JPS6020995B2 - 発酵法によるウリカ−ゼの製造法 - Google Patents
発酵法によるウリカ−ゼの製造法Info
- Publication number
- JPS6020995B2 JPS6020995B2 JP53024482A JP2448278A JPS6020995B2 JP S6020995 B2 JPS6020995 B2 JP S6020995B2 JP 53024482 A JP53024482 A JP 53024482A JP 2448278 A JP2448278 A JP 2448278A JP S6020995 B2 JPS6020995 B2 JP S6020995B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- uricase
- enzyme
- buffer
- medium
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は発酵法によるウリカーゼの製造法に関する。
さらに詳しくは、本発明はトリコスボロン属に属し、ウ
リカーゼ生産館を有する微生物を栄養培地に培養し、培
養物中にゥリカーゼを生成せしめ、これを採取すること
を特徴とするウリカーゼの製造法に関する。ウリカーゼ
（ＥＣ１７紙）は尿酸を酸化的に加水分解して、アラン
トィンと過酸化水素および炭酸ガスを生成する作用を触
媒する酵素である。本酵素は診断用試薬として血中ある
いは尿中の尿酸含有量の測定に使用され、また尿酸が体
内に過剰に蓄積することによっておこる痛風、関節炎等
の治療薬としても注目されている。従来、発酵法による
ゥＩＪカーゼの製造法としては、ミクロコツカス属、ブ
レビバクテリウム属（特公昭４４−１４７班号公報）、
キャンディダ属（特公昭４２一５１９２号公報）、スト
レプトミセス属（Ａｇ比．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ
．＄，１２８２，１９６９）などに属する微生物を用い
る多くの方法が知られている。
リカーゼ生産館を有する微生物を栄養培地に培養し、培
養物中にゥリカーゼを生成せしめ、これを採取すること
を特徴とするウリカーゼの製造法に関する。ウリカーゼ
（ＥＣ１７紙）は尿酸を酸化的に加水分解して、アラン
トィンと過酸化水素および炭酸ガスを生成する作用を触
媒する酵素である。本酵素は診断用試薬として血中ある
いは尿中の尿酸含有量の測定に使用され、また尿酸が体
内に過剰に蓄積することによっておこる痛風、関節炎等
の治療薬としても注目されている。従来、発酵法による
ゥＩＪカーゼの製造法としては、ミクロコツカス属、ブ
レビバクテリウム属（特公昭４４−１４７班号公報）、
キャンディダ属（特公昭４２一５１９２号公報）、スト
レプトミセス属（Ａｇ比．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ
．＄，１２８２，１９６９）などに属する微生物を用い
る多くの方法が知られている。
又、本発明者と同一人にかる特厭昭５２−１１２９６号
明細書には、ェンテロバクター属に属する微生物を用い
てウリカーゼを製造する方法が開示されている。
明細書には、ェンテロバクター属に属する微生物を用い
てウリカーゼを製造する方法が開示されている。
本発明者らはウリカーゼを生産する能力を有する微生物
を広範囲にわたり検索した結果、トリコスポロン属に属
する菌株がウリカーゼを箸量にしかも経済的に生産する
ことを見出し本発明を完成するに到った。
を広範囲にわたり検索した結果、トリコスポロン属に属
する菌株がウリカーゼを箸量にしかも経済的に生産する
ことを見出し本発明を完成するに到った。
以下本発明をさらに詳細に説明する。
本発明によれば、トリコスポロン属に属し、ウリカーゼ
生産能を有する微生物を栄養培地に培養すれば培養物中
にウリカーゼが生成するので、これを採取する。
生産能を有する微生物を栄養培地に培養すれば培養物中
にウリカーゼが生成するので、これを採取する。
本発明に使用される微生物は、トリコスポロン属に属し
、ウリカーゼを生産する能力を有するものであれば、い
ずれの菌株でもよい。
、ウリカーゼを生産する能力を有するものであれば、い
ずれの菌株でもよい。
好適な菌株としてはトリコスポロン・クタニウム（Ｔｒ
ｉＣｈｏＳｐｏｒｏｎＣｕｔａＭｕｍ）ＫＹ５５７５（
ＩＦ。
ｉＣｈｏＳｐｏｒｏｎＣｕｔａＭｕｍ）ＫＹ５５７５（
ＩＦ。
０７１４）トリコスポロン・ヘテロモルフム（Ｔｒｉｃ
ｈｏｓｐｏｒｏｎｈｅｔｅｒｏｍｏｒｐｈｕｍ）ＡＴＣ
Ｃ２０００１等があげられる。
ｈｏｓｐｏｒｏｎｈｅｔｅｒｏｍｏｒｐｈｕｍ）ＡＴＣ
Ｃ２０００１等があげられる。
本発明に使用される栄養塔地は炭素源、窒素源、無機物
、その他使用菌株の必要とする徴量栄養素を程よく含有
するものであれば合成培地、天然培地のいずれも使用可
能である。
、その他使用菌株の必要とする徴量栄養素を程よく含有
するものであれば合成培地、天然培地のいずれも使用可
能である。
炭素源としては、グルコース、フラクトース・シュクロ
ース、糟蜜などの炭水化物のほか尿酸なども用いられる
。
ース、糟蜜などの炭水化物のほか尿酸なども用いられる
。
窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、
