹−＋、ど坑」８２惣月目ζ学皇け
１π以下の物性測定は、実施例１で精製したモノクロー
ナル抗体（ＭＡＲ−３８１０）を用いて行った。

１）抗体のクラスとアイソタイプ ＭＡＢ−３８１０のクラスとアイソタイプを１゜５％Ｆ
４層アガロースゲルを用いた免疫電気泳動法で調べたと
ころ、ザブクラスはＩｇＧ、であり、ＬｍＯタイプはｇ
ｔｌ＋を持つ抗体であった。

２）等電点 等電点を州範囲３．５〜９．５の１層ポリアクリルアミ
ドゲルを用いた等電点電気泳動法で測定した。その結果
ＭＡＢ−３８１０の等電点は６゜２±０．１であった。

実施例４ 素　　測　法　ＥＬｒＳＡ　　によるｈ−ＴＮヱ立斑定 ｈ−ＴＮＦを迅速かつ筒便に測定するために、ウサギｈ
−ＴＮＦポリクローナル抗体（ＰＡＢ−Ｒ５）とビオチ
ン標識したＭＡＢ−３８１０を用いたＥＬｒＳＡ法の改
良について検討した。

コーティング緩衝液（Ｎａ　２ＣＯ３：　１．５９ｇ　
／　ｌ　、　Ｎ　ａ　ＨＣＯｓ　＝　２−９３　ｇ　／
　’　、ｐＨ９。

６）を用いてＰＡＢ−Ｒ５を２０雌／−に調製したのち
、９６穴マイクロカルチヤープレートに１００ｐＫ／ウ
エル分注した。４℃で一晩放置後、上清を捨て、１％卵
白アルブミンを含むＰＢＳを１５０ｐ１／ウェル分注し
、３７℃で１時間静置した。

種々の濃度に調製したＴＮＦをＰＡＢ−Ｒ５でコーティ
ングしたプレートに１００ａｊ／ウェル分注し３７℃で
２時間反応させた。０．１％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２
０を含むＰＢＳ　（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄後、ビオチ
ン標識したＭＡＢ−３８ＩＯ（２，０００倍希釈液）を
１００１１！／ウェル分注し、３７℃で２時間反応させ
た０次いで、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、ストレプトアビ
ジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ
社製：ｉ、ｏｏｏ倍希釈液）を１００パ／ウェル分注し
、室温で１時間反応させた。この混合液に０−フェニレ
ンジアミン（０，４３ｕ／ｍ１．ｐＨ４゜８）と■（２
０□（０，００２％）を０．１Ｍクエン酸バッファー中
に調製したもの２００ｄ／ウエル添加し、暗所、室温で
３０分間反応させた０反応は３ＭのＨ２ＳＯ，を５０ｄ
／ウエル添加して停止させた。吸光度をグイナテック・
マイクロイライザオートリーダー（４９０ｎｗ）で測定
した。

第４図に示すように２〜６０ｎｇ／−の範囲で濃度依存
的にｈ−ＴＮＦを検出できた。このことから、測定感度
はＬ９２９を用いるパイオア７セイの場合とほぼ同程度
であることがわかり、従ってこの方法により未知試料中
のＴＮＦを迅速かつ確実に検出できることを確認した。

（発明の効果） 本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＴＮＦの細胞毒性
に対して中和活性をもち、また非活性型ＴＮＦおよび異
種動物ＴＮＦには結合せず、さらにヒト由来リンホトキ
シンと交叉反応を示さない。

即ち、生物学的活性をもつヒトＴＮＦのみにだけ反応す
るので、ヒ）ＴＮＦの活性を従来の煩雑なバイオアッセ
イに変えて容易に測定することが可能となる０例えば、
ポリクローナル抗体と共に用いて、ＥＬＩＳＡにより、
特定のヒトＴ　Ｎ　Ｆだげを検出することが出来る。ま
た、本発明におけるヒトＴＮＦに特異的なモノクローナ
ル抗体を利用して、ヒ）ＴＮＦの＄ｉ？ｍ、免疫学約定
■を行うことも可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒトＴＮＦのアミノ酸配列を示す配列図であり
、 第２図はヒトＴＮＦおよび組換え型ヒトＴＮＦの細胞毒
性に対するＭＡＲ−３８Ｉ　Ｏの中和活性のグラフであ
り、 第３図は加熱変性したヒトＴＮＦのバイオアッセイおよ
びＥＬＩＳＡによる検贋曲線グラフを示し、 第４図はポリクローナル抗体（ＰＡＢ−Ｒ５）とＭＡＢ
−３８１０を併用したＥＬ［ＳＡによるヒトＴＮＦのｇ
Ｑ曲線グラフを示す。 特許出願人　　　サントリー株式会社 代理人　　　　　弁理士　温浸　恭三−外５名 具ｌ凹 ＋１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　＋２０ＣｙｓＧｌ　ｎＡｒｇＧＩ　ｕＴｈｒρｒ
ｏＧＩ　ｕＧ　ｌｙＡ　ｌ　（ＬＧＩＬＩＡ　ｌ　（ｌ
Ｌ７ｓ　ＰｒｏＴｒｐＴ　ｙ　ｒＧ　１ｕＰｒｏ　Ｉ　
ｌ　ｅＴｙｒ　Ｌ＠ｕＧｌ　ｙ　Ｇｌ　ｙＶａｌ　Ｐｈ
＠ＧｌｎＬｅ　ｕ　ＧＩｕＬｙｓ　Ｇ　Ｉ　ｙＡｓｐＡ
ｒｇ　ＬｅｕＳｅｒＡ　１ａＧＩｕ　Ｘ　ｌ　ｅＡ　ｓ
ｎＡｒｇＰｒｏＡｓｐＴｙｒＬ＠ｕＡｓｐＰｈ＠Ａ　１
ａＧＩ　ｕｓｅｒＧＩ　ｙＧＩ　ｎＶａｌＴｙ　ｒ　Ｐ
ｈｅＧｌ　ｙ　Ｉ　Ｉ　ｅ　Ｉ　ｌ　ｅＡＩｃＬｅｕ巻
２０

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の性質： ａ、ヒト腫瘍壊死因子の腫瘍細胞に対する細胞毒性を中
   和する； ｂ、腫瘍細胞に対する細胞毒性を失った非活性型ヒト腫
   瘍壊死因子およびヒト以外の動物の腫瘍壊死因子とは、
   免疫反応で結合しない； ｃ、リンホトキシンと免疫反応で結合しない；ｄ、サブ
   クラスがＩｇＧ＿１であり、Ｌ鎖のタイプがアイソタイ
   プκである； ｅ、等電点は６．２±０．１である； を有するヒト腫瘍壊死因子の活性部位に対する特異的モ
   ノクローナル抗体。
2. （２）組換えＤＮＡにより得られた式 I ： 【遺伝子配列があります】 （ I ） のアミノ酸配列で表されるヒト腫瘍壊死因子で感作した
   マウスの肺細胞とマウス骨髄腫細胞とのハイブリドーマ
   から得られることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載のモノクローナル抗体。
3. （３）ＭＡＢ−３Ｂ１０の名称で表される特許請求の範
   囲第１項記載のモノクローナル抗体。
4. （４）特許請求の範囲第１項ないし第３項記載のモノク
   ローナル抗体を用いてヒト腫瘍壊死因子の活性を測定す
   る方法。
5. （５）ＥＬＩＳＡ法である特許請求の範囲第４項記載の
   方法。