JPS60210994A - ヒスチジンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は遺伝子の新規形質発現方法によりヒスチジンを
製造する方法に関与する。さらに詳細には本発明はヒス
チジン生成に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクタ
ーＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを用いコリネバクテリウム
属またはブレビバクテリウム属に属する微生物から選ば
れる宿主菌株を形質転換して得られる形質転換株を培地
に培養し、培養物中にヒスチジンを生成蓄積せしめ、該
培養物からヒスチジンを採取することを特徴とするヒス
チジンの製造法に関する。

発酵法によるし一ヒスチジンの直接的製造法としては、
コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、セラチ
ア属などの細菌のヒスチジンアナログ耐性株などの突然
変異株を用いる方法が知られている。

コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物を宿主として用い、これに該宿主に対して外
来性であるところの目的遺伝子またはベクターを含む組
み換え体ＤＮＡを導入して該目的遺伝子の形質を発現さ
せた例は今まで全く知られていない。コリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物を宿主
とする組換えＤＮＡ技法においても、これら微生物中で
自律複製し１選択可能な表現型を有し、多くの遺伝子の
クローニングに用いろるベクター系の造成と、効率のよ
い形質転換系の確立が必要である。

さらに発現に際して現れる種々の障壁の解消方法の確立
が必要である。

本発明者らは先にコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属に属する微生物中で自律複製し１選択可能
な表現型と適当なりローニング部位を有するプラスミド
ベクターを造成する一方効率の高い形質転換系を開発し
特許出願を行った（特開昭５７−１８３７９９．同５７
−１８６４９２゜同５７−１８６４８９）。また本発明
者らは該プラスミドベクターに既に知られているインビ
トロにおける組換えＤＮＡ技法（口、Ｓ、　Ｐａｔｅｎ
ｔ　４．２３？、　２２４　）を用い、グルタミン酸、
リジンなどのアミノ酸の生合成に関与する外来性遺伝子
を含むＤＮＡ断片を連結し、開発した形質転換系を用い
てコリネバクテリウム・グルタミクムし一２２株または
その誘導株を形質転換したところ、該外来性遺伝子が該
宿主中で形質を発現され、該アミノ酸の生産の増大に利
用することができることを見出し特許出願を行った（特
願昭５６−２１１９０８）。

さらに研究の結果、ヒスチジンに関しても同様の方法に
よって得られた菌株が著量のヒスチジンを培地に蓄積で
きることを見出し本発明を完成するに至った。

以下本発明の詳細な説明する。

本発明はヒスチジン生成に関与する遺伝子を含むＤＮＡ
断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを用いコリネ
バクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する微
生物から選ばれる宿主菌株を形質転換して得られる形質
転換株を培地に培養し、ヒスチジンを製造する方法を提
供する。

本発明に用いる遺伝子を含むＤＮＡ断片としては、真核
生物、原核生物、ウィルス、バクテリオファージまたは
プラスミドに由来しヒスチジン生成に関与する遺伝子を
含むＤＮＡ断片があげられる。原核生物に由来する遺伝
子としては細菌とくにエッシエリヒア属、コリネバクテ
リウム属、プレヒハクテリウム属、バチルス属、スタフ
ィロコッカス属またはセラチア属に属する細菌の菌株に
由来する遺伝子で、ヒスチジンの生成ならびにその生成
に関与する代謝系に係る遺伝子が好適にあげられる。

本発明に用いるベクターとしては、宿主菌細胞内で自律
増殖できるものでなくてはならない。具体例としては本
発明者らがコリネバクテリウム属に属する微生物から採
取した。または採取したものから誘導して造成したｐｃ
Ｇｌ（特開昭５７−１３４５００）、ｐＣＧ２　（特願
昭５６−１３３５５７　）　。

ｐＣＧ４（特開昭５７−１８３７９９）、Ｉ）ＣＥ５３
、ｐＣＥ５４．ｐｃＧｌｌ、ｐｃ８１０１などがあげら
れる。

これらプラスミドを保有する菌株はそれぞれ下記の寄託
番号で工業技術院微生物工業技術研究所ならびに米国ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託さ
れている。

プラスミド　ＦＥＲＭ−Ｐ　ＡＴＣＣ ｐｃＧｌ　５８６５　３１８０８ ｐｃｃ２　５９５４　３１８３２ ｐＣＧ４　５９３９　３１８３０ ｐＣＥ５４　３９０１９ ｐｃｃｉｉ　３９０２２ ｐ　ＣＢＩＯＩ　３．９０２０ 好適にはｐｃＧｌｌが用いられる。

ｐＣＧｌｌは本発明者らが先に発明し特許出願（特開昭
５７−１３４５００）したプラスミドで。

コリネバクテリウム・グルタミクム２２５−５７（ＡＴ
ＣＣ３１８０８，ＦＥＲＭ−Ｐ５８６５）から分離され
たプラスミドｐＣＧｌにおける制限酵素Ｂｇｊ！ＩＩの
ただ一つの切断部位に、コリネバクテリウム・グルタミ
クム２２５−２５０（ＡＴＣＣ３１８３０，ＦＥＲＭ−
Ｐ５９３９）から分離されｊこプラスミドｐＣＧ４のス
トレプトマイシンおよび／またはスペクチノマイシン耐
性（Ｓ　ｍ　Ｏ。

／５ｐｅｃｋ、）遺伝子を含むＢａｍＨＩ断片を両者の
同一接着末端を利用して結合せしめたプラスミドである
。

ｐｃＧＩＬは９分子量約６．８　Ｋ　ｂのプラスミドで
単一な制限部位としてＢｇＡＩＩ、Ｐｓｔｌを有しＳｍ
Ｏ，／５ｐｅｃＯ，（Ｄ表現型を与エル。

ＤＮＡ混成物による形質転換は１本発明者らが先に特許
出願したコリネバクテリウム属およびブレビバクテリウ
ム属菌種のプロトプラストを使用する形質転換法（特開
昭５７−１８６４９２および特開昭５７−１８６４８９
）により実施することができる。選択にはストレプトマ
イシンまたはスペクチノマイシンを使用すればよい。形
質転換株はＤＮＡ無添加系で受容菌プロトプラストが正
常細胞へ復帰増殖できない濃度の薬剤〔通常、ストレプ
トマイシン１００〜４００μｇ　／＋ｎｌもしくはスペ
クチノマイシン２００〜１０００　μｇ／ｍｌ）を含む
高張寒天培地上で形成されるコロニーを分離するか、あ
るいは、一旦非選択的に再生培地上で正常細胞に復帰増
殖させた後にかき集め、この懸濁液を受容菌正常細胞が
生育できない濃度の薬剤（通常、ストレプトマイシン５
〜５０μｇ　／Ｑ１１もしくはスペクチノマイシン５０
〜５００μｇ／ｍｌ）を含む寒天培地上で生育するコロ
ニーを分離することによって得られる。

