JPH0243480B2 - - Google Patents

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JPH0243480B2
JPH0243480B2 JP60225022A JP22502285A JPH0243480B2 JP H0243480 B2 JPH0243480 B2 JP H0243480B2 JP 60225022 A JP60225022 A JP 60225022A JP 22502285 A JP22502285 A JP 22502285A JP H0243480 B2 JPH0243480 B2 JP H0243480B2
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Description

【発明の詳細な説明】 腎蔵及び泌尿生殖器の疾病の診断において、尿
中の白血球の検出は非常に重要である。従来、こ
の検出は顕微鏡で行なわれており、この際特定の
量の尿中に存在する白血球の数を顕微鏡で数えて
いた。しかしながらこの方法は時間がかかり、労
多く、煩雑であり、更に熟練した人材を必要とす
る。
最近、種々の体液中の白血球の検出原理とし
て、酵素反応が採用されている。それというのも
白血球は広い酵素スペクトルを有するからであ
る。
白血球に存在するエステル分解及び／又は蛋白
分解作用が分析の目的に利用される体液中の白血
球の検出手段は、西ドイツ特許出願公開第
2826965号及び同第2836644号明細書から公知であ
る。この場合には、スルホンフタレインエステル
もしくはアゾ−色素エステルが白血球−エステラ
ーゼ及び／又は−プロテアーゼに対する基質とし
て使用される。酵素反応時に遊離する色素は一般
に公知の方法で評価される。これらの明細書中に
記載の検出剤はなお敏感すぎる。これらは、検出
下限値に対して反応時間が長すぎるから、実用に
はなお特定の欠点を有し、特に試験の実施の際に
長すぎる待期時間を伴なつている。
プロテアーゼ及びエステラーゼを検出する種種
の方法が組織化及び細胞化学的酵素学からも公知
である（例えば、A.G.E.ピアス（Pearse）の
Hitochemistry、Theoretical and Applied第３
版Churchill Livingstone、Edinburgh−London
−New−York1968年）。この場合、原理的には、
同様に無色又は僅かに着色したエステルが使用さ
れ、これは、酵素分解により少なくとも無色の酸
及び同様に無色のアルコール−（フエノール）−成
分に分解する。次いで後者は、酵素鹸化に引続く
反応で例えば、ジアゾニウム塩との結合又は酸化
反応により、着色した物質に変えられる。
F.シユマルツル（Schmalzl）及びH.ブラウン
スタイナー（Braunsteiner）は、例えばKlin.
Wschr.46巻642頁（1968年）に、基質としてナフ
トール−AS−Ｄ−クロルアセテート及び着色ア
ゾ化合物形成のためのジアゾニウム塩を用いる特
異な細胞化学的白血球エステラーゼ検出に関して
記載している。
体液例えば尿中の白血球を迅速かつ簡単に検出
するための検出剤を得るためには、この種の２成
分系は好適でないことが判明した。これらはあま
りに鈍感に反応する。例えば白血球5000／μを
有する試料は反応を示さない。尿中に存在する多
くの化合物例えばウロビリノーゲン、ステルコビ
リノーゲン、ビリルビン等はジアゾニウム塩と反
応することは公知である。このことは尿中のウロ
ビリノーゲン又はビリルビンを検出するための市
販の試験片（これは検出反応のためにジアゾニウ
ム塩を使用する）が最良であることを立証してい
る。エステラーゼ検出のために文献中で使用され
ているジアゾニウム塩は、他の尿成分との副反応
を示し、一部は、その個有の色にも基づき白血球
試験には使用できない。
ところで、本発明の課題は、酵素に対する反応