リン酸アンモニウム、尿素などのほか、グルタミン酸な
どのアミノ酸類、あるいは尿酸など無機あるいは有機の
窒素化合物が使用できる。
リン酸アンモニウム、尿素などのほか、グルタミン酸な
どのアミノ酸類、あるいは尿酸など無機あるいは有機の
窒素化合物が使用できる。
さらに窒素源としては、ベプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、コーン・ステーブ・リカーなど窒素含有天然物も使
用できる。そのほかグアニン、アデニン、ヒボキサンチ
ン、キサンチン、ウラシル、シトシン、オロツト酸など
の核酸関連物質、ィノシトール、チアミン、リボフラピ
ン、ピリドキシン、ニコチン酸、パラアミノ安息香酸、
パントテン酸カルシウム、ビオチンなどのビタミン類な
どが単独または組み合わせて用いられる。
ス、コーン・ステーブ・リカーなど窒素含有天然物も使
用できる。そのほかグアニン、アデニン、ヒボキサンチ
ン、キサンチン、ウラシル、シトシン、オロツト酸など
の核酸関連物質、ィノシトール、チアミン、リボフラピ
ン、ピリドキシン、ニコチン酸、パラアミノ安息香酸、
パントテン酸カルシウム、ビオチンなどのビタミン類な
どが単独または組み合わせて用いられる。
無機物としては、食塩、塩化カリウム、リン酸塩、マグ
ネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛
、鋼、モリブデン、コバルト、ホウ酸などの塩類が必要
に応じて使用される。
ネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛
、鋼、モリブデン、コバルト、ホウ酸などの塩類が必要
に応じて使用される。
そのほか、本菌の生育やゥリカーゼの生産を促進する有
機物や無機物を適当に添加することができる。一般に、
微生物によって生産されるウリカーゼは、誘導酵素であ
り、尿酸あるいはキサンチンまたはヒポキサンチンが培
地あるいは誘導塔地に存在しない場合にはウリカーゼが
生成しない。この点において、本菌は天然栄養源として
コ−ン・スチーブ・リカ一等を培地に含ませた場合には
尿酸などをとくに培地に加えなくても箸量のウリカーゼ
を生成する。また、一方、尿酸を培地中に存在させるこ
とによって、尿酸を存在させない場合に比べて明らかに
ウリカーゼの生成が増大する。しかしながら、この場合
も特願昭５２−１１２９６号に記載の細菌などの場合に
比べて極めて低い尿酸濃度で効果が認められる。したが
って、従来の菌株に比べて経済的なゥリカーゼの生産が
可能となる。
機物や無機物を適当に添加することができる。一般に、
微生物によって生産されるウリカーゼは、誘導酵素であ
り、尿酸あるいはキサンチンまたはヒポキサンチンが培
地あるいは誘導塔地に存在しない場合にはウリカーゼが
生成しない。この点において、本菌は天然栄養源として
コ−ン・スチーブ・リカ一等を培地に含ませた場合には
尿酸などをとくに培地に加えなくても箸量のウリカーゼ
を生成する。また、一方、尿酸を培地中に存在させるこ
とによって、尿酸を存在させない場合に比べて明らかに
ウリカーゼの生成が増大する。しかしながら、この場合
も特願昭５２−１１２９６号に記載の細菌などの場合に
比べて極めて低い尿酸濃度で効果が認められる。したが
って、従来の菌株に比べて経済的なゥリカーゼの生産が
可能となる。
尿酸を使用する場合、尿酸は培地中に最初から存在させ
てもよいし、培養途中に添加してもよい。
てもよいし、培養途中に添加してもよい。
培地中の尿酸濃度は５雌／ｄ‘で充分である。培養は、
通常振縄培養あるいは通気縄梓培養で行なう。培養温度
は２０〜４０℃、好適には３０℃付近で行なつｏ培地の
ｐＨは３．０〜７．０好適には４．０〜６．０の範囲に
あることが望ましい。
通常振縄培養あるいは通気縄梓培養で行なう。培養温度
は２０〜４０℃、好適には３０℃付近で行なつｏ培地の
ｐＨは３．０〜７．０好適には４．０〜６．０の範囲に
あることが望ましい。
培養期間は、１〜５日、通常は２〜４日間である。かく
して培養することにより、培養物中、主として菌体中に
ウリカーゼが生成蓄積する。
して培養することにより、培養物中、主として菌体中に
ウリカーゼが生成蓄積する。
培養物中からのウリカーゼの採取は次のように行なう。
培養終了後、培養物中から菌体を遠心分離などにより取
得し、ついでこの菌体を適当な手段で破砕し、破砕液か
ら遠０分離等によって上情液を得る。上蒲液を、通常酵
素精製に用いられる方法、たとえば塩折、有機溶媒沈澱
、透析、イオン交換セルロースクロマト、セフアデツク
スカラムクロマト、凍結乾燥などの方法にて処理する。
かくして精製ウリカーゼを得ることができる。本発明に
おけるウリカーゼの活性は次の方法で測定する。
得し、ついでこの菌体を適当な手段で破砕し、破砕液か
ら遠０分離等によって上情液を得る。上蒲液を、通常酵
素精製に用いられる方法、たとえば塩折、有機溶媒沈澱
、透析、イオン交換セルロースクロマト、セフアデツク
スカラムクロマト、凍結乾燥などの方法にて処理する。
かくして精製ウリカーゼを得ることができる。本発明に
おけるウリカーゼの活性は次の方法で測定する。
以下に述べる測定方法の原理は尿酸の示す２８劫伽にお
ける吸収（分子吸光係数、１２斑×１ぴ）の酵素反応に
よる減少度を測定することによって活性を算出するもの
で、例えば、下記の文献に記載されている。本発明者ら