こうして得られる形質転換株の保有するプラスミドＤＮ
Ａは１本発明者らが特開昭５７−１３４５００および特
開昭５７−１８６４８９に開示した方法で培養菌体から
単離精製でき、さらに各種制限酵素で消化して生成する
ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で解析する常法に
より構造を知ることができる。形質転換株の一株から分
離されたプラスミドがｐｃＧｌｌである。

プラスミド保有菌株からのプラスミドの採取は。

たとえば特開昭５７−１３４５００．同５７−１８３７
９９および特願昭５６−１３３５５７に記載の方法に従
って行えばよい。

遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組み換え
体の作製は、公知の試験管内組み換えＤＮＡ技法を駆使
することにより実施できる。

試験管内のＤＮＡ組み換えは１通常、目的の遺伝子を含
む供与体ＤＮＡとベクターＤＮＡの切断と結合（リガー
ゼ反応）により行われる（特願昭５６−２１１９０８号
、　ＬＩ　Ｓ　Ｐ　４．２３７．２２４参照）。

リガーゼ反応により目的の組み換え体以外に他の組み換
え体も生成するが、目的の組み換え体を取得するにはこ
のＤＮＡ混成液を用いてコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属菌種を直接形質転換し、目的の遺伝
子の遺伝情報に由来する遺伝形質を付与された形質転換
株を選択分離し、その培養菌体から抽出単離することに
よって達成できる。コリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属菌様を直接形質転換しないで例えば大腸
菌のような他の微生物の宿主ベクター系にて目的の遺伝
子を−Ｈクローン化し、しかる後にコリネバクテリウム
属またはブレビバクテリウム属菌種のベクターとの組み
換え体を試験管内で作製してからコリネバクテリウム属
またはブレビバクテリウム属菌種を形質転換し前記と同
様に形質転換株を選択分離しても組み換え体を取得でき
る。

組み換え体製造のためには下記文献の記載が広く応用で
きる。

Ｓ、Ｎ、Ｃｏｈｅｎ、ｅｔ　ａｌ、ロ、Ｓ、Ｐａｔｅｎ
ｔ　４，２３７，２２４　、遺伝子操作実験法〔高木康
敬編著、講談社サイエンティフィック（１９８０）　）
　、　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｂｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（ｉ
３．　Ｒ６にｏｍｂｉｎａｎｔ　ロＮＡ、ｅｄｉｔｅｄ
　ｂｙ　Ｒａｙ　Ｍｕ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ　
１９７９．特願昭５６−２１１９０８゜本発明の宿主微
生物としては、コリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属に属しＤＮＡ取り込み能を有する菌株ならば
いかなる菌株を用いてもよい。好適には次の菌株があげ
られる。

寄託番号 ＦＩＩＩＲＭ−Ｐ　ＡＴＣＣ コリネバクテリウム・グルタミクムＬ−１５５９４６’
　３１８３４コリネバクテリウム・ハーキュリス　１３
８６８コリネバクテリウム・ハーキュリスＬ−１０３５
９４７３１８６６プレビバクテリウム・ディバリカラム
Ｌ−２０４５９４１１３１８６７プレビバクテリウム・
ラクトファーメンタム　１３８６９ブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタムＬ−３１２５９４９３１８６８
ブレビバクテリウム・フラバム　１４０６７宿主微生物
の組み換え体ＤＮＡによる形質転換は１）培養細胞から
のプロトプラストの調製。

２）プロトプラストの組み換え体ＤＮＡによる形質転換
処理、３）プロトプラストの正常細胞への復帰再生と形
質転換株の選択、からなる工程にて行われる。具体的方
法の例を以下に示す。

１）培養細胞からのプロトプラストの調製プロトプラス
ト形成は、微生物を細胞壁溶解酵素リゾチームに感受性
にする条件下で増殖させ。

この培養細胞を高張液中でリゾチーム作用させ細胞壁を
溶解除去することによって行われる。微生物をリゾチー
ム感受性型細胞にするには各種細胞壁合成阻害剤が用い
られる。例えば、微生物培養の対数増殖期の中途で生育
を抑制しないかあるいは半抑制する濃度のペニシリンを
添加し、さらに数世代増殖させることによって微生物細
胞をリゾチーム感受性にすることができる。

このとき使用する培地は微生物が増殖できる培地であれ
ばよく１例えば栄養培地ＮＢ（粉末ブイヨン２０ｇ、酵
母エキス５ｇを純水１βに含み。

ｐ　Ｈ７，２に調整した培地）あるいは半合成培地ＳＳ
Ｍ（グルコース１０ｇ、ＮＨａ　Ｃ１２４ｇ、尿素２ｇ
、酵母エキス１　ｇ＋　ＫＨ２ＰＯ４１ｇ。

Ｋａ　ＨＰＯ４３ｇ、ＭｇＣＩｈｒ　・６　Ｈ２００，
４ｇ、Ｆｅ５Ｏｓ　’７８２０　１０ｍｇ、Ｍ］ｌＳＯ
４・４〜６８２０　０．２ｍｇ、Ｚｎ５Ｏａ　・７Ｈ２
００，９ｍｇ、Ｃｕ５Ｏ＜　・５Ｈ２００，４ｍｇ、Ｎ
ａｚＢ４０７・１０Ｈ２００，０９１ｎｇ、（ＮＨ４）
ｓＭＯ７０２４・４Ｈ２００，０４ｍｇ、ビオチン３０
μｇ、サイアミン塩酸塩１■を水１βに含み、ｐＨ７，
２に調整した培地〕などが用いられる。

この培地に微生物を接種し、振盪培養する。

比色計によって６６０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ＞を測
定し対数増殖期の初期（ＯＤ＝０．１〜０．４）に培養
液中０．１〜２．０単位／ｍｌの濃度になるようにペニ
シリンＧなどのペニシリン類を添加する。

培養をさらに続けて、ＯＤが０．３〜０．５に増加した
ところで細胞を集菌し３３Ｍ培地で洗滌する。

次いで細胞を適当な高張培地９例えばＰＦＭ培地（３３
Ｍ２倍希釈液中にシヨ糖０．４Ｍ、ＭｇＣＲ２・６Ｈ２
００，０１Ｍを含み、ｐＨ７，０〜８．５に調整した培
地）あるいはＲＣＧ培地〔グルコース５ｇ、カゼイン加
水分解物５ｇ、酵母エキス２．５ｇ＋　Ｋ２　ＨＰＯＩ
　３．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１，５ｇ、ＭｇＣＲｘ　・６
Ｈ２００，４１ｇ、Ｆｅ５Ｏ４・７Ｈ２０１０ｍｇ、Ｍ
ｎＳ○、・４〜６Ｈ６Ｈ２Ｏ２，ＺｎＳＯ４＋　７Ｈ２
００，９ｍｇ、ＣｕＳＯｓ・５Ｈ２００，４ｍｇ、　Ｎ
ａ２Ｂ４０７・１０Ｈ２００，０９ｍｇ、（ＮＨ４）６
　ＭＯ７０２４’４８２００．０４ｍｇ、ビオチン３０
μｇ、サイアミン塩酸塩２ｍｇ、コハク酸二ナトリウム
１３５ｇを水１１に含み、ｐＨ７，０〜８．５に調整し
た培地〕もしくはＲＣＧ培地にポリビニルピロリドン３
％を添加した培地（ＲＣＧＰ培地、以下同じ）に再懸濁
する。