成分としてエステル及びジアゾニウム塩の組成物
を有するエステル分解及び／又は蛋白分解酵素の
検出剤を調製することであり、これを用いると、
酵素は簡単かつ容易に取扱い可能な方法で短時間
に検出でき、被検試料の他の成分との障害性副反
応は認められない。
この課題は好適なエステルと特別に置換された
ジアゾニウム塩との特定の組成物を使用すること
により解決され、この際意外にも、使用ジアゾニ
ウム塩は、他の尿成分例えばビリルビン及びウヨ
ビリノーゲンと反応せず、特異的にかつ迅速に使
用したエステルの分解時に生じるフエノール成分
と結合して着色化合物を形成する。
好適なエステルは、エステル分解及び／又は蛋
白分解酵素に対して充分に反応性であるはずであ
り、従つて、これらはできるだけ迅速に分解され
て酸及びアルコール成分（これにはフエノールも
入り得る）になる。エステルは、遊離したアルコ
ール成分が良好かつ完全に使用ジアゾニウム塩と
結合するように選択すべきでもある。ジアゾニウ
ム塩の反応性は置換分を適当に選択することによ
り、本発明により使用されているエステルから遊
離されたアルコール成分と充分に迅速に反応する
が、試験溶液のその他の成分とは反応しないよう
に調節すべきである。
従つて、本発明の目的物は、エステル分解及
び／又は蛋白分解酵素殊に白血球中に存在するエ
ステラーゼ及び／又はプロテアーゼを検出するた
めの検出剤であり、これは適当なエステラーゼも
しくはプロテアーゼ検出系、緩衝剤並びに場合に
よつては他の慣用の添加物を含有する吸着性担
体、膜層、粉末混合物、凍結乾燥物、溶液又は試
験錠剤よりなり、その特徴は、エステラーゼ−も
しくはプロテアーゼ検出系として、置換分の適当
な選択により、エステルから遊離されたアルコー
ル成分と充分に迅速に反応するが試験溶液の他の
成分とは反応しないようにその反応性が調節され
ている、特別に置換されたジアゾニウム塩と適当
なエステルとの組成物を使用することよりなる。
本発明における適当な置換されたジアゾニウム
塩は、例えば、一般式： 〔式中R1は低級アルキル基、低級アルコキシ基、
低級アルキルメルカプト基、Ｎ−モルホリノ基、
Ｎ−チオ−モルホリノ基、Ｎ−ピロリジノ基、
N′−アルキル化されていてもよいＮ−ピペラジ
ノ基、Ｎ−ピペリジノ基、ハロゲン又は水素を表
わし、R3は低級アルキル基、低級アルコキシ基、
アリールオキシ基、低級アルキルメルカプト基、
アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、ヒドロ
キシ基、Ｎ−モルホリノ基、Ｎ−チオ−モルホリ
ノ基、Ｎ−ピロリジノ基、N′−アルキル化され
ていてもよいＮ−ピペラジノ基、Ｎ−ピペラジノ
基、フエニルアミノ基、低級アルキル又は低級ア
ルコキシ基で置換されていてもよいフエニル基、
ハロゲン又は水素を表わし、R2、R4、R6は同一
又は異なるものであつてよく、それぞれ、低級ア
ルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルメル
カプト基、ハロゲン又は水素を表わし、Ｘは安定
化性アニオンを表わす〕の化合物である。
本発明により使用可能な好適なエステルは、例
えば一般式： 〔式中R′1、R′2、R′3、R′4は同一又は異なるもの
であつてもよく、それぞれ、水素原子又はハロゲ
ン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ア
リール基、アラルキル基、アラルコキシ基、ヒド
ロキシ基、カルボキシ基、カルボキシ低級アルコ
キシ基、アラルコキシカルボニル基、アラルコキ
シ−カルボニル−低級アルコキシ基、ニトロ基又
は低級アシルアミノ基を表わすか、又は各々隣接
している２個の置換分は一緒になつてハロゲン原
子で置換されていてもよいベンゾ縮合基を表わ
し、X′は硫黄原子又は１個の低級アルキル、ア
リール、アラルキル又はアシル基で置換されてい