はより測定精度を高めるために、この方法を大中に改変
して活性を測定した。１ Ｗｏｎｈｉｎｇｔｏｎ ｔ
ｅｃｈｎｉｃａｌ ｄａね ｓｈｅｅｔ，１７３３（１
９６４）２ Ｊ．Ｌ．Ｎｂｋｌｅｒ．ＡＭＩ．ＢｉＭｈ
ｅｍ．，３８，６５（１９７０）すなわち、次の第１表
に示す組成をもつ。
ける吸収（分子吸光係数、１２斑×１ぴ）の酵素反応に
よる減少度を測定することによって活性を算出するもの
で、例えば、下記の文献に記載されている。本発明者ら
はより測定精度を高めるために、この方法を大中に改変
して活性を測定した。１ Ｗｏｎｈｉｎｇｔｏｎ ｔ
ｅｃｈｎｉｃａｌ ｄａね ｓｈｅｅｔ，１７３３（１
９６４）２ Ｊ．Ｌ．Ｎｂｋｌｅｒ．ＡＭＩ．ＢｉＭｈ
ｅｍ．，３８，６５（１９７０）すなわち、次の第１表
に示す組成をもつ。
反応液１，０および各々の対照液を用いて各反応液の吸
光度測定を行ない、後述の式１より反応液中の尿酸の減
少による吸光度差を測定し、次いで式２より活性を算出
する。第１表 但し、以下の説明の便意上、第１表において、尿酸、０
．２Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ８．０）および水からな
る組成を組成Ｓ，，０．２Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ８
０）および水からなる組成を組成Ｓ２と称す。
光度測定を行ない、後述の式１より反応液中の尿酸の減
少による吸光度差を測定し、次いで式２より活性を算出
する。第１表 但し、以下の説明の便意上、第１表において、尿酸、０
．２Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ８．０）および水からな
る組成を組成Ｓ，，０．２Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ８
０）および水からなる組成を組成Ｓ２と称す。
次に実際の酵素反応を用いる各反応液の吸光度測定およ
び吸光度差、なちびに活性の算出法を以下に説明する。
反応液１の吸光度測定： 組成Ｓ，に酵素液を添加し、３７０でｌｑ分間反応させ
る。
び吸光度差、なちびに活性の算出法を以下に説明する。
反応液１の吸光度測定： 組成Ｓ，に酵素液を添加し、３７０でｌｑ分間反応させ
る。
反応後、ＩＮ塩酸．を添加し、２８知ｍでの吸光度を測
定する。この測定値をＡとする。反応液１の対照液の吸
光度測定： 組成Ｓ，にＩＮ塩酸を添加した後、酵素液を添加し２織
地での吸光度を測定する。
定する。この測定値をＡとする。反応液１の対照液の吸
光度測定： 組成Ｓ，にＩＮ塩酸を添加した後、酵素液を添加し２織
地での吸光度を測定する。
この測定値をＢとする。反応液０の吸光度測定：
組成Ｓ２に酵素液を添加し、３７０で１０分間反応させ
る。
る。
反応後、ＩＮ塩酸を添加し、２８飢ｍでの吸光度を測定
する。この測定値をＣとする。反応液０の対照液の吸光
度測定： 組成Ｓ２にＩＮ塩酸を添加した後、酵素液を添加し、２
脚血での吸光度を測定する。
する。この測定値をＣとする。反応液０の対照液の吸光
度測定： 組成Ｓ２にＩＮ塩酸を添加した後、酵素液を添加し、２
脚血での吸光度を測定する。
この測定値をＤとする。じ入上の測定値Ａ，Ｂ，Ｃおよ
びＤから、尿酸の減少による吸光度差（△Ｅ）は次式‘
１｝から算出する。
びＤから、尿酸の減少による吸光度差（△Ｅ）は次式‘
１｝から算出する。
即ち△Ｅ＝（Ｂ−Ａ）一（０一Ｃ） …｛１１尚
、反応液ロおよびその対照液の吸光度を測定する目的は
、反応条件下での酵素蛋白などによる吸光度の変化を測
定し、これを補正してより定量の精度（尿酸の減少）を
高めようとするものである。酸素活性（Ｕ／秋）△Ｅイ
ｍｉｎ×１０３×３×ｄｉｌｕｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ
．．．（２）１．２３８×１０４×０．５上の式で、酵
素活性は扮ご間に叫ｍｏＺｅの尿酸を分解する酵素量を
１単位（Ｕ）としたものである。
、反応液ロおよびその対照液の吸光度を測定する目的は
、反応条件下での酵素蛋白などによる吸光度の変化を測
定し、これを補正してより定量の精度（尿酸の減少）を
高めようとするものである。酸素活性（Ｕ／秋）△Ｅイ
ｍｉｎ×１０３×３×ｄｉｌｕｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ
．．．（２）１．２３８×１０４×０．５上の式で、酵
素活性は扮ご間に叫ｍｏＺｅの尿酸を分解する酵素量を
１単位（Ｕ）としたものである。
上の式で△Ｅ：尿酸の減少による吸光度差３：反応液量
（泌） ｄｉｌｕｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ：酵素の希釈倍率０．５
：使用酵素液量（舷）となる。
（泌） ｄｉｌｕｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ：酵素の希釈倍率０．５
：使用酵素液量（舷）となる。
したがって、１００のと（ｄ‘）あたりの活性で示す場
合は上式で算出された値を１００倍することになる。以
下実験例によって培地中の尿酸濃度の好適な範囲を示す
。
合は上式で算出された値を１００倍することになる。以
下実験例によって培地中の尿酸濃度の好適な範囲を示す