この細胞懸濁液に最＃濃度０．２〜１０ｍｇ／ｍｌとな
るようにリゾチームを加え３０〜３７℃で反応する。プ
ロトプラスト化は反応時間が進むにつれて進行し、その
経過は光学顕微鏡で観察できる。顕微鏡下でほとんどの
細胞がプロトプラスト化されるに要する時間は、細胞培
養時の添加ペニシリン濃度および用いるリゾチームの濃
度によって変わるが、前記条件にて３〜２４時間である
。

生成したプロトプラストは低張条件で破裂列するので、
プロトプラストの形成度は低張条件で生残する正常細胞
の残存度で間接的に知ることができる。通常、正常細胞
はりゾチーム処理供試正常細胞の約１０−４の残存度に
抑えることができる。

このようにして調製したプロトプラストは適当な高張寒
天培地上でコロニー形成能（再生能）を有する。この寒
天培地としては栄養培地、半合成培地あるいは数種類の
アミノ酸を補充した合成培地に０．３〜０．８Ｍコハク
酸二ナトリウムおよび０．５〜６％ポリビニルピロリド
ン（分子量１０．０００あるいは４ｏ、　ｏｏｏ　＞を
含有せしめたものが好適に用いられる。

通常、半合成培地ＲＣＧＰ寒天培地（ＲＣＧ培地に３％
のポリビニルピロリドン（分子量１０．０００　）と１
．４％の寒天を添加した培地、ｐＨ７，２）を用いるこ
とができる。培養は２５〜３５℃で行うのが好ましい。

再生コロニーの出現が認められるのに要する培養日数は
菌株により差があるが、釣菌できるまでの大きさになる
の（ま１０〜１４日である。

ＲＣＧＰ培地でのプロトプラストの再生は菌種。

培養中途ペニシリン添加濃度およびリゾチーム処理濃度
によって異なるが、リゾチーム処理供試正常細胞あたり
１０−２〜１０−４の効率である。

２）プロトプラストの組み換え体ＤＮＡによる形質転換 プロトプラストへの組み換え体ＤＮＡの取り込みは細胞
がプロトプラスト状態を保持できる高張液中でプロトプ
ラストと組み換え体ＤＮＡとを混合し、これにＤＮＡ取
り込み媒介作用のあるポリエチレングリコール（ＰＥ（
１，、平均分子量１，５４０〜６，０００　）あるいは
ポリビニルアルコール（ＰＶＡ３重合度５００〜１，５
００　）と二価金属陽イオンを加えて処理することによ
って行われる。高張条件を与える安定化剤としては、微
生物のプロトプラストの保持に一般に使われるものでよ
く１例えばショ糖やコハク酸二ナトリウムを用いること
ができる。ＰＥＧおよびＰＶＡの使用可能な濃度範囲は
最終濃度で各々５〜６０％１１〜２０％である。

二価金属陽イオンは最終濃度１〜１００ｍＭの。

たとえばＣａ＋＋、　Ｍ　ｇ＋＋、　Ｍ　ｎ＋＋、　Ｂ
　ａ＋＋、　Ｓｒ＋＋などが効果的で単独あるいは併用
することができる。処理の温度は０〜２５℃が好適であ
る。

３）プロトプラストの正常細胞への復帰再生と形質転換
株の選択 組み換え体ＤＮＡで形質転換処理したプロトプラストの
再生は、前記のプロトプラストの再生と同様に、コハク
酸二ナトリウムとポリビニルピロリドンを含有する高張
寒天培地（例えばＲＣＧＰ培地）上にプロトプラストを
塗布し、正常細胞が生育できる温度、一般に２５〜３５
℃で培養することによって行われる。形質転換株は供与
ＤＮＡに由来する遺伝子が菌に付与する形質について選
択することによって取得できる。この特徴的形質獲得に
基づく選択は、高張寒天培地上で再生と同時に行っても
よく、あるいは一旦非選択的に再生させてから再生正常
細胞を集め普通の低張寒天培地上で行ってもよい。

本発明における具体的に好適な宿主菌株として示したり
ゾチーム感受性菌株を用いる場合には形質転換は上記工
程（１）におけるペニシリン処理を行わずに単に培養増
殖させた細胞を直接リゾチーム処理する以外は上記工程
（１）〜（３）と同様に行えばよい。リゾチーム感受性
微生物を用いる場合の形質転換株は再生菌あたり１０−
２〜１０−４の高頻度で得られる。

形質転換株は通常の栄養培地に培養することにより導入
した組み換え体ＤＮＡの形質を発現させることができる
。組み換え体ＤＮ１６１に遺伝子ＤＮＡまたはベクター
Ｄ、ＮＡ由来の性質が付与されている場合は、その性質
にあわせて培地に薬剤を補給するときもある。

かくして得られた形質転換株を、従来発酵法によるヒス
チジン製造に用いられる培養方法により培養することに
よって、ヒスチジンを製造することができる。すなわち
、該形質転換株を炭素源。

窒素源、無機物、アミノ酸、ビタミンなどを含有する通
常の培地中、好気的条件下、温度、ｐＨなどを調節しつ
つ培養を行えば、培養物中にヒスチジンが生成蓄積する
ので、これを採取する。

炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトー
ス、シュークロース、マルトース、マンノース、ｉ＆粉
、澱粉加水分解液、糖蜜などの種々の炭水化物、ポリア
ルコール、ピルビン酸、フマール酸、乳酸、酢酸などの
各種有機酸が使用できる。更に菌の資化性によって、炭
化水素、アルコール類なども用いうる。とくに廃糖蜜は
好適に用いられる。

窒素源としてはアンモニアあるいは塩化アンモニウム、
？ｉ１２アンモニウム、炭酸アンモニウム。

酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウ
ム塩類あるいは尿素および他の窒素含有物質ならびにペ
プトン、ＮＺ−アミン、肉エキス。

酵母エキス、コーン・スチープ・リカー、カゼイン加水
分解物、フィツシュミールあるいはその消化物、脱脂大
豆粕あるいはその消化物、ｍ加水分解物などの窒素性有
機物など種々のものが使用可能である。

さらに無機物としては、燐酸第一水素カリウム。

燐酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一
鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどを使用する
。とくに硫酸アンモニウム。

塩化アンモニウムが好適である。微生物の生育に必要と
するビタミン、アミノ酸源などは、前記したような他の
培地成分に従って培地に供給されれば特に加えなくても
よい。

培養は振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的条件
下に行う。培養温度は一般に２０〜４０℃が好適である
。培養中の培地のｐＨは中性付近に維持することが望ま
しい。培養期間は通常１〜５日間で培地中に著量のヒス
チジンが蓄積する。