てもよいイミノ基を表わし、Ａはアミノ酸残基又
はペプチド基を表わし、Ｂはペプチド化学に慣用
の又はこれから誘導された窒素保護基を表わす〕
の化合物である。
一般式のエステルは、エステラーゼ及び／又
はプロテアーゼ例えば好中性顆粒性白血球中に存
在するエステラーゼ及びプロテアーゼにより迅速
かつ完全に鹸化される。遊離されたフエノール成
分は良好、迅速かつ選択的に低い親電子性の一般
式のジアゾニウム塩と反応する。従つて、本発
明の原理により、体液中の白血球を検出するため
の安定で迅速に指示する検出剤を製造することが
できる。更に、本発明による検出剤は蛋白分解酵
素例えば水溶液又は体液例えば完全血液、血清及
び髄液、膵液又は便抽出液中のエステラーゼ、キ
モトリプシン又はトリプシンの一般的検出にも優
れている。
一般式のジアゾニウム塩は部分的に公知の化
合物である。置換分R1及び／又はR3がＮ−チオ
モルホリノ−、Ｎ−ピロリジノ−、場合により
N′−アルキル化されたＮ−ピペラジノ−又はＮ
−ピペリジノ基を表わす誘導体は、新規化合物で
ある。しかしながら、これらは、公知物質を得る
と同時に公知方法で製造できる。
一般式の化合物は、西ドイツ特許出願第
P2854987.5号明細書に記載されている。
R1、R2、R3、R4及びR5もしくはR′1、R′2、R′3
及びR′4の定義におけるハロゲンとは、弗素、塩
素、臭素及び沃素特に塩素及び臭素である。
R1〜R5、R′1〜R′5の定義における低級アルキ
ル−、アルコキシ−、アルキルメルカプト−、ア
ルキルアミノ−、及びジアルキルアミノ−基、炭
素原子１〜５特に１〜３を有し、この際相応する
メチル基が特に有利である。
安定性アニオンＸとしては、テトラフルオロボ
レート、テトラクロルジンケートもしくはペルク
ロレートが有利である。
R′1、R′2、R′3及びR′4の定義におけるアラルコ
キシ基並びにX′の定義にけるアラルキル基とは、
オキシ−低級−アルキルもしくは低級アルキル
基、置換されたフエニル及びナフチル基であり、
ここでアルキル基は炭素原子１〜５、特に１〜３
を有する。特にベンジルオキシ−もしくはベンジ
ル基が有利である。
R′1、R′2、R′3、及びR′4の低級アシルアミノ基
としては、炭素原子数１〜５特に１〜３の低級脂
肪酸カルボン酸のアミド基がこれに該当する。特
にアセチルアミノ基が有利である。
X′の定義におけるアミノ基としては、炭素原
子数１〜５特に１〜３の脂肪族カルボン酸又は芳
香族カルボン酸例えば安息香酸又はナフトエ酸の
残基がこれに該当する。特にアセチル基及びベン
ゾイル基が有利である。
R′1、R′2、R′3、R′4及びX′の定義におけるアリ
ールもしくはアラルキル基とは、特にフエニル
基、ナフチル基もしくはベンジル基である。
Ａの定義におけるアミノ酸残基とは、有利にＬ
−又はＤ−型又はラセミ形の天然の−アミノ酸の
残基である。特にグリシン、アラニン、バリン、
ロイシン、イソロイシン、フエニルアラニン及び
チロシンの残基であり、この際それぞれＬ−型が
特に有利である。場合によつて存在する遊離ヒド
ロキシル基はアシル化特にアセチル化されていて
よい。
Ｂの定義におけるアミノ保護基とは、例えばア
シル−、オキシカルボニル−、チオカルボニル
−、スルホニル−、スルフエニル、ビニル−、シ
クロヘキセニル−、ホスホリル−又はカルバモイ
ル基である。
一般式の本発明により使用されるジアゾニウ
ム塩及び一般式のエステルは、含浸溶液被覆物
質又は被検液体１当り10-4モル／〜10-1モ
ル／特に10- 3モル／〜10-2モル／の濃度で
使用される。
蛋白分解酵素及び殊に白血球−プロテアーゼを
検出するための本発明による検出剤のもう１つの
成分は適当な緩衝剤系である。これには、例えば
隣酸塩−、ホウ酸塩−バルビツール酸塩、トリス
−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン−（＝トリ
ス）、２−アミノ−２−メチル−プロパンジオー