。
実験例 １
尿酸（第２表に示す濃度）、グルコース５．０タノｄ‘
、コーン・スチーブ・リカー２０夕／ｄ【、ＫＣそｏ．
０５夕／ｄ‘、Ｎａ２ＨＲ０４・１２日２０ ０．２夕
／ｄ‘、ＫＨ２Ｐ０４ ０．１夕／ｄ‘、ＭがＱ・７日
２０ ０．０５夕／ｄ‘、（ＮＨ４）２ＳＱ Ｏ．６夕
／ｄ‘、尿素※０．２夕／ｄ‘よりなる培地（ｐＨ５．
５）５０の‘を５００の【容振濠フラスコに入れ、１２
０午○で１８分間殺菌する。
、コーン・スチーブ・リカー２０夕／ｄ【、ＫＣそｏ．
０５夕／ｄ‘、Ｎａ２ＨＲ０４・１２日２０ ０．２夕
／ｄ‘、ＫＨ２Ｐ０４ ０．１夕／ｄ‘、ＭがＱ・７日
２０ ０．０５夕／ｄ‘、（ＮＨ４）２ＳＱ Ｏ．６夕
／ｄ‘、尿素※０．２夕／ｄ‘よりなる培地（ｐＨ５．
５）５０の‘を５００の【容振濠フラスコに入れ、１２
０午○で１８分間殺菌する。
〔※この際尿素は１０夕／１００の‘の溶液を調製し、
１２０ｑｏで３分間殺菌後、各１私を上の殺菌後の培地
（５０の‘）に添加する〕。各培地にトリコスポロン・
クタニウムｍｏｏ１７４を１白金耳接種し、３０午○で
６筋馬間振顔培養する。培養終了後、培養物を遠心分離
して（８００仇ｐｍ１５分）菌体を得る。培養液と同量
の０．０８Ｍホウ酸バッファーを使用して洗浄し、再び
遠心分離によって菌体を得る。
１２０ｑｏで３分間殺菌後、各１私を上の殺菌後の培地
（５０の‘）に添加する〕。各培地にトリコスポロン・
クタニウムｍｏｏ１７４を１白金耳接種し、３０午○で
６筋馬間振顔培養する。培養終了後、培養物を遠心分離
して（８００仇ｐｍ１５分）菌体を得る。培養液と同量
の０．０８Ｍホウ酸バッファーを使用して洗浄し、再び
遠心分離によって菌体を得る。
得られた緑菌体１夕とガラスビーズ（０．２５〜０．５
０風０）１０夕を上記のホウ酸バッファー５Ｍに懸濁し
、耐圧ガラス製試験管を用い周囲を氷水で冷却しながら
、内部を高速の蝿梓羽根によって櫨拝することによって
摩砕した。この蝿梓にはユニバーサルホモジナイザー（
日本精機ＫＫ製）を用い、ホモジナィザーの濃拝軸の先
端にポリウレタン製の手製の濃拝翼（２仇岬◇）を取り
付け、２０００〜３００比ｐｍの回転速度とした。破砕
液を遠心分離（１０００比ｐｍｌ０分）して上情液を得
る。上清液を酵素液とし、上に示したバッファで適当な
酵素濃度に希釈したものを酵素活性の測定に使用した。
結果を第２表に示す。第２表 実験例１に示すように本菌によるゥＩＪカーゼの生産は
上に述べた培地で尿酸無添加でも箸量のウリカーゼを生
成し、さらに尿酸を添加することによってウＩＪカーゼ
の生成の増大が認められた。
０風０）１０夕を上記のホウ酸バッファー５Ｍに懸濁し
、耐圧ガラス製試験管を用い周囲を氷水で冷却しながら
、内部を高速の蝿梓羽根によって櫨拝することによって
摩砕した。この蝿梓にはユニバーサルホモジナイザー（
日本精機ＫＫ製）を用い、ホモジナィザーの濃拝軸の先
端にポリウレタン製の手製の濃拝翼（２仇岬◇）を取り
付け、２０００〜３００比ｐｍの回転速度とした。破砕
液を遠心分離（１０００比ｐｍｌ０分）して上情液を得
る。上清液を酵素液とし、上に示したバッファで適当な
酵素濃度に希釈したものを酵素活性の測定に使用した。
結果を第２表に示す。第２表 実験例１に示すように本菌によるゥＩＪカーゼの生産は
上に述べた培地で尿酸無添加でも箸量のウリカーゼを生
成し、さらに尿酸を添加することによってウＩＪカーゼ
の生成の増大が認められた。
しかしながら尿酸の添加濃度は０．００５夕／ｄ‘で充
分な効果を示すことが判った。次に実施例２で得られた
酵素標品によるウリカーゼの性質を示す。
分な効果を示すことが判った。次に実施例２で得られた
酵素標品によるウリカーゼの性質を示す。
‘１１至通ｐＨ
酵素標品を種々のｐＨ（６．０，６．５，７．０，７．
２，７．５，７．＆ ８．０，８．２，８．５，９．０
，９．を ９．８）の０．２Ｍホウ酸バッファーに０．
１５Ｕ／の‘になるように溶解する。
２，７．５，７．＆ ８．０，８．２，８．５，９．０
，９．を ９．８）の０．２Ｍホウ酸バッファーに０．
１５Ｕ／の‘になるように溶解する。
これらの酵素液０．５のとを使用し前記の方法にしたが
って酵素活性を測定した。反応液中のバッファーは第１
表に示したＰＨ８．０のバッファーに代えて上記の酵素
の溶解に用いた種々の餌のバッファーを使用した。ｐＨ
８．０での活性を１００とした場合の各州における活性
の関係は第１図に示すようになりｐＨ８．川寸近に至適
ｐＨが認められた。■ 安定ｐＨ範囲この試験で安定ｐ
ＨをしらべるためのｐＨ保持用のバッファーにはｐＨ範
囲によって次の２種類のバッファーを用いた。
って酵素活性を測定した。反応液中のバッファーは第１
表に示したＰＨ８．０のバッファーに代えて上記の酵素
の溶解に用いた種々の餌のバッファーを使用した。ｐＨ
８．０での活性を１００とした場合の各州における活性
の関係は第１図に示すようになりｐＨ８．川寸近に至適
ｐＨが認められた。■ 安定ｐＨ範囲この試験で安定ｐ
ＨをしらべるためのｐＨ保持用のバッファーにはｐＨ範
囲によって次の２種類のバッファーを用いた。
すなわち、斑６０〜９．８の範囲では０．０２９Ｍホウ
砂−０．１Ｍホウ酸−０．０２則似ａＣそのバッファー
をＰＨ５．０〜６．０の範囲では０．０２９Ｍホウ酸−
０．０２５一Ｍコハク酸のバッファを使用し、各ｐＨの
バッファーによってウリカーゼ活性１５Ｕ／の‘になる