培養終了後、菌体を除去して活性炭処理、イオン交換樹
脂処理などの公知の方法で培養液からヒスチジンが回収
される。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１゜ コリネバクテリウム・グルタミクム０１５６株のし一ヒ
スチジン生合成に関与する遺伝子のクローン化および該
遺伝子の発現を利用したコリネバクテリウム・グルタミ
クム、コリネバクテリウム、ハーキュリス、ブレビバク
テリウム、フラバムおよびブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムによるし一ヒスチジンの生産： （１）　コリネバクテリウム・グルタミクム０１５６株
の染色体ＤＮＡとプラスミドｐｃｃ　１１の調製：１．
２．４−）リアゾール−３−アラニン耐性でヒスチジン
生産能を有するコリネバクテリウム・グルタミクムＣ１
５６（ＦＢＲＭ　Ｐ−６９１０）　（ＦＵＲ）Ｊ　ＩＩ
ＩＰ−４５３）の染色体ＤＮＡを以下の方法で調製する
。

４０　Ｑｍｌ半合成培地ＳＳＭ　（グルコース２０ｇ。

（Ｎ　Ｈ４ン。ＳＯ４１０ｇ、尿素３ｇ、酵母エキスＩ
ｇ、ＫＨ２Ｐｏ４１ｇ、ＭｇＣｌ１２・６Ｈ２００，４
ｇ、Ｆｅ５Ｏｓ　Ｉ　７Ｈａ　Ｏ１０ｍｇ、Ｍｎ５Ｏｎ
’　４〜６８２０　０．２ｍｇ、Ｚｎ５Ｏ１’　７Ｈｉ
　００．９ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２００，４ｍｇ、Ｎ
ａ５Ｂ、０．・１０Ｈ２００，０９■、（ＮＨ４）ｓ　
ＭＯ７０２、・４Ｈ，００，０４ａ＋ｇ、ピオチン３０
μｇ。

サイアミン塩酸塩１ｍｇを水Ｈに含みｐ　Ｈ７，２に調
整した培地〕に種培養を接種して３０℃で振盪培養する
。種培養はＮＢ培地を用いる。東京光電比色計で６６０
ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定し、ＯＤｏ、２にな
った時点で培養液中０，５単位／ｍｌの濃度となるよう
にペニシリンＧを添加する。

さらに培養を継続しＯＤ約０．６になるまで生育させる
。

培養液から菌体を集菌し、ＴＥＳ緩衝液（０，０３Ｍト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−ＨＣｌ（以下
トリスと略す）、０．００５ＭＥＤＴＡ。

０．０５ＭＮａＣｊ！　：　ｐＨ８，０）で洗浄後、リ
ゾチーム液（１２，５％シヨ糖、０．１ＭＮａＣｊ！、
０．０５Ｍトリス、Ｑ、３ｍｇ／ｍｌリゾチーム：ｐ８
８．０以下同じ）で１０ｍｌに懸濁し３７℃で４時間反
応させる。

集菌した菌体から斉藤らの方法（Ｓａｉｔｏ、　Ｈｏｅ
ｔ　ａｌ：　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｃ
ｔａ、　７２６１９　（１９６３）　）に従って高分子
染色体ＤＮＡを単離する。

一方、ベクタープラスミドとして用いるｐＣＧｌｌは、
コリネバクテリウム・グルタミクムＬ−２２株の誘導株
ＬＡ１０３のｐＣＧ１１保有株ＬＡ１０３／ｐＣＧ１１
（ＡＴＣＣ３９０２２）から次のようにして単離する。

４００ｍ１ＮＢ培地（粉末ブイａン２０ｇ、酵母エキス
５ｇを水１１に含みｐ　Ｈ７，２に調整した培地）で３
０℃で振盪培養しＯＤ約０．７になるまで生育させる。

菌体を集菌し、ＴＢＳ緩衝液で洗浄後、リゾチーム液１
０ｍ１に懸濁し、３７℃で２時間反応させる。反応液に
５ＭＮａＣｌ１　２．４ｍｌ。

０．５ＭＥＤＴＡ　（ｌ（８，５）０．６ｍｌ、４％ラ
ウリル硫酸ナトリウムと０．７　Ｍ　Ｎ　ａ　ＣＩｔか
らなる溶液４．４ｍｌを順次添加し、緩やかに混和して
から氷水中に１５時間置く。

溶菌物全体を遠心管に移し４℃で６０分間６９．４００
ｘｇの遠心分離にかけ上澄液を回収する。これに重量百
分率１０％相当のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）　
６．０００　（半井化学薬品社製）を加え。

静かに混和して溶解後、氷水中に置く。１０時間後１．
５００Ｘｇで１０分間遠心分離してペレットを回収する
。ＴＥＳ緩衝緩衝液５奢ｌえてペレットを静かに再溶解
してから１．５　ｍｇ　／ｍ＋エチジウムブロマイド２
．０ｍｌを添加し、これに塩化セシウムを加えて静かに
溶解し密度を１．５８０に合わせる。

この溶液を１０５．０００　Ｘｇ、１８℃で４８時間超
遠心分離にかける。この密度匂配遠心により共有結合で
閉じられた環状のＤＮＡは紫外線照射下に遠心チューブ
中下方の密度の高いバンドとして見出される。このバン
ド画分を注射器で遠心チューブの側面から抜きとること
によってｐｃｃ　１１　ＤＮＡが分離される。次いで分
画液を等容量のイソプロピルアルコール液〔容量百分率
９０％イソプロピルアルコール、１０％ＴＥＳ緩衡液（
この混液中に飽和溶解量の塩化セシウムを含む）〕で５
回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、しかる
後にＴＢＳ緩衝液に対して透析する。

（２〕　コリネバクテリウム・グルタミクム０１５６株
のヒスチジン生合成に関与する遺伝子のクローン化： 上記で調製したｐｃＧ１１プラスミドＤＮＡ　３μｇお
よび上記染色体ＤＮＡ９μｇを含む制限酵素ＢｇｌＴＪ
用反応液ＣＩ　ＯｍＭ　）リス（ｐＨ７，５）。

１ｍＭＭｇＣ１ｚ　、６０ｍＭＮａＣＡ’、７ｍＭ２−
メルカプトエタノール〕２００μｌに１０単位のＢｇＩ
ｌｎ（宝酒造社製）を添加し、３７℃で６０分間反応後
、６５℃で１０分間加温して反応を停止させる。この混
合消化物にＴ４リガーゼ用緩衝液（トリス２００ｍＭ、
Ｍｇ（ｌｉ　６６ｍＭ、ジチオスレイトールｌ　Ｑ　Ｑ
ｍＭ、ｐＨ７，６）４０μｌ。