ル−１，３−（＝アメジオール）−又はアミノ酸−
緩衝剤が該当し、この際PH値及びキヤパシテイ
は、測定溶液中もしくは試験片上のPH値が６〜10
特に７〜９になるように選択すべきである。
本発明による蛋白分解酵素の検出のもう１つの
成分は、湿潤剤であつてもよい。それというの
も、これによつて均一な色素分配及び部分的に鮮
明な色を得ることができるからである。カチオン
−及びアニオン活性、かつ無定形及び非イオン性
湿潤剤も0.05〜２（ｗ／ｖ）％特に0.1〜１（ｗ／
ｖ）％の濃度で使用できる。
本発明の検出剤のもう１つの成分は安定剤とし
ての一般式： 〔式中R6はジアルキルアミノ−、アルコキシ−、
アリロキシ、アルキル又はアリール基又はＮ−モ
ルホリノ基を表わし、R7とR8はジアルキルアミ
ノ基又はＮ−モルホリノ基を表わす〕の燐酸−も
しくはホスホン酸−アミドを使用することができ
る。
R6の定義におけるアルコキシもしくはアルキ
ル基としては、炭素原子数10までの炭化水素基が
これに該当する。
R6の定義におけるアリールもしくはアリロキ
シ基とは、場合によつてはハロゲン、低級アルキ
ル−又は低級アルコキシ基で置換されたフエニル
−又はナフチル基である。
一般式の化合物を用いて、処理の意想外の安
定化が得られる。
一般式の燐酸アミド及びホスホン酸アミド
は、公知化合物であり、これらは例えば西ドイツ
特許出願公告第2235127号明細書中で、ペルオキ
シダーゼ検出を基礎として作用する試験片処理の
安定剤として使用される。
一般式の燐酸アミド及びホスホン酸アミド型
の安定剤は、水性又は有利に有機含浸液に１〜20
（ｗ／ｖ）％特に５〜15（ｗ／ｖ）％の濃度で添加
される。
意外にも、本発明による診断剤の蛋白分解酵素
殊に蛋白分解性白血球酵素の検出剤の反応時間
は、ジアゾニウム塩、エステル類及び従来挙げら
れている助剤に加えて、１種以上の活性剤を使用
する際に著るしく短縮される。本発明による検出
剤に好適な活性化剤としては、西ドイツ特許出願
第P2905531.0号明細書に記載されている化合物が
判明している。
この活性化剤は、含浸溶液中で0.5〜10％特に
１〜５（ｗ／ｖ）％の濃度で使用される。
本発明による検出剤の製造のために、例えば吸
着性担体有利に濾紙、セルロース又は人造繊維フ
リースに、易揮発性溶剤例えば水、メタノール、
エタノール又はアセトン中の試験片製造のために
必要な通前使用さる試薬（基質、緩衝剤、場合に
よつては湿潤剤）の溶液を含浸させる。これは、
有利に２つの別個の工程で行なう即ち、まず、緩
衝液及び他の水溶性添加物を含有する水溶液で含
浸させる。その後、一般式もしくはのプロテ
アーゼ基質、一般式のジアゾニウム塩及び活性
化剤の溶液で含浸する。しかしながらこの含浸
は、他の順序でもしくは双方の含浸剤溶液の他の
組成のものを用いて実施することができる。
得られた試験紙は、そのまま使用できるか又は
公知方法で把手に接着して又は有利にプラスチツ
クと細かい目の網との間に西ドイツ特許第
2118455号明細書記載の方法で封入することもで
きる。
膜被覆された試験片を製造するために、全試薬
を膜形成物質例えばポリビニルエステル又はポリ
アミドの溶液又は分散液中に入れ、均一に混合す
る。この混合物を薄層でプラスチツク担体上に塗
布し、乾燥させる。本発明による膜被覆された試
験片を乾燥後に切断し、そのまま使用するか又は
公知方法で把手に接着し又は例えばプラスチツク
と細かい目の網との間に西ドイツ特許第2118455
号明細書記載の方法で封入することができる。
蛋白分解酵素殊に白血球プロテアーゼを検出す
るための本発明による診断剤は、粉末混合物又は
試薬錠剤の形で製造でき、この際、テストの前記
成分に慣用のガレヌス製剤添加物を加え、造粒す
る。この種の添加物質は例えば炭水化物例えばモ
ノ−、オリゴー又はポリサツカライド、又は糖ア
ルコール例えばマンニツト、ソルビツト又はキシ