ように酵素標品を溶解し、２５ｑｏで２斑時間保ったの
ちし これらの酵素溶液１泌に０．１Ｍホウ砂−０．４
Ｍホウ酸−０．１ＭＮａＣそのバッファー（ｐＨ８．０
）９泌を加えてｐＨを８．０付近とした。これらの酵素
サンプル０．５私を用い前記の方法によって酵素活性を
測定し、相対活性で示した結果を第２図に示す。本酵素
はｐＨ７．６から９．３の間で最も安定であった。【３
｝ 至適温度 酵素標品を０．１５Ｕ／の‘になるように０．２Ｍホウ
酸バッファー（ｐＨ８．０）に溶解する。
砂−０．１Ｍホウ酸−０．０２則似ａＣそのバッファー
をＰＨ５．０〜６．０の範囲では０．０２９Ｍホウ酸−
０．０２５一Ｍコハク酸のバッファを使用し、各ｐＨの
バッファーによってウリカーゼ活性１５Ｕ／の‘になる
ように酵素標品を溶解し、２５ｑｏで２斑時間保ったの
ちし これらの酵素溶液１泌に０．１Ｍホウ砂−０．４
Ｍホウ酸−０．１ＭＮａＣそのバッファー（ｐＨ８．０
）９泌を加えてｐＨを８．０付近とした。これらの酵素
サンプル０．５私を用い前記の方法によって酵素活性を
測定し、相対活性で示した結果を第２図に示す。本酵素
はｐＨ７．６から９．３の間で最も安定であった。【３
｝ 至適温度 酵素標品を０．１５Ｕ／の‘になるように０．２Ｍホウ
酸バッファー（ｐＨ８．０）に溶解する。
反応温度を２０，２５，３０，３５，３７，４０，４５
，５０，５５，６０，６５および７０ｑｏとする。前記
ウリカーゼ活性の測定法で反応温度のみを変更して至薄
反応温度をしらべた。結果は第３図に示すようになり、
至適温度は３７０から４０２０の範囲にあることが判っ
た。■ 基質特異性酵素標品を０．１５Ｕ／泌になるよ
うに０．２Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ８．０）に溶解さ
せる。
，５０，５５，６０，６５および７０ｑｏとする。前記
ウリカーゼ活性の測定法で反応温度のみを変更して至薄
反応温度をしらべた。結果は第３図に示すようになり、
至適温度は３７０から４０２０の範囲にあることが判っ
た。■ 基質特異性酵素標品を０．１５Ｕ／泌になるよ
うに０．２Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ８．０）に溶解さ
せる。
基質として第３表に示すものを用いる以外は前記ゥＩＪ
カーゼ活性の測定法と同様にして、基質の減少量を測定
する。吸光度の測定波長は、各基質における最大吸収波
長を用いる。結果を第３表に示す。第３表 上の結果から、本ウリカーゼは尿酸に基質特異性を有す
ることがわかる。
カーゼ活性の測定法と同様にして、基質の減少量を測定
する。吸光度の測定波長は、各基質における最大吸収波
長を用いる。結果を第３表に示す。第３表 上の結果から、本ウリカーゼは尿酸に基質特異性を有す
ることがわかる。
（５１ ミカェリス定数
酵素標品を０．１５Ｕ／の‘になるように０．２Ｍホウ
酸バッファー（ｐＨ８．０）に溶解させる。
酸バッファー（ｐＨ８．０）に溶解させる。
種々の濃度の基質溶液を調製する。基質濃度以外は前記
ウリカーゼ活性の測定法と同様に測定する。初発基質濃
度〔Ｓ〕と得られた酵素活性値〔Ｕ〕をＬｉｎｅｗｅａ
ｖｅｒ−Ｂｕｒｋの方法にしたがって逆数プロットした
結果、ミカェリス定数ｋｍ（尿酸）は８．９３×１０‐
６Ｍになることが判った。
ウリカーゼ活性の測定法と同様に測定する。初発基質濃
度〔Ｓ〕と得られた酵素活性値〔Ｕ〕をＬｉｎｅｗｅａ
ｖｅｒ−Ｂｕｒｋの方法にしたがって逆数プロットした
結果、ミカェリス定数ｋｍ（尿酸）は８．９３×１０‐
６Ｍになることが判った。
以下、実施例を示す。実施例 １
ウリカーゼ生産菌株としてトリコスポロン・クタニウム
ｍＣＯ１７４を使用するグルコース５夕／ｄと、コーン
・スチーブ・リカー３ 夕／ｄ【、Ｎａ２ＨＰＱ・１２
も〇０．２タノの、ＫＨ２Ｐ０４０．１夕／ｄ‘、Ｍが
０４・７日２００．０５夕／ｄ‘、（Ｎ日）交０４０．
６タノの、（尿素 ０．２夕／ｄ‘）より成る培地（ｐ
Ｈ５．５）３０の‘を３０肋【容三角フラスコに入れ、
１２０℃１８分間殺菌する。
ｍＣＯ１７４を使用するグルコース５夕／ｄと、コーン
・スチーブ・リカー３ 夕／ｄ【、Ｎａ２ＨＰＱ・１２
も〇０．２タノの、ＫＨ２Ｐ０４０．１夕／ｄ‘、Ｍが
０４・７日２００．０５夕／ｄ‘、（Ｎ日）交０４０．
６タノの、（尿素 ０．２夕／ｄ‘）より成る培地（ｐ
Ｈ５．５）３０の‘を３０肋【容三角フラスコに入れ、
１２０℃１８分間殺菌する。
尿素は６夕／１００の‘の溶液を別に調製し１２０℃で
３分間殺菌後、その１の‘を上の殺菌後の培地３０肌に
添加する。
３分間殺菌後、その１の‘を上の殺菌後の培地３０肌に
添加する。
この培地における尿素の割合は０．２夕／ｄ【である。
培地調製後、前記菌を接種する。
培地調製後、前記菌を接種する。
接種はあらかじめ２日間培養した寒天塔地より１白金耳
をとり上記培地に移して行なった。培養は２４０回転／
分のロータリー・シェーカーで３０℃、４２時間行なう
。この培養液を下記の様に調整した５〆容ジャー・ファ
ーメンタ−に移した。本培地は、グルコース１５０夕、
コーン・スチーブ・リカー６０夕、ＫＣ夕１．５夕、Ｎ
ａ２ＨＰ０４・１２も０６夕、Ｋ母Ｐ０４３夕、ＭｇＳ
０４・７日２０１．５タＬ（ＮＡ）夕０４１８夕、尿酸
１５０倣を２．９のこなるように溶解した培地（ｐＨ５