５ｍＭＡＴＰ溶液４０μ１１．Ｔ４リガーゼ（宝酒造社
製、１単位／μＪ）０．３μｌおよび水１２０μｌを加
え、１２℃で１６時間反応させる。

Ｔ４リガーゼ反応混合物をコリネバクテリウム・グルタ
ミクムＬＨ３３株（ヒスチジン要求性。

リゾチーム感受性）の形質転換に供する。

形質転換はＬＨ３３株のプロトプラストを用いて行う。

ＬＨ３３株の種培養をＮＢ培地に植菌し３０℃で振盪培
養する。ＯＤｏ、６になった時点で集菌し、該細胞をＲ
ＣＧＰ培地〔グルコース５ｇ。

カザミノ酸５ｇ、酵母エキス２．５ｇ、に２　ＨＰＯ４
３，５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１，５ｇ２ＭｇＣＬ　・６Ｈ，
００，４１ｇ、Ｆｅ５０．　・７８２０　１０ｍｇ、Ｍ
ｎＳＯ４・４〜６Ｈｗ　Ｏ２ｍｇ、Ｚｎ５Ｏ＊’　７８
２０　０．９ｍｇ、（ＮＨ４）８　ＭＯ７０２４”４　
Ｈｓ　Ｏ０，０４ｍｇ、ビオチｙ３０μｇ、サイアミン
塩酸塩２ｍｇ、コハク酸二ナトリウム１３５ｇ。

ポリビニルピロリドン（分子量１０，０００）　３０　
ｇを水１！に含む培地〕にＬＩＩＩｇ／ｍｌのりゾチー
ムを含む液（ｐＨ７，６＞に約１０９細胞／ｍｌとなる
ように懸濁し、Ｌ型試験管に移して３０℃で５時間緩や
かに振盪反応してプロトプラスト化する。

このプロトプラスト懸濁液０．５ｍｌを小試験管にとり
２５００Ｘｇで５分間遠心分離し、ＴＳＭＧ緩衝液（１
０ｍＭ塩化マグネシウム、３０ｍＭ塩化カルシウム、５
０ｍＭ）リス、４００ｍＭシヨ糖、ｐＨ７，５）ｌａ＋
１に再懸濁して遠心洗浄後、１３ＭＣ緩衝液０．１ｍｌ
に再懸濁する。この懸濁液に２倍濃度のＴＳＭＣ緩衝液
と上記リガーゼ反応ＤＮＡ混合物の１対１混合液１００
μｌを加えて混和し２次いでＴＳＭＣ緩衝液中に２０％
ＰＥＧ６、０００を含む液０．３ｍｌを添加して混合す
る。３分後、ＲＣＧＰ培地（ｐＨ７，２）２ｍｌを添加
し。

２．５００Ｘｇで５分間遠心分離にかけて上澄み液を除
去し、沈降したプロトプラストを１ｍｌのＲＣＧＰ培地
に懸濁してから０．２ｍｌをスペクチノマイシン４００
μｇ／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天培地（ＲＣＧＰ培地に１
．４％寒天を含む培地、ｐＨ７，２）に塗抹し、３０℃
で７日間培養する。

選択プレート上に生育したスペクチノマイシン耐性コロ
ニーをかき集め、生理食塩水を用いて２回遠心洗浄後、
スペクチノマイシン１００μｇ／ｌ１１１を含む最小寒
天培地Ｍ１［グルコース１０ｇ。

ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４１ｇ、ＫＣｌ１０．２ｇ、ＭｇＳＯ４
・７Ｈ２００，２ｇ、Ｆｅ５Ｏｎ　・７Ｈ２０１０＋ｎ
ｇ、ＭｎＳＯ４４〜６Ｈ２００，２ｍｇ。

Ｚｎ５Ｏａ　・７Ｈ２００，９ｍｇ、Ｃｕ５ＣＬ　・５
Ｈａ　ＯＯ，４ｍｇ、　Ｎａｇ　Ｂ４０ｑ　・１０Ｈｚ
　ＯＯ，０９ｇ１ｇ、（ＮＨａ　）ｓ　Ｍｏり０２４・
４Ｈ２００，０４ｍｇ、ビオチン５０μｇ、ｐ−アミノ
安息香酸２．５ｍｇ、サイアミン塩酸塩１■、寒天１６
ｇを１１中に含みｐ　Ｈ７，２に調整した培地〕に塗布
して３０℃で２日間培養し、スペクチノマイシン耐性で
かつヒスチジン非要求性となった形質転換株を選択する
。

形質転換株の１株から上記第（１）項記載のエチジウム
ブロマイド・セシウムクロライド密度匂配遠心によりプ
ラスミドを単離する。各種制限酵素による単独消化およ
び２種類の制限酵素による二重消化で生成するＤＮＡ断
片をアガロースゲル電気泳動で解析し、このプラスミド
ＤＮＡの制限酵素切断様式を同定する。このプラスミド
をｐＰＨ８と命名した。ｐＰＨ８はｐｃＧｌｌのＢｇｊ
！ＩＩ切断部位に約１０．６　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片が挿
入された構造である。

さらにｐＰＨ８ＤＮＡを用いて８３３株（ＬＨ３３株の
親株（ヒスチジン要求性、リゾチーム耐性）　：　ＦＯ
ＲＭ　Ｐ−６９０９，Ｆ［ｉＲＭ　０Ｐ−４５２３を再
形質転換したところスペクチノマイシン耐性株として選
択される形質転換体のすべてがヒスチジン非要求性とな
っていた。これらのことより、ヒスチジン生産菌Ｃ１５
６株のヒスチジン生合成に関与する遺伝子がクローン化
されていることが明白である。

ヒスチジン生成に関与する遺伝子のクローニングは最初
から８３３株を宿主菌株として用いて行うこともできる
。

（３）ｐＰＨ８を保存するコリネバクテリウム・グルタ
ミクム菌株によるし一ヒスチジンの生産：コリネバクテ
リウム・グルタミクム１．、Ａ−１０３株（リゾチーム
感受性、アルギニンおよびメチオニン要求性）をｐｐＨ
３ＤＮＡで形質転換し、スペクチノマイシン４００μｇ
　／ｍｌを含むＲＣ（、Ｐ寒天培地上で同薬剤耐性の形
質転換株を選択する。

得られた形質転換株を純化後、上記と同様にプラスミド
単離構造解析を行って、ｐＰＨ８と同じ構造のプラスミ
ドであることを確認した。

ｐＰＨ８保有株コリネバクテリウム・グルタミクムＬＡ
Ｉ　０３／ｐＰＨ８は米国アメリカン・タイプ書カルチ
ャー・コレクションにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｒ
ｒｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＫ　３２．　ＡＴＣＣ３９２８
１として寄託されている。

コリネバクテリウム・グルタミクムＬＡ１０３／ｐＣＧ
　ｌ　１　（ＡＴＣＣ３９０２２）および同ＬＡ１０３
／ｐＰＨ８（ＡＴＣＣ３９２８１）のＬ−ヒスデシン生
産試験を以下のとおり行う。