リツト又は他の可溶性の不活性化合物例えばポリ
エチレングリコール又はポリビニルピロリドンで
ある。粉末混合物又は試薬錠剤は一般に約50〜
200mg特に50〜80mgの最終重量を有する。
全重量約５〜20特に約10mgの凍結乾燥物を製造
するために、試験に必要なすべての試薬と共に慣
用の基剤物質例えばポリビニルピロリドン及び場
合によつては他の填料例えばマンニツト、ソルビ
ツト又はキシリツトを含有する溶液を凍結乾燥さ
せる。
本発明による溶液の形の診断剤は有利に試験に
必要なすべての試薬を含有している。溶剤とし
て、水又は水と水溶性有機溶剤例えばメタノー
ル、エタノール、アセトン又はジメチルホルムア
ミドとの混合物がこれに該当する。貯蔵性の理由
から、試験に必要な試薬を２種以上の溶液に分
け、これを実際の検査の際にはじめて一緒にする
のが有利に可能である。
こうして製造した診断剤は、被検体液に浸漬す
るか又は当該体液の添加の後に、蛋白分解酵素殊
に白血球プロテアーゼの存在を、迅速かつ簡単に
可視で又は光度測定により、例えばレミツシヨン
フオトメトリーにより又はキユベツト中で評価で
きる色素形成により検出可能とする。
１細胞当りの白血球−プロテアーゼの活性は実
際に一定の大きさとみなすことができるから、色
形成の強さから被検体液の白血球濃度を測定する
ことができる。この場合、本発明による診断剤を
用いて、完全な白血球も溶解した白血球も捕捉さ
れる。それというのも、白血球−プロテアーゼの
活性は、白血球の溶解の後にも完全に残存するか
らである。溶解誤差は結果的に現われない。
例 １ 濾紙（例えばSchleicher ＆ Schuell23SL）
を順次に次の溶液で含浸し、次いで60℃で乾燥さ
せる： 溶液１ 0.2モルポラツクス−塩酸−緩衝液（PH８）燐
酸トリモルホリド 10％ 溶液２ 基 質 ２×10-3モル／ ジアゾニウム塩 10-2モル／ をアセトン／１−デカノール98：２中に溶かす。
基 質 S1：３−〔Ｎ−（トルオール−4′−スルホニル）
−Ｌ−アラニルオキシ〕−インドール ジアゾニウム塩 D1：２，４−ジメトキシ−ベンゾールジアゾ
ニウム−テトラフラオロボレート D2：４−メトキシ−ナフタリン−１−ジアゾ
ニウム−テトラフルオロボレート D3：２，５−ジメトキシ−４−ジメチルアミ
ノ−ベンゾールジアゾニウム−テトラフ
ルオロボレート D4：４−ジメチルアミノ−ベンゾールジアゾ
ニウム−テトラフルオロボレート 白血球含有尿（白血球100／尿μ）中に浸漬
する際に、約３分以内に表に示すような色を示す
試験紙が得られる。評価はレミツシヨンフオトメ
ーターで行なうこともできる。 基質 ジアゾニウム塩 色 S1 D1 赤褐色 S1 D2 赤褐色 S1 D3 青灰色 S1 D4 緑 色 例 ２ 濾紙に次の溶液を含浸させ60℃で乾燥させる。
溶液１ 0.1モルのホウ酸塩−緩衝液（PH８） 溶液２ ２−メトキシ−４−（Ｎ−モルホリノ）−ベンゾ
ールジアゾニウムテトラクロルジンケート
２×10-3モル／ 基 質 ２×10-3モル／ 燐酸トリモルホリド 10％ をエタノール／１−デカノール98：２中に溶か
す。
基 質 Ａ：３−〔Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ
−アラニルオキシ〕−インド−ル Ｂ：３−〔Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ
−アラニルオキシ〕−５−メチル−インド
ール Ｃ：３−〔Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ
−アラニルオキシ〕−７−メチル−インド
ール Ｄ：３−〔Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ
−アラニルオキシ〕−４−クロル−インド
ール Ｅ：３−〔Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ
−アラニルオキシ〕−５−ブロム−インド
ール Ｆ：３−〔Ｎ−（トルオール−4′−スルホニル）
−Ｌ−アラニルオキシ〕−インドール Ｇ：３−〔Ｎ−（トルオール−4′−スルホニル）
−Ｌ−アラニルオキシ〕−５−メトキシ−
インドール Ｈ：３−〔Ｎ−（4′−アセタミドベンゾールスル
ホニル）Ｌ−アラニルオキシ〕−インドー
ル Ｉ：３−〔Ｎ−（4′−メトキシトジル）−Ｌ−ア
ラニルオキシ〕−インドール こうして得た試験紙を用いて、白血球含有尿中
の白血球100／μを検出することができる。
前記のジアゾニウム塩の代りに次のものを使用
する際に匹敵しうる反応性を有する試験紙を得る
こともできる： ２−メトキシ−４−（Ｎ−ピペリジノ）−ベンゾ
ールジアゾニウム−テトラフルオロボレート、２
−メトキシ−４−（Ｎ−ピペリジノ）−ベンゾール
ジアゾニウム−テトラフルオロボレート、２，６
−ジメトキシ−４−（Ｎ−モルホリノ）ベンゾー
ルジアゾニウム−テトラフルオロボレード、４−
メトキシ−２−（Ｎ−モルホリノ）−ベンゾールジ
アゾニウム−テトラフルオロボレート、２−メト
キシ−４−〔Ｎ−（N′−メチル）−ピベラジノ〕−
ベンゾールジアゾニウム−テトラフルオロボレー
ト、２−メトキシ−４−（Ｎ−チオモルホリノ）−
ベンゾールジアゾニウム−テトラフルオロボレー
ト。
例 ３ 濾紙に次の溶液を含浸させ、この含浸の後にそ
れぞれ60℃で乾燥させる。
溶液１ アセトン／１−デカノール（98：２）中の３−
（Ｎ−トルオール−4′−スルホニル−Ｌ−アラ
ニルオキシ）−インドール ２×10-3モル／ ２−メトキシ−４−モルホリノ−ベンゾールジ
アゾニウム−テトラクロルジンケート
２×10-3モル／ 溶液２ 0.2モルのボラツクス−塩酸−緩衝液（PH８）
燐酸トリモルホリド 10％ もう１つの実験で、溶液２中の燐酸トリモルホ
リドを用いた。
燐酸トリモルホルドを有する見本は60℃で２日
間にわたる負荷の後に変色しないまま残つた。燐
酸トリモルホリドを含まない見本は灰色に変色す
る。
例 ４ 公知方法で、次の成分を含有する試薬錠剤を製
造した： ３−（Ｎ−トリオール−4′−スルホニル−Ｌ−
アラニルオキシ）インドール ２mg ２−メトキシ−４−（Ｎ−モルホリノ）ベンゾ
ールジアゾニウムテトラクロルジンケート ２mg 燐酸二水素カリウム 1.5mg 燐酸水素ジナトリウム・２水和物 30mg マンニツト 20mg この錠剤を白血球含有尿２ml中に溶かし、良好
に混合する。白血球が存在する場合に赤紫色変色
が現われた。
白血球100個は約２分以内に検出できた。
尿を錠剤添加前及び反応の間に37℃の温度に保
持すると、同じ時間内に白血球20個が検出でき
た。
例 ５ ２−メトキシ−４−（Ｎ−モルホリノ）−ベンゾ
ールジアゾニウム−テトラクロルジンケート ５−クロル−２−ニトロアニソールを1.5倍モ
ル過剰のモルホリンと共に溶剤としてのトルオー
ル中で数時間加熱により還流下に（10〜14時間）
反応させる。反応は溶剤としてのモルホリン中で
実施するのが有利である。このために、この５−
クロル−２−ニトロアニソールに５〜10倍量のモ
ルホリンを加える。場合により脱メチル化された
生成物を苛性ソーダと共に振ることにより分離さ
せるか又はジアゾメタンとの反応により後メチル
化する。
得られたニトロ化合物を常法でメタノール中の
パラジウム／炭又は塩酸中の塩化錫（）で還元
してアミドにし、次いでこれをジアゾ化する。こ
のジアゾニウム化合物を公知方法で塩酸溶液中で
濃塩化錫溶液の添加により、テトラクロルジンケ
ートに変るか又はテトラフルオロホウ酸の添加に
よりテトラフルオロボレートに変え、それ自身を
単離する。
融点170〜172℃ （テトラクロルジンケート） 166〜168℃ （テトラフルオロボレート） 例 ６ ４−メトキシ−２−（Ｎ−モルホリノ）−ンゾ−
ルジアゾニウム−テトラフルオロボレート ３−クロル−４−ニトロアニソール（融点52