．５）を５〆容ジャー，ファーメンターに入れ１２０℃
で２０分殺菌する。他に尿素６夕を１００の‘になるよ
うに溶解し、１２０ｑ０で３分間殺菌する。本塔地を殺
菌後、この尿素溶液を加え、上記の種培養液３０の‘を
移す。５〆容ジャー・ファーメンターでの培養は通気量
３そ／分、凝拝５００回転／分、温度３０℃で４曲寿間
行なう。
をとり上記培地に移して行なった。培養は２４０回転／
分のロータリー・シェーカーで３０℃、４２時間行なう
。この培養液を下記の様に調整した５〆容ジャー・ファ
ーメンタ−に移した。本培地は、グルコース１５０夕、
コーン・スチーブ・リカー６０夕、ＫＣ夕１．５夕、Ｎ
ａ２ＨＰ０４・１２も０６夕、Ｋ母Ｐ０４３夕、ＭｇＳ
０４・７日２０１．５タＬ（ＮＡ）夕０４１８夕、尿酸
１５０倣を２．９のこなるように溶解した培地（ｐＨ５
．５）を５〆容ジャー，ファーメンターに入れ１２０℃
で２０分殺菌する。他に尿素６夕を１００の‘になるよ
うに溶解し、１２０ｑ０で３分間殺菌する。本塔地を殺
菌後、この尿素溶液を加え、上記の種培養液３０の‘を
移す。５〆容ジャー・ファーメンターでの培養は通気量
３そ／分、凝拝５００回転／分、温度３０℃で４曲寿間
行なう。
培養後遠心分離して菌体斑０夕（湿重量）を得る。この
菌体に０．０５Ｍホウ酸バッファ（ｐＨ８．０）５そを
加えて洗浄し、遠心分離によって菌体を得る。この菌体
を０．０９Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ８．０）１のこ懸
濁したのち、ダイノ・ラボラトリ−・ミル（Ｄｙｎｏ仏
ｂｏねｔｏひｍｉｌｌ）ＫＤＬ型（Ｗｍｙ Ａ，Ｂａｃ
ｈｏｆｅｎ Ｉｎｃ，Ｓｗｉｔｚｅｒ鷺ｎｄにより製造
されている）にて菌体を破砕しｔ菌体破砕液を得る。菌
体破砕液を遠心分離して上溶液を得る。この上情液中の
ゥリカーゼ活性を測定し、培養液ｌｄ‘あたりの生産量
に換算した結果は６０．５７Ｕ／ｄ‘なる値を得た。（
上蒲１．２〆、全活性１総５Ｕのウリカーゼを含む）。
この上清液に硫安一を添加して硫安３０％飽和とし、沈
澱物を遠Ｄ分離により除き、上清液を得、さらに硫安を
添加して硫安６０％飽和とし、沈澱物を遠心分離により
集める。この沈澱物を０．０９Ｍホウ酸バッファー（Ｐ
Ｈ８．０）２００泌にとかし、同バッファー２０夕を用
い、セロフアンチューブを透析膜として、５℃で一晩透
析を行なう。透析チューブ内液を０．０９Ｍホウ酸バッ
ファー（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥーセルロー
ス１〆を充填したカラムにチャージし、０．０９Ｍホウ
酸バッファー（ｐＨ８０）１そで洗浄後塩化ナトリウム
を含まない上記のバッファー（ｐＨ８．０）１．５夕と
塩化ナトリウム０．２Ｍを含むバッファー（ｐＨ８０）
１．５そで濃度幻配溶出を行なう。溶出液を２０タづつ
分画し、ウリカーゼ溶出区分を集め、硫安６０％飽和と
し、沈澱物を遠○分離により集める。この沈澱物を０．
０８Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ８０）約１００の‘に溶
解し、同じバッファー（解８．０）１０Ｚを用いて、セ
ロフアンチューブを透析膜として、５℃で一晩透析を行
なう。この透析内液を０．０９Ｍホウ酸バッファー（ｐ
Ｈ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セフアデツクスＡ−
５０１そを充填したカラムにチャージし、同バッファー
ＩＺで洗浄後、同バッファ−１．２夕（ＮａＣＺを含ま
ない。ｐＨ８．０）と０．２けＮａＣ夕を含む同じバッ
ファー１．２夕（ｐＨ８．０）を用いて濃度勾配で溶出
を行なう。溶出液を２０夕ずつ分画し、ウリカーゼ活性
画分を集める。これに硫安を添加して６０％飽和とし、
生成する沈澱物を遠０分離により得る。この沈澱物を５
０の‘の０．０９Ｋホウ酸バッファー（ＰＨ８．０）に
溶解し、同バッファ−で平衡化したセフアデツクスＧ−
２００５００のとを充填したカラムにチャ−ジし、同バ
ッファーで溶出する。溶出液を２０夕ずつ分画し、ウリ
カーゼ活性画分を集めて凍結乾燥し、ゥＩＪカーゼの粉
末を得る。菌体破砕液を遠心分離して得られた上清から
の活性収率１０．７％、比活性９．７Ｕ／倣蛋白質であ
る。実施例 ２ グルコース５．０夕／ｄ‘、コーン・スチーブ・１′カ
ー２．０夕／ｄ【、ＫＣそ０．０５夕／ｄ‘、ＮａＨＰ
〇４‐１２ＬＯＯ．１クノｄ‘、ＭｇＳ０４・７４０
０．０５夕／ｄと、（ＮＨ４）よ○４０．５夕／ｄ‘、
尿酸０．００５夕／ｄ上、（尿素０．３夕／ｄ‘）より
成る培地（ｐＨ５．５０）５０の‘を５００のＺ客振鑑
フラスコに入れ、１２０午０で１５分間殺菌する。
菌体に０．０５Ｍホウ酸バッファ（ｐＨ８．０）５そを
加えて洗浄し、遠心分離によって菌体を得る。この菌体
を０．０９Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ８．０）１のこ懸
濁したのち、ダイノ・ラボラトリ−・ミル（Ｄｙｎｏ仏
ｂｏねｔｏひｍｉｌｌ）ＫＤＬ型（Ｗｍｙ Ａ，Ｂａｃ
ｈｏｆｅｎ Ｉｎｃ，Ｓｗｉｔｚｅｒ鷺ｎｄにより製造
されている）にて菌体を破砕しｔ菌体破砕液を得る。菌
体破砕液を遠心分離して上溶液を得る。この上情液中の
ゥリカーゼ活性を測定し、培養液ｌｄ‘あたりの生産量
に換算した結果は６０．５７Ｕ／ｄ‘なる値を得た。（