ＮＢ寒天培地上で３０℃−晩培養した上記の菌をそれぞ
れｌ白金耳ずつ２００μｇ　／ｍｌのアルギニンおよび
メチオニンを補った５ｍｌの生産培地Ｐ５〔糖蜜１２％
（糖として）　、　ＫＨ２ＰＯ４０，２％、に２８Ｐ０
．　０．１％、Ｍｇ５Ｏ＜　・７Ｈ２００，０５％、Ｎ
ａＣ１Ｏ，２５％、（ＮＨ４）２５Ｏ４２，３％、尿素
０．２％、ＣａＣ０＋　２％、ｐＨ７，４（アンモニア
で調整）〕に植菌する。３０℃で７５時間培養後、培地
中のし一ヒスチジン生成量をスルファニル酸（ポーリー
）試薬を用いる比色法（ｔｌ、　Ｐａｕｌｙ、　１ｌｏ
ｐｐｅ−８ｅｙｌｅｒｓ　；　Ｚ、　Ｐｈｙｓｉｏｌｏ
、Ｃｈｅｍ、　。

浜、　５０８　（１９０４）、同９４．２８４　（１９
１５）　）によって定量した。結果を第１表に示す。

第１表 ｒ−Ａ１０３／ｐｃＧ１１　０ （４）　ｐＰＨ８を保有するコリネバクテリウム・ノ１
−キュリス、ブレビバクテリウム・フラバムおよびブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタムによるし一ヒス
チジンの生産： コリネバクテリウム・ハーキユリスＡＴＣＣ１３８６８
、ブレビバクテリウム・フラバムＡＴＣＣ１４０６７お
よびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣ
Ｃ１３８６９にプラスミドｐＰＨ８を保有せしめるため
に、各菌株を受容菌として形質転換を行う。

各菌株を５５Ｍ培地で増殖させ、ＯＤ６６０ｎｍが０．
２になったときにペニシリンＧを０．３単位／ｍｌとな
るように添加する。培養を続け、０Ｄ６６０が０，６ま
で増加したところで集菌し、ｌ’ｍｇ／ｍ＋リゾチーム
を含むＲＣＧＰ培地中で上記の記載と同様にプロトプラ
ストを形成させる。ｐＰＨ３を用い、上記の方法に従い
形質転換を行い。形質転換株をスペクチノマイシン４０
０μｇ　／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天培地上で生育するコ
ロニーとして選択する。

純化したスペクチノマイシン耐性形質転換株の培養菌体
よりプラスミドＤＮＡを特開昭５７−１８３７９９、同
５７−１３４５００の記載に従って調製し、これらがｐ
ＰＨ８と同じ構造を有することが制限酵素切断様式より
確認される。以上の−とから、プラスミドｐｃＧ１１の
誘導体であるプラスミドｐＰＨ８はコリネバクテリム・
ハーキュリス、ブレビバクテリウム・フラバムおよびブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタム中でも複製可
能であり、プラスミドｐｃＧ１１が広くこれら菌種の細
菌で使用可能であることがわかる。

ｐＰＨ８保有株であるコリネバクテリウム・ハーキュリ
スに３３．ブレビバクテリウム・フラバムに３４．およ
びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムに３５は
それぞれ米国アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションにＡＴＣＣ３９２８２，３９２８３および３９２
８４として寄託されている。

これら菌株によるし一ヒスチジン生産試験を次のように
行う。

ＮＢ寒天培地上で３０℃−晩培養させたｐＰＨ８保有株
およびそれらの親株をそれぞれ１白金耳ずつ５ｍｌの生
産培地Ｐ５に植菌する。３０℃で７５時間振盪培養後、
培地中のし一ヒスチジン生産量をポージー法によって比
色定量する。結果を第２表に示す。

以上より、コリネバクテリウム・グルタミクム由来のヒ
スチジン生成に関与する遺伝子がコリネバクテリウム・
グルタミクム以外にコリネバクテリウム・ハーキュリス
、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタムの諸菌種において発現し、ヒス
チジンの生産に寄与していることが明らかであった。

実施例２゜ 大腸菌に１２株亜株ＡＴＣＣ２３７４０のＬ−ヒスチジ
ン生合成に関与する遺伝子を含む組換え体プラスミドの
作製、同プラスミドへの１．２゜４−トリアゾール−３
−アラニン耐性突然変異の付与ならびに該突然変異誘起
プラスミドを・保有せしめたコリネバクテリウム・グル
タミクムによるし一ヒスチジンの生産： （１）大腸菌に１２株亜株　ＡＴＣＣ２３７４０の染色
体ＤＮＡとプラスミドｐＣＥ５３の調製：大腸菌の高分
子染色体ＤＮＡは、ヒスチジンに関して野性型の大腸菌
に１２株亜株ＡＴＣＣ２３７４０の培養菌体からスミス
のフェノール抽出法（Ｓｍｉｔｈ。

Ｍ、Ｇ、　：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｂｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ　ｌじ’）、　ＰａｒｔＡ、。

５４５　（１９６７）　）に従い単離した。

ベクタープラスミドとして用いるｐＣＥ５３は同プラス
ミドを保有する大腸菌に１２株亜株ＭＭ２９４／　ｐＣ
Ｅ５３の培養菌体からアンらの方法ＣＡｎ。

Ｇ、ｅｔ　ａユ、、：　Ｊ、口ａｃｔｅｒｉｏ１．．　
１４０．　４００（１９７９）　：１に従い単離した。

ＭＭ２９４／ｐＣＥ５３は次のような工程で造成した。

コリネバクテリウム・グルタミクムＬＡ１０３／ｐＣＥ
５３の培養菌体から実施例１に記載の方法でプラスミド
ＤＮＡを単離し、大腸菌に１２株亜株Ｍ　Ｍ　２９４　
〔Ｍｉｉｌｌｅｒ−旧ＩＩ、Ｂ、ｅｔ　ａｌ、、ｉｎ　
Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｇａｎｄ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏ
ｎｓ、ｅｄｓ、　５ｕｎｄ、Ｈ，ａｎｄ　Ｂｌａｕｅｒ
、Ｇ、ｐ２１Ｈ１９７５）　：１の形質転換に供した。

ＭＭ２９４株のコンピテント・セルはダジェルトらの方
法〔口ａｇｅｒｔ、　Ｍ、　ｅｔａｌ、、　Ｇｅｎｅ　
６．２３　（１９７９））に従って調製した。

カナマイシン２５μｇ　／ｍｌを含むＬ寒天培地（バク
トドリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム
５ｇ、ブドウ糖１ｇおよび寒天１６ｇを水１βに含み、
ｐＨ７，２に調整した培地）上に生育したカナマイシン
耐性形質転換体の１株を単集落分離した後、同様の培養
菌体からプラスミドＤＮＡを上記のアンらの方法に従っ
て単離した。プラスミドＤＮＡの構造を制限酵素切断様
式から解析し、もとのｐＣＥ５３と同一構造を有してい
ることを確認した。

コリネバクテリウム・グルタミクムＬΔ１０３／ｐＣＥ
５３は次のようにして造成した。プラスミドｐｃＧ１の
ＢｇｌＩＩ切断産物とｐｃΔ２２のＢａｍ８１部分切断
産物をＴ４リガーゼ（全酒造社製）を用いて連結せしめ
た。同連結物を用いてコリネバクテリウム・グルタミク
ムＬＡ１０３株を特開昭５７−１８６４９２および５７
−１８６４８９記載の方法に従って形質転換した。カナ
マイシン耐性形質転換体は１００　Ｍｇ　／ｍｌのカナ
マイシンを含むＲＣＧＰ寒天培地上で選択した。