℃）18.76ｇ（0.1モル）をモルホリノ87.1ｇ（１
モル）と共に還流下に４時間加熱する。その後、
室温まで冷却し、反応溶液に氷水100mlを加え、
析出した黄色反応性生成物を吸引し、氷冷10％酢
酸で洗浄し、得られた物質を60℃、真空中で乾燥
させる。Ｎ−（３−ヒドロキシ−６−ニトロフエ
ニル）−モルホリン及びＮ−〔３−メトキシ−６−
ニトロフエニル）−モルホリンからなる混合物
19.5ｇを生じる。この生成物を塩化メチレン中に
溶かし、ジアゾメタンのエーテル溶液を加える。
室温で２日放置の後に過剰のジアゾメタンを2N
酢酸の添加により分解し、有機相を2N苛性ソー
ダで数回振出し、溶剤を真空中で溜去する。Ｎ−
（３−メトキシ−６−ニトロフエニル）モルホリ
ン（融点84〜96℃）19.1ｇ（＝80.2％）が得られ
る。引続き、これら物質をメタノール250ml中で
懸濁させ、パラジウム−炭（10％）1.9ｇの添加
の後に20〜30℃で水性添加する。
触媒の濾去の後に、充分に濃縮し、遊離した塩
基をエーテル性塩酸の添加により塩酸塩に変え
る。Ｎ−（３−メトキシ−６−アミノ−フエニル）
モルホリン−２塩酸（融点237〜240℃）20.6ｇ
（＝理論量の73.1％）が晶出する。
この物質を−５℃で6N塩酸96ml中に懸濁させ、
30分かかつて水12ml中に亜硝酸ナトリウム６ｇの
溶液を滴加し、生じる褐赤色ジアゾニウム塩溶液
を０℃、撹拌下に35％テトラフルオロホウ酸120
mlに加える。数時間放置の後に４−メトキシ−２
−（Ｎ−モルホリノ）−ベンゾールジアゾニウムテ
トラフルオロボレート19.5ｇ（＝理論量の635％）
が得られる。黄色結晶、融点115〜116℃（分解）。
同様な方法で、 (a) ５−クロル−２−ニトロアニソール及びチオ
モルホリンから２−メトキシ−４−（Ｎ−チオ
モルホリノ）−ベンゾールジアゾニウムテトラ
フルオロボレートが得られる。
融点106〜108℃（分解）。
中間体２−アミノ−５−（Ｎ−チオモルホリ
ノ）−アニソール・２塩酸は次のようにして製
造される。
撹拌機を備えた１−三頚フラスコ中に、
6N塩酸400ml中の塩化錫（）・２水和物100ｇ
を装入し、Ｎ−ニトロ−５−（Ｎ−チオモルホ
リノ）アニソール25.4ｇを少量宛室温で撹拌下
に加える。その後75℃に30分間加熱し、室温ま
で冷却し、反応溶液を氷冷下に30％苛性ソーダ
750ml中に滴加する。遊離した塩基をエーテル
で数回抽出し、これを乾燥及び溶剤の部分的蒸
発の後に、エーテル性塩酸の添加により塩酸塩
に変える。２−アミノ−５−（Ｎ−チオモルホ
リノ）−アニソール・２塩酸（融点218〜220℃）
24.9ｇ（＝理論量の83.8％）が得られる。
(b) ５−クロル−２−ニトロアニソール及びピリ
ジンから２−メトキシ−４−（Ｎ−ピペリジノ）
−ベンゾールジアゾニウム−テトラフルオロボ
レートが得られた。
融点123〜125℃（分解） (c) ５−クロル−２−ニトロアニソール及びピロ
リジンから２−メトキシ−４−（Ｎ−ピロリジ
ノ）−ベンゾールジアゾニウム−テトラフルオ
ロボレートが得られた。
融点137〜139℃（分解） (d) ５−クロル−２−ニトロアニソール及びＮ−
メチル−ピペラジンから２−メトキシ−４−
〔Ｎ−（N′−メチル）−ピペラジノ〕−ベンゾー
ルジアゾニウム−テトラフルオロボレートが得
られる。
融点163℃（分解）。
この化合物の製造時に、メタノール中の亜硝
酸アミルを用いるジアゾ化を行なう。このため
に、２−アミノ−５−（Ｎ−メチル−ピペラジ
ノ）アニソール−ジヒドロ−テトラフルオロボ
レート39.6ｇ（0.1モル）をメタノール175ml中
に溶かし、メタノール25ml中の亜硝酸アミル
11.6ｇ（0.1モル）を加え、徐々に０℃で撹拌
下に35％四弗化ホウ酸60mlを滴加する。放置時
に２−メトキシ−４−〔Ｎ−（N′−メチル）ピ
ペラジノ〕−ベンゾールジアゾニウム−テトラ
フルオロボレート−ジヒドロ−テトラフルオロ