上蒲１．２〆、全活性１総５Ｕのウリカーゼを含む）。
この上清液に硫安一を添加して硫安３０％飽和とし、沈
澱物を遠Ｄ分離により除き、上清液を得、さらに硫安を
添加して硫安６０％飽和とし、沈澱物を遠心分離により
集める。この沈澱物を０．０９Ｍホウ酸バッファー（Ｐ
Ｈ８．０）２００泌にとかし、同バッファー２０夕を用
い、セロフアンチューブを透析膜として、５℃で一晩透
析を行なう。透析チューブ内液を０．０９Ｍホウ酸バッ
ファー（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥーセルロー
ス１〆を充填したカラムにチャージし、０．０９Ｍホウ
酸バッファー（ｐＨ８０）１そで洗浄後塩化ナトリウム
を含まない上記のバッファー（ｐＨ８．０）１．５夕と
塩化ナトリウム０．２Ｍを含むバッファー（ｐＨ８０）
１．５そで濃度幻配溶出を行なう。溶出液を２０タづつ
分画し、ウリカーゼ溶出区分を集め、硫安６０％飽和と
し、沈澱物を遠○分離により集める。この沈澱物を０．
０８Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ８０）約１００の‘に溶
解し、同じバッファー（解８．０）１０Ｚを用いて、セ
ロフアンチューブを透析膜として、５℃で一晩透析を行
なう。この透析内液を０．０９Ｍホウ酸バッファー（ｐ
Ｈ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セフアデツクスＡ−
５０１そを充填したカラムにチャージし、同バッファー
ＩＺで洗浄後、同バッファ−１．２夕（ＮａＣＺを含ま
ない。ｐＨ８．０）と０．２けＮａＣ夕を含む同じバッ
ファー１．２夕（ｐＨ８．０）を用いて濃度勾配で溶出
を行なう。溶出液を２０夕ずつ分画し、ウリカーゼ活性
画分を集める。これに硫安を添加して６０％飽和とし、
生成する沈澱物を遠０分離により得る。この沈澱物を５
０の‘の０．０９Ｋホウ酸バッファー（ＰＨ８．０）に
溶解し、同バッファ−で平衡化したセフアデツクスＧ−
２００５００のとを充填したカラムにチャ−ジし、同バ
ッファーで溶出する。溶出液を２０夕ずつ分画し、ウリ
カーゼ活性画分を集めて凍結乾燥し、ゥＩＪカーゼの粉
末を得る。菌体破砕液を遠心分離して得られた上清から
の活性収率１０．７％、比活性９．７Ｕ／倣蛋白質であ
る。実施例 ２ グルコース５．０夕／ｄ‘、コーン・スチーブ・１′カ
ー２．０夕／ｄ【、ＫＣそ０．０５夕／ｄ‘、ＮａＨＰ
〇４‐１２ＬＯＯ．１クノｄ‘、ＭｇＳ０４・７４０
０．０５夕／ｄと、（ＮＨ４）よ○４０．５夕／ｄ‘、
尿酸０．００５夕／ｄ上、（尿素０．３夕／ｄ‘）より
成る培地（ｐＨ５．５０）５０の‘を５００のＺ客振鑑
フラスコに入れ、１２０午０で１５分間殺菌する。
尿素は１０夕／１００の‘の溶液を別に調製し１２０ｏ
ｏで３分間殺菌後、各１泌を上の培地（５０地）に添加
する。各培地における尿素の割合は０．３多／ｄ‘であ
る。各培地に寒天塔地に生育した第４表に示す菌株の細
腕をそれぞれ一白金耳接種した。培養時間は筋時間とし
、下記の様に培養した。培養は温度３０ｑｏ、振鶴は１
４の主復／分の往復振函機によって行なった。
ｏで３分間殺菌後、各１泌を上の培地（５０地）に添加
する。各培地における尿素の割合は０．３多／ｄ‘であ
る。各培地に寒天塔地に生育した第４表に示す菌株の細
腕をそれぞれ一白金耳接種した。培養時間は筋時間とし
、下記の様に培養した。培養は温度３０ｑｏ、振鶴は１
４の主復／分の往復振函機によって行なった。
培養終了後、前記の方法にしたがって菌体を回収摩砕し
て酵素液（上清）を得た。これらの酵素液中のゥリカー
ゼ活性を前記の方法によって測定し、第４表に示すよう
な結果を得た。この結果はトリコスポロン属に属する多
くの菌株が箸類なウリカーゼの生産性を有していること
を示すものである。第４表 トリコスポロン属菌株に よるゥｌｊヵーゼの生産 図面の髄単な説明 第１図は本ウリカーゼの相対活性とｐＨとの関係を示す
。
て酵素液（上清）を得た。これらの酵素液中のゥリカー
ゼ活性を前記の方法によって測定し、第４表に示すよう
な結果を得た。この結果はトリコスポロン属に属する多
くの菌株が箸類なウリカーゼの生産性を有していること
を示すものである。第４表 トリコスポロン属菌株に よるゥｌｊヵーゼの生産 図面の髄単な説明 第１図は本ウリカーゼの相対活性とｐＨとの関係を示す
。
第２図は本ウリカーゼの相対活性と安定ｐＨ範囲を示す
。第３図は本ウリカーゼの相対活性と温度との関係を示
す。象’欄 多Ｚ１幻 多３粉
。第３図は本ウリカーゼの相対活性と温度との関係を示
す。象’欄 多Ｚ１幻 多３粉
Claims (1)
- １ トリコスポロン属に属し、ウリカーゼ生産能を有す
る微生物を栄養培地に培養し、培養物中にウリカーゼを
生成せしめ、これを採取することを特徴とするウリカー
ゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53024482A JPS6020995B2 (ja) | 1978-03-06 | 1978-03-06 | 発酵法によるウリカ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53024482A JPS6020995B2 (ja) | 1978-03-06 | 1978-03-06 | 発酵法によるウリカ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS54119086A JPS54119086A (en) | 1979-09-14 |