同薬剤耐性の形質転換体の１株からプラスミドＤＮＡを
単離し、制限酵素切断により構造を解析した。同プラス
ミドはｐＧＡ２２のカナマイシン耐性を規定する遺伝子
近傍のＢａｍＨＩ切断部位にｐｃＧｌが挿入された構造
を有していた。本プラスミドｐＣＥ５３を含んだ形質転
換体をＬＡＩ０３／Ｉ）ＣＥ５３と命名した。

（２）大腸菌ＡＴＣＣ２３７４０のヒスチジン生合成に
関与する遺伝子のクローン化： 前項で記載した方法に従って調製したｐＣＥ５３プラス
ミドＤＮＡ３μｇおよび大腸菌染色体ＤＮＡ９μｇを含
む制限酵素Ｐｓｔｌ用反応液Ｃ２０ｍＭトリス（ｐＨ７
，５）、ｌＱｎ＋ＲＩＭｇｃβ２．５０１１１Ｍ　（Ｎ
Ｈ４）２Ｓｏ−、０，０１％ウシ血清アルブミン以下同
じ〕２００μβに１０単位のＰｓｔＩを添加し、３７℃
で６０分間反応せしめた後、６５℃で１０分間加温して
反応を停止させた。この混合消化物にＴ４リガーゼ用緩
衝液１４０μｊ７，５ｍＭＡＴＰ溶液４０μＡ、Ｔ４リ
ガーゼ０．３単位および水１２０μβを加え、１２℃で
１６時間反応させた。Ｔ４’Ｊガーゼ反応混合物を大腸
菌に１２株亜株Ｊ　Ｃ４ｌ　ｌ　［ｈｉｓＧ、　Ｉｅｕ
Ｂ、　ａｒｇＧ、　ｍｅｔＢ　：　ＣＩａｒｋｅｔ　ａ
ｌ、、　Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１０５
．１　（１９６９）　〕の形質転換に供した。

ＪＣ４１１のコンピテント・セルはダジェルトらの方法
［Ｄａｇｅｒｔ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ　、、：　Ｇｅｎ
ｅ　５　。

２３　（１９７９）］に従って調製した。即ち、Ｌ−ｂ
ｒｏｔｈ　Ｃバクトドリプトン１０　ｇ　、酵母エキス
５ｇおよび塩化ナトリウム５ｇを水ｌＩｌに含む培地（
以下ＬＢという））　（ｐ＋４７．２）　５０ｍ１にＪ
Ｃ４１１株を植菌し、対数期中期まで３７℃で振盪培養
した。培養液を氷水中で１０分間冷却してから遠心集菌
した。冷却した０、１Ｍ塩化カルシウム２０ｍ１に菌体
を再懸濁し、０℃に２０分間装いた。再び遠心集菌した
後、０．ＩＭ冷塩化カルシウム０．５ｍｌに再懸濁し、
０℃で１８時間装いた。

塩化カルシウム処理した菌液１５０μβに前記リガーゼ
反応混合物５０μｌを加え、０℃１０分間放置後、３７
℃で３分間加温した。Ｌ培地２１Ｔ１１を加え３７℃で
２時間振盪培養した。生理食塩水で２回遠心洗浄後、各
５０μｇ　／ｍｌのロイシン、アルギニン７メチオニン
および２５μｇ　／ｍｌのカナマイシンを添加したＡ寒
天培地［Ｎａ２１ＩＰＯｎ　８　ＬＫＩＩ２ＰＯ４２ｇ
、（ＮＨ４）２ＳＯ４１ｇ、Ｍｇ５Ｏ，・７１１２００
．１ｇ、サイアミン塩酸塩４ｍｇ、ブドウ糖Ｌｏｇおよ
び寒天１６ｇを水１１に含み、ｐ　Ｈ７，２に調整した
培地（以下同じ）〕に塗布し、３７℃で３日間培養した
。出現した形質転換株の培養菌体から前項と同様の方法
によってプラスミドＤＮＡを単離した。単離したプラス
ミドＤＮＡを制限酵素切断とアガロースゲル電気泳動法
により解析した結果的４．８　Ｋ　ｂのＰｓｔＩＤＮＡ
断片がｐＣＥ５３の唯１カ所のＰＳｔｌ切断部位に挿入
した構造を有していることがわかった。このプラスミド
をｐＥＧ７と命名した。

ＪＣ４１１株から前記と同様の方法によりコンピテント
・セルを調製しｐＥＧ？ＤＮＡを用いて形質転換した。

カナマイシン２５μｇ　／ｍ＋を含むＮＢ栄養寒天培地
上に生育した形質転換株は全てヒスチジン非要求性とな
っていたことから、ｐＥＧ７ブラスミドにはＪＣ４１１
株のｈｉｓＧ欠損変異を相補する活性が存在することが
明白である。

（３）プラスミドｐＥＧ７のコリネバクテリウム・グル
タミクムへの導入： ｐＥＧ？プラスミドＤＮＡを用いてコリネバクテリウム
・グルタミクムＬＨ７３株（ヒスチジン要求性、リゾチ
ーム感受性）を形質転換した。

形質転換はＬＨ７３株のプロトプラストを用いて実施例
１（２）と同様の方法で行った。カナマイシン２００μ
ｇ　／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天培地上に生育したカナマ
イシン耐性形質転換体から調製したプラスミドはｐＥＧ
７と同じ構造を有していることが制限酵素切断様式から
確認された。またカナマイシン形質転換体は全てヒスチ
ジン非要求性となっていた。これらのことから大腸菌由
来のヒスチジン生合成に関与する遺伝子がコリネバクテ
リウム・グルタミクムにおいても発現することが明白で
ある。

（４）プラスミドｐＥＧ７へのヒスチジンアナログ１．
２．４−）！ｊアゾールー３−アラニン耐性突然変異の
付与： 前項で造成したｐＥＧ７を保有するコリネバクテリウム
・グルタミクムＬＨ７３／Ｉ］ＢＧ７株を常法によりニ
トロソグアニジンで変異誘起し、ｌｌｌ１ｇ／ｍ１の１
．２．４−）リアゾール−３−アラニン（以下ＴＲＡと
略す）を含む最小寒天培地Ｍ１に塗布した。

３０℃で５日間培養後、出現したコロニーをかき集め、
生理食塩水に懸濁した。この菌液をカナマイシン２５μ
ｇ　／ｍｌを含む栄養培地ＮＢに約１０７細胞／ｍｌと
なるように植菌し、３０℃で１晩振盪培養した。培養菌
体から実施例１〔１〕項記載の方法に従ってプラスミド
を単離した。単離した混合プラスミドを用いてコリネバ
クテリウム・グルタミクムＬＨ７３株を再形質転換した
。得られたカナイシン耐性形質転換体のうちＴＲＡに対
する耐性形質を獲得した１株からプラスミドを単離した
。