ボレートの褐色結晶24.8ｇ（＝理論量の51.7
％）が得られた。
融点163℃（分解）。
(e) ５−クロル−２−ニトロアニソールとモルホ
リンとから２−メトキシ−４−（Ｎ−モルホリ
ノ）−ベンゾールジアゾニウム−テトラフルオ
ロボレートが得られた。
融点166〜168℃（分解）。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 吸着性担体、フイルム層、粉末混合物、凍結
    乾燥物質、適当なエステラーゼ−及び／又はプロ
    テアーゼ−検出系、緩衝液、並びに場合によつて
    は、更に慣用の添加物を含有する溶液又は試薬錠
    剤よりなるエステル分解−及び／又は蛋白質分解
    酵素の検出剤において、エステラーゼ−及び／又
    はプロテアーゼ−検出系として、一般式： 〔式中、R1は低級アルキル基、低級アルコキシ
    基、低級アルキルメルカプト基、Ｎ−モルホリノ
    基、Ｎ−チオ−モルホリノ基、Ｎ−ピロリジノ
    基、N′−アルキル化されていてもよいＮ−ピペ
    ラジノ基、Ｎ−ピペリジノ基、ハロゲン又は水素
    を表わし、R3は低級アルキル基、低級アルコキ
    シ基、アリールオキシ基、低級アルキルメルカプ
    ト基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、
    ヒドロキシ基、Ｎ−モルホリノ基、Ｎ−チオ−モ
    ルホリノ基、Ｎ−ピロリジノ基、N′−アルキル
    化されていてもよいＮ−ピペラジノ基、Ｎ−ピペ
    リジノ基、フエニルアミノ基、低級アルキル又は
    低級アルコキシ基で置換されていてもよいフエニ
    ル基、ハロゲン又は水素を表わし、R2、R4、R5
    は同一又は異なるものであつてよく、それぞれ、
    低級アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキ
    ルメルカプト基、ハロゲン又は水素を表わし、Ｘ
    は安定化性アニオンを表わす〕のジアゾニウム塩
    と一般式： 〔式中R′1、R′2、R′3、R′4は同一又は異なるもの
    であつてよく、それぞれ、水素原子又はハロゲン
    原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アリ
    ール基、アラルキル基、アラルコキシ基、ヒドロ
    キシ基、カルボキシ基、カルボキシ低級アルコキ
    シ基、アラルコキシカルボニル基、アラルコキシ
    −カルボニル−低級アルコキシ基、ニトロ基又は
    低級アシルアミノ基を表わすか又は、各々隣接し
    ている２個の置換分は一緒になつてハロゲン原子
    で置換されていてもよいベンゾール環を形成して
    いてもよく、X′は硫黄原子又は１個の低級アル
    キル、アリール、アラルキル又はアシル基で置換
    されていてもよいイミノ基を表わし、Ａは天然α
    −アミノ酸を表わし、Ｂはアミノ保護基を表わ
    す〕の化合物〔式中R″1、R″2、R″3、R″4は同一
    又は異なるものであつてよく、それぞれ、水素、
    低級アルキル基、低級アルコキシ基、アルキルア
    ミノ基又はジアルキルアミノ基を表わし、この
    際、隣接している２個の置換分は縮合ベンゾール
    環を形成していてもよく、Ａ及びＢは前記のもの
    を表わす〕の化合物とからなる組成物を使用する
    ことを特徴とする、エステル分解及び／又は蛋白
    質分解酵素の検出剤。 ２ 付加的に、助剤、湿潤剤、安定剤、活性化
    剤、膜形成剤、ガレヌス製剤添加物及び／又は基
    剤を使用する、特許請求の範囲第１項記載の検出
    剤。
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