| JPS6020995B2 true JPS6020995B2 (ja) | 1985-05-24 |
Family
ID=12139396
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP53024482A Expired JPS6020995B2 (ja) | 1978-03-06 | 1978-03-06 | 発酵法によるウリカ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6020995B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6357198U (ja) * | 1986-10-02 | 1988-04-16 | ||
| JPS63108894U (ja) * | 1986-12-30 | 1988-07-13 |
-
1978
- 1978-03-06 JP JP53024482A patent/JPS6020995B2/ja not_active Expired
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6357198U (ja) * | 1986-10-02 | 1988-04-16 | ||
| JPS63108894U (ja) * | 1986-12-30 | 1988-07-13 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS54119086A (en) | 1979-09-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0671425B2 (ja) | ウリカ−ゼおよびその製造法 | |
| JPS6031472B2 (ja) | 酸性ウリカ−ゼ | |
| EP0133694B1 (en) | Process for producing neuraminidase and method and reagent for the quantitative determination of a sialic acid-containing substance using neuraminidase | |
| WO1980000454A1 (fr) | Methode de mesure d'un substrat de xanthine oxydase et composition pour sa determination | |
| JPS61268178A (ja) | フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ | |
| JPS6020995B2 (ja) | 発酵法によるウリカ−ゼの製造法 | |
| US3669843A (en) | Process for the production of uricase | |
| Bdolah et al. | Uridine diphosphate D-glucose dehydrogenase of Aerobacter aerogenes | |
| JPS6030679A (ja) | Ｓ−アデノシル−ｌ−ホモシステインハイドロラ−ゼの製造法 | |
| Kinoshita et al. | Purification and properties of aldose 1-epimerase from Aspergillus niger | |
| US4800161A (en) | Process for the microbiological preparation of aldose-1-epimerase | |
| JP3959439B2 (ja) | 耐熱性トレハラーゼと、その製造法 | |
| JPS6020994B2 (ja) | 発酵法によるキサンチン・オキシダ−ゼの製造法 | |
| JPS6119483A (ja) | アルカリ性セルラ−ゼの製造法 | |
| JPS6098982A (ja) | ポリアミン測定用酵素の製造法 | |
| JPH05236954A (ja) | 耐熱性アデノシン−５’−ホスホスルフェートキナーゼ及びその製造法 | |
| Hendry et al. | Coproporphyria excretion by Rhizobium meliloti | |
| JPS58165789A (ja) | α−グリセロリン酸オキシダ−ゼの製造法 | |
| JPS5840470B2 (ja) | ザルコシン酸化酵素の製造法 | |
| JPS6228678B2 (ja) | ||
| JPS6019990B2 (ja) | 発酵法によるウリカ−ゼの製造法 | |
| JPH08163992A (ja) | εーポリーＬーリジンの製造法 | |
| JPS6122956B2 (ja) | ||
| JPH03133376A (ja) | ザルコシンオキシダーゼの製造法 | |
| JPS62275682A (ja) | 新規トレハラ−ゼおよびその製法 |