同プラスミドはｐＥＧ７と同一の制限酵素切断様式を有
していた。このプラスミドをｐＥＧ７ｔ１８０と命名し
た。

（５）ｐＥＧ７１８０の４．８Ｋｂ　ＰｓｔｌＤＮＡ断
片のサブクローニング： ＴＲＡ耐性突然変異が大腸菌染色体に由来する４、８Ｋ
ｂ　ＰｓｔｌＤＮＡ断片上にあることをさらに確認する
ために同ＤＮＡ断片のサブクローニングを行った。それ
ぞれ３μｇのｐＥＧ７ｔ１８０およびｐＣＧｌｌＤＮＡ
をＰｓｔＩで切断した後、Ｔ４リガーゼを用いて連結し
た。ＤＮＡ連結物を用いてコリネバクテリウム・グルタ
ミクムＬＡ１０３株を実施例１（２）項記載と同様な方
法によって形質転換した。得られたスペクチノマイシン
耐性形質転換体をｌｌｌ１ｇ／ｍ１ＴＲＡおよび各５０
μｇ／ｍｌのアルギニン、メチオニンを含むＡ寒天培地
、２５μｇ　／ｍｌのカナマイシンを含むＮＢ寒天培地
ならびに１００μｇ　／ｍ＋のスペクチノマイシンを含
むＮＢ寒天培地に順次塗布した。３０℃で５日間培養後
スペクチノマイシンおよびＴＲＡに耐性でカナマイシン
に感受性を示した１株を選び、純化後、培養菌体からプ
ラスミドを単離した。同プラスミドの制限酵素切断様式
から、このプラスミドはｐｃＧｌｌのＰｓｔｌ切断部位
に４．８　Ｋ　ｂのＰＳｔＩＤＮＡ断片が挿入されてい
る構造を有していることがわかった。同プラスミドをｐ
ｃｓｔ１８０と命名した。ｐＣ５ｔ１８０ＤＮＡを用い
てＬＨ７３株を再形質転換したところ、得られたスペク
チノマイシン耐性形質転換株は全てヒスチジン非要求性
であった。

つぎにアルギニン、メチオニンをそれぞれ２００μｇ　
／ｍｌ袖った生産培地Ｐ５を用いてコリネバクテリウム
・グルタミクムＬＡ１０３／ｐＥＧ？。

ＬＡ１０３／ｐＥ（ｄｔ１８０．　ＬＡ１０３／ｐｃＧ
１１　（ＡＴＣＣ３９０２２）およびＬＡＩ０３／ｐｃ
ｓｔ１８０株（に−４９）のし−ヒスチジン生産試験を
行った。

３０℃７５時間培養後、培地中に蓄積したし一ヒスチジ
ンを実施例１（３）項に示した方法で比色定量した。結
果を第３表に示す。

第　３　表 ＬＡ１０３／ｐＥＧ７　０ ＬＡ１０３／ｐＥＧ７ｔ１８０　Ｌ、８ＬＡ１０３／ｐ
ｃＧ１１　０ ＬＡ１０３／ｐｃｓｔ１８０　２．０ これらのことから大腸菌染色体由来のヒスチジン生合成
に関与する遺伝子を含む４．８Ｋｂ　ＰｓｔＩＤＮＡ断
片上にＴＲＡ耐性突然変異が存在し、同ＤＮＡ断片上の
遺伝子発現によりコリネバクテリウム・グルタミクムを
用いてＬ−ヒスチジンが生産されることが示された。

ＬＡ１０３／ｐｃｓｔ１８０株は工業技術院微生物工業
技術研究所にコリネバクテリウム・グルタミクムに４９
ＦＥＲＭ−ＢＦ２６４として寄託されている。

第１頁の続き

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　ヒスチジン生成に関与する遺伝子を含むＤＮＡ
   断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを用いコリネ
   バクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する微
   生物から選ばれる宿主菌株を形質転換して帰られる形質
   転換株を培地に培養し、培養物中にヒスチジンを生成蓄
   積せしめ。 該培養物からヒスチジンを採取することを特徴とするヒ
   スチジンの製造法。 （２）該遺伝子を含むＤＮＡ断片が真核生物、原核生物
   、ウィルス、バクテリオファージまたはプラスミド由来
   であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 （３）該原核生物が細菌であることを特徴とする特許請
   求の範囲第２項記載の方法。 （４）該細菌がエッシエリヒア属、コリネバクテリウム
   属、ブレビバクテリウム属、バチルス属。 スタフィロコッカス属およびセラチア属から選ばれるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の方法。 （５）該細菌がヒスチジンアナログに耐性であることを
   特徴とする特許請求の範囲第４項記載の方法。 （６）該細菌がコリネバクテリウム・グルタミクムの１
   ．２．４−ト！Ｊアゾールー３−アラニン耐性株である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第５項記載の方法。 （７）該ベクターがコリネバクテリウム属またはブレビ
   バクテリウム属細菌中で自律複製できる微生物由来のプ
   ラスミド、ファージまたはその誘導体であることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 （８）該プラスミドおよびその誘導体がコリネバクテリ
   ウム属に属する微生物由来のｐｃＧｌ、ｐＣＧ２．ｐＣ
   Ｇ４．ｐＣＥ５２．ｐＣＥ５３゜ｐＣＥ５４．　ｐＣＧ
   Ｉ　１またはｐｃＢｌｏｌと名付けたプラスミドである
   ことを特徴とする特許請求の範囲第７項記載の方法。 （９）該宿主菌株がコリネバクテリウム・グルタミクム
   、コリネバクテリウム・ハーキュリス、ブレビバクテリ
   ウム・フラバムおよびブレビバクテリウム・ラクトファ
   ーメンタムからえらばれることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 α１　該宿主菌株がコリネバクテリウム属またはブレビ
   バクテリウム属に属し、かつリゾチーム感受性であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 （１１）該宿主菌株がコリネバクテリウム・グルタミク
   ムし−２２またはその誘導株であることを特徴とする特
   許請求の範囲第１０項記載の方法。 （１２）コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
   ム属に属する微生物由来のヒスチジン生成に関与する遺
   伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体を
   含むコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
   に属する微生物。 （１３）　該ＤＮＡ断片が微生物にヒスチジンまたはヒ
   スチジンのアナログに耐性を与えるＤＮＡ断片であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１２項記載の微生物。 （１４）コリネバクテリウム・グルタミクムに３２゜Ａ
   ＴＣＣ３９２８１゜ （１５）コリネバクテリウム・ハーキュリスに３３゜Ａ
   ＴＣＣ３９２８２゜ （１６）ブレビバクテリウム・フラバムに３４．ＡＴＣ
   Ｃ３９２８３゜ （１７）　ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
   に３５．ＡＴＣＣ３９２８４゜ （１８）コリネバクテリウム・グルタミクムに４９゜Ｆ
   ＥＲＭ−ＢＦ２６４